Studium struktury fotosyntetického aparátu pomocí konfokální mikroskopie a stereologických metod 2. Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 ZUZANA LHOTÁKOVÁ Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra experimentální biologie rostlin Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 : aplikace stereologických metod na data z konfokální a elektronové mirkoskopie. Osnova přednášky Spjatost struktury a funkce fotosyntetického aparátu: vliv CO2 Zvýšená koncentrace CO 2 = změny ve struktuře mezofylu Vybrané strukturální parametry mezofylu vnitřní povrch listu počet chloroplastů ultrastruktura chloroplastů kvantitativně Shrnutí a další výzkum 1
Globální souvislosti: Spjatost struktury a funkce fotosyntetického aparátu Globální hledisko: vzrůstající koncentrace CO 2 v atmosféře terestrická vegetace důležitý sink C hlavně lesní porosty biogeochemické cykly C, N fixace CO 2 probíhá v listovém mezofylu Nárůst koncentrace CO 2 v atmosféře Temperátní a boreální vegetace sink až 2,4 Pg ročně Spjatost struktury a funkce fotosyntetického aparátu Podmínky prostředí (ozářenost, koncentrace CO 2, stresové faktory) Anatomické a morfologické adaptace listoví (Nobel 1976) Kontrolní 750 ppm CO 2 Simulace kyselého deště 350 ppm CO 2 Lin et al., 2001 2
Spjatost struktury a funkce fotosyntetického aparátu Jemné změny ve struktuře listů, závislé na podmínkách prostředí, není možné kvantitativně charakterizovat s použitím klasických mikrotechnických metod např. vnitřní povrch listu 750 ppm CO 2 350 ppm CO 2 Lin et al., 2001 Geometrické parametry mezofylu ovlivňují: fyziologické procesy probíhající v listu fotosyntéza, transpirace, respirace (Hanba et al. 1999) Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 vznik a rychlost růstu listů velikost buněk, vlastnosti buněčných stěn tloušťka a tvar listu hustota průduchů struktura mezofylu ultrastruktura chloroplastů, ukládání škrobu 3
Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 Tloušťka, tvar, specifická hmotnost listu změny tvaru listu, zejména tloušťky často větší tloušťka díky nárůstu mezofylu u jehličnanů se většinou nemění specifická hmotnost listu (poměr hmotnost : plocha) Řezy jehlicemi Pinus sylvestris vlevo jehlice rostliny pěstované v normální [CO 2 ] a vpravo ve zvýšené [CO 2 ]. Jehlice ze zvýšené koncentrace je mírně širší a tlustší. Převzato z Lin et al. (2001). Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 Průduchy obecně: pokles hustoty průduchů, stomatálního indexu (Arabidopsis Teng et al. 2006, Woodward et al. 2002) u zkoumaných jehličnanů většinou nenastaly změny v hustotě průduchů (nejdelší experiment 8 let) paleoklimatologie v dlouhodobém měřítku se se zvyšující se [CO 2 ] snižuje hustota průduchů 4
Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 Mezofyl větší tloušťka mezofylu velmi záleží na kombinaci působení vnějších faktorů délka experimentu více živin (N, P, K) více buněk mezofylu Řez jehlicemi Pinus taeda. Vlevo jehlice z normální a vpravo ze zvýšené [CO 2 ]. Jehlice ve zvýšené koncentraci byly tlustší. Převzato z Thomas a Harvey (1987). Řez listy Glycine max. Vlevo list z normální a vpravo ze zvýšené [CO 2 ]. Listy ve zvýšené koncentraci měly jednu vrstvu palisádového parenchymu navíc. Převzato z Thomas a Harvey (1987). Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 ultrastruktura chloroplastů, ukládání škrobu větší počet chloroplastů větší počet a velikost škrobových zrn narušení struktury thylakoidů => aklimační deprese Foto: Lhotáková chloroplasty smrku ztepilého rostoucího při 700 ppm CO 2 5
Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 ultrastruktura chloroplastů, ukládání škrobu větší poměr stromatálních thylakoidů ke granálním Vyšší zastoupení stromatálních tylakoidů oproti granálním: při vyšší asimilaci CO2 => větší požadavek na NAPDH pro redukci v Calvin cyklu => větší nároky na PSI (posílení necyklického transportu elektronů): víc stromatálních tylakoidů normální [CO 2 ] zvýšená [CO 2 ] stromatální tylakoidy Griffin et al., PNAS 2001, vol. 98, no. 5 u 2473 2478 Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 Změny ve struktuře chloroplastů Arabidopsis thaliana pod vlivem zvýšene koncentrace CO 2 1. vyšší počet chloroplastů 2. větší velikostní rozměry chloroplastů (šířka a plocha profilu) 3. větší zastoupení škrobových zrn 4. ALE snížený počet granálních tylakoidních membrán Nianjun Teng et al. (2006) Elevated CO 2 induces physiological, biochemical and structural changes in leaves of Arabidopsis thaliana. New Phytologist (2006) 172: 92 103 6
Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 Obtíže při porovnávání údajů pojetí normální a zvýšené [CO 2 ] použitá metoda a délka působení zvýšené [CO 2 ] další podmínky prostředí (živiny, ozářenost, teplota) druhy (genotypy) a stáří rostlin počet vzorků zahrnutých do analýz Příčnéřezy jehlicemi Larix kaempferi, pěstovanými ve čtyřech odlišných prostředích: A normální koncentrace AC, méně živin LN C normální koncentrace AC, více živin HN B zvýšená koncentrace EC, méně živin D zvýšená koncentrace EC, více živin HN Převzato z Eguchi et al. (2004), upraveno. Struktura mezofylu při zvýšené koncentraci CO 2 Příklad využití různých stereologických metod k odhadu strukturálních parametrů mezofylu smrku ztepilého Zvětšení příčné řezy mezofylové buňky 4 m 25 mm 2 mm 0.75 mm 7
Cíl výzkumu: studium struktury fotosyntetického aparátu při dlouhodobém zvýšení koncentrace CO 2 Materiál: Jehlice smrku ztepilého dlouhodobé ošetření, porost! stromy pěstované při atmosférické koncentraci CO 2 při 700 ppm CO 2 Ve spolupráci s Laboratoří ekologické fyziologie rostlin, CZECH GLOBE - Centrum výzkumu globální změny AV ČR, v.v.i. Experimentální stanoviště Bílý Kříž Foto Czech Globe Cíl výzkumu: studium struktury fotosyntetického aparátu při dlouhodobém zvýšení koncentrace CO 2 Ve spolupráci s Laboratoří ekologické fyziologie rostlin, CZECH GLOBE - Centrum výzkumu globální změny AV ČR, v.v.i. Dlouhodobá stimulace rychlosti světlem saturované asimilace 2004: 18 letý smrkový porost po 8 letech ošetření (A, C = 365 ppm CO 2, E = 700 ppm CO 2 ) 2010: smrkový porost po 5 letech ošetření (A = 380 ppm CO2, E = 700 ppm CO2) A (umol m-2 s-1) 16 12 8 4 0 AC EC -4 0 500 1000 1500 2000 PPFD (umol m-2 s-1) O. Urban a M. Šprtová 8
Cíl výzkumu: studium struktury fotosyntetického aparátu při dlouhodobém zvýšení koncentrace CO 2 Otázka: Je zvýšená rychlost asimilace při dlouhodobém ošetření zvýšenou koncentrací CO 2 spojena se změnami ve struktuře mezofylu jehlic? - na úrovni mezofylu (hustota vnitřního povrchu) - na úrovni mezofylové buňky (počet chloroplastů na buňku) - na úrovni ultrastruktury chloroplastů (uspořádání membrán, škrob, plastoglobuly) Experimentální stanoviště Bílý Kříž Foto Czech Globe Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Metody Konfokální mikroskopie: čerstvé příčné řezy, bez fixace, využití autofluorescence chlorofylu a fenolických látek vázaných v buněčných stěnách Elektronová mikroskopie: chemická fixace (glutaraldehyd, OsO 4 ), ultratenké řezy vysokotlakové zmrazování a mrazová substituce 9
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Metody Použité stereologics tereologické Metody: Metoda Fakíra (Kubínová & Janáček, 1998): vnitřní povrch jehlice Optický disektor (Sterio 1984): průměrný počet mezofylových buněk v jehlici, průměrný počet chloroplastů v mezofylové buňce Bodová metoda: poměrné zastoupení membrán, škrobu, plastoglobulů Využití stereologických metod: SYSTEMATICKY ROVNOMĚRNĚ NÁHODNÝ VÝBĚR systematicky rovnoměrně náhodný výběr příčných řezů možné fyziologické, anatomické gradienty geometrických parametrů v rámci orgánu 10
Využití konfokální mikroskopie využití konfokální mikroskopie Konfokální mikroskopie: vizualizace autofluorescencí Série 40-ti optických řezů příčný ruční řez jehlicí smrku Autofluorescence 750 µm Fenolické látky vázané v buň. stěně Chlorofyl Objektiv 20x (planapochromate, N.A.=0.7),vodní imerse Excitace Ar laser 488 nm Detekce ve 2 kanálech 1st: 553-588 nm 2nd: 640-703 nm Využití stereologických metod: SYSTEMATICKY ROVNOMĚRNĚ NÁHODNÝ VÝBĚR Systematický rovnoměrn rně náhodný (SRN) výběr hodnocených polí mezofyl smrku zteplého Příčný řez! nepravidelný tvar objektů! y y Podélný řez z Podélný řez x Příčný řez 11
Využití stereologických metod: metoda FAKÍR vnitřní povrch jelice Měření povrchu metoda FAKÍR Série po sobě jdoucích řezů mezofylovou buňkou, po 1 µm Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 1mm Úroveň jehlice Úroveň mezofylu Úroveň mezofyové buňky Je zvýšená rychlost asimilace při dlouhodobém ošetření zvýšenou koncentrací CO 2 podmíněna plochou vnitřního povrchu jehlice? Úroveň organel 1µm 12
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Jak se vybrané geometrické parametry mezofylu jehlic smrku ztepilého mění pod vlivem zvýšené koncentrace CO 2? Hypotézy: Pod vlivem zvýšené koncentrace CO 2 : 1) Vzroste objemový podíl mezofylu jehlic. 2) Zvýší se vnitřní povrch jehlic. 3) Zvýší se počet mezofylových buněk v jednotce objemu jehlice (objemová hustota mezofylových buněk) Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Hypotézy: Pod vlivem zvýšené koncentrace CO 2 : 1) Vzroste objemový podíl mezofylu jehlic. 2) Zvýší se vnitřní povrch jehlic. 3) Zvýší se počet mezofylových buněk v jednotce objemu jehlice (objemová hustota mezofylových buněk) Lin et al 2001: 3-letá borovice lesní, 1 roky vystavená zvýšené (750ppm) koncentraci CO 2 Změny v parametrech příčného řezu: zvýšení poměrné plochy mezofylu o 10% na základě zvětšení velikosti mezofylových buněk a zvýšení jejich počtu. 750 ppm CO 2 Materiál 18-letý smrk ztepilý, 8 let vystavený koncentraci 700 µmol.mol -1 CO 2, Bílý kříž, odběr 2004, jehlice 1. a 3. ročníku 350 ppm CO 2 Lin et al., 2001 13
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 1) Objemové podíly pletiv zůstaly beze změny u slunných i stinných jehlic 2) Hustota vnitřního povrchu i vnitřní povrch jehlic se nemění s ošetřením zvýšenou koncentrací CO 2 100 80 60 40 a a a Slunné jehlice Control Ambient Elevated 20 0 a a a a a a 3) Objemová hustota mezofylových buněk se nemění se zvyšující se koncentrací CO2 u slunných ani stinných jehlic. DP Z. Kubínová 2010 Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Bude slunný a stinný ekotyp jehlic vyvinut stejně silně u jedinců smrku ztepilého dlouhodobě vystavených zvýšené koncentraci CO 2? Hypotéza: Rozdíl ve struktuře mezofylu slunných a stinných jehlic, smrku ztepilého ošetřeného zvýšenou koncentrací CO 2 bude potlačen oproti kontrolním jedincům. Marek et al. 2002: smrk ztepilý, 3 roky vystavený zvýšené (700ppm) koncentraci CO 2 Rozdílná odpověď slunných a stinných jehlic na zvýšenou koncentraci CO 2 : stimulace asimilační aktivity hlavně u zastíněných jehlic Projev aklimační deprese hlavně u slunných jehlic. 14
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Hypotéza: Rozdíl ve struktuře mezofylu slunných a stinných jehlic stromů pěstovaných při zvýšené koncentraci CO2 bude potlačen oproti kontrolním jedincům. The impact of long-term CO 2 enrichment on sun and shade needles of Norway spruce (Picea abies): photosynthetic performance, needle anatomy and phenolics accumulation Lhotáková, Urban, Dubánková, Cvikrová, Tomášková, Kubínová, Zvára, Marek, Albrechtová. in preparation Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Závěry na úrovni mezofylu Objem jehlic, objemové podíly pletiv ani vnitřní povrch mezofylu jehlic nebyl ovlivněn zvýšenou koncentrací CO 2. Po anatomické stránce byly slunné a stinné jehlice diferenciovány bez ohledu na okolní koncentraci CO 2 15
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 1mm Úroveň jehlice Úroveň mezofylu Úroveň mezofyové buňky Je zvýšená rychlost asimilace při dlouhodobém ošetření zvýšenou koncentrací CO 2 podmíněna počtem chloroplastů v mezofylu? Úroveň organel 1µm Vyšší plocha chloroplastů vystavená intercelulárám S c - zvýšení plochy pro rozpouštění CO2 a efektivní plochy difuze CO2 - potenciál pro vyšší A max Oguchi et al. 2005 Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Hypotéza: V jehlicích stromů ošetřených zvýšenou koncentrací CO 2 se zvýší hustota chloroplastů. DP Z. Kubínová 2010 DP Z. Kubínová 2010 Prostředí Hustota chloroplastů v jehlici i mezofylu není závislá na okolní koncentraci CO 2, stejně tak jako průměrný počet chloroplastů v mezofylové buňce smrku se při působení zvýšené koncentrace CO 2 nezměnil. 16
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 1mm Úroveň jehlice Úroveň mezofylu Impact of CO 2 enrichment and irradiance on structure and performance of forest tree photosynthetic apparatus at different hierarchical levels. GA ČR: P501/10/0340 Smrk ztepilý Picea abies Buk lesní Fagus sylvatica Úroveň mezofyové buňky Úroveň organel 1µm Je zvýšená rychlost asimilace při dlouhodobém ošetření zvýšenou koncentrací CO 2 spojena se změnami v ultrastruktuře chloroplastů? -obsah škrobu v chloroplastech (zároveň biochemicky) -výskyt plastoglobulů (senescence) -zastoupení granálních a stromatálních tylakoidů Ultrastruktura chloroplastů při zvýšené koncentraci CO 2 Hypotéza: V jehlicích stromů ošetřených zvýšenou koncentrací CO 2 se bude v chloroplastech ukládat více asimilačního škrobu. µm 2 Plocha mediálního řezu chloroplastem a 15 b 10 5 % 40 30 20 10 Plošný podíl škrobových zrn na řezu b a 0 Atmosférická Zvýšená 0 Atmosférická Zvýšená Koncentrace CO2 Koncentrace CO2 Plošný podíl plastoglobulů na řezu Smrk ztepilý % 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 a Atmosférická b Zvýšená Koncentrace CO2 17
Ultrastruktura chloroplastů při zvýšené koncentraci CO 2 plocha chloroplastů vystavená intercelulárám S c - zvýšení plochy pro rozpouštění CO2 a efektivní plochy difúze CO2 - potenciál pro vyšší A max µm 2 Plocha mediálního řezu chloroplastem a 15 b 10 5 0 Atmosférická Zvýšená Koncentrace CO2? jak aplikovat stereologické metody? a odhadnout plochu S c ve 3D Ultrastruktura chloroplastů při zvýšené koncentraci CO 2 Hypotéza: V chloroplastech jehlic stromů ošetřených zvýšenou koncentrací CO 2 bude vyšší zastoupení stromatálních tylakoidů. % Plošný podíl granálních tylakoidů na řezu chloroplastem 30 25 20 15 10 5 0 a AC a EC % Plošný podíl stromatálních tylakoidů na řezu chloroplastem 1,5 1,2 0,9 0,6 0,3 0 a AC a EC Koncentrace CO2 Koncentrace CO2 DP E. Hlízová 2011 DP E. Hlízová 2011 18
A C EC Ultrastruktura chloroplastů při zvýšené koncentraci CO 2 Hypotéza: V chloroplastech jehlic stromů ošetřených zvýšenou koncentrací CO2 bude vyšší zastoupení stromatálních tylakoidů. Podíl zastoupení stromatálních a granálních tylakoidů AC EC Stromatální / Granální 0,08 0,06 0,04 0,02 0 a a DP E. Hlízová 2011 Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Závěry na úrovni počtu a ultrastruktury chloroplastů Nebyl jasně prokázán vztah mezi zvýšenou rychlostí asimilace smrku ztepilého a sledovanými strukturálními parametry: -počtem chloroplastů v mezofylové buňce -poměrném zastoupení stromatálních a granálních tylakoidů Změny ve struktuře mezofylu (na sledovaných hierarchických úrovních) pravděpodobně nejsou nezbytně spojeny se stimulací asimilace při zvýšení okolní koncentrace CO 2. 19
Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Závěry: Změny ve struktuře mezofylu (na sledovaných hierarchických úrovních) pravděpodobně nejsou nezbytně spojeny se stimulací asimilace při zvýšení okolní koncentrace CO 2. zaměřit se na parametr S c (plocha chloroplastů vystavená intercelulárám) chloroplasty při 700 ppm CO 2 měly větší plochu řezu KAM DÁL? Zvýšená rychlost asimilace může být dána: změnami v obsahu Rubisco/S C změnami ve tvaru chloroplastů (vliv na stromatální koncentraci CO 2 ) změnami v rozdělení LHC mezi PSI a PSII Studium strukturálních změn listoví při zvýšené koncentraci CO 2 Otázka: Liší se reakce na zvýšenou koncentraci CO 2 ve strukturálních parametrech mezofylu u stálezelených a opadavých dřevin? Smrk ztepilý Picea abies Buk lesní Fagus sylvatica 20
Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra experimentální biologie rostlin Doc. Jana Albrechtová Dr. Zuzana Lhotáková Mgr. Zuzana Kubínová Eliška Hlízová Oddělení biomatematiky, Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Dr. Lucie Kubínová Dr. Jiří Janáček Dr. Barbora Radochová Centrum výzkumu globální změny AV ČR, v.v.i. Dr. Otmar Urban, Dr. Mirka Šprtová Prof. Michal V Marek Institute of Experimental Physics, Slovak Academy of Sciences, Košice, Slovakia Zoltán Tomori 21