ACh II - MS Analytická chemie II: Úvod do hmotnostní spektrometrie Jan Preisler 3A14, Ústav chemie PřF MU, UKB, tel.: 54949 6629 preisler@chemi.muni.cz Specializovaný kurz: C7895 Hmotnostní spektrometrie biomolekul http://bart.chemi.muni.cz/courses.htm Prezentace s využitím: Daniel C. Harris: Quantitative Chemical Analysis, 7th Edition, 27, Chapter 22: Mass Spectrometry, W. H. Freeman and Company Gary D. Christian, Purnendu K. Dasgupta, Kevin A. Schug: Analytical Chemistry, 7th Edition, 214, Chapter 22: Mass Spectrometry, Wiley Stručná historie hmotnostní spektrometrie 183 Daltonova atomová teorie hmota se skádá z atomů; všechny atomy maji stejnou hmotu ne tak docela: izotopy Důkaz izotopů: - spektroskopie: nepatrný posun čar... vyžaduje kvalitní přístroj - MS: snadné stanovení ACh II - MS 4 Obsah I. Základní koncepty MS II. Hmotnostní analyzátory vzorku III. Ionizační metody a aplikace MS Stručná historie hmotnostní spektrometrie První hmotnostní spektrometr 1911 J. J. Thomson: Parabola MS (Phil Mag. 1911, 21, 225) Paprsky pozitivní elektřiny 1913 http://antoine.frostburg.edu/chem/senese/11/atoms/faq/how-does-mass-spec-work.shtml Magnetický sektor s energetickým analyzátorem 1919 F. W. Aston: Mass Spectrograph (Phil. Mag. 1919, 38, 29) IV. Seminář Elektronová ionizace 194 C. Berry: Struktura organických sloučenin Nové ionizační techniky (FAB, PD, ESI a MALDI) 198+ Analýza těžkých a velmi těžkých molekul 214 Kvalitativní, strukturní i kvantitativní analýzu anorganických organických a biologických molekul, často ve spojení s chromatografií; široká škála komerčních hmotnostních spektrometrů ACh II - MS 2 ACh II - MS 5 Mass spectrometry, MS Stručná historie Hmotnostní spektrum Definice rozlišení Izotopové vzory Interpretace spekter Fragmentace Základní koncepty Zpráva o stavu MS v ČR 398 MS LC-MS 86 MALDI MS 1 spektrometr/22 tis. obyvatel Počet instalací do září 215: Nezahrnuje GC-MS ( 5), ICP-MS (nepočítaně) Jde pouze o odhad instalovaných, nikoli funkčních přístrojů 1 spektrometr/163 km 2 ACh II - MS 3 6 1
1995-99 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 21 211 2 213 214 215 1997-99 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 21 211 2 213 214 215 6 5 4 3 Přehled instalací přístrojů LC-MS a MALDI MS (do září 215) Celkový počet instalací: 398 Celkový počet instalací: 86 15 1 Hmotnostní spektrum Hmotnost, m a.m.u., u, Da (Dalton), počet atomových hmotnostních jednotek číselně rovný molární hmotnosti m/z - účinná hmotnost, Th (Thomson) 2 1 5 Počet nábojů, z počet elementárních nábojů iontu obvykle ±1 výjimky, např. elektrosprej: z >> 1 počet za rok 215 je o cca ¼ nižší; loni v září instalováno 28 LC-MS, do konce roku 39 počet LC-MS instalovaných od r. 26: 34 vliv nasazení MALDI MS pro identifikaci mikroorganismů v klinické praxi počet MALDI MS instalovaných od r. 26: 75 7 Ionty: pozitivní a negativní, ne kationty a anionty Hmotnostní spektrometrie, ne spektroskopie ACh II - MS 1 Vybrané veličiny v hmotnostní spektrometrii Hmotnostní rozlišení (Mass Resolution, Resolving Power)...Míra separace dvou přilehlých píků. Definice: 1. FWHM (full width at half maximum), R = m/m 1/2 2. Nejmenší rozdíl hmotností ( m), při kterém lze ještě rozlišit sousední píky s definovaným údolím (1-9%) mezi píky. 3. Max. hmotnost, při které lze ještě rozlišit píky s jednotkovým rozdílem hmotností. Energie iontu Joule, J elektronvolty, ev atomy misto molů... elektronvolty místo Joulů. 1 ev = 1.6 x 1-19 J jednoduchost: urychlovací napětí = 1 V, náboj = 1... E = 1 ev vhodné pro srovnání s energií ionizační, vazebnou, s energií fotonu atd. Tlak, p 1 atm = 76 Torr = 11 325 Pa = 1,1325 bar = 14,7 PSI 8 ACh II - MS 11 Hmotnostní spektrum Rozlišení, Rozlišovací schopnost, R(FWHM) Iontový signál vs. m/z Iontový signál, intenzita libovolné jednotky (counts, arbitrary units, a.u.) normalizace signálu: intenzita nejvyššího píku = 1% m R m 28 14.146 1 9 8 7 6 5 4 normalizace iontového signálu Vhodné pro píky s gausovským, lorentzovským nebo trojúhelníkovým profilem, pro hmotnostní spektrometry B, TOF, FT ICR, O 3 2 1 6 7 8 9 1 11 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 m/z ACh II - MS 9 (příměs Pb v mosazi) ACh II - MS 2
Rozlišovací schopnost 92% 5% 1% ACh II - MS 13 ACh II - MS 16 Jednotkové rozlišení Izotopy vybraných prvků Uvádí do jaké hmotnosti lze rozlišit pík od píku o jednotku vyšší Vhodné pro kvadrupólové hmotnostní spektrometry http://www.jeolusa.com/desktopmodules/bring2mind/dmx/download.aspx?command=core_download&entryid=283&portalid=2&tabid=337 ACh II - MS 14 Kalkulátory izotopových profilů; např.: http://www.sisweb.com/mstools/isotope.htm ACh II - MS 17 Izotopy... atomy stejného prvku lišící se hmotností Vede k jemné izotopové struktuře píků Např. izotopy uhlíku: 99% C, 1% 13 C Výsledná kombinace je funkcí počtu uhlíkových atomů v molekule: C: 99% C 1% 13 C C 2 : 98% C C 2% C 13 C.1% 13 C 13 C C 3 : 97% C C C 3% C C 13 C.4% C 13 C 13 C 1-4 % 13 C 13 C 13 C Relativní výskyt molekul v %: C 6 : C 6 1 C 1 : C 1 1 C 13 59 C 66 C 13 99 C 11 C 13 58 C 2 21 C 13 98 C 2 6 C 13 57 C 3 4.6 C 13 97 C 3 22 Praktické důsledky výskytu izotopů + Objasňování struktury + Použití izotopových vnitřních standardů - Snížení citlivosti u těžších molekul - Nutnost vysokého R při vysoké m/z pro správné stanovení m/z Se stoupajícím n přestává být monoizotopická forma dominantní a intenzity různých forem jsou porovnatelné (široká obálka)... viz příklad dále. ACh II - MS 15 ACh II - MS 18 3
Molecular formula: C3H45N6O6S Resolution: 2 at 5% 617.3 1 Molecular formula: C18H27N36O36S6 Resolution: 2 at 5% 375.9 1 8 Peptid, M mono ~ 617 8 374.9 377.9 Peptid, M mono ~ 3 74 6 6 4 618.3 4 373.9 378.9 2 619.3 62.3 621.3 622.3 623.3 616 617 618 619 62 621 622 623 624 625 2 379.9 371.9 37.9 374 376 378 371 37 3714 ACh II - MS 19 ACh II - MS 22 Molecular formula: C6H9NOS2 Resolution: 2 at 5% 34.6 1 8 35.6 Peptid, M mono ~ 1 234 6 Molecular formula: C27H45N54O54S9 Resolution: 2 at 5% 5559.8 1 556.8 8 5557.8 Peptid, M mono ~ 5 556 5561.8 6 4 36.6 4 5556.8 5562.8 2 37.6 39.6 34 36 38 4 2 5555.8 5563.8 5564.8 5566.8 5569.8 5555 556 5565 557 ACh II - MS 2 ACh II - MS 23 Molecular formula: C9H135N18O18S3 Resolution: 2 at 5% 1852.9 1 1851.9 8 Peptid, M mono ~ 1 852 1853.9 6 Molecular formula: C36H54N272O272S Resolution: 2 at 5% 13414.4 1 134.4 8 13416.4 Protein, M mono ~ 13 47 13411.3 6 13417.4 4 2 1854.9 1855.9 1857.9 1852 1854 1856 1858 4 2 1341.3 13418.4 1349.3 1348.3 13419.4 1342.4 13422.4 1345 1341 13415 1342 13425 ACh II - MS 21 ACh II - MS 24 4
Molecular formula: C9H135N18O18S3 Resolution: 2 at 5% 18533.4 1 1853.4 18535.4 8 Protein, M mono ~ 18 52 18536.4 18529.4 6 4 2 18524.2 18528.3 18527.3 18526.3 18537.5 18538.5 18539.5 1852 1853 1854 18541.5 18544.6 ACh II - MS 25 Izotopy: objasňování struktury ACh II - MS 28 Molecular formula: C18H27N36O36S6 Resolution: 2 at 5% 3766. 1 Izotopy: objasňování struktury 8 Protein, M mono ~ 37 5 6 4 m/z ~ 2 375 376 377 378 ACh II - MS 26 ACh II - MS 29 Izotopy: objasňování struktury MS s vysokým rozlišením (R = 1 4 1 5 ) ACh II - MS 27 ACh II - MS 3 5
Stanovení izotopových poměrů MS izobarů, izomerů ACh II - MS 31 ACh II - MS 34 Interpretace hmotnostních spekter Značení fragmentace Reakce v plynné fázi fragmentace, přesmyky... Identifikace píku molekulového iontu Stanovení počtu dvojných vazeb a aromatických jader Objasnění píků fragmentů a fragmentačních reakcí x 3 y 3 z 3 x 2 y 2 z 2 x 1 y 1 z 1 H + R 1 O R 2 O R 3 O R 4 H 2 N - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - COOH a 1 b 1 c 1 a 2 b 2 c 2 a 3 b 3 c 3 ACh II - MS 32 ACh II - MS 35 Fragmentace Hmotnostní spektrometry Hmotnostní spektrometr... přístroj, který z analyzované látky produkuje ionty a stanovuje jejich hmotnost, přesněji poměr hmotnosti a náboje Součásti spektrometru 1. Iontový zdroj (zařízení na zavádění vzorku, iontová optika) 2. Hmotnostní analyzátor (iontová optika, magnet, detektor) 3. Vakuové pumpy (nízké, vysoké a ultra vysoké vakuum) 4. Řídící a vyhodnocovací elektronika, software Magnetický sektor Kvadrupólový analyzátor Iontový cyklotron (FT-ICR-MS) Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOFMS) Iontová past (IT) Orbitrap ACh II - MS 33 ACh II - MS 36 6
Kvadrupólová iontová past (Ion Trap, IT) ACh II - MS 37 ACh II - MS 4 Magnetický sektor, B Průletový analyzátor (Time-of-flight MS, TOFMS) s iontovým zrcadlem (reflektor, reflektron) ACh II - MS 38 ACh II - MS 41 Kvadrupólový filtr, Q Ionizační techniky a aplikace Doutnavý výboj (GD) Elektronová ionizace (EI) Chemická ionizace (CI) Indukčně vázané plazma (ICP) Ionizace rychlými atomy (FAB) MS sekundárních iontů (SIMS) Termosprej (TSI) Iontový sprej (IS) Elektrosprej (ESI) Plazmová Desorpce (PD) Laserová Desorpce (LD) Laserová desorpce za účasti matrice (MALDI) atd. atd. ACh II - MS 39 ACh II - MS 42 7
Ionizace Elektrosprej Tvorba iontů: ztráta elektronu, H + zachycení elektronu, H +, Na +, Ag +... Ionizace: měkká/tvrdá anorganická/organická on-line/of-line kontinuální/pulzní ACh II - MS 43 ACh II - MS 46 Měkké a tvrdé ionizační techniky Elektrosprej Tvrdá: vysoký stupeň fragmentace, tvorba molekulárních iontů Měkká: tvorba protonovaných molekul (pseudomolekulárních iontů) Elektronová ionizace M + e - M +. + 2e - Chemická ionizace M + RH + MH + + R ACh II - MS 44 ACh II - MS 47 Elektrosprej (Electrospray Ionization, ESI) Hmotnostní spektrum ESI cytochromu c Tvorba vícenásobně nabitých iontů [M+zH] z+ s obálkou ve tvaru zvonu. Odstupy mezi píky nejsou stejné (narozdíl od izotopového vzoru). MW (cyt.c) ~ 22 ACh II - MS 45 ACh II - MS 48 8
Např. MALDI MSI Zobrazovací hmotnostní spektrometrie Mass Spectrometry Imaging, MSI vizualizace prostorového rozložení látek v tkáních bez derivatizace distribuce léčiv a metabolitů Distribuce lipidů v myším mozku ACh II - MS 49 MALDI Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Chemická ionizace za atmosferického tlaku, APCI Atmospheric pressure chemical ionization ACh II - MS 5 ACh II - MS 53 Hmotnostní spektrum MALDI MALDI MS směsi proteinů kravského mléka Příklady aplikací 1. Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS, MS n ) Kolizně indukovaná disociace (CID) 2. Separace MS 3. Hmotnostní spektrometrie iontové mobility, IMMS ACh II - MS 51 ACh II - MS 54 9
Tandemová hmotnostní spektrometrie HPLC UV herbicidů MS/MS, MS n Kolizně indukovaná disociace (CID), kolizně aktivovaná disociace (CAD) Trojitý kvadrupólový filtr: Směs 6 herbicidů, c = 1 ppb prekurzor produkt ACh II - MS 55 ACh II - MS 58 Kolizně indukovaná disociace HPLC MS herbicidů kladně nabité ionty záporně nabité ionty Celkový iontový proud (Total Ion Current, TIC) integrovaný iontový signál (proud) přes celý měřený rozsah m/z vhodný pro celkový obrázek o chromatografii a nalezení nových píků nevhodný při analýze komplexních směsí ACh II - MS 56 ACh II - MS 59 Spojení separace - MS Zpravidla on-line Sprejovací techniky: ESI, API... LC MS CE MS HPLC MS herbicidů Monitorování vybraného iontu (Selected Ion Monitoring, SIM) detekce při vybrané m/z pro experiment navržený pro monitorování pouze vybraného iontu pro více iontů peak switching ACh II - MS 57 ACh II - MS 6 1
Analýza estrogenu v odpadních vodách IMMS... 17a-ethinylestradiol, antikoncepce, negativní vliv na ryby již v koncentracích ~ppt... velmí nízké koncentrace, složitá matrice vzorku MS/MS estrogenu ACh II - MS 61 ACh II - MS 64 Analýza estrogenu v odpadních vodách Monitorování vybrané reakce (Selected reaction monitoring, SRM) analogie SIM s využitím tandemové MS pro více rekcí multiple reaction monitoring, MRM Vzorek: estrogen v odpadních vodách po prekoncentraci; 3,6 ng/l HPLC MS/MS (MRM) 295,2 145, 295,2 159, Seminář 1. Pík iontu o m/z = 1 má pološířku,25. Jaké dva ionty lišící se o 1 a.m.u. bude ještě schopen rozlišit? (Předpoklad: R nezávisí na m/z.) 2. Jaká rozlišovací schopnost je třeba k separaci CH 3 CH 2 +. od HCO +.? 3. Poměry m/z 253, 22, 1668, 143, 51, 11 a 11 patří píkům téže látky v jediném spektru ESI MS. Jaká je MW této látky? 4. Co můžete říci o hmotnostním spektru organické sloučeniny: I.S. 1,3 1,7 1, 11, ACh II - MS 62 m/z Hodnoty m/z byly určeny s tolerancí ~,1. ACh II - MS 65 Hmotnostní spektrometrie iontové mobility (Ion Mobility Mass Spectrometry, IMMS)... na pomezí mezi hmotnostní spektrometrií a elektroforézou Seminář 5. Odhadněte dobu letu iontu koňského cytochromu c (MW = 384) v TOF MS na obrázku. laserový puls (+2 kv) odpuzovací elektroda s naneseným vzorkem driftová zóna (2 m) vstupní a výstupní mřížky detektor 6. Jaký bude poměr intenzit píků benzenu C 6 H 6 + při m/z = 79 a 78? 7. Jaký bude poměr intenzit píků hexanu C 6 H 14 + při m/z = 87 a 86? ACh II - MS 63 ACh II - MS 66 11
Seminář 8. Jaký mod (pozitivní, negativní) a jaké ph vzorku byste zvolili k detekci a) ibuprofenu b) peptidu c) fosfopeptidu d) nukleové kyseliny 9. Pokuste se odvodit vztah pro m/z jako funkci B, U a r v magnetickém sektoru. vstupní štěrbina iontový zdroj + B........ r m 2 m 1 detektor m 1 /z 1 <> m 2 /z 2 U ACh II - MS 67 ACh II - MS 7 Seminář 1. Co můžete říci o 2 různých spektrech téhož peptidu? (Počátek osy m/z nezačíná v nule, měřítka os jsou různá.) S S m/z m/z 11. Pro 2 sousední píky téže látky v hmotnostním spektru ESI byly změřeny tyto hodnoty: (m/z) 1 = 1,3 a (m/z) 2 = 15,1. Určete nominální m analytu.. Proč je v hmotnostním spektrometru vakuum? ACh II - MS 68 ACh II - MS 71 Další otázky (Christian a kol.: Analytical Chemistry) ACh II - MS 69 ACh II - MS 72