Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta. Katedra experimentální biologie rostlin

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Katedra experimentální biologie rostlin Bc. Eliška Hlízová Struktura a funkce chloroplastů smrku ztepilého pěstovaného pod vlivem zvýšené koncentrace CO2 The effect of elevated CO2 concentration on structure and function of chloroplasts of Norway spruce Diplomová práce Školitelka: Doc. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D. Praha, 2011

2 2

3 Školitelka diplomové práce: Doc. RNDr. Jana Albrechtová, Ph.D., Katedra experimentální biologie rostlin PřF UK Konzultantky diplomové práce: RNDr. Dana Holá, Ph.D., Katedra genetiky a mikrobiologie PřF UK RNDr. Marie Kočová, CSc., Katedra genetiky a mikrobiologie PřF UK Mgr. Zuzana Lhotáková, Ph.D., Katedra experimentální biologie rostlin PřF UK Mgr. Barbora Radochová, Ph.D., Oddělení biomatematiky, Fyziologický ústav AV ČR Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze,

4 4

5 Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala paní docentce Janě Albrechtové a doktorkám Zuzaně Lhotákové, Barboře Radochové, Marii Kočové a Daně Holé za mimořádnou vstřícnost a trpělivost při vedení této práce a cenné rady a připomínky při jejím sepisování. Můj velký dík patří také doktorce Olze Rothové za pomoc při izolaci chloroplastů a docentu Jaromíru Kutíkovi za rady a doporučení týkající se elektronové mikroskopie a studia chloroplastů i za komentáře k textu této práce. Děkuji doktorce Mirce Šprtové, doktoru Otmaru Urbanovi a dalším pracovníkům Laboratoře ekologické fyziologie rostlin Centra výzkumu globální změny AV ČR za poskytnuté výsledky a možnost odběru vzorků z jejich experimentálního stanoviště. Dále děkuji všem členům Katedry experimentální biologie rostlin, dvojnásob pak Mgr. Zuzce Kubínové, Mgr. Hance Ševčíkové a Dr. Petře Maškové za pomoc při odběrech. V neposlední řadě bych chtěla poděkovat mým přátelům a blízkým za psychickou podporu, Ondrovi navíc za vytrvalé pomáhání s prací na počítači. Mimořádný dík pak patří za velkou inspiraci a neúnavné pobízení k vědecké práci panu Radkovi Zbořilovi. Práce byla vypracována v rámci projektu GA ČR č. P501/10/0340 s názvem Vliv zvýšené koncentrace CO2 a ozářenosti na strukturu a funkci fotosyntetického aparátu dřevin na různých hierarchických úrovních a dále podpořena grantem MEB Projekt česko- slovenské spolupráce, v rámci něhož došlo k vytvoření příslušného modulu Ellipse. 5

6 ABSTRAKT Fotosyntéza je zvýšenou koncentrací CO2 ovlivněna na mnoha hierarchických úrovních. Přestože je této problematice věnováno v posledních desetiletích mnoho pozornosti, stále je poměrně málo známo o přizpůsobení aktivity fotosystémů (PS) 1 a 2 a ultrastruktury chloroplastů zvýšené koncentraci CO2. Hlavním cílem této práce bylo proto zjistit vliv zvýšené koncentrace CO2 na strukturu a funkci chloroplastů smrku ztepilého, a to hlavně na uspořádání tylakoidních membrán a elektronový transport na nich probíhající. Studovány byly jehlice let starých jedinců smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucích za stávající koncentrace (AC) a zvýšené koncentrace (EC = 700 ppm) CO2 v kultivačních sférách s automaticky otevíratelnými okny. Byl sledován vliv zvýšené koncentrace CO2 na obsah fotosyntetických pigmentů, fluorescenční a reflektanční indexy, aktivitu PS 1 a PS 2 izolovaných chloroplastů, plochu mediánního řezu chloroplastem a zastoupení plochy granálních a stromatálních tylakoidů na tomto řezu. Přestože byla při EC CO2 zvýšena rychlost světlem saturované asimilace, poklesl obsah pigmentů (chlorofylu a, b, karotenoidů) i aktivita obou fotosystémů. Míra poklesu aktivity fotosystémů se mezi PS 1 a PS 2 nelišila, nebylo tedy pravděpodobně ovlivněno zastoupení cyklického a necyklického elektronového transportu. EC CO2 mírně, ale průkazně snížila kvantový a maximální kvantový výtěžek PS 2 (QY a FV/FM), hodnota reflektančních indexů NDVI a PRI ovlivněna nebyla. Vlivem EC CO2 byla dále zmenšena plocha mediánního řezu chloroplastem (avšak pouze po vyhodnocení většího datového souboru), hodnota poměru stromatálních a granálních tylakoidů ovlivněna nebyla. V rámci této práce byla optimalizována metodika pro izolaci chloroplastů smrku a otestována nově vyvinutá stereologická metoda umožňující souběžně měřit plochu čtyř různých struktur chloroplastu. Klíčová slova: aklimace, aktivita fotosystému 1 a 2, elektronový transport, fotosyntéza, granální a stromatální tylakoidy, chloroplast, Picea abies, smrk ztepilý, tylakoidní membrána, zvýšená koncentrace CO2 6

7 ABSTRACT The effect of elevated CO2 concentration (EC CO2) on photosynthesis has been observed on many hierarchical levels. There is not sufficient information about its effect on electron transport and chloroplast ultrastructure including thylakoid membrane stacking though. There was a significant increase in the rate of photosynthesis of examined trees observed in previous studies thus I hypothesised these changes are accompanied by changes of chloroplast ultrastructure and photosystem content and function and the main aim of this study is to evaluate these adjustments. In this study years old seedlings of Norway spruce (Picea abies L. Karst.) grown in glass domes with adjustable windows one with ambient CO2 concentration as a control, the other one with simulated EC CO2 (700 ppm) during the vegetative season were examined. Pigment content, fluorescence and reflectance indexes, activity of photosystem 1 (PS1) and 2 (PS 2) of isolated chloroplasts, size of cross-sectional area of chloroplast and proportion of stromal to granal thylakoids under EC CO2 treatment were investigated. Although there was a significant increase in the maximum rate of photosynthetic assimilation of trees from EC CO2 (observed by other researchers of our team), decreased chlorophyll and carotenoid content as well as the activity of both photosystems were observed, which is usually atributed to photosynthetic acclimation. As the rate of decrease of photosystem 1 and photosystem 2 was similar there is probably no alteration in linear and cyclic electron transport ratio under EC CO2. Quantum yield (QY) and maxium quantum yield (FV/FM) of photosystem 2 were slightly but significantly decreased by EC CO2, NDVI (normalized difference vegetation index) and PRI (photochemical reflectance index) were not significantly affected by the treatment. Under elevated CO2 concentration chloroplast cross-sectional area was higher but no significant ultrastructural changes in terms of thylakoid membrane stacking were observed. Methodical approach of chloroplast isolation was optimized for conifers and new plug-in of stereological programme Ellipse was successfully tested during this study. Keywords: acclimation, electron transport, elevated CO2 concentration, granal and stromal thylakoids, Norway spruce, photosynthesis, photosystem 1 and 2 activity, Picea abies, thylakoid membrane 7

8 OBSAH SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ÚVOD Cíle práce a hypotéza Struktura a členění práce LITERÁRNÍ PŘEHLED...13 Nárůst atmosférické koncentrace CO2 a její vliv na rostliny Vliv zvýšené koncentrace CO2 na fyziologické reakce rostlin Vliv zvýšené koncentrace CO2 na transpiraci Vliv zvýšené koncentrace CO2 na respiraci Vliv zvýšené koncentrace CO2 na fotosyntézu Vliv zvýšené koncentrace CO2 na aktivitu Rubisca Důsledky rychlejší produkce asimilátů při zvýšené koncentraci CO Ovlivnění exprese fotosyntetických genů zvýšenou koncentrací CO Ovlivnění struktur a procesů primární fáze fotosyntézy zvýšenou koncentrací CO Cyklický a necyklický elektronový transport Vliv CO2 na elektronový transport Vliv akumulace škrobu při zvýšené koncentraci CO2 na ultrastrukturu chloroplastu Změna ultrastruktury chloroplastů jako způsob optimalizace elektronového transportu při zvýšené koncentraci CO Vliv stáří fotosyntetického pletiva a ročního období v reakci na EC CO Metody měření primárních reakcí fotosyntézy Měření hodnoty Jmax Měření fluorescence chlorofylu Měření fotochemické aktivity izolovaných chloroplastů Používané systémy pro experimentální navození EC CO METODIKA...31 Odběr vzorků Stanovení fotochemické aktivity chloroplastů Obecný postup Příprava suspenze chloroplastů Stanovení obsahu chlorofylu v suspenzi izolovaných chloroplastů Měření fotochemické aktivity Měření AHR a aktivity PS Měření aktivity PS Metodické pokusy Uchování vzorků Množství vzorku Homogenizace Centrifugace Složení izolačního, resuspendačního a měřícího média Koncentrace suspenze v expoziční komůrce pro měření AHR a aktivity PS Koncentrace suspenze v expoziční komůrce pro měření aktivity PS Ozářenost Akceptory elektronů pro měření aktivity PS Vliv stáří odebraného vzorku na fotochemické aktivity chloroplastů Uchování a zpracování vzorků při hlavních experimentech

9 3.3 Stanovení obsahu pigmentů Měření fluorescenčních a reflektančních indexů Měření hodnoty FV/FM a QY Měření hodnoty indexu NDVI Měření hodnoty PRI Zpracování vzorků pro elektronovou mikroskopii a měření plochy tylakoidů na řezech chloroplastů Použité statistické metody VÝSLEDKY Optimalizace metodiky pro izolaci chloroplastů a měření jejich fotochemické aktivity Vliv zvýšené koncentrace CO2 na obsah fotosyntetických pigmentů Vliv zvýšené koncentrace CO2 na aktivitu PS 1 a PS Vliv zvýšené koncentrace CO2 na hodnotu fluorescenčních a reflektančních indexů Ultrastruktura chloroplastů DISKUZE Diskuze použitých metodických přístupů Vliv zvýšené koncentrace CO2 na obsah fotosyntetických pigmentů a elektronový transport Vliv zvýšené koncentrace CO2 na ultrastrukturu chloroplastů Začlenění výsledků do širšího kontextu a směřování budoucího výzkumu ZÁVĚR SEZNAM CITOVANÉ LITERATURY

10 Seznam použitých zkratek AC ambient concentration, stávající koncentrace Amax světlem saturovaná rychlost asimilace CO2 CET cyklický elektronový transport EC elevated concentration, zvýšená koncentrace FV/FM maximální kvantový výtěžek fotosystému 2 gs vodivost průduchů Chl chlorofyl Jmax maximální výtěžek elektronového transportu LHCII light harvesting complex II, světlosběrný komplex II NDVI NIR normalized difference vegetation index, normalizovaný diferenční vegetační index near infrared, blízké infračervené záření NET necyklický elektronový transport Pi anorganický fosfát ppm pars per milion, miliontina (10-6) PRI photochemical reflectance index, fotochemický reflektanční index PS 1 fotosystém 1 PS 2 fotosystém 2 QY kvantový výtěžek fotosystému 2 RuBP ribulózabisfosfát TEM transmisní elektronová mikroskopie Vcmax efektivita karboxylace VIS visible, viditelné záření WUS water use efficiency, účinnost využití vody 10

11 1 ÚVOD Nárůst koncentrace CO2 v zemské atmosféře bývá v posledních letech sledován s výjimečnou pozorností. Důvodem jsou obavy z následků (ať už hypotetických či reálných), jež by mohlo přinést globální oteplování, na kterém má CO2 jako jeden ze skleníkových plynů v atmosféře významný podíl. Zvýšení průměrné globální teploty (byť třeba jen o 2 C) by představovalo zásadní zásah do rovnováhy a fungování ekosystémů. Vliv zvýšené koncentrace (EC) CO2 na ekosystémy, obzvláště na jejich autotrofní složku, však není jen přes následky změny teploty. Atmosférický CO2 představuje hlavní zdroj uhlíku fotosyntetizujících organizmů, jeho koncentrace tak fotosyntézu ovlivňuje přímo. Fotosyntéza je ale zároveň procesem, který atmosférickou koncentraci CO2 nezanedbatelně ovlivňuje. Lesy představující hlavní rezervoár terestrického uhlíku disponují značným potenciálem ke snížení koncentrace atmosférického CO2. K tomu, aby mohla být za tímto účelem plánována podoba lesů budoucích, je nezbytné jejich reakci na EC CO2 co nejdetailněji porozumět. Není proto překvapující, že během několika posledních desetiletí počet experimentů a literárních rešerší na toto téma výrazně narůstá. Podobnou rychlostí ale roste i poptávka po experimentech dalších, které by nejednoduchý vztah mezi fotosyntézou a atmosférickou koncentrací CO2 ovlivněný řadou dalších proměnných objasnily hlouběji. Tým Doc. Albrechtové, jehož součástí je i autorka předkládané práce, se dlouhodobě vlivem CO2 na dřeviny zabývá. Tato práce je součástí řešeného projektu s názvem Vliv zvýšené koncentrace CO2 a ozářenosti na strukturu a funkci fotosyntetického aparátu dřevin na různých hierarchických úrovních a navazuje na ni další výzkum členů řešitelského kolektivu grantu z pracovišť Katedry experimentální biologie rostlin a Katedry genetiky a mikrobiologie PřF UK v Praze, Fyziologického ústavu AV ČR a Laboratoře ekologické fyziologie rostlin Centra výzkumu globální změny AV ČR. Záměrem této práce proto není vyčerpávající postižení problematiky vztahu rostlin a atmosférické koncentrace CO2, a část jejího významu částečně vyplyne až v kontextu s výsledky kolegů. Nárůst rychlosti asimilace uhlíku vlivem EC CO2 je poměrně často pozorovaným jevem, který byl sledován i u smrku ztepilého rostoucího v kultivačních sférách experimentálního ekofyziologického stanoviště Bílý Kříž při různé koncentraci CO2 (Kosvancova et al., 2009) a vyžaduje řadu fyziologických přizpůsobení rostliny na úrovni fotosyntetického pletiva. V předchozích studiích našeho týmu však nebyl sledován rozdíl 11

12 mezi plochou vnitřního povrchu listu (Lhotakova, 2009) ani mezi počtem chloroplastů na mezofylovou buňku (Kubinova, 2010). Je tedy možné, že dochází k ovlivnění na úrovni struktury a funkce chloroplastů (včetně elektronového transportu). Hlavním cílem této práce je zjistit vliv EC CO2 na strukturu a funkci chloroplastů smrku ztepilého, a to obzvláště na úrovni elektronového transportu probíhajícího na tylakoidních membránách a na úrovni uspořádání těchto membrán. 1.1 Cíle práce a hypotéza Cíle: Optimalizace metodiky pro izolaci chloroplastů smrku a pro měření aktivity PS 1 a PS 2 Vyhodnocení vlivu zvýšené koncentrace CO2 na vybrané funkční a strukturální vlastnosti fotosyntetického aparátu smrku, konkrétně na: elektronový transport primární fáze fotosyntézy strukturální uspořádání tylakoidů se zřetelem na lokalizaci fotosystémů Hypotéza: Zvýšená míra asimilace CO2 je doprovázena změnami ultrastruktury chloroplastů a aktivit fotochemických procesů na úrovni fotosystémů. 1.2 Struktura a členění práce Práce je členěna standardním způsobem. V Literárním přehledu jsou shrnuty poznatky o vlivu zvýšené koncentrace CO2 na fotosyntézu se zaměřením na procesy a struktury primární fáze fotosyntézy. V části Metodika je kromě postupů použitých při sledování experimentálních cílů popsán i proces optimalizace metodiky pro izolaci chloroplastů smrku. Ačkoli by dílčí výsledky tohoto procesu mohly být zahrnuty do kapitoly výsledky, pro větší přehlednost a snazší orientaci v metodických postupech jsou ponechány v metodické části páce. Následuje kapitola s uvedenými výsledky ( Výsledky ) hlavních experimentů, které jsou spolu s metodickými výsledky vyhodnoceny v kapitole Diskuze. Poslední kapitolou je Závěr shrnující nejdůležitější výstupy práce. 12

13 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Nárůst atmosférické koncentrace CO2 a její vliv na rostliny Od počátku průmyslové revoluce vzrostla koncentrace CO2 v atmosféře z 280 ppm na dnešních 292,4 ppm (průměr z března 2011 z Mauna Loa; Tans, 2011), což představuje zhruba 200 Gt uhlíku dodaného do atmosféry (IPCC, 2007). A nárůst koncentrace CO2 bude pokračovat i v budoucnosti. Předpokládaná koncentrace atmosférického CO2 v roce 2100 se dle různých scénářů a postupů odhadu pohybuje mezi ppm (Prinn et al., 2011) (Obr. 2.1). Zdrojem tohoto nadbytečného atmosférického uhlíku je především spalování fosilních paliv a změny ve využití krajiny, zejména odlesňování. CO2 je v současnosti nejvýznamnějším skleníkovým plynem podílejícím se na zesílení skleníkového efektu. Výrazně tak přispívá k oteplování atmosféry se všemi důsledky označovanými souhrnně jako globální klimatická změna. Ta má zásadní vliv na jednotlivé organismy i celé ekosystémy. Jediným biologickým procesem vázajícím atmosférický uhlík do struktury organických látek je fotosyntéza. Autotrofní organizmy tak zpřístupňují heterotrofním organizmům nezbytný organický uhlík a zároveň energii slunečního záření uloženou v chemických vazbách. Koncentrace CO2 okolního prostředí je vedle intenzity slunečního záření a dostupnosti vody a živin jedním z klíčových faktorů ovlivňujících rychlost fotosyntézy, neboť jeho dostupnost je při současné koncentraci CO2 pro rostliny limitující. Lesy představují hlavní zásobárnu terestrického uhlíku s potenciálem ke snižování atmosférické koncentrace CO2. Bývají považovány za významné sinky a hrají tak v regulaci klimatu klíčovou roli (Korner, 2003). Zároveň jsou však lesní dřeviny zvýšenou koncentrací CO2 v atmosféře ovlivněny, a to pravděpodobně více než byliny (Ainsworth a Long, 2005). Smrk ztepilý (Picea abies) je převládající dřevinou v 54,5 % plochy současných českých lesních porostů (Kristek a Zarnik, 2007) a častou dřevinou evropských temperátních lesů vůbec. V ekofyziologických studiích mu je proto věnována značná pozornost. 13

14 Obr. 2.1 Možné trajektorie vývoje atmosférické koncentrace CO2. Upraveno podle IPCC (2007) 2.2 Vliv zvýšené koncentrace CO2 na fyziologické reakce rostlin Přestože většina autorů rozlišuje mnoho dílčích fyziologických změn v důsledku působení EC CO2, je možné tyto reakce rozdělit na tři základní skupiny, z nichž jsou ostatní změny vyplývající a odvoditelné, a to na ovlivnění transpirace, respirace a fotosyntézy. Hlavní reakce (s ohledem na zaměření této práce) ilustruje Obr

15 Obr. 2.2 Schéma základních fyziologických reakcí, které jsou obsahem Literárního přehledu této práce. Šipky v rámečku znázorňují nárůst nebo pokles daného procesu. Obsah přerušovaného rámečku s otazníkem je hlavním tématem této práce. 15

16 2.2.1 Vliv zvýšené koncentrace CO2 na transpiraci Je-li vzduch pronikající do fotosyntetizujících částí rostlin průduchy bohatší na CO2, je ho pro účely fotosyntézy potřeba relativně méně. Jeho příjem je omezen snížením vodivosti průduchů (Ainsworth a Rogers, 2007). Průměrný pokles gs v důsledku EC CO2 je 20 % (Ainsworth a Long, 2005). Protože jsou průduchy zároveň většinou hlavní cestou ztráty vody, jejíž nedostatek pro rostlinu v prostředí bývá poměrně častý, zvýšená koncentrace CO2 tento únik sníženou vodivostí průduchů výrazně omezuje a zvyšuje tak účinnost využití vody (WUE - water use efficiency) (Onoda et al., 2009; Teng et al., 2006; Allen et al., 2003). Rostlina se díky lepšímu hospodaření stává na dostupnosti vody méně závislou, což se obzvláště v suchých oblastech projevuje její vyšší asimilací a růstem (Ephrath et al., 2011). Průměrný vzrůst WUE o 74% byl vyhodnocen v metaanalytické studii, v které byly sledovány reakce 12ti dřevin (Ainsworth et al., 2007; Ainsworth a Long, 2005) Vliv zvýšené koncentrace CO2 na respiraci Sledované změny respirace v důsledku vystavení rostliny EC CO2 se velmi různí. EC CO2 respiraci snižuje průměrně o %, ale rozmezí může být od 20 % stimulace po 60 % inhibici (Gonzalez-Meler a Siedow, 1999). Mechanismem poklesu respirace je inhibice respiračních enzymů ale tento efekt je možná jen malý (Gonzalez-Meler et al., 2009; Urban, 2003). I přes často sledovaný pokles respirace vlivem EC CO2 bývá rovněž sledován nárůst počtu mitochondrií (Griffin et al., 2001) a celkové respirace (Wang et al., 2004). Zvýšení respirace je ale spíše jen krátkodobý efekt v důsledku navýšení obsahu sacharidů (Gonzalez-Meler a Siedow, 1999). Pokles respirace fotosyntetického pletiva o 15% v důsledku zdvojnásobení současné koncentrace CO2 by představoval uložení 3 Gt uhlíku v biomase ročně (Drake et al., 1999) Vliv zvýšené koncentrace CO2 na fotosyntézu Ovlivnění fotosyntézy EC CO2 je velmi komplexní reakcí probíhající na několika hierarchických úrovních. Změny či přizpůsobení fotosyntézy odráží skutečnost, že při současné koncentraci CO2 v atmosféře je CO2 pro rostlinu limitujícím substrátem a jeho 16

17 nárůst je tedy příznivý (Leakey et al., 2009; Huang et al., 2007). Klíčovou roli hrají vlastnosti enzymu Rubisco, neboť tento enzym je místem přímého kontaktu fotosyntetického aparátu s atmosférickým CO2 a další reakce představují snahu o optimalizaci fotosyntézy a znovuvytvoření rovnováhy ve změněných podmínkách Vliv zvýšené koncentrace CO2 na aktivitu Rubisca Molekula CO2 je v procesu fotosyntézy nejprve vázána na molekulu RuBP (ribulózabisfosfát), tato reakce je katalyzována enzymem Rubisco (ribulóza-1,5-bisfosfátkarboxyláza/oxygenáza). Rubisco, klíčový enzym fotosyntézy, má jako jediná molekula schopnost vázat anorganický C z molekuly CO2 do struktury organických látek (karboxylázová aktivita). Zároveň je však schopen vázat i O2 v procesu vedoucím k fotorespiraci, jehož důsledkem je naopak uvolnění CO2 (oxygenázová aktivita). Jelikož vazebné místo pro CO2 a O2 je totožné a liší se jen afinitou k těmto substrátům, probíhá oxygenázová aktivita na úkor aktivity karboxylázové. Zvýšením oxygenázové aktivity tak dochází k poklesu čisté fotosyntézy (Ellsworth et al., 2004; Long et al., 2004; Drake et al., 1997). Zvýšení atmosférické koncentrace CO2 vede automaticky k vyšší koncentraci CO2 v mezibuněčných prostorách fotosyntetického pletiva, čímž se zvýší i difúzní gradient koncentrace CO2 mezi intercelulárami a chloroplastem a tedy i rychlost světlem saturované asimilace (Amax). Průměrný nárůst Amax je 30 %, u stromů 47 % (Ainsworth a Long, 2005), u evropských stromů dokonce 51 % (Medlyn, 1999), ale může se pohybovat v rozmezí % (Ainsworth et al., 2007; Ellsworth et al., 2004; Long et al., 2004; Norby et al., 1999; Curtis a Wang, 1998; Saxe et al., 1998). Zvýšená rychlost asimilace vlivem EC CO2 byla sledována i u smrku ztepilého (Kosvancova et al., 2009; Urban et al., 2003) Důsledky rychlejší produkce asimilátů při zvýšené koncentraci CO2 Rostliny rychlost tvorby asimilátů optimalizují tak, aby odpovídala kapacitě transportních drah i aktivitě příslušných sinků. Fotosyntetické produkty (sacharidy) mohou zůstat v chloroplastu zdrojové buňky ve formě asimilačního škrobu nebo mohou být transportovány na místo jejich využití, sinku. Zvýšením rychlosti fotosyntézy v důsledku EC CO2, kdy afinita k Rubiscu a rychlost karboxylace přestávají být limitující, se zvýší i rychlost tvorby fotosyntetických 17

18 produktů. Aby však bylo dosaženo také optimalizace spotřeby fotosyntetických produktů, je nezbytná celá řada přizpůsobení na anatomické, fyziologické, biochemické i molekulární úrovni (DeSouza et al., 2008). Pokud však rostlina nemá jak nadbytečné produkty fotosyntézy upotřebit dochází k aklimaci, tedy snížení rychlosti fotosyntézy (Drake et al., 1997), která bývá doprovázena poklesem množství a aktivity Rubisca (Hrstka et al., 2005; Rogers a Humphries, 2000). Příčinou aklimace může být nedostatek prostoru, nejčastěji pro růst kořenů. Z tohoto důvodu byla u prvních experimentů, kde byly rostliny pěstovány obvykle v květináčích, často pozorována brzká aklimace, se zvětšováním prostoru pro kořeny docházelo k jejímu časovému oddálení nebo vůbec nenastala (Pinkard et al., 2010; Arp, 1991). K aklimaci také dochází, není-li v půdě dostatek živin. Pokles karboxylace z důvodu aklimace bývá často následkem nedostatku N, neboť jeho deficience významně omezuje zakládání nových sinků (Finzi et al., 2006; McCarthy et al., 2006; Stitt a Krapp, 1999). Sledováno bylo ukončení aklimace a opětovné zvýšení rychlosti fotosyntézy po obohacení půdy dusíkem. (Springer a Thomas, 2007). U luštěnin, které dokáží fixovat vzdušný dusík, je míra aklimace nižší (Luscher et al., 1998). Pokud se při EC CO2 stane limitujícím dostatek živin a rostlina má dostatek prostoru pro rozšiřování kořenů, dochází ke snížení hodnoty poměru stonku vůči kořeni (Handa et al., 2008). Další častou limitací bývá nedostatečný morfogenetický potenciál rostliny, tedy neschopnost tvorby nových sinků a zvýšení rychlosti růstu. Pro větší přehlednost textu budu schopnost zvýšení růstu zahrnovat pod schopnost zvýšení kapacity sinku. Dobrým důkazem je experiment, při kterém byly mechanicky odstraňovány listy Lolium perenne, následkem čehož k aklimaci vůbec nedošlo (Ainsworth et al., 2003) nebo experiment, při kterém byla rostlina geneticky modifikována tak, aby kapacita jejího sinku byla nižší, čímž byl nástup aklimace naopak urychlen (Ainsworth et al., 2004). Nízký obsah nestrukturních sacharidů v pletivu obecně odráží limitaci rychlosti asimilace rychlostí karboxylace (Korner, 2003), naopak jejich vysoký obsah bývá důsledkem pomalého spotřebovávání fotosyntetických produktů (Li et al., 2002). Zvýšená akumulace neupotřebených produktů fotosyntézy (sacharidů) vlivem EC CO2 je tedy důkazem rychlosti tvorby asimilátů přesahující možnosti jejich transportu a využití v sinku (Ghildiyal et al., 2001; Arp, 1991). Častým jevem je pak zvýšená tvorba a ukládání škrobu v chloroplastech zdrojových buněk (Wang et al., 2004) (o důsledcích pojednává kapitola ). Sledován bývá rovněž nárůst obsahu rozpustných nestrukturních sacharidů a jejich meziproduktů, který 18

19 např. u Arabidopsis thaliana může v důsledku vystavení EC CO2 dosáhnout 70 % (Teng et al., 2006). Nárůst obsahu trióza-fosfátů je důsledkem malé poptávky rostliny po sacharidech vedoucí k nedostatečné rychlosti reakcí, v nichž by byl Pi (anorganický fosfát) uvolňován. V cytoplazmě zdrojové buňky pak dochází k nedostatku Pi pro tvorbu ATP nezbytného pro asimilaci uhlíku v Calvinově cyklu a regeneraci RuBP (Urban, 2003). Rychlost regenerace RuBP se pak stává limitujícím procesem. Důsledkem bývá pokles obsahu a aktivity enzymu Rubisco tak, aby se jeho aktivita vyrovnala rychlosti regenerace RuBP (Rogers a Humphries, 2000). Dusík, který je součástí Rubisca, může být následně využit za jiným účelem, což vede ke snížení koncentrace dusíku v pletivu (Crous et al., 2008; Gielen et al., 2000; Jach a Ceulemans, 2000). Případná limitace zabraňující využití EC CO2 samozřejmě nemusí být trvalá a aklimace může být snížena či ukončena, stejně tak k ní může za určitou dobu dojít i u rostlin, které z EC CO2 dokáží profitovat relativně dlouhodobě. Není také výjimkou stav, kdy byly u rostlin vykazujících zvýšení rychlosti fotosyntézy pozorovány zároveň i příznaky aklimace (Medlyn et al., 1999) Ovlivnění exprese fotosyntetických genů zvýšenou koncentrací CO2 Nestrukturní sacharidy hrají v reakci na EC CO2 klíčovou roli. Nejsou totiž jen zdrojem uhlíku, ale slouží také jako signál o fyziologickém stavu buňky a jsou do velké míry zodpovědné za zpětnovazebné mechanismy optimalizující fotosyntetickou aktivitu. (Teng et al., 2006). Registrování hladiny určitých sacharidů je klíčovým mechanismem v regulaci genové exprese (Moore et al., 1999), k jejímuž ovlivnění dochází prostřednictvím hexóz. Ty zahajují signální dráhu vedoucí k optimalizaci exprese fotosyntetických genů, obzvláště enzymů důležitých v procesu fixace CO2 (Smith a Stitt, 2007). Obecně dochází k poklesu exprese genů zodpovědných za syntézu sacharidů a nárůstu exprese genů zodpovědných za jejich utilizaci (DeSouza et al., 2008). V případě existence vnitřní či vnější limitace, kdy sinky nemohou být dále rozšířeny, tak bývá aklimace důsledkem zpětnovazebné inhibice fotosyntézy jejími produkty. Sledován bývá pokles transkriptů pro D1 a D2 proteiny, cytochrom b6/f, malé podjednotky Rubisca, Rubisco aktivázy a karbonát-anhydrázy či proteinů světlosběrných komplexů, dále např. fosfoglycerát-kinázy a glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenázy (Fukuyama et al., 2009; DeSouza et al., 2008; Ainsworth et al., 2006; Moore et al., 1999; 19

20 Webber et al., 1994; Wilkins et al., 1994). Oproti tomu bývá sledován nárůst transkriptů pro fosfatázu, fruktóza-bisfosfát-aldolázu a fosforibulo-kinázu a transkriptů genů pro syntézu škrobu (Fukuyama et al., 2009; DeSouza et al., 2008). Fukuyama et al. (2009) sledovali nárůst transkriptů 46 genů a pokles 35 transkriptů v důsledku působení EC CO2. O roli sacharidů jako signálních molekul svědčí například experimenty se sacharidy uměle dodávanými. Po jejich dodání přímo do fotosyntetického pletiva byl sledován pokles transkripce fotosyntetických genů, pokles obsahu proteinu Rubisca, chlorofylu, D1 proteinu, nárůst cukrů a škrobu (Krapp et al., 1991; Jones et al., 1996). Experimenty s dodáváním sacharidů do fotosyntetického pletiva představují slibný rychlý a levný nástroj při zkoumání vlivu EC CO2 na rostliny za účelem výběru vhodných genotypů hospodářských plodin i lesních stromů (Pinkard et al., 2010). Ovlivnění genové exprese rostlin v důsledku EC CO2 je druhově specifické. Pozornost je věnována především modelovým a hospodářským plodinám jako je např. Arabidopsis (Li et al., 2006), topol (Taylor et al., 2005), rýže (Fukuyama et al., 2009), cukrová třtina (DeSouza et al., 2008) sója (Ainsworth et al., 2006). Výrazné odlišnosti mohou být i mezi jednotlivými genotypy, což dokazuje např. experiment, kde byla sledována zvýšená rychlost fotosyntézy dvou různých genotypů topolu, ke zvýšení růstu došlo však pouze u jednoho, což odrážely i hladiny transkriptů (Cseke et al., 2009). V posledních letech se experimenty zabývající se ovlivněním genové exprese zvýšenou koncentrací CO2 v atmosféře stávají významnou částí studia reakce rostlin na EC CO2 a jejich podíl výrazně poroste i v budoucnosti. Genomika a transkriptomika poskytují hlubší porozumění dříve pozorovaným reakcím (Lindroth, 2010; Whitham et al., 2006) Ovlivnění struktur a procesů primární fáze fotosyntézy zvýšenou koncentrací CO2 Jak bylo popsáno v předchozích kapitolách, posílení karboxylázové aktivity Rubisca na úkor aktivity oxygenázové by mohlo mít za následek ovlivnění struktury tylakoidních membrán a elektronového transportu s výsledkem efektivnější karboxylace, což bylo sledováno i na úrovni genové exprese. Nadprodukce asimilátů však může tylakoidní membrány a elektronový transport ovlivnit i mechanicky. Před samotným shrnutím vlivu EC CO2 na primární reakce fotosyntézy uvádím krátký popis elektronového transportu, neboť porozumění tomuto procesu je pro 20

21 vyhodnocení případného ovlivnění struktur a primárních reakcí fotosyntézy vlivem EC CO2 nezbytné Cyklický a necyklický elektronový transport V necyklickém elektronovém transportu (NET), je elektron z Chl a reakčního centra PS 1 postupně přenesen na NADP+ za současné tvorby protonového gradientu na tylakoidní membráně. Samotný NET vede k produkci ATP : NADPH v poměru 9 : 7. Pro redukci uhlíku v Calvinově cyklu je však potřeba poměr 3 : 2 (Kuvykin et al., 2011; Joliot a Joliot, 2002). Cyklický elektronový transport (CET), ve kterém se elektrony z ferredoxinu vrací přes plastochinon a cytochrom b6/f na PS 1, zvyšuje transferem protonů H+ přes tylakoidní membránu protonový gradient, který je následně využit pro tvorbu ATP. Při cyklickém transportu tak nedochází k redukci NADP+(Obr. 2.3). CET je zvláště důležitý za určitých stresových podmínek, jakými je nízká koncentrace CO2, vysoká ozářenost či sucho (Kuvykin et al., 2011; Rochaix et al., 2011; Vershubskii et al., 2007). CET přispívá k okyselení lumenu tylakoidů, které je předpokladem syntézy ATP a vede také ke spuštění nefotochemického zhášení. Proto, když bylo z buňky Chlamydomonas reinhardtii odebráno ATP, došlo k výraznému posílení cyklického elektronového transportu (Rochaix et al., 2011). CET je rovněž nezbytný, při zvýšené míře fotorespirace, jelikož za těchto podmínek je žádoucí vyšší produkce ATP (Rochaix et al., 2011). Kombinace necyklického transportu elektronů s cyklickým tedy umožňuje optimalizaci produkce ATP a NADPH tak, aby odpovídala aktuálním potřebám (Kuvykin et al., 2011; Kanervo et al., 2005). Kapacita a rychlost elektronového transportu může být měřena a vyjádřena několika způsoby, tři dle mého soudu nejvýznamnější jsou popsány v

22 Obr. 2.3 Cyklický a necyklický elektronový transport a jejich lokalizace na tylakoidní membráně chloroplastu. Necyklický elektonový transport je znázorněn červeně, cyklický elektronový transport modře. PS1: fotosystém 1, PS2: fotosystém 2, cyt cytochrom b6/f. Vytvořeno v programu Inkscape podle Joliot a Joliot (2002) Vliv CO2 na elektronový transport Fotosyntetický aparát reaguje na změny podmínek okolního prostředí (jakou může být např. zvýšení koncentrace CO2) regulačními mechanismy včetně regulace elektronového transportu. Přestává-li v důsledku EC CO2 být limitující rychlost karboxylace a zároveň nedochází k omezení vnějším prostředím či velikostí sinku rostliny, může se stát limitující rychlost reakcí primární fáze fotosyntézy, tedy elektronový transport a tvorba ATP a redukce NADP+. Aby byl umožněn nárůst Amax, jsou primární reakce fotosyntézy optimalizovány tak, aby byla nastolena efektivní rovnováha mezi rychlostí elektronového transportu, regenerace RuBP a karboxylace (Kanervo et al., 2005). Někteří autoři tak předpokládali a prokázali zvýšení kapacity elektronového transportu rostlin rostoucích při EC CO2 za podmínek nesaturovaného sinku (Hymus et al., 1999). Naopak vlivem nástupu fotosyntetické aklimace jako možného důsledku působení EC CO2 dochází často k poklesu kapacity elektronového transportu Jmax. Ten pak bývá při aklimaci doprovázen i snížením efektivity karboxylace (Vcmax), k němuž dochází následkem poklesu obsahu a aktivity Rubisca (Ainsworth a Long, 2005). Elektronový transport však na rozdíl od karboxylace není EC CO2 ovlivněn přímo, pokles Jmax tak bývá nižší než pokles Vcmax a hodnota poměru Jmax/Vcmax při aklimaci roste. U jehličnanů byl při aklimaci sledován 36 % pokles 22

23 hodnoty Vcmax zatímco Jmax pokleslo jen o 21 % (Tissue et al., 1999). Příčinou rozdílné míry poklesu je pravděpodobně zvýšení efektivity karboxylace při snížení fotorespirace za podmínek EC CO2 (Norby et al., 1999), jako důsledek zdvojnásobení koncentrace CO2 byl sledován nárůst Jmax/Vcmax dokonce o 40 % (Medlyn et al., 1996). Metaanalytická studie uvádí jeho zvýšení o 5 % (Ainsworth a Long, 2005). Stanovení poměru Jmax/Vmax bývá častým nástrojem při popisu a modelování fotosyntetické dynamiky vegetace a je často stanovován i při experimentech zabývajících se vlivem EC CO2 na rostliny (Zheng et al., 2010). Při zkoumání ovlivnění elektronového transportu nicméně závisí na způsobu, kterým je charakterizován a vyjádřen. Změna hodnoty Jmax totiž ne vždy odpovídá například maximálnímu kvantovému výtěžku PS 2 FV/FM, který bývá zjišťován metodou měření fluorescence. U borovice kadidlové (Pinus taeda) byl například několikrát sledován pokles hodnoty Jmax při dlouhodobém vystavení EC CO2 (Lewis et al., 1996; Tissue et al., 1996). Měřením rychlosti tvorby kyslíku, které představuje přímé měření kapacity elektronového transportu, však rozdíl v elektronovém transportu způsobený vlivem EC CO2 prokázán nebyl (Logan et al., 2009). Změna fotochemické efektivity PS 2 vyjádřená na základě fluorescenčních měření nenastala při zvýšené koncentraci CO2 ani u Pinus sylvestris (Gielen et al., 2000). Optimalizaci elektronového transportu provází také změny velikosti a složení světlosběrných komplexů a obsahu pigmentů. Pokles obsahu chlorofylu při EC CO2 bývá přisuzován aklimaci a je často sledován spolu s poklesem elektronového transportu. To může být vysvětleno potřebou realokace zdrojů za účelem optimalizace fotosyntetického procesu (Arp, 1991). Při nárůstu či neovlivnění Amax zvýšenou koncentrací CO2 se obsah pigmentů spíše nemění (Logan et al., 2009; Springer 2007) Vliv akumulace škrobu při zvýšené koncentraci CO2 na ultrastrukturu chloroplastu Jak již bylo popsáno v kap , následkem nárůstu koncentrace CO2 dochází k průkaznému zvýšení obsahu škrobu v chloroplastech. Zatímco některé rostliny pěstované za stávající koncentrace CO2 často neobsahují žádná škrobová zrna, u rostlin z vysoké koncentrace CO2 je jejich nepřítomnost výjimečná (Pritchard et al., 1997) a na řezu chloroplastem mohou představovat % plochy (Wang et al., 2004) (Obr. 2.4). V různých studiích se pak nárůst obsahu škrobu liší dle druhu zkoumané rostliny a podmínek prostředí, při kterých byla kultivována (např. dostupnost živin a vody). 23

24 Zaznamenán byl nárůst o 160 % (Long a Drake, 1991), 62 % (Moore et al., 1997) 50 % (DeLucia et al., 1985) či 27 % (Sholtis et al., 2004). Oproti tomu jiní autoři žádný nárůst obsahu škrobu nepozorovali (Robertson a Leech, 1995). U sóji (Glycine max) byla sledována zvýšená akumulace škrobu na konci dne, ale ne v noci, rostliny v EC CO2 tedy škrob více utilizovaly (Ainsworth et al., 2006). Obsah škrobu v chloroplastu významně ovlivňuje jeho tvar, strukturu a funkci. Důsledkem většího počtu a velikosti škrobových zrn se zvětší šířka a plocha řezu chloroplastu. Délka chloroplastů je obvykle ovlivněna podstatně méně nebo vůbec, chloroplasty se tak pod tlakem škrobových zrn stávají většími a kulatějšími (Wang et al., 2004; Griffin et al. 2001; Pritchard et al., 1997; Kutik et al., 1995). Změna ultrastruktury chloroplastů při EC CO2 je též ovlivněna dostupností živin. Nárůst obsahu škrobu u rostlin z EC CO2 je výraznější v chloroplastech rostlin pěstovaných v podmínkách nižší dostupnosti dusíku, a to patrně jako důsledek nadprodukce asimilátů, které není možné při nedostatku živin upotřebit. Velikost plochy řezu chloroplastem byla např. pozitivně ovlivněna u rostlin pěstovaných za EC CO2, ale průkazně pouze u rostlin pěstovaných při nedostatku dusíku. Tyto chloroplasty byly také kulatější (Kutik et al., 1995). Vyšší akumulace škrobu byla rovněž sledována při nedostatku vody (Pritchard et al., 1997). Četnější a větší škrobová zrna mohou zastiňovat reakční centra, a tím snížit množství dostupné světelné energie nezbytné pro fotosyntézu, sledována byla i průkazná inhibice difůze CO2 do chloroplastu (Eguchi et al., 2008). Akumulace škrobu může také výrazně ovlivňovat tvar tylakoidních membrán. Někteří autoři sledovali natolik zvýšený obsah škrobu v chloroplastech, že docházelo k jejich narušení (Utriainen et al., 2000). Jak se škrob pod vlivem EC CO2 akumuluje, tlačí na tylakoidní membránu, deformuje ji a může od sebe oddělovat jednotlivá grana (Teng et al., 2006; Pritchard et al., 1997). Formace gran je tedy negativně ovlivněna a plocha granálních tylakoidů vůči ploše tylakoidů stromatálních je pak nižší. Pokud je akumulace škrobu extrémní, membrány mohou být narušeny, což vede k negativnímu ovlivnění fotosyntetického aparátu, následkem čehož dochází k poklesu fotosyntézy a aklimační depresi (Teng et al., 2006, Pritchard et al., 1997). 24

25 Obr. 2.4 Chloroplasty v mezofylových buňkách tabáku planého (Nicotiana sylvestris) rostoucího při A stávající a B zvýšené koncentraci CO2. V chloroplastech ze zvýšené koncentrace CO2 byla nápadná škrobová zrna, která představovala 51-67% plochy řezu chloroplastem. Úsečka znázorňuje délku 1 m Upraveno podle Wang et al.(2004) Změna ultrastruktury chloroplastů jako způsob optimalizace elektronového transportu při zvýšené koncentraci CO2 Ačkoli akumulace škrobu může hrát důležitou roli v ovlivňování poměru S/G (poměr stromatálních a granálních tylakoidů), někteří autoři považují za pravděpodobnější, že průkazné zvýšení hodnoty poměru S/G je důsledkem snahy o vyvážení změněné energetické potřeby rostliny při EC CO2 (Teng et al., 2006). Fotosystémy nejsou na tylakoidní membráně rozmístěny náhodně. Zatímco PS 2 (podílející se pouze na necyklickém transportu elektronů) se nachází přednostně v granálních tylakoidech, PS 1 (podílející se mimo necyklický transport i na transportu cyklickém) a ATP syntáza se nachází převážně v tylakoidech stromatálních (Obr. 2.3). Poměr G/S tak může odrážet poměr necyklického a cyklického transportu elektronů a jeho nižší hodnota snahu rostliny o efektivnější fixaci CO2 optimalizací produkce energie a redukční síly (Griffin et al., 2001). Přestože jisté ovlivnění poměru S/G vlivem EC CO2 již 25

26 bylo sledováno vícekrát (Teng et al., 2006; Pritchard et al., 1997; Kutík et al., 1995), příčiny nebyly dosud spolehlivě vysvětleny. Ať už jsou změny ultrastruktury chloroplastů a S/G způsobeny mechanicky nebo fyziologicky (v případě genetických změn by se jednalo o optimalizaci, v případě těch mechanických ale spíše o poškození), odráží vliv EC CO2 na fotosyntézu a jejich sledování poskytuje dobrý vhled do studované problematiky Vliv stáří fotosyntetického pletiva a ročního období v reakci na EC CO2 Ke změně rychlosti fotosyntézy či aklimaci může dojít přirozeným vývojem rostliny. Stromy EC CO2 využijí nejefektivněji ve stádiu nejrychlejšího růstu. Výrazně vyšší stimulace fotosyntézy zvýšenou koncentrací CO2 bývá sledována u mladých stromů oproti stromům zralým (s konstantním listovou plochou). U mladých stromů je také průkazný rozdíl v produkci biomasy při různých koncentracích CO2 (Idso, 1999) (Obr.2.5). Geny, které byly vlivem EC CO2 exprimovány odlišně byly u mladých listů obvykle exprimovány více, zatímco u starých listů v EC představovala odlišná genová exprese převážně pokles (Taylor et al., 2005). Se stárnutím rostliny ubývá přirozených sinků, limitující začíná být i dostupnost vody a živin a dochází k nižší stimulaci růstu zvýšenou koncentrací CO2. Když byla např. experimentálně zvýšena koncentrace CO2 ve 100 let starém švýcarském lese, nebyl růst stromů nijak ovlivněn (Asshoff et al., 2006). Naopak jiný experiment se zralými stromy prokázal dlouhodobý (8 let) nárůst fotosyntézy (Bader et al., 2010). U jehličnanů bývá sledován výraznější pokles rychlosti fotosyntézy u rok starých jehlic oproti jehlicím tohoročním (Zhou et al., 2011; Logan et al., 2009; Rogers a Ellsworth, 2002; Jach a Ceulemans, 2000). Stejný trend, kdy došlo k aklimaci pouze starších jehlic, zatímco fotosyntéza nových jehlic z EC CO2 byla stimulována, pozorovali i jiní autoři (Crous a Ellsworth, 2004; Crous et al., 2008). Vliv EC CO2 na fotosyntézu se mění i během roku. Rychlost fotosyntézy je totiž závislá na stáří fotosyntetického pletiva a případně nástupu senescence. Ta může být vlivem CO2 urychlena či oddálena (Curtis a Teeri, 1992; Lewis et al., 1996; Murthy a Dougherty, 1997). Výraznější pokles rychlosti fotosyntézy rostlin z EC CO2 v průběhu vegetační sezóny byl sledován i na experimentálním stanovišti Bílý Kříž (Marek et al., 1995). Aklimace bývá obecně koncem vegetační sezóny častější (Medlyn et al., 1999), u jehličnanů bývá sledován pokles rychlosti fotosyntézy v zimě (Gielen et al., 2000). 26

27 Některé odhady predikující vyšší produktivitu lesů při EC CO2 tak mohou být značně nadhodnocené, neboť většina experimentů probíhá v době vegetační sezóny. Sledovaná aklimace fotosyntézy může také nastat v důsledku rychlejší ontogeneze rostliny vlivem EC CO2, kdy na počátku vegetační sezóny dojde k dřívějšímu dosažení maxima fotosyntézy a následně také dřívější senescenci. Nižší rychlost fotosyntézy v EC CO2 tedy může ve skutečnosti odrážet to, že rostlina z EC CO2 je relativně starší než rostlina z AC (stávající koncentrace) CO2 (Miller et al., 1997). Obr. 2.5 Rozdíl ve vyprodukované hmotnosti biomasy mezi stromy rostoucími při stávající a zvýšené (+300 ppm) koncentraci CO2 v procentech. Zvýšená koncentrace byla simulována v systému FACE. Křivka je zobrazením průměrných hodnot těchto druhů: Borovice kadidlová (Pinus taeda), dub cesmínovitý (Quercus ilex) citroník hořký (Citrus aurantium). Upraveno podle Pinkard et al., (2010) Metody měření primárních reakcí fotosyntézy Měření hodnoty Jmax Elektronový transport bývá v literatuře často vyjadřován jako Jmax (maximální výtěžek elektronového transportu) a představuje často sledovanou fotosyntetickou charakteristiku při porovnávání jehličnanů rostoucích při AC a EC CO2. Jeho hodnota bývá stanovena na základě gazometrických měření a přímo odráží maximální rychlost regenerace RuBP. Tato rychlost je limitována rychlostí syntézy ATP, která je podmíněna 27

28 rychlostí elektronového transportu. Hodnota Jmax by tedy měla s hodnotami přímých měření elektronového transportu (které byly použity v této práci) korelovat Měření fluorescence chlorofylu K popsání elektronového transportu bývá hojně využíváno měření fluorescencenčních charakteristik, při kterém bývá nejčastěji sledován maximální kvantový výtěžek PS 2 vyjádřený jako poměr FV/FM. Ten porovnává minimální (F0) a maximální (FM) výtěžek fluorescence chlorofylu. Maximální výtěžek variabilní fluorescence chlorofylu v temnotně adaptovaném stavu (FV) se spočítá jako rozdíl FM a F0. K změření hodnoty těchto parametrů je potřeba sledovanou rostlinu či její část nechat adaptovat na tmu, čímž je zajištěno, že všechna reakční centra jsou oxidována, tedy otevřena a rozdíl výtěžku fluorescence po ozáření fotosyntetického pletiva sledované rostliny saturačním pulzem je skutečně maximální. Stejným postupem, avšak bez adaptace rostliny na tmu, může být změřena hodnota parametru FV /FM označovaného též jako QY (quantum yield, kvantový výtěžek fluorescence) (Maxwell a Johnson, 2000; Rohacek a Bartak, 1999). Jelikož vztah mezi fluorescencí chlorofylu a elektronovým transportem na PS 2 je antiparalelní (pokles zastoupení jednoho procesu se projeví vzrůstem druhého), poskytuje měření fluorescence relevantní nástroj k postihnutí fotochemické aktivity primární fáze fotosyntézy (Govindjee, 1995). Měření fluorescence přímo umožňuje rutinní odhad kvantového výtěžku necyklického elektronového transportu, na který má vliv jak obsah otevřených reakčních center PS 2, tak rychlost excitace těchto reakčních center (Genty et al., 1989). Výhodou fluorescenční metody je její neinvaznost (nedojde k poškození, tedy ovlivnění sledované rostliny, a pletivo může být případně použito pro další analýzu), rychlost, a možnost měření in vivo. S rozvojem fluorescenčních přístrojů, které se již vyrábí i v kapesním provedení a nejsou náročné na obsluhu, se metoda měření fluorescence stala ve fotosyntetickém výzkumu velmi populární, což má za následek velké množství (ne vždy však dostatečně interpretovaných) výsledků, s kterými je možné vlastní naměřená data porovnávat. 28

29 2.3.3 Měření fotochemické aktivity izolovaných chloroplastů Další metodou, která bývá pro vyjádření kapacity elektronového transportu využita je měření fotochemické aktivity izolovaných chloroplastů (komplexů proteinů tylakoidních membrán) za dodání umělých akceptorů a donorů elektronu (Holá et al., 2003). Právě přítomnost umělých akceptorů a donorů elektronu představuje hlavní rozdíl oproti fluorescenčním měřením, neboť těmi může být při měření fluorescence výtěžek elektronového transportu limitován. Měření aktivity navíc postihuje aktivitu PS 1 a PS 2 zvlášť, zatímco fluorescenční parametry charakterizují spíše PS 2. Nevýhodou je časová náročnost a nemožnost měření in situ. Z toho důvodu je od tohoto dříve poměrně hojně využívaného způsobu měření fotochemické aktivity, a to i jehličnanů (Martin et al., 1978; Malthora, 1976; Oku a Tomita, 1976) s rozvojem jiných technik upouštěno. Přesto se jedná o užitečný způsob i při studiu vlivu EC CO2 na fotosyntézu (Sicher, 1999). Protože je měřena aktivita různých složek elektrontransportního řetězce zvlášť, umožňuje měření fotochemické aktivity izolovaných chloroplastů v kombinaci s informacemi o ultrastruktuře chloroplastů postihnutí vztahu mezi strukturou a funkcí chloroplastů za suboptimálních podmínek. 2.4 Používané systémy pro experimentální navození EC CO2 K simulaci zvýšené koncentrace CO2 v atmosféře bývají použity různé systémy. Nejjednodušší jsou různé kyvety a vaky. V nich je EC CO2 vystavena pouze část rostliny, jsou proto k získání relevantních výsledků poměrně nevyhovující (Saxe et al., 1989). Alternativou jsou větší komory a skleníky. Přestože umožňují sledování vlivu EC CO2 na celou rostlinu, výstupy jsou často zkresleny izolací od běžných podmínek prostředí a prostorovou limitací. V omezeném prostoru růstových komor a skleníků dochází rychleji k aklimaci, navíc mohou být sledovány jen mladé stromy (Pinkard et al., 2010) (jejichž reakce se od starších stromů často výrazně liší, viz kapitola ). V současné době jsou velmi rozšířené FACE systémy. V systému FACE jsou rostliny pěstovány v přirozeném prostředí, od kterého nejsou odděleny žádnou bariérou, CO2 je do prostoru vháněno do kruhu umístěnými tryskami. Výsledky z těchto experimentů se proto nejvíce blíží skutečnosti. Hlavní nevýhoda otevřenosti systému je velká spotřeba CO2 a s tím spojené vysoké finanční náklady. Navíc fluktuace koncentrace CO2 v těchto systémech může vést k určitému zkreslení (Ainsworth a Long, 2005; Long et 29

30 al., 2004). Kompromisem mezi vysokými finančními náklady systému FACE a nedostatečnou simulací přirozeného prostředí zcela uzavřených komor a skleníků jsou otevřené růstové komory (OTC) a lamelové kultivační sféry s automaticky otevíratelnými okny, které minimalizují finanční náklady za současného zachování co nejpřirozenějších okolních podmínek sledovaných rostlin (Urban et al., 2001). 30

31 3 METODIKA 3.1 Odběr vzorků Všechny vzorky jehlic byly odebírány z experimentálního ekologického pracoviště Laboratoře ekologické fyziologie rostlin Centra výzkumu globální změny AV ČR Bílý Kříž v Moravskoslezských Beskydech ( s. š., v. d., 908 m.n.m.) (Urban et al., 2001). Testované smrky byly pěstovány ve dvou lamelových kultivačních sférách (Obr. 3.1) při stanovené koncentraci CO2. Obě sféry o půdorysu 10 x 10 m jsou ve střední části vysoké 7 m. Železná konstrukce je vyplněna bezpečnostním sklem s automaticky (v závislosti na podmínkách prostředí) otevíratelnými okny. Tím je zajištěna co nejnižší spotřeba dodávaného CO2 a zároveň je dosaženo podmínek blížících se podmínkám okolí. Teplota a vlhkost vzduchu uvnitř sfér je srovnatelná s okolím. Jediným výrazněji ovlivněným faktorem je ozářenost, která je uvnitř sfér snížena o 26% (Urban et al., 2001). V jedné sféře byly smrky pěstovány při normální koncentraci CO2, zatímco druhá byla sycena CO2 tak, aby jeho koncentrace ve vzduchu dosahovala 700 ppm. Smrky staré 10 let byly do kultivačních sfér s normální a zvýšenou koncentrací CO2 přesazeny v roce Zároveň byly do sfér přesazeny i buky. Celkem bylo testováno 15 stromů z každé sféry zvolených tak, aby byly zastoupeny stromy z různých částí (okraje i středu) sféry a zároveň tak, aby poloha stromů z obou sfér byla přibližně stejná. Testovány byly jak jedinci rostoucí mezi smrky, tak jedinci v sousedství buků. Celkem byly provedeny 3 odběry jehlic.v srpnu 2009 byly odebrány čerstvé výhony pro měření fotochemické aktivity chloroplastů a za účelem zpracování pro elektronovou mikroskopii. V červenci a říjnu 2010 byly odebrány jehlice pro měření fotochemické aktivity chloroplastů a stanovení obsahu chlorofylu, zároveň byly změřeny fluorescenční a reflektanční charakteristiky (Tab. 3.1). 31

32 Obr. 3.1 Lamelové kultivační sféry na experimentálním ekologickém stanovišti Bílý Kříž v Moravskoslezských Beskydech. Parametr Termín odběru/ měření in vivo Počet stromů či vzorků pro každou variantu (AC, EC) Počet opakování měření vzorku Celkový počet měření - v 1 termínu pro 1 variantu / celkem Aktivita PS 1 VIII.09; VII.10; IX.10 4* V průměru 3 12 / 62 Aktivita PS 2 VIII.09; VII.10; IX.10 4* V průměru 3 12 / 62 Obsah pig. VII.10; IX / 30 NDVI VII.10; IX ** / 480 PRI VII.10; IX ** / 480 FV/FM VII.10; IX ** 2 60 / 240 QY VII.10; IX ** 4 (VII.); 2 (IX.) 120; 60 / 480; 240 Plocha tylakoidů VIII (různých chloroplastů) 25 / 50 Tab. 3.1 Termíny odběru / měření in vivo: VIII.09 ( ); VII.10 ( ) IX.10 ( ) * směsné vzorky; v každé skupině 3-4 stromy ** bylo provedeno 15 měření na severně orientovaném výhonu a 15 měření na jižně orientovaném výhonu smrku, jelikož mezi hodnotami fluorescenčních a reflektančních indexů severních a jižních výhonů nebyly průkazné rozdíly, byla tato měření považována za opakování v rámci jedné varianty. 32

33 3.2 Stanovení fotochemické aktivity chloroplastů Počáteční pokusy byly zaměřeny na vypracování metodiky pro měření fotochemické aktivity chloroplastů jehličnanů, neboť ta doposud nebyla v Laboratoři genetiky rostlin měřena a experimentální postupy popsané v různých publikacích se liší (viz Tab. 3.2, Tab. 3.4, Tab. 3.5, Tab. 3.6). Při vypracovávání metodiky izolace chloroplastů byla měřena aktivita Hillovy reakce (AHR) různě modifikovanými postupy, dále byla dopracována metodika pro měření aktivity PS 1 a PS 2. Optimalizovaný postup měření fotochemické aktivity chloroplastů byl posléze použit při hlavních experimentech Obecný postup Předmětem této kapitoly je obecný postup izolace chloroplastů a měření jejich aktivit, který byl použit jak při metodických pokusech, tak při pokusech hlavních Příprava suspenze chloroplastů Báze jehlic odloupnutých z výhonu byla odstřihnuta, poté byly vzorky zváženy a konkrétní navážka homogenizována v izolačním médiu. Po provedení centrifugace (či série centrifugací) vzniklého homogenátu byl pelet resuspendován v resuspendačním médiu a přemístěn do uzavíratelné mikrozkumavky. Vzorky byly po celou dobu zpracovávány a uloženy při teplotě 0 4 C Stanovení obsahu chlorofylu v suspenzi izolovaných chloroplastů Fotochemická aktivita byla vztahována na jednotku obsahu chlorofylu, který byl stanovován spektrofotometricky. Suspenze (50 l) chloroplastů bylo extrahováno v 5 cm3 80 % vodného roztoku acetonu a následně centrifugováno 10 min při 1000 g v centrifuze K 23 (MLW, Německo) či 10 min při 4000 g v centrifuze Universal 320R (Hettich, Německo). Supernatant takto zbavený nečistot byl použit k měření absorbance ve vlnových délkách 663 (A663), 645 (A645) a 710 (A710) nm. Měření každého vzorku proběhlo ve dvou opakováních. Z průměrných hodnot absorbance byl vypočítán obsah chlorofylu v suspenzi dle vzorce (Porra et al., 1989): Chl = 8,02 (A663 A710) + 20,2 (A645 A710) 33 (1)

34 Měření fotochemické aktivity AHR a aktivity fotosystémů daných vzorků byly ve speciální expoziční komůrce (Bartoš et al., 1975) měřeny polarograficky kyslíkovou elektrodou Clarkova typu (Theta 90, Česká republika) jako produkce kyslíku po osvětlení a po dodání umělého akceptoru/ů elektronů v případě AHR a aktivity PS 2, nebo jako úbytek kyslíku po osvětlení v přítomnosti umělého akceptoru, donoru elektronů a inhibitoru aktivity PS 2 v případě měření aktivity PS 1. Aktivita každého vzorku byla měřena v několika opakováních. Před a po ukončení měření série vzorků byl systém kalibrován na 0 a 20,99 % O2 přítomného v komůrce. Expoziční komůrka byla naplněna destilovanou vodou, sycena postupně dusíkem a vzduchem a posléze byl odečten rozdíl naměřených hodnot. Hodnoty aktivit byly vyjadřovány v přepočtu dle vzorce: 0,258 a 10 6 [mmol O2 kg-1 chl s-1] b [chl ] 120 (2) 0,258 konstanta rozpustnosti kyslíku při normálním tlaku a teplotě 25 C[mmol O2 dm-3] a počet dílků stupnice, odečtený během doby měření b počet dílků stupnice odpovídající rozsahu 0 20,99 % O2 zjištěný kalibrací soustavy [chl] koncentrace chlorofylu v expoziční komůrce [kg m-3] 120 doba, po kterou byla měřena změna koncentrace [O2] Měření AHR a aktivity PS2 Do 5 cm3 měřícího media v komůrce byl napipetován objem vzorku stanovený na základě toho, jaké množství chlorofylu suspenze chloroplastů obsahovaly. Suspenze chloroplastů a měřícího media byla poté sycena dusíkem tak, aby se koncentrace kyslíku v komůrce blížila nule. Pro měření AHR bylo následně přidáno 200 mm3 umělého akceptoru elektronů FeCy (ferrikyanidu draselného), takže jeho výsledná koncentrace v komůrce byla 7 mm, a komůrka byla uzavřena (akceptory elektronů pro měření PS 2 byly nejprve testovány, (viz kapitola ). Po 1 min byl vzorek na 3 min osvětlen bílým světlem (170 W m-2, pokud není uvedeno jinak). Pro výpočet AHR byly použity poslední 2 min osvětlení vzorku. Mezi měřením jednotlivých vzorků byla komůrka vždy několikrát propláchnuta destilovanou vodou a měřícím médiem Měření aktivity PS 1 34

35 Složení klasického měřícího média (použitého pro měření aktivity PS 1 u všech experimentů) bylo: 0,04 M sacharóza, 0,05 M NaH2PO4 H2O, ph 6,5 (NaOH). Do 4,45 cm3 tohoto reakčního roztoku byly přidány následující složky reakční směsi v tomto pořadí: askorbát sodný Konečná konc. v komůrce 1 mm DCPIP 0,15 mm umělý donor elektronů pro PS 1 metylviologen 0,1 mm umělý akceptor elektronů z PS 1 DCMU 0,01 mm inhibuje el. transport z PS 2 na PS 1 NH4Cl 0,05 mm odpřahuje fotorespiraci Složka Funkce redukuje DCPIP Na závěr byla do expoziční komůrky přidána suspenze chloroplastů a komůrka uzavřena. Po 1. min byl vzorek osvětlen a rozdíl mezi začátkem 2. a 4. min od osvětlení byl použit pro vypočítání aktivity PS Metodické pokusy Za účelem vypracování metodiky byly odebírány nové výhony smrku pichlavého (Picea pungens) ze dvora budovy ve Viničné 5 v Praze Uchování vzorků Jelikož místo odběru vzorků (Moravskoslezské Beskydy) je od místa jejich zpracování (Praha) poměrně vzdálené a měření fotochemické aktivity vzorků mohlo probíhat 1-3 dny po odběru, bylo třeba nejprve otestovat způsob skladování vzorku mezi dobou odběru a dobou zpracování. Testovány byly vzorky uchovávané 24 hodin v kapalném dusíku, mrazáku a lednici. Protože vzorky uchovávané v mrazáku a kapalném dusíku vykazovaly pouze minimální nebo žádnou fotochemickou aktivitu, byly dále testovány už jen vzorky skladované v lednici Množství vzorku Z důvodu limitace množstvím pokusného materiálu bylo třeba vyzkoušet různé navážky čerstvých jehlic. Testovány byly hmotnosti 1 g, 1,5 g, 2 g, 3 g a 4 g. Jako nejnižší možná a zároveň dobře měřitelná navážka byly vybrány 3 g. Při použití menšího množství 35

36 jehličí byly chloroplastové suspenze velmi světlé a vykazovaly jen minimální fotochemickou aktivitu Homogenizace Pro zjištění optimálního způsobu homogenizace byla porovnávána aktivita vzorků homogenizovaných mechanickým homogenizátorem Thurmix 302 (MPW, Polsko), rozetřených ve třecí misce a ve třecí misce s použitím kapalného dusíku. Homogenizace ve třecí misce se neosvědčila (vzorky vykazovaly jen minimální aktivitu), byl proto zvolen homogenizátor. Dále byla testována optimální délka homogenizace jehlic, jako nejvhodnější byla zvolena doba 120 s při rpm. Konkrétní výsledky jsou zobrazeny na obr Homogenizátor Thurmix 302 byl dále použit u všech metodických pokusů a hlavních pokusů z odběru Pro měření aktivit vzorků z obou odběrů v roce 2010 byl používán homogenizátor OV5 (Velp Scientifica, Itálie), který mezitím Laboratoř získala. Před samotným měřením byl tento homogenizátor opět testován a jako optimální byla v tomto případě zvolena 60ti sekundová doba homogenizace při rpm. 4,5 Homogenizace AHR [mmol O 2 kg -1 Chl s -1] 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Délka homogenizace [s] Obr. 3.3 Závislost AHR na délce homogenizace homogenizátorem Thurmix 302. Postup izolace chloroplastů a měření AHR: navážka: 3g jehlic skladovaných 24 hod v lednici, izolační médium K, resuspendační médium K, měřící médium K, centrifugace 1000g 10 min, akceptor elektronů 7mM FeCy. 36

37 Centrifugace Pro izolaci fotochemicky aktivních chloroplastů z jehličnanů jsou v literatuře publikovány různé metodické postupy. Bylo proto nezbytné některé vyzkoušet a optimalizovat. Seznam testovaných postupů je uveden v Tab. 3.2 a Tab Nejprve byly testovány dle izolačního postupu I. centrifugační postupy 3, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Jelikož naměřená aktivita takto zpracovaných vzorků byla velmi nízká, byly dle izolačního postupu I. otestovány centrifugační postupy 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 11. Nejvyšší fotochemickou aktivitu vykazovaly vzorky zpracované centrifugačním postupem č. 1. Posléze byl porovnáván postup č. 1 s postupem č.7. V tomto případě proběhlo zpracování vzorků dle izolačního postupu II. Lépe se osvědčil postup č. 7. Nakonec byly vyzkoušeny centrifugační postupy 8, 9 a 10 dle izolačního postupu III. Z těchto 3 postupů byl zvolen postup č. 8, který byl použit při dalších metodických měřeních a při měření vzorků z odběru O rok později byl proveden doplňující experiment, kdy byly s dříve vybranou nejoptimálnější centrifugací č. 8 porovnávány dle izolačního postupu III další postupy 19, 20, 21, 22. Z těchto se nejlépe osvědčil postup č. 21 a byl použit pro veškerá následující měření včetně měření fotochemické aktivity vzorků z odběrů roku

38 1. centrifugace 1000 g (10 min) 700 g (1 min) 250 g (5 min) 6000 g (3 min) 7000 g (10 min) g (4 min) 1000 g (10 min) 200 g (2 min) 200 g (2 min) 1200 g (2 min) 6000 g (3 min) 2. centrifugace ,4. centrifugace g (1 min) 700 g (1 min S 2000 g (1 min) S 2000 g (1 min) g (5 min) 1300 g (10 min) 1300 g S 2000 g (10 min) P 1300 g (10 min) P 1300 g (10 min) g (5 min) 200 g (5 min) 200 g (2 min) 200 g (2 min) 200 g (2 min) 200 g (2 min) P 1000 g (10 min) S 1000 (2 min) S 1000 g (5 min) S 500 g (5 min) S 500 g (10 min) S 2000 g (10 min) S 1000 g (10 min) S 2000 g (10 min) S 6000 g (10 min) P 3000 g (10 min) S 6000 g (10 min) S 6000 g (10 min) S 6000 g (10 min) P 150 g (2 min) S 3000 g (10 min) P 2000 g (1 min) P 2000 g (1 min) P 2000 g (10 min) P 150 g (2 min) P 150 g (2 min) S 1300 g (10 min) S 6000 g (10 min) S 6000 g (10 min) S 6000 g (10 min) S 6000 g (10 min) zdroj (Holá et al., 2003) (Malhotra, 1976) modif. (Oku a Tomita, 1976) modif. (Martin et al., 1978) modif. (Lewandowska a Oquist, 1980) (Oku a Tomita, 1980) (Holá et al., 2003) modif. modif. modif. modif. (Martin et al., 1978) PI I, II I I I I I II III III III I (Malhotra, 1976) modif. (Malhotra, 1976) I I (Oku a Tomita, 1976) (Oquist et al., 1974) modif. (Oquist et al., 1974) I I I (Oku a Tomita, 1976) (Oku a Tomita, 1976) modif. modif. modif. modif. modif. I I III III III III Tab. 3.2 Testované centrifugační postupy. Tučně je zobrazen optimální postup pro izolaci chloroplastů. PI: postup izolace chloroplastů (navážka 3 g jehlic uložených 24 hodin v lednici, homogenizace 120 s v 40 cm3, akceptor elektronů 7mM FeCy, použitá média jsou obsahem Tab. 3.3); S: pro toto kolo centrifugace byl použit supernatant z centrifugace předchozí; P: pro toto kolo centrifugace byl použit pelet z předchozí centrifugace resuspendovaný v izolačním médiu. Postup izolace Izol. médium Resusp. médium Měřící médium I K K K II A,B,C K K III C C Cm Tab. 3.3 Postupy izolace použité při centrifugačních experimentech. Složení konkrétních médií je obsahem tabulek Tab. 3.4, Tab. 3.5, Tab

39 Složení izolačního, resuspendačního a měřícího média Měřitelnost aktivity chloroplastů rovněž závisí na složení izolačního média, v kterém je vzorek homogenizován a posléze centrifugován, resuspendačního média, v němž je pelet po centrifugaci rozetřen a chloroplasty uchovávány, a měřícího média, v němž probíhá vlastní měření fotochemických aktivit. Seznam složení otestovaných izolačních médií je obsahem Tab. 3.4, resuspendačních médií Tab. 3.5 a měřících médií Tab Nejvyšší aktivity vykazovaly vzorky homogenizované v izolačním médiu C, resuspendačním médiu C a měřícím médiu Cm. Tato média byla použita pro veškeré další experimenty. A 0,4 M sach. 50 mm Tris-HCl; ph: 7,6 10 mm NaCl 5 mm MgCl2 B 0,5 M sach. 50 mm Tris-HCl; ph: 7,8 10 mm NaCl C 0,4 M sach. 50 mm HEPES NaOH; ph: 7,6 10 mm NaCl 5 mm MgCl2 20% (w/v) PEG D 0,4 M sach. 50 mm Tris-HCl; ph: 7,8 10 mm NaCl 10 mm C6H7O6Na 10% (w/v) PEG E 0,5 M sach. 50 mm Tris-HCl; ph: 7,8 10 mm NaCl 27 mm C6H7O6Na F 0,35 M sorb. 50 mm HEPES NaOH; ph: 7,5 10 mm NaCl 1 mm MgCl2 K 0,4 M sach. 50 mm Tris-HCl; ph: 7 25% (w/v) PEG 30% (w/v) BSA 25% (w/v) PEG 5 mm EDTA 10% (w/v) PEG 50 mm Na2CO3 10% (w/v) PEG 2 mm MgCl2 Tab. 3.4 Složení testovaných izolačních médií. Tučně je zobrazeno médium, které bylo vybráno pro následující pokusy. sach: sacharóza, sorb: sorbitol. zdroj: A (Öquist et al., 1974), B (Oku et al., 1971), C (Martin et al., 1978), D (Oku a Tomita, 1976; Oku et al. 1975) E (Oku et al., 1974), F (Oku a Tomita, 1980), K (Holá et al. 2003). C (Martin et al., 1978) (Martin et al., 1978) modif. 1,2 M sacharóza 50 mm HEPES NaOH; ph: 6,9 Cm 0,4 M sacharóza 50 mm HEPES; ph: 6,9 10 mm NaCl 5 mm MgCl2 E 0,5 M sacharóza 50 mm Tris-HCl; ph: 7,8 10 mm NaCl 27 mm C6H7O6Na 5 mm EDTA (Oku et al., 1974) F 0,1 M sacharóza 25 mm HEPES NaOH; ph: 7,3 5 mm NaCl (Oku a Tomita, 1980) K 0,4 M sacharóza 50 mm Tris-HCl ph: 7 6 mm MgCl2 4% glycerol (Holá et al. 2003) Tab. 3.5 Složení testovaných resuspendačních médií. Tučně je zobrazeno médium, které bylo vybráno pro následující pokusy. Cm F K 0,4 M sacharóza 50 mm HEPES NaOH; ph: 6,9 10 mm NaCl 5 mm MgCl2 (Martin et al.,1978) modif. 0,1 M sacharóza 25 mm HEPES NaOH; ph: 7,5 1 mm NH4Cl 5 mm MgCl2 (Oku a Tomita, 1980) 0,4 M sacharóza 50 mm Tris-HCl; ph: 7 2 mm MgCl2 (Holá et al., 2003) Tab. 3.6 Složení testovaných měřících médií. Tučně je zobrazeno médium, které bylo vybráno pro následující pokusy. 39

40 Koncentrace suspenze v expoziční komůrce pro měření AHR a aktivity PS 2 Pro určení vhodné koncentrace vzorku v komůrce byly chloroplasty izolovány a jejich fotochemická aktivita měřena postupem zvoleným na základě výše popsaných metodických pokusů. Samostatné vzorky byly po resuspendaci v 0,6 cm3 resuspendačního média smíchány. Z tohoto směsného vzorku bylo 3,8 cm3 použito přímo k měření v měřícím médiu Cm jako vzorek s vyšší koncentrací chlorofylu ( koncentrovanější vzorek ). Zbytek z původního objemu byl naředěn 2 cm3 resuspendačního média C, čímž vznikl méně koncentrovaný vzorek. Při měření AHR byly do expoziční komůrky pipetovány různé objemy vzorků (Obr. 3.4). Koncentrovanější vzorky vykazovaly při stejné výsledné koncentraci chlorofylu v komůrce jako vzorky méně koncentrované větší fotochemickou aktivitu, ovšem pouze při výsledných koncentracích chlorofylu nižších než 10 mg dm-3, poté se hodnoty AHR u obou typů vzorků již výrazně nelišily (Obr 3.4). Jako optimální koncentrace chlorofylu v komůrce byla zvolena hodnota mg Chl dm Koncentrační závislost (PS 2) AHR [mmol O 2 kg -1 Chl s -1] Koncentrovanější vzorek [531,804 mg Chl dm-3] 4 Méně koncentrovaný vzorek [293,186 mg Chl dm-3] Koncentrace Chl v komůrce [mg Chl dm ] Obr. 3.4 Závislost AHR na koncentraci vzorku v expoziční komůrce. Postup izolace chloroplastů a měření AHR: navážka 3 g jehlic uložených 24 hodin v lednici, homogenizace 120 s v 40 cm3 izolačního média C, resuspendační médium C, měřící médium Cm, centrifugace 200 g (10 min), následná centrifugace supernatantu 1000 g (10 min) a poté 6000 g (10 min), akceptor elektronů 7mM FeCy. 40

41 Koncentrace suspenze v expoziční komůrce pro měření aktivity PS 1 Obdobně jako v případě AHR byla testována optimální koncentrace chlorofylu v expoziční komůrce při měření aktivity PS 1. Bylo prokázáno, že nejvhodnější koncentrace chlorofylu v expoziční komůrce pro měření aktivity PS 1 je přibližně 7 mg Chl dm-3 (Obr.3.5) Při měření aktivity PS 1 všech následujících vzorků byl tedy do expoziční komůrky přidáván právě takový objem suspenze chloroplastů, aby výsledná koncentrace chlorofylu v expoziční komůrce dosahovala právě 7 mg Chl dm-3. Akt. PS 1 [mmol O 2 kg-1 Chl s -1] 80 Koncentrační závislost (PS 1) Koncentrovanější vzorek [419,773 mg Chl dm-3] 20 Méně koncentrovaný vzorek [225,385 mg Chl dm-3] Koncentrace Chl v komůrce [mg Chl dm ] Obr. 3.5 Závislost aktivity PS 1 na koncentraci vzorku v expoziční komůrce. Postup izolace chloroplastů: navážka 3 g jehlic uložených 24 hodin v lednici, homogenizace 120 s v 40 cm3 izolačního média C, resuspendační médium C, měřící médium klasické, centrifugace 200 g (10 min), následná centrifugace supernatantu 1000 g (10 min) a poté 6000 g (10 min) Ozářenost Pro úplnost metodické studie bylo nezbytné vyzkoušet vliv intenzity ozáření na fotochemickou aktivitu vzorku. Pro tuto metodickou část byly vzorky zpracovány postupem zvoleným na základě výše popsaných metodických pokusů. Několik takto připravených vzorků bylo smícháno do vzorku jednoho, který byl následně měřen klasickým postupem při různé intenzitě ozáření. Jako vhodná intenzita ozářenosti vzorku po dobu měření bylo zvoleno 170,4 Wm-2 (Obr.3.6) která byla následně použita pro veškerá další měření. 41

42 16 Ozářenost AHR [mmol O2 kg-1 Chl s-1] Ozářenost [W m-2] Obr. 3.6 Závislost AHR na ozářenosti v průběhu měření aktivity chloroplastové suspenze. Postup izolace chloroplastů a měření AHR: navážka 3 g jehlic uložených 24 hodin v lednici, homogenizace 120 s v 40 cm3 izolačního média C, resuspendační médium C, měřící médium Cm, centrifugace 200 g (10 min), následná centrifugace supernatantu 1000 g (10 min) a poté 6000 g (10 min), akceptor elektronů 7mM FeCy Akceptory elektronů pro měření aktivity PS 2 Pro měření aktivity PS 2 byly vyzkoušeny různé akceptory elektronů uvedené v Tab Výsledky experimentu shrnuje Obr.3.7. Jako optimální byla zvolena kombinace akceptorů FeCy (2mM) a DMBQ (1mM). Porovnáním výsledků z měření aktivity vzorků dvou různých koncentrací chlorofylu v expoziční komůrce bylo zjištěno že při použití kombinace FeCy a DMBQ jako akceptorů elektronů je vhodnější nižší koncentrace chlorofylu v expoziční komůrce. Při srovnání naměřené aktivity po přidání 50 mm3 a 200 mm3 suspenze chloroplastů do expoziční komůrky vykazoval vzorek odpovídající nižší koncentraci suspenze chloroplastů v měřícím médiu vyšší aktivitu (Obr. 3.7). Při všech následujících měřeních aktivity PS 2 bylo tedy do expoziční komůrky přidáváno 50 mm3 suspenze chloroplastů. 42

43 ferrikyanid draselný (FeCy) Koncentrace v expoziční komůrce 7 mm FeCy Objem vzorku mm ferrikyanid draselný + p-fenylendiamin (ppd) 1,2 mm FeCy + 0,5 mm ppd 200 mm 3 ferrikyanid draselný + p-fenylendiamin * 7 mm FeCy + 0,5 mm ppd 200 mm 3 ferrikyanid draselný + 2,6-dimetylbenzochinon 2 mm FeCy + 1 mm DMBQ 200 mm 3 2,6-dimetylbenzochinon (DMBQ) 1mM DMBQ 50 mm ferrikyanid draselný + 2,6-dimetylbenzochinon 2 mm FeCy + 1 mm DMBQ 50 mm Akceptor elektronů 3 3 Aktivita PS 2 [mmol O2 kg-1 Chl s -1] Tab. 3.7 Seznam akceptorů elektronů či jejich kombinací vyzkoušených při měření aktivity PS 2 izolovaných chloroplastů. Tučně je zobrazená na základě pokusů zvolená kombinace akceptorů elektronů. *K suspenzi chloroplastů byl nejprve přidán FeCy, komůrka byla uzavřena a po jedné minutě osvětlena, po dalších dvou minutách byl přidán ppd a bylo zahájeno dvouminutové měření aktivity (v ostatních případech byly akceptory elektronů přidávány současně). 70 Akceptory elektronů mm FeCy (200 mm3) 1,2 mm FeCy + 7 mm FeCy + 2 mm FeCy + 1 0,5 mm ppd 0,5 mm ppd mm DMBQ (200 (200 mm3) postupně (200 mm3) mm3) 1 mm DMBQ (50 mm3) 2 mm FeCy + 1mM DMBQ (50 mm3) Obr. 3.7 Závislost aktivity PS 2 na použitém akceptoru (akceptorů) elektronů. Postup izolace chloroplastů a měření AHR: navážka 3 g jehlic uložených 24 hodin v lednici, homogenizace 120 s v 40 cm3 izolačního média C, resuspendační médium C, měřící médium Cm, centrifugace 200 g (10 min), následná centrifugace supernatantu 1000 g (10 min) a poté 6000 g (10 min). 43

44 Vliv stáří odebraného vzorku na fotochemické aktivity chloroplastů Z důvodu velkého množství odebíraných jehlic není možné aktivity PS 1 a PS 2 a AHR měřit v jeden den a bylo tedy nezbytné zjistit případné změny aktivity v čase. Nejvíce se s časem snižovala AHR a aktivita PS 2, nejlépe si aktivitu udržoval PS 1 (Obr. 3.8). Této skutečnosti bylo podřízeno plánování hlavních pokusů. 90 Změna aktivity v čase Aktivita [mmol O2 kg Chl -1 s -1] AHR 50 PS 2 40 PS Počet d ní od odebrání vzorku 3 Obr. 3.8 Změna AHR a aktivity PS 1 a PS dny po odebrání jehlic. Postup izolace chloroplastů a měření aktivity. AHR, PS 2, PS1: navážka 3 g jehlic uložených 24 hodin v lednici, homogenizace 120 s v 40 cm3 izolačního média C, resuspendační médium C, centrifugace 200 g (10 min), následná centrifugace supernatantu 1000 g (10 min) a poté 6000 g (10 min); AHR a PS 2: měřící médium Cm; PS 1: měřící médium klasické; AHR: akceptor elktronů FeCy; PS 2: akceptory elektronů FeCy a DMBQ Uchování a zpracování vzorků při hlavních experimentech V srpnu 2009 byly odebírány 3 4 čerstvé výhony z každého sledovaného stromu. Ty byly uloženy do uzavíratelných igelitových sáčků s mokrou buničinou a v přenosné lednici převezeny ještě týž den do Prahy, kde byly uchovány v lednici. Dva dny od odběru byla změřena aktivita PS 2 a 3. den aktivita PS 1. V červenci a říjnu 2010 byly odebrány pouze jehlice a ponechány v uzavřených igelitových sáčcích v lednici, následující den byly vzorky převezeny v přenosné lednici do Prahy a přes noc opět ponechány v lednici. Druhý den od odběru byla měřena aktivita PS 2 a třetí den aktivita PS 1. Zpracování a měření vzorků probíhalo postupem, který byl předmětem výše popsaných metodických pokusů. 44

45 3.3 Stanovení obsahu pigmentů Za účelem provedení analýzy obsahu pigmentů byly odebírány 2 vzorky (uzavíratelné mikrozkumavky do poloviny naplněné jehlicemi) z každého stromu. K odběru bylo vybráno 15 stromů ze sféry s normální koncentrací CO2 a 15 stromů ze sféry se zvýšenou koncentrací CO2. Jeden vzorek z každého stromu sloužil ke stanovení koncentrace pigmentů (Chl a, Chl b a karotenoidů) čerstvé hmotnosti vzorku, druhý vzorek sloužil k přepočtu čerstvé hmotnosti na hmotnost sušiny. Vzorky byly ihned po odběru uloženy do mrazáku, následující den byly převezeny do Prahy v chladícím boxu a posléze uloženy v mrazáku až do doby dalšího zpracování. Koncentrace pigmentů byla stanovena spektrofotometricky. Zvážené mražené vzorky byly nastříhány a extrahovány v 10 cm3 dimethylamidu kyseliny mravenčí (DMF) (Porra et al. 1989). Celková doba extrakce, po kterou byly vzorky uchovány v chladu (v lednici) při 4 C byla 7 dní. Před samotným měřením byl extrakt naředěn v poměru 1:4 s čistým DMF, takže výsledný vzorek měl objem 50 cm3. Měření absorbance ve všech vlnových délkách bylo provedeno spektrofotometrem (Unicam Helios, Velká Británie) a konkrétní hodnoty absorbance ve vlnových délkách 480 nm (A480), 647 nm (A647), 664 nm (A664) a 750 nm (A750) byly odečteny v programu VISION V3.31. K výpočtu koncentrace chlorofylu a a b a karotenoidů (Car) byly použity následující vzorce (Lichtenthaler, 1987): Chl a = 11,65 A664 2,69 A647 Chl b = 20,81 A647 4,53 A664 [ g cm3] [ g/cm3] Car = (1000 A480 0,89 Chl a 52,02 Chl b) / 245 [ g/cm3] (3) (4) (5) Od hodnot A480, A647 a A664 byla z důvodu korekce před dosazením do vzorce odečtena hodnota A750. Paralelně byly zváženy mražené vzorky odpovídající vzorkům určeným ke stanovení obsahu chlorofylu, ty pak byly sušeny v sušárně při (65 C) a znovu zváženy. Ze získaných hodnot pak byla dopočítána koncentrace chlorofylu a a b a karotenoidů v hmotnosti sušiny vzorku. 45

46 3.4 Měření fluorescenčních a reflektančních indexů Měření fluorescenčních a reflektančních charakteristik probíhalo in situ na Bílém Kříži v červenci a říjnu K stanovení hodnoty FV/FM a QY byl použit FluorPen 100, NDVI PlantPen NDVI 300 a PRI PlantPen PRI 200 (PSI, Česká republika). Měřena byla vždy skupina jehlic z čerstvého výhonu tak, aby jehlice pokrývaly celou plochu zorného pole měřícího záření Měření hodnoty FV/FM a QY FV/FM odpovídá maximálnímu kvantovému výtěžku PS 2, QY kvantovému výtěžku PS 2. Pro změření hodnoty FV/FM je nezbytná adaptace rostliny na tmu, měřené výhony smrku byly proto nejprve na min zabaleny do alobalu a až poté měřeny. Maximální kvantový výtěžek PS 2 (FV/FM) a kvantový výtěžek fluorescnce (QY) byly spočítány dle vzorců: FV / FM QY FM F0 FM FM ' F0 ' FM ' (6) (7) F0... minimální výtěžek fluorescence chlorofylu v temnotně adaptovaném stavu FV... maximální výtěžek variabilní fluorescence chlorofylu v temnotně adaptovaném stavu FM... maximální výtěžek fluorescence chlorofylu v temnotně adaptovaném stavu F0... minimální výtěžek fluorescence chlorofylu ve světelně adaptovaném stavu FV... maximální výtěžek variabilní fluorescence chlorofylu ve světelně adaptovaném stavu FM... maximální výtěžek fluorescence chlorofylu ve světelně adaptovaném stavu Měření hodnoty indexu NDVI Zatímco chlorofyl absorbuje záření o vlnových délkách nm, záření o vlnové délce vyšší než 710 nm silně odráží. Tuto skutečnost je možné interpretovat stanovením reflektančního indexu NDVI, (Normalized Difference Vegetation Index, normalizovaný diferenční vegetační index) který porovnává množství odražené radiace viditelného záření 46

47 (VIS visible, obvykle červené) a blízkého infračerveného záření (NIR near infrared). Vypovídá tak o obsahu chlorofylu měřeného vzorku. Velmi časté je jeho stanovování při dálkovém průzkumu, kdy slouží jako indikátor množství zelené vegetace na určité ploše. Vyšší hodnota NIR záření bývá v tomto případě indikátorem vysoké hustoty vegetace, pokud se NIR a VIS liší jen velmi málo, je vegetace řídká. Možné je však jeho využití i při měření malých částí listu či skupiny jehlic v případě jehličnanů, kde hodnota indexu přibližně odráží obsah chlorofylu. Index NDVI bývá spočítán podle obecného vzorce: NDVI NIR VIS NIR VIS (8) PlantPen NDVI 300 zaznamená hodnoty ve vlnových délkách 635 nm (VIS) a 760 (NIR) nm. Ty pak byly pro výpočet indexu dosazeny do vzorce (8) Měření hodnoty PRI Reflektanční index PRI (Photochemical Reflectance Index, fotochemický reflektanční index) bývá rovněž často vyhodnocován při dálkovém průzkumu, kde vypovídá o obsahu karotenoidů a produktivitě vegetace, jeho hodnota je spolehlivým indikátorem stresu. Přístrojem PlantPen PRI 200 byla měřena intenzita odraženého záření o vlnové délce 535 nm (R535) a 592 nm (R592), hodnota indexu PRI byla vypočtena podle vzorce PRI R535 R592 R535 R (9)

48 3.5 Zpracování vzorků pro elektronovou mikroskopii a měření plochy tylakoidů na řezech chloroplastů Segmenty jehlic dlouhé zhruba 1 mm byly fixovány, odvodněny a zalévány v následujícím pořadí: Odběr segmentů jehlic a fixace v terénu (BK) 25% glutaraldehyd + fosfátový pufr ph 7,3 (0,1M) v poměru 1:4 fixováno ve 4 ml fixačního roztoku Postfixace (Praha) promytí fosfátovým pufrem 4% OsO4 + fosfátový pufr 1:1 promytí fosfátovým pufrem fosfátový pufr promytí fosfátovým pufrem Odvodnění v ethanolové řadě z čistého Et-OH 30, 40, 50% čistý Et-OH 70% Et-OH s 1% octanem uranylu 70% Et-OH 70% Et-OH, v lednici 80, 96,100% Et-OH ethanol + propylenoxid (1:1) čistý propylenoxid Zalévání směs propylenoxid + Spurrovo médium 3:1, 1:1, 1:3 čisté Spurrovo médium čisté Spurrovo médium, v lednici nové Spurrovo médium, polymerace ve formách, v termostatu při 65 C 13:30 14:00 7 hod (převoz BK, Praha) 3 x 15 min 2 hod 15 min přes noc 15 min vždy po 30 min přes noc 15 min 10 dní vždy po 30 min 30 min 2x po 30 min vždy po 60 min 2 hod přes noc přes noc Řezání vzorků bylo provedeno na objednávku v Laboratoři elektronové mikroskopie PřF UK. Řezy o tloušťce asi 70 nm byly řezány na ultramikrotomu (Leica EM UC6, Německo) diamantovým nožem a kontrastovány uranyl acetátem a citrátem olova. Vzorky byly pozorovány elektronovým mikroskopem TEM JEOL 1011 (JEOL, Japonsko). Obraz byl snímán kamerou Veleta (Olympus, Německo) s použitím softwarového programu Olympus Soft Imaging Solution GmbH (Olympus, Německo). Vybráno bylo 5 stromů z každé kultivační sféry, z každého stromu pak bylo snímáno 5 náhodně zvolených chloroplastů. Plocha řezů chloroplastů a tylakoidů byla měřena v programu Ellipse (ViDiTo, Slovensko) bodovou metodou pomocí mřížky PG MultiFG. Tato mřížka umožňuje souběžně měřit plochu čtyř různých struktur. Plocha řezu chloroplastu a tylakoidů byla spočítána jako počet bodových zásahů do určité struktury vynásobený plochou připadající jednomu bodu (Obr. 3.9). 48

49 Obr. 3.9 Výřez fotografie měřeného chloroplastu s přiloženou bodovou mřížkou v modulu PG MultiFG v programu Ellipse. Červené křížky: zásah mimo chloroplast, zelené křížky: zásah do stromatu, modré křížky: zásah do granálních tylakoidů, žluté křížky: zásah do stromatálních tylakoidů. 3.6 Použité statistické metody Statistické vyhodnocení výsledků bylo provedeno v programu NCSS 2000 (NCSS, USA). Rozdílnost dat byla vyhodnocována analýzou rozptylu ANOVA, analýzou dvojného třídění s interakcemi a jednovýběrovým t-testem. 49

50 4 VÝSLEDKY 4.1 Optimalizace metodiky pro izolaci chloroplastů a měření jejich fotochemické aktivity Byla optimalizována metodika pro izolaci chloroplastů smrku a měření jejich aktivity. Seznam částí metodického postupu, které se podařilo upravit tak, aby aktivita chloroplastů smrku ztepilého byla měřitelná je uveden v Tab.4.1. Způsob uchování vzorků mezi dobou odběru a zpracování lednice Doba, po kterou je fotochemická aktivita jehlic zachována minimálně 3 dny Minimální navážka jehlic potřebná pro izolaci chloroplastů 3g Způsob a doba homogenizace homogenizátor (OV5), 60 s při rpm Centrifugace 2000 g (10 min), následná 2 kola centrifugace supernatantu 1000 g (10 min) a 6000 g (10 min) Složení izolačního média 0,4 M sacharóza; 50 mm HEPES NaOH; ph: 7,6; 10 mm NaCl; 5 mm MgCl2; 20% (w/v) PEG Složení resuspendačního média 1,2 M sacharóza; 50 mm HEPES NaOH; ph: 6,9 Složení měřícího média (pro PS 2) 0,4 M sacharóza; 50 mm HEPES NaOH; ph: 6,9; 10 mm NaCl; 5 mm MgCl2 Koncentrace suspenze v expoziční komůrce pro měření AHR a aktivity PS mg Chl dm-3 Koncentrace suspenze v expoziční komůrce pro měření aktivity PS 1 7 mg Chl dm-3 Ozářenost vzorku v expoziční komůrce 170,4 Wm-2 Akceptory elektronů pro měření aktivity PS 2 FeCy (2mM) a DMBQ (1mM) Tab. 4.1 Dílčí části postupu izolace chloroplastů optimalizované pro jehlice smrku. 50

51 4.2 Vliv zvýšené koncentrace CO2 na obsah fotosyntetických pigmentů V červenci i v říjnu byla pozorována průkazně nižší průměrná koncentrace fotosyntetických pigmentů jehlic smrků rostoucích při EC CO2 oproti smrkům z AC CO2. Koncentrace chlorofylu byla u stromů z EC CO2 v červenci nižší o 17,1 %, Chl a o 17 % a Chl b o 17,4 %, koncentrace karotenoidů vlivem EC poklesla o 20%. V říjnu byla vlivem EC CO2 koncentrace chlorofylu snížena o 24,8 %, Chl a o 24,6 % a Chl b o 25,3 %. Obsah karotenoidů fotosyntetického pletiva byl u stromů z EC CO2 nižší o 16,9 %. Obsah Chl a i Chl b od července do října signifikantně vzrostl, obsah karotenoidů naopak signifikantně poklesl. Rozdíl v obsahu chlorofylu (a, b i celkového) mezi červencem a říjnem byl u smrků z AC CO2 větší než u smrků z EC CO2, interakce mezi vlivem koncentrace CO2 a dobou odběru však byla statisticky průkazný pouze u Chl b (Obr. 4.1, Tab. 4.2). Poměr Chl a/b od října do července signifikantně poklesl, koncentrace CO2 na jeho hodnotu neměla žádný průkazný vliv (Obr. 4.2, Tab. 4.2). Průkazný byl rozdíl mezi hodnotou poměru Car/Chl při jednotlivých odběrech, kdy jeho hodnota od července do října poklesla. Tento pokles byl průkazně větší u smrků z AC CO2 (Obr. 4.3, Tab. 4.2). Obsah pigmentů AC [mg pigmentu g -1 sušiny] 5 EC červenec říjen Chl (a+b) červenec říjen Chl a červenec Chl b říjen červenec říjen Car Obr. 4.1 Srovnání koncentrace pigmentů smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 v červenci a říjnu Zobrazené hodnoty představují průměrnou koncentraci pigmentu z 14 (červenec) či 15 (říjen) stromů v každé variantě (AC a EC). Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru (SE). Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab

52 Chl a /b AC 3,5 EC Obr. 4.2 Srovnání poměru koncentrace chlorofylu a a b smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2. Zobrazené hodnoty představují průměrný poměr Chl a/b z 14 (červenec) či 15 (říjen) stromů v každé variantě. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru (SE). Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab ,5 2 1,5 1 0,5 0 červenec říjen Car/Chl AC EC 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 červenec Obr. 4.3 Srovnání poměru koncentrace karotenoidů (Car) a chlorofylu (Chl) smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2. Zobrazené hodnoty představují průměrný poměr Car/Chl z 14 (červenec) či 15 (říjen) stromů v každé variantě. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru (SE). Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab říjen Chl (a+b) Chl a Chl b Chl a/b Car Car/Chl *** ** ns *** *** *** CO2 T ns ns *** *** * ns T ** *** ns ns CO2 *** * Tab. 4.2 Hladiny statistické významnosti rozdílů mezi obsahem a poměry obsahu fotosyntetických pigmentů smrku ztepilého rostoucího při stávající (AC) a zvýšené (EC) koncentraci CO2. CO2: koncentrace CO2 (AC a EC), T: měsíc odběru (červenec a říjen), CO2 T: jejich interakce. * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; ns: statisticky neprůkazný rozdíl. Hladina statistické významnosti byla vyhodnocena analýzou dvojného třídění s interakcí. 52

53 4.3 Vliv zvýšené koncentrace CO2 na aktivitu PS 1 a PS 2 Aktivita PS 1 a PS 2 vyjádřená jako množství vyprodukovaného či spotřebovaného O2 za sekundu v přepočtu na množství chlorofylu se průkazně nelišila mezi stromy z AC a EC CO2, průkazné rozdíly nebyly ani mezi jednotlivými odběry roku 2010 (Obr. 4.4, Obr. 4.5). Při vyjádření aktivity PS 1 a PS 2 jako množství vyprodukovaného či spotřebovaného O2 za sekundu v přepočtu na hmotnost sušiny byly rozdíly v aktivitě obou fotosystémů, a to jak v závislosti na koncentraci CO2, tak v závislosti na měsíci odběru statisticky průkazné. Aktivita obou fotosystémů byla vlivem EC CO2 nižší a v období mezi červencem a říjnem vzrostla. V červenci byla aktivita PS 2 nižší o 16,2 % v říjnu dokonce o 39,2 %. Výraznější pokles aktivity PS 2 od října do července vlivem EC CO2 však nebyl statisticky průkazný (Obr. 4.6, Tab. 4.3) Aktivita PS 1 byla u stromů rostoucích při EC CO2 v červenci nižší o 20,7% a v říjnu o 23 % oproti stromům z AC CO2 (Obr. 4.7, Tab. 4.3) A Aktivita PS 2 (chlorofyl) B AC EC Aktivita PS 2 (chlorofyl) Produkce O2 [mmol O2 kg-1 Chl s-1 ] AC EC srpen 2009 červenec 2010 říjen 2010 Obr. 4.4 Aktivita fotosystému 2 (PS 2) smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 vyjádřená jako množství O2 vyprodukovaného suspenzemi chloroplastů za sekundu v přepočtu na množství chlorofylu. A. srpen 2009, B. červenec a říjen Hodnoty představují průměrnou aktivitu 4 směsných vzorků (3-4 stromy na vzorek) z každé varianty. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Rozdíly porovnávané analýzou dvojného třídění s interakcí nebyly statisticky průkazné na hladině pravděpodobnosti p = 0,05. 53

54 Aktivita PS 1 (chlorofyl) Úbytek O2 [mmol O2 kg-1 Chl s -1] A AC EC B AC EC Aktivita PS 1 (chlorofyl) červenec 2010 srpen 2009 říjen 2010 Produkce O2 [mmol O 2 s -1 kg-1] sušiny] Obr. 4.5 Aktivita fotosystému 1 (PS 1) smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 vyjádřená jako množství O2 spotřebovaného suspenzemi chloroplastů za sekundu v přepočtu na množství chlorofylu. A. srpen 2009, B. červenec a říjen Hodnoty představují průměrnou aktivitu 4 směsných vzorků (3-4 stromy na vzorek) z každé varianty. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Rozdíly mezi aktivitami porovnávané analýzou dvojného třídění s interakcí nebyly statisticky průkazné na hladině pravděpodobnosti p = 0,05. 0,18 Aktivita PS 2 (sušina) AC EC 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 červenec 2010 říjen 2010 Obr. 4.6 Aktivita fotosystému 2 (PS 2) smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 vyjádřená jako množství O2 vyprodukovaného suspenzemi chloroplastů za sekundu v přepočtu na hmotnost sušiny v červenci a říjnu Hodnoty představují průměrnou aktivitu 4 směsných vzorků (3-4 stromy na vzorek) z každé varianty. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab

55 Aktivita PS 1 (sušina) Úbytek O2 [mmol O 2 s -1 kg-1 sušiny] 0,6 AC EC 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 červenec 2010 říjen 2010 Obr. 4.7 Aktivita fotosystému 1 (PS 1) smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 vyjádřená jako množství O2 spotřebovaného suspenzemi chloroplastů za sekundu v přepočtu na hmotnost sušiny v červenci a říjnu Hodnoty představují průměrnou aktivitu 4 směsných vzorků (3-4 stromy na vzorek) z každé varianty. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab. 4.3 PS 2 PS 1 T * * *** *** CO2 T ns ns CO2 Tab. 4.3 Hladiny statistické významnosti rozdílů mezi aktivitami fotosystémů smrku ztepilého rostoucího při stávající (AC) a zvýšené (EC) koncentraci CO2 vyjádřenými jako množství O2 vyprodukovaného či spotřebovaného suspenzemi chloroplastů v přepočtu na hmotnost sušiny. PS 2: fotosystém 2, PS 1: fotosystém 1, CO2: koncentrace CO2 (AC či EC), T: měsíc odběru (červenec či říjen), CO2 T: jejich interakce, * P < 0,05; *** P < 0,001; ns statisticky neprůkazný rozdíl. Hladina statistické významnosti byla vyhodnocena analýzou dvojného třídění s interakcí. 55

56 4.4 Vliv zvýšené koncentrace CO2 na hodnotu fluorescenčních a reflektančních indexů Zvýšená koncentrace CO2 neměla průkazný vliv na hodnotu indexu NDVI a PRI, jejich průkazný pokles byl však sledován od července do října (Obr. 4.8, Obr. 4.9, Tab. 4.4). EC CO2 průkazně snížila hodnotu FV/FM a QY. V červenci byl FV/FM nižší u EC oproti AC o 4% a v říjnu o 2,7% (Obr. 4.10, Tab. 4.4). Hodnota QY byla v červenci u stromů z EC oproti AC CO2 nižší o 11,3 % zatímco v říjnu byla o 0,5 % vyšší. U QY byl sledován průkazně vyšší nárůst hodnoty od července do října u smrků z EC CO2 oproti smrkům z AC CO2 (Obr. 4.11, Tab. 4.4). NDVI AC 0,8 EC 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 červenec říjen PRI AC 0,07 EC 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0 červenec říjen 56 Obr. 4.8 Průměrná hodnota indexu NDVI smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 v červenci a říjnu Zobrazené hodnoty představují průměr ze 120 měření (u každého z 15 stromů byla měřena hodnota NDVI na severně a jižně orientovaném výhonu, a to ve 4 opakováních) v každé variantě. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab Obr. 4.9 Průměrná hodnota indexu PRI smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 v červenci a říjnu Zobrazené hodnoty představují průměr ze 120 měření (u každého z 15 stromů byla měřena hodnota PRI na severně a jižně orientovaném výhonu, a to ve 4 opakováních) v každé variantě. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab. 4.4.

57 Obr Průměrná hodnota indexu FV/FM smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 v červenci a říjnu Zobrazené hodnoty představují průměr z 60 měření (u každého z 15 stromů byla měřena hodnota FV/FM na severně a jižně orientovaném výhonu, a to ve 2 opakováních) v každé variantě. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab AC FV/FM EC 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 červenec říjen QY 0,8 Obr Průměrná hodnota indexu QY smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 v červenci a říjnu Zobrazené hodnoty představují průměr ze 120 (v červenci) a 60 (v říjnu) měření (u každého z 15 stromů byla měřena hodnota QY na severně a jižně orientovaném výhonu, a to ve 4 resp. 2 opakováních) v každé variantě. Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Hladina statistické významnosti rozdílů je uvedena v Tab AC EC 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 červenec říjen NDVI PRI FV/FM QY CO2 ns ns T *** *** *** * CO2 T ns ns ns *** *** *** Tab. 4.4 Hladiny statistické významnosti rozdílů mezi průměrnou hodnotou fluorescenčních a reflektančních indexů smrku ztepilého rostoucího při stávající (AC) a zvýšené (EC) koncentraci CO2. CO2: koncentrace CO2 (AC či EC), T: měsíc odběru (červenec či říjen), CO2 T: jejich interakce, * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001; ns statisticky neprůkazný rozdíl. Hladina statistické významnosti byla vyhodnocena analýzou dvojného třídění s interakcí. 57

58 4.5 Ultrastruktura chloroplastů Po srovnání plochy přibližně mediánního řezu chloroplastem 25 náhodně zvolených chloroplastů každé varianty (AC, EC) byl sice sledován trend k větší ploše u chloroplastů smrků rostoucích při EC CO2, nicméně rozdíl nebyl průkazný. Při srovnání většího souboru dat, kdy byly započítány i výsledky Radochove et al. (nepublikováno), konkrétně hodnota plochy mediánního řezu 45 chloroplastů z AC CO2 a 44 chloroplastů z EC CO2, byla průměrná plocha mediánního řezu chloroplastem smrku z EC CO2 průkazně větší o 18,9 % (Obr. 4.12). Počet škrobových zrn a jejich plocha na řezu nebyly předmětem kvantitativní analýzy, jejich rozdíl však nebyl ve sledovaných chloroplastech patrný. V důsledku akumulace škrobu se sice některé chloroplasty jevily jako kulatější, sledováno bylo i prohýbání tylakoidů, nebyly však pozorovány výrazné rozdíly mezi variantami z různé koncentrace CO2 (Obr. 4.13, Obr. 4.14). Rozdíl podílu celkové plochy tylakoidů, plochy granálních tylakoidů a tylakoidů stromatálních na ploše řezu chloroplastu nebyl průkazný (ačkoli byl pozorován trend k většímu zastoupení granálních i stromatálních tylakoidů v EC CO2) (Obr. 4.15). Průkazný nebyl ani rozdíl mezi hodnotami poměru S/G (Obr. 4.16). Kvantitativní analýza zastoupení granálních a stromatálních tylakoidů tedy neprokázala žádný rozdíl mezi chloroplasty smrků z AC a EC CO2. Plocha mediánního řezu chloroplastem A 14 AC B EC [ m2] Plocha mediánního řezu chloroplastem AC EC * Obr Srovnání průměrné plochy mediánního řezu chloroplastem smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci (AC) a zvýšené koncentraci (EC) CO2 v červenci Znázorněné hodnoty představují průměr z A 25 chloroplastů (5 chloroplastů z každého z 5 různých stromů) v každé variantě B ze 70 chloroplastů z AC CO2 a 69 z EC CO2 v každé variantě (hodnoty plochy 45 resp. 44 chloroplastů poskytli se svolením Radochova et al. - nepublikováno). Chybové úsečky znázorňují střední chybu průměru. Rozdíly porovnávané pomocí jednovýběrového t-testu označené * byly statisticky průkazné na hladině pravděpodobnosti p = 0,05. 58

59 Obr Fotografie přibližně mediánních řezů chloroplastem smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při stávající koncentraci CO2. Obraz byl snímán na transmisním elektronovém mikroskopu. Tučná šipka ukazuje na škrobové zrno, přerušovaná na stromatální tylakoid a tečkovaná na granální tylakoidy. Úsečky znázorňují délku 1 m. 59

60 Obr Fotografie přibližně mediánních řezů chloroplastem smrku ztepilého (Picea abies L. Karst.) rostoucího při zvýšené koncentraci CO2. Obraz byl snímán na transmisním elektronovém mikroskopu. Tučná šipka ukazuje na škrobové zrno, přerušovaná na stromatální tylakoid a tečkovaná na granální tylakoid. Úsečky znázorňují délku 1 m. 60