Předmět: Biologie ŠVP: Prokaryotní organismy Doporučený věk žáků: 16-18 let Doba trvání: 45 minut Specifické cíle: poznat jednu z nejdůležitějších a nejpoužívanějších mikrobiologických technik Seznam pomůcek: agarové plotny s čerstvou kulturou Escherichia coli a Bacillus subtilis, očkovací kličky, kahan, barvící roztoky, barvící nádoby, filtrační papír,mikroskopy Stručná anotace: Barvení podle Grama je jednou z diagnostických metod, na jejímž základě lze rozlišit gram-pozitivní bakterie (G + ) od gram-negativních (G - ). Zástupci gram-pozitivních jsou např. rody Clostridium a Bacillus, dále mykobakterie, koky, laktobacily, aj. Ze zástupců gram-negativních se jedná např. o pseudomonády, enterobakterie, meningokoky a gonokoky. Mechanizmus barvení spočívá v rozdílné propustnosti (tj. permeabilitě) buněčných stěn G + a G - bakterií po působení etanolem. V případě G- bakterií je stěna v důsledku vymytí v alkoholu rozpustných lipidů snadno průchodná a barevný komplex, stejně jako jiné látky, z buňky uniká. Tak tomu není u bakterií G+, kde naopak alkohol působí dehydrataci stěnového peptidoglykanu a snížení permeability stěn. 1
Přípravy pro učitele Motivace Pomoci studentům pochopit mechanismus barvení bakterií podle Grama. Teorie Buněčná stěna Gram-pozitivních bakterií je tvořena mohutnou vrstvou peptidoglykanu, skrze níž pronikají až na povrch lineární řetězce teichoových kyselin. Teichoové kyseliny jsou lineární polymery glycerolfosfátu s glykozidicky navázanými cukry. Jsou nepostradatelné pro integritu buněčné stěny a jsou hlavním povrchovým antigenem gram-pozitivních bakterií. Buněčná stěna G+ neobsahuje lipidy (s výjimkou mykobakterií či korynebakterií) ani bílkoviny (obr. č. 1). teichoová kyselina peptidoglykan cytoplazmatická membrána obr. č. 1 zdroj: společnost Forenzní DNA servis s.r.o. Buněčná stěna Gram-negativních bakterií je tvořena tenkou vrstvou peptidoglykanu, nad níž se nachází tzv. vnější membrána složená (podobně jako jiné biologické membrány) z dvojvrstvy fosfolipidů a z bílkovin vázanými po obou jejích stranách. Ve vnější vrstvě vnější membrány jsou na místě fosfolipidů molekuly lipopolysacharidu (LPS). LPS neexistuje nikde jinde než ve vnější vrstvě G- bakterií a je složen ze 3 částí: lipid A (vysoce toxický pro vnímavé živočišné buňky), základní polysacharid a specifický polysacharid, který vyčnívá ven do prostředí kolmo na povrch buňky a je nositelem antigenicity těla bakterie (obr. č. 2). 2
lipopolysacharid vnější membrána peptidoglykan cytoplazmatická membrána obr. č. 2 zdroj: společnost Forenzní DNA servis s.r.o. 3
Schéma a princip barvení 1.Tepelná fixace vzorku 2. Barvení bakterií (krystalvioleť a lugol) 3. Odbarvení bakterií (etanol) 4. Dodatečné barvení G- bakterií (safranin) pozn. G + G - Krystalvioletí se obarví stěna G+ i G- bakterií. Jod z Lugolova roztoku vytvoří s barvivem komplex, který je v buněčné stěně G- bakterií rozpustitelný účinkem alkoholu a barvivo se vyplaví. Tím se G- bakterie stanou opět bezbarvé, zatímco G+ bakterie zůstávají obarveny modře. G- bakterie lze dodatečně pro lepší odlišení barvit na růžovo například fuchsinem nebo safraninem. 4
Pomůcky a vybavení Agarové plotny s čerstvou kulturou Escherichia coli HB101 a Bacillus subtilis Odmaštěná podložní skla, 2-3 ks / skupinu Očkovací klička Kahan Barvící roztoky krystalová violeť, Lugolův roztok, technický etanol, safranin Destilovaná voda Barvící nádoby, 2 ks na skupinu Kádinka na promývání, 1 ks na skupinu Filtrační papír Mikroskop Poznámky Informace o použitých chemikáliích: Krystalová violeť. Příprava : 9,81 g krystalové violeti na 10 ml vody. Lugolův roztok je roztok jodu (I2) a jodidu draselného (KI) ve vodě. Příprava: 5 g I2, 10 g KI, 85 ml destilované vody. Celkový obsah jodu 130 mg/ml. Safranin je organické barvivo dobře rozpustné ve vodě. Roztok je sytě červeně zbarven. Dostupné pod obchodním názvem Safranin O nebo Základní červeň 2. Skladování: Barvící roztoky skladujte v tmavých lahvičkách nebo lahvičkách obalených v alobalu na temném místě bez přístupu světla. Plotny s narostlou bakteriální kulturou skladujte při 4 C. 5
Bezpečnost Bakterie Escherichia coli a Bacillus subtilis jsou zcela nepatogenní. Zacházení s mikroorganizmy nicméně vyžaduje řadu standardních mikrobiologických praktik: Povrch pracovních stolů je třeba jednou denně ošetřit dezinfekčním roztokem (savo) a zároveň vždy poté, co v průběhu práce dojde ke kontaminaci povrchu. 2. Osoby pracující v laboratoři si myjí ruce mýdlem vždy, když pracují s materiálem obsahujícím živé mikroorganizmy a vždy před opuštěním laboratoře. 3. Pokud není k dispozici autokláv, musí být veškerý materiál, který přišel do kontaktu s bakteriemi (tzn. veškerý spotřební materiál, špičky, očkovací kličky, roztoky) ponořen alespoň na 20 min do 10% roztoku sava. Na každém pracovním stole by měla být umístěna mělká nádoba s tímto roztokem. Živé kultury se v žádném případě nevylévají do odpadu! Použité misky s agarem je nutné převrstvit 10% roztokem sava a nechat působit minimálně 1 hodinu. Poté lze agarové plotny umístěné v igelitových sáčcích vyhodit do běžného odpadu. 4. Dojde-li při práci s mikroorganizmy k potřísnění či poranění pokožky, je nutné zasažené místo opláchnout 1% roztokem ajatinu. Při vniknutí mikroorganizmu do poraněné kůže se dezinfikuje postižené místo jódovou tinkturou. Pokud je zasaženo oko, vyplachuje se 3% roztokem kyseliny borité a dezinfikuje opthalmoseptonexem. V místnosti, kde jsou pokusy prováděny, není dovoleno jíst, pít, kouřit ani používat kosmetické přípravky. Je velmi vhodné nosit ochranné brýle, rukavice a laboratorní plášť. 6
Pracovní list pro studenty Úvod Barvení podle Grama je jednou z diagnostických metod, na jejímž základě lze rozlišit gram-pozitivní bakterie (G + ) od gram-negativních (G - ). Zástupci gram-pozitivních jsou např. rody Clostridium a Bacillus, dále mykobakterie, koky, laktobacily, aj. Ze zástupců gram-negativních se jedná např. o pseudomonády, enterobakterie, meningokoky a gonokoky. Mechanizmus barvení spočívá v rozdílné propustnosti (tj. permeabilitě) buněčných stěn G + a G - bakterií po působení etanolem. V případě G- bakterií je stěna v důsledku vymytí v alkoholu rozpustných lipidů snadno průchodná a barevný komplex, stejně jako jiné látky, z buňky uniká. Tak tomu není u bakterií G+, kde naopak alkohol působí dehydrataci stěnového peptidoglykanu a snížení permeability stěn. Pomůcky Agarové plotny s čerstvou kulturou Escherichia coli HB101 a Bacillus subtilis Odmaštěná podložní skla, 2-3 ks Očkovací klička Kahan Barvící roztoky krystalová violeť, Lugolův roztok, etanol, safranin Destilovaná voda Barvící nádoby, 2 ks Kádinka na promývání, 1 ks Filtrační papír Mikroskop 7
Pracovní postup Příprava preparátu a fixace vzorku 1. Na dobře odmaštěné podložní sklo naneste očkovací kličkou kapku vody. Poté kličku vypalte v plameni a ochlaďte o agar. 2. Z příslušné agarové plotny setřete bakteriální kulturu (cca 2-3 kolonie, aby nátěr nebyl příliš hustý) a rozetřete ji do kapky vody na podložním skle. Nechte na vzduchu zaschnout. 3. Stěr fixujte dvojím či trojím protažením preparátu nad horní částí svítivého plamene hořáku. Celková doba ohřevu by neměla přesáhnout dobu cca 2 sekund. Barvení a odbarvení vzorku 1. Fixovaný preparát převrstvěte krystalickou violetí a nechte působit cca 1 min. 2. Barvivo slijte a preparát krátce opláchněte destilovanou vodou. 3. Preparát ponořte do Lugolova roztoku na cca 1 min. 4. Barvivo slijte a preparát krátce opláchněte destilovanou vodou. 5. Preparát odbarvujte etanolem (několik desítek sekund, dokud promývající kapalina není bezbarvá). 6. Preparát opláchněte destilovanou vodou a usušte mezi filtračními papíry. Dobarvení G- bakterií 1. Na preparát nalijte safranin a nechte působit cca 1 min. 2. Preparát opláchněte destilovanou vodou a usušte mezi filtračními papíry. safranin 8
Hodnocení Obarvené preparáty pozorujte pod mikroskopem. U zvětšení 100x použijte olejovou imerzi. Grampozitivní organizmy jsou zbarveny tmavě fialově až modročerně, gram-negativní bakterie jsou červené nebo růžové. Své pozorování zakreslete. Po ukončení práce očistěte imerzní objektiv xylenem. 9
Pracovní list pro studenty 1. Definujte pojem buněčná stěna. 2. Jaká je funkce buněčné stěny? 3. Napište základní složení buněčných stěn rostlin a bakterií. 4. Napište hlavní rozdíly ve složení buněčné stěny Gram-pozitivních a Gram-negativních bakterií. 5. V čem spočívá základní mechanizmus Gramova barvení? 6. Čísla na obrázcích přiřaďte k pojmům: 10
A B 1 2 3 4 4 5 Peptidoglykan 2, 4 Vnější membrána 3 Cytoplazmatická membrána 5 Teichoová kyselina 1 7. Který z obrázků v úloze 6 odpovídá stavbě buněčné stěny Gram-pozitivních bakterií? Odpověď zdůvodněte. 11
Pracovní list pro studenty s odpověďmi 1. Definujte pojem buněčná stěna. Buněčná stěna je pevná struktura nacházející se na povrchu buněk bakterií, hub a rostlin. 2. Jaká je funkce buněčné stěny? Primární funkce je krycí a ochranná. 3. Napište základní složení buněčných stěn rostlin a bakterií. Základní složkou buněčné stěny rostlin je polysacharid celulóza, dále pak hemicelulózy a pektiny. Základní složkou buněčné stěny bakterií je peptidoglykan. 4. Napište hlavní rozdíly ve složení buněčné stěny Gram-pozitivních a Gram-negativních bakterií. G+ - silná vrstva peptidoglykanu, teichoové kyseliny, neobsahuje lipidy ani bílkoviny; G- - tenká vrstva peptidoglykanu, vnější membrána, obsahuje lipidy a bílkoviny. 5. V čem spočívá základní mechanizmus Gramova barvení? V rozdílné propustnosti buněčných stěn G + a G - bakterií po působení alkoholem. 12
6. Čísla na obrázcích přiřaďte k pojmům: A B 1 2 3 4 4 5 Peptidoglykan 2, 4 Vnější membrána 3 Cytoplazmatická membrána 5 Teichoová kyselina 1 7. Který z obrázků v úloze 6 odpovídá stavbě buněčné stěny Gram-pozitivních bakterií? Odpověď zdůvodněte. Obrázek A. Buněčná stěna Gram-pozitivních bakterií je ve svém složení jednodušší - obsahuje silnou vrstvu peptidoglykanu a řetízky teichoových kyselin. 13