Laboratoře AGEL a.s., klinické laboratoře, tel.: 800 700 701 Laboratoř imunologie a sérologie Revoluční 2214/35, Nový Jičín 741 01, tel.: 556 416 242-244 NEPŘÍMÁ IMUNOFLUORESCENCE Autoimunitní choroby jsou onemocnění, při kterém autoprotilátky nebo autoreaktivní T-lymfocyty reagují s endogenními antigeny s následným poškozením vlastních buněk a tkání. Autoimunitní onemocnění se dají zhruba rozdělit na systémová a orgánově specifická, hranice mezi těmito chorobami ale není ostrá. Celková incidence autoimunitních onemocnění v populaci je kolem 5%. Pro diagnostiku autoimunitních chorob se využívá zejména technika nepřímé imunofluorescence, kdy se prokazuje přítomnost autoprotilátek. Zde se na lidské protilátky, které reagovaly s příslušným antigenem, váží zvířecí imunoglobuliny označené fluorochromem. Fluorochrom je nízkomolekulární chemická substance, která absorbuje energii zprostředkovanou buď světlem tvořeným rtuťovou výbojkou nebo laserovým paprskem. Pro každý fluorochrom je stanovena optimální vlnová délka, při které je daný fluorochrom excitován a následně emituje světlo určené vlnové délky ve viditelném spektru. Nejčastěji používaný fluorochrom je FITC (Fluorescein IsoThioCyanát), který má absorpční maximum v oblasti 490 až 495 nm a emituje světlo o vlnové délce zhruba 520 nm v zelené oblasti spektra. Při hodnocení tkáně fluorescenčním mikroskopem pak nalezení typického fluorescenčního zbarvení (zeleného v případě FITC) značí přítomnost autoprotilátek. Jako zdroje antigenů se používá živočišná tkáň, nejčastěji se jedná o řezy z opičí nebo krysí tkáně. Stanovení autoprotilátek metodou nepřímé imunofluorescence představuje významnou, ne však rozhodující součást diagnostiky autoimunitních imunopatologických nemocí. Základem diagnostiky těchto stavů je především podrobné klinické vyšetření, doplněné o další laboratorní postupy. Nález autoprotilátek by však měl být důvodem pro sledování takového pacienta. ANTINUKLEÁRNÍ PROTILÁTKY (ANA) 1. KLINICKÝ VÝZNAM Identifikace ANA (antinuclear autoantibodies, autoprotilátky proti buněčnému jádru) je důležitou součástí klinické medicíny a klinické imunologie. Využívá se k hodnocení systémových a orgánově specifických autoimunitních onemocnění. Antinukleární a anticytoplazmatické protilátky se objevují u mnoha nemocí viz. tabulka č.1. (dle Bradwell et. al., 1995). Pozitivní výsledky se vyskytují také u starších lidí, těhotných žen, dále u pacientů s nádorovým onemocněním, chronickou infekcí a u mnoha dalších vážnějších onemocnění. Autoprotilátky se objevují měsíce nebo i roky před propuknutím vlastní nemoci. Přes důležitost informace musí být ANA interpretována v kontextu klinických dat.
Nemoci spojené s ANA Nemoc Chronický discoidní lupus 5-50 Chronická infekce 10-50 Poly-/dermatomyositis 30-40 indukovaný léky <50 Feltyho syndrom 95-100 Zdravá populace <5 Zdraví příbuzní pacientů 25 Juvenilní arthritis 15-30 Lupoidní hepatitis 95-100 Neonatal lupus syndrom <90 Neoplasma 10-30 Staří lidé <30 Polyarteritis nodosa 15-25 Těhotenství 5-10 Primární biliární cirhóza 95-100 Revmatická arthritis >95 Revmatická horečka <5 Sjögrenův syndrom >95 Systematický lupus erythematodes 95-100 Systémová skleróza (sklerodermie) >90 Smíšená pojivová nemoc (MCTD) 100 CREST syndrom 95 Chronická aktivní hepatitis 75 Autoimunní trombocytopenická purpura 60 Myasthenia gravis 50 Autoimunní hemolytická anémie 50 Autoimunní onemocnění štítné žlázy 30 Akutní lymfatická leukémie 25 Infekční mononukleóza 50 Uveitis 60 % Incidence Hodnocení fluorescenčních metod Negativní N Není pozorována žádná fluorescence očekávaných struktur v preparátu. Hraniční +/- Nezřetelná, ale patrná fluorescence očekávaných struktur. Slabě pozitivní + Zřetelná, ale slabá fluorescence očekávaných struktur. Pozitivní ++ Zřetelná, jasná, fluorescence očekávaných struktur. Silně pozitivní +++ Velmi silná fluorescence, která může někdy způsobovat i splývání očekávaných struktur ( např. zrnění ).
IMUNOFLUORESCENČNÍ OBRAZY (STRUKTURY) HEp-2 BUNĚK I. Fluorescenční obrazy autoprotilátek proti jaderným strukturám 1) Homogenní jaderná fluorescence (plazma) Klinika:, indukován léky, revmatická arthritis, juvenilní chronická arthritis, systémová skleróza Antigeny: protilátky proti dsdna, histonům ([H2A-H2B]-DNA komplex), Ku. Pozn. intenzivní jemně zrnitá fluorescence (př. Scl-70 a PM-Scl) se může jevit jako homogenní. 2) Zrnitá (skvrnitá) fluorescence (někdy nelze rozlišit podtyp) 2a) Nukleární matrix (jaderná fluorescence s velkými skvrnami) Klinika: MCTD, a další chronické revmatické nemoci Antigeny: skupina heterogenních ribonukleárních proteinů hnrnp 26 kda a 70kDa. 2b) Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Klinika: Antigeny: U1-snRNP nebo Sm protein 2c) Klinika:, Sjögrenův syndrom, sklerodermie, subakutní kožní lupus Antigeny: SS-A(Ro), SS-B (La), polymerasa II, III 2d) Různorodá zrnitá fluorescence (anti-pcna) Klinika: 1-3% pacientů s proliferativní glomerulonefritis a lymfoproliferativní onemocnění. Antigeny: DNA-polymerása delta aux. protein (cyclin) 3) Centromery (centromerová fluorescence) Klinika: CREST syndrom Antigeny: protilátky proti třem proteinům CENT-B, A, C (80, 17, 140 kda) 4) Jaderné tečky (body) 4a) Ojedinělé jaderné tečky (body) Klinika: autoimunitní a virové jaterní nemoci (PBC, chronická aktivní hepatitis) Antigeny: 80 kda jaderný protein + p80-coilin obsahující snrnps 4b) Četné jaderné tečky (body) Klinika: 6% PBC se Sjögren. syndromem, méně často s Antigeny: jaderný protein (100 kda) 5) Fluorescenční obrazy jadérka (někdy nelze rozlišit podtyp) 5a) Homogenní jadérka Klinika: 50% polymyositis sklerodermie, primární plícní hypertense se sklerodermií Antigeny: PM-Scl, Ku 5b) Chuchvalcovitá jadérka Klinika: systémová skleróza, nemoc příčně pruhovaných svalů, plícní hypertense Antigeny: fibrilarin
5c) Zrnitá (tečkovitá) jadérka Klinika: 30% systémová skleróza Antigeny: RNA polymerasa I 6) Fluorescenční obrazy dělícího aparátu (vzácné struktury) není ANA 6a) Centrioly Klinika: nejčastěji při nespecifických revmatických nemocích a po virových syndromech Antigeny: autoprotilátky reagují s centriolovým proteinem a heat shock proteinem (48 kda) 6b) Póly dělicího vřeténka (NuMA) Klinika: nespecificky při, Sjögrenův syndrom, CREST, MCTD Antigeny: 250 kda protein 6c) Dělící tělísko (Midbody, MSA-2) Klinika: systémová skleróza, Raynaudův fenomén 6d) CENP-F (Nsp-II, MSA-3) Klinika: tumory plic Antigeny: neznámý 6e) Tubulin Klinika: vzácně při infekční mononukleóze, alkoholová cirhóza 6f) Vlákna dělícího vřeténka 7) Fluorescenční obrazy na jaderné membráně 7a) Homogenní jaderná membrána Klinika: smíšené chronické autoimunitní nemoci Antigeny: polypeptid lamin A, B, C (74, 68, 60 kda) 7b) Póry v jaderné membráně Klinika: vzácně při PBC, polymyositis Antigeny: komplex membránových proteinů, hlavní integrální glykoprotein (210 kda) II. Fluorescenční obrazy v cytoplazmě (není pozitivita ANA!) A. Organely 1) Jemně zrnitý cytoplazmatický obraz (Jo-1) Klinika: 20-40% agresivní polymyositis ve spojitosti s intersticialním plícním onemocněním a arthralgiemi, protilátky jsou velmi specifické (>95%) a koncentrace koreluje s aktivitou nemoci Antigeny: histidyl-trna syntasa, 2) Difúzní cytoplazmatický obraz (ribozomy) Klinika: 10-15%, neuropsychiatrické symptomy, ledvinové nemoci Antigeny: ribosomální P fosfoprotein
3) Mitochondriální obraz Klinika: PBC, sklerodermie Antigeny: mnoho mitochondriálních antigenů, nejčastěji M2 (pyruvát dehydrogenásový komplex) 4) Endoplazmatické retikulum Klinika: léky indukována hepatitis Antigeny: cílový antigen zahrnuje CYP-450 5) Golgiho aparát Klinika:, Sjögrenův syndrom a další systémové chronické revmatické nemoci Antigeny: např. periferní membránový protein (230 kda) 6) Lysozomální a/nebo peroxizomální obraz Klinika: Bez známých nebo jasných klinických asociací B. Cytoskelet (slabá fluorescence cytoskeletu - při nejasné a slabé fluorescenci) 7) Aktin Klinika: důležitá protilátka při chronické aktivní hepatitis Antigeny: aktin (34 kda) 8) Vimentin Klinika: chronické revmatické a jaterní nemoci (>90%),, rakovina, hematologické poruchy Antigeny: vimentin 9) Cytokeratin Klinika: revmatická arthritis, chronická aktivní hepatitis, Antigeny: cytokeratiny (8, 18, 19) 10) Tropomyosin Klinika: revmatická arthritis, chronická aktivní hepatitis, Antigeny: Tropomyosin 11) Vinkulin Klinika: nespecifický při mnoha autoimunitních a chronických nemocích Antigeny: vinkulin (117 kda) 12) Desmin Klinika: bez známých nebo jasných klinických asociací
ASOCIACE NEMOCÍ A VÝSKYTU AUTOPROTILÁTEK Protilátky při dsdna 60-90% ssdna 70-95% Histony 95% Sm 20-40% U1-snRNP 30-40% SS-A 20-60% SS-B 10-20% Ribosomal RNP 10% PCNA (cyklin) 3% Ku 10% HnRNP protein A1 Negativní Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Difúzní (ribozomální) cytoplazmatický obraz s homogenní Různorodá zrnitá fluorescence Nukleární matrix (jaderná fluorescence s velkými skvrnami) Protilátky při systémové skleróze Antigen DNA topoizomerasa 1 (Scl-70) Centromery PM-Scl RNA-polymerasa 1 RNA-polymerasa 11 U1-snRNP Fibrilarin Ku NOR Mitochondrie Midbody Centromery (Centromerová fluorescence) Zrnitá (skvrnitá) fluorescence jadérek Zrnitá (skvrnitá) fluorescence Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Chuchvalcovitá fluorescence jadérek Zrnitá (skvrnitá) fluorescence Mitochondriální obraz (slabá cytoplazmatická fluorescence) Dělící tělísko (MSA-2) Protilátky při Sjögrensově syndromu SS-A 40-95% SS-B 40-95% Ku NOR p80-colin NuMA Ki/SL Zrnitá (skvrnitá) fluorescence jadérek Jaderné tečky (body) Póly dělícího vřeténka Zrnitá (skvrnitá) fluorescence
Protilátky při poly-/dermatomyositis trna-synthasa (Jo-1, PL-7, PL-12, EJ, KJ) 25-35% PM-Scl 50-70% Ku 50% Mi-2 5% SRP SS-A SS-B Jemně zrnitý cytoplazmatický obraz (fluorescence) Jo-1 Zrnitá (skvrnitá) fluorescence Difúzní cytoplazmatický obraz Protilátky při revmatické arthritis Histony 15-50% dsdna RNP SSA/SS-B Cytokeratin Tropomyosin Hrubě zrnitá (skvrnitá) fluorescence Cytokeratin (slabá fluorescence cytoskeletu) Tropomyosin (slabá fluorescence cytoskeletu) Protilátky při jaterních nemocích Mitochondrie Aktin (hladká svalovina) Laminy Nuclear pore complex Coilin p80 sp-100 Tropomyosin Vimentin Mitochondriální obraz (slabá cytoplazmatická fluorescence) Aktin (slabá fluorescence cytoskeletu) Jaderná membrána Póry v jaderné membráně Jaderné tečky (body) Četné jaderné tečky (body) Tropomyosin (slabá fluorescence cytoskeletu) Vimentin (slabá fluorescence cytoskeletu)
VÝSKYT AUTOPROTILÁTEK PROTI BUNĚČNÉMU JÁDRU U JEDNOTLIVÝCH NEMOCÍ Antigen Nemoc Prevalence (%) ds DNA 60-90 ss DNA indukovaný léky MCTD Poly-/dermatomyositis Sklerodermie, Sjögrenův syndrom, revmatická 70-95 60 20-50 40-50 8-14 arthritis RNA 50 Histony 4-6-S-RNA, skleroderma, Sjögrenův syndrom indukovaný léky Revmatická arthritis 65 95 30-70 15-50 U1-nRNP MCTD Revmatická arthritis 95-100 30-40 3 Sm 20-40 SS-A (Ro) SS-B (La) Sjögrenův syndrom Neonatal lupus syndrom Sjögrenův syndrom 40-95 20-60 100 40-95 10-20 Fibrilarin Progresivní systémová skleróza, difúzní forma 5-10 RNA-Polymerasa I Progresivní systémová skleróza, difúzní forma 4 PM-Scl (PM1) Poly-/dermatomyositis Progresivní systémová skleróza, difúzní forma 50-70 5-10 Centromery Progresivní systémová skleróza, difúzní forma 80-95 Scl-70 Progresivní systémová skleróza, difúzní forma 25-75 Cyklin (PCNA) 3 RANA Revmatická arthritis 90-95 Ku 10 Poly-/dermatomyositis, progr. systémová skleróza >50 Mi-1, Mi-2 Dermatomyositis 5-10