Vybrané imunologické metody

Transkript

1 Vybrané imunologické metody Ing. Petra Šandová Klinická imunologie a alergologie laboratoř ÚKBLD a 1. LF UK VFN

2 Laboratorní imunologická vyšetření Humorální imunita proteiny krevního séra (Ig, C, CRP), IK paraproteiny, kryoglobuliny specifické IgE, ECP autoprotilátky Buněčná imunita subpopulace lymfocytů - imunofenotypizace intracelulární cytokiny fagocytóza HLA B27

3 Laboratorní imunologická vyšetření Periferní krev Humorální imunita - sérum, plazma Buněčná imunita - plná krev s antikoagulačním činidlem Tělní tekutiny - likvor, BAL, punktáty, výpotky

4

5 Indikace laboratorních vyšetření v klinické imunologii Určení diagnózy Diferenciální diagnostika Potvrzení diagnózy Monitorování terapie Screening rodin

6 Imunologické laboratorní metody 1. volby Hladiny imunoglobulinů - IgG, IgA, IgM event. IgE Cirkulující imunokomplexy metodou PEG C3, C4 složka komplementu Antinukleární protilátky (ANAb) metodou NIF ENA screening Stanovení povrchových znaků lymfocytů (CD3, CD4, CD8), B lymfocytů (CD19, CD20), NK buněk (CD3-CD16+56+) U dětí vyšetření fagocytózy

7 Imunologické laboratorní metody 1. volby Součástí kompletního imunologického vyšetření je vždy: kompletní krevní obraz t.j. včetně diferenciálního rozpočtu leukocytů FW (ev. CRP zejména u dětí)

8 Imunologické laboratorní metody 2. volby Autoprotilátky orgánově nespecifické (dsdna, ENA typizace, ANCA, APLA, SMAb, AMAb a další) Orgánově specifické protilátky (anti-ttg, ASCA, anti-tg, anti-tpo, LKM a další) Další ukazatele buněčné imunity např. znaky aktivace T lymfocytů, adhezívní molekuly Funkční testy T a B lymfocytů (blastická transformace) Vyšetření fagocytárních funkcí včetně oxidativního vzplanutí granulocytů

9 Imunologické laboratorní metody 2. volby Stanovení specifických IgE ECP C1 inhibitor, C1inh funkční test Stanovení sekrečního IgA Stanovení podtříd IgG1, IgG2, IgG3, IgG4

10 Principy laboratorních imunochemických metod Antigen + protilátka imunitní komplex detekce protilátky pomocí antigenu detekce antigenu pomocí protilátky Principy detekce přímá detekce nepřímá detekce detekce založená na značení antigenu nebo protilátky

11 Přímá detekce Ag nebo Ab Imunonefelometrie Imunoturbidimetrie Radiální imunodifúze Imunoelektroforéza Protisměrná imunoelektroforéza Imunofixační elektroforéza

12 Imunonefelometrie Ig, složky komplementu, CRP, CIK-C1q Měření světla rozptýleného na komlexech Ag-Ab

13 Imunonefelometrie Dade Behring BN II

14 Radiální imunodifúze C1q Kruhová difúze roztoku Ag z kruhové jamky do vrstvy gelu s obsahem protilátky

15 CH100 Funkční test stanovení celkové hemolytické aktivity komplementu V gelu ovčí ery s navázanou Ab proti ovčím ery. Séra se pipetují do aplikačních jamek Komplement se aktivuje při 37 0 C (klasická cesta) Lýza ery - projasnění

16 Protisměrná imunoelektroforéza ENA screen Migrace antigenu a protilátky při elektroforéze proti sobě

17 Imunofixační elektroforéza Gamapatie Elektroforetická separace proteinů na gelu Imunoprecipitace s monospecifickými antiséry

18 Nepřímá detekce Ag nebo Ab Latex fixační test Nepřímá (pasivní) hemaglutinace Aglutinační inhibiční test Komplement fixační reakce

19 Latex fixační test RF Latexová částice Ab + Ag aglutinace

20 Nepřímá hemaglutinace Protilátky proti zona pellucida Antigen je adsorbován na erytrocytech Protilátka je přítomna ve vzorku V případě nepřítomnosti hledané protilátky nedojde k hemaglutinaci

21 Detekce založená na značení antigenu nebo protilátky Enzymy EIA Flurochromy FIA Chemiluminiscenční látky CLIA Radionuklidy - RIA

22 Enzymová imunoanalýza Stanovení autoprotilátek ELISA enzymová imunoanalýza na pevné fázi

23 Enzymová imunoanalýza Imunoblotting WB Dot blot ENA typizace Anti-gangliosidy AMAb II Jaterní blot

24 Protilátky proti extrahovatelnému nukleárnímu antigenu Anti-SSA/Ro Anti-SSB/La Anti-Sm (B B) Anti-Sm (D) Anti-Scl 70 Anti-RNP Anti-Pm-Scl Anti-NuMA Anti-Ku Anti-Jo Anti-histon ACA SLE, Sjögrenův syndrom SLE, Sjögrenův syndrom SLE SLE systémová sklerodermie smíšená choroba pojiva SLE polymyositida, dermatomyositida Sjögrenův syndrom, SLE, RA sklerodermie dermatomyositida, polymyositida léky indukovaný SLE, SLE, RA CREST syndrom, sklerodermie

25 Fluorescenční imunoanalýza Stanovení autoprotilátek Nepřímá imunofluorescence

26 Fluorescenční imunoanalýza Typy substrátů Tkáňovéřezy krysí - LKS Tkáňovéřezy opičí - ovaria, ledviny, mozeček, nadledvinky, endomýzium Suspenze - prvok Crithidia luciliae - lidské granulocyty Tkáňové kultury - HEp-2, HUVEC

27 Tkáňovéřezy krysí AMAb GPCAb SMAb

28 Tkáňovéřezy opičí Protilátky proti bazální membráně glomerulů (GBM)

29 Suspenze: lidské granulocyty canca panca

30 Suspenze: prvok Crithidia lucilae Protilátky proti dsdna

31 Tkáňové kultury: HEp-2 buňky Antinukleární protilátky (ANAb)

32 Antigenní cíle v buňce Antigenní cíle v buňce Jaderné autoantigeny polynukleotidy histony ribonukleoproteiny antigeny jadérek centroméra další antigeny Antigeny asociované s dělením buňky centriola dělící vřeténko separační zóna buňky Orgánově nespecifické antigeny cytoplazmy buněčné organely antigeny cytoskeletu další antigeny Jaderná membrána s póry

33 Průtoková cytometrie Technika umožňující kvantitativně analyzovat velké množství částic (např. buněk) v suspenzi Buňky lze rozlišit dle jejich velikosti (FSC), granularity (SSC), obsahu DNA, značením monoklonálními Ab,

34 Průtoková cytometrie SSC Eosinofily Neutrofily Monocyty Lymfocyty a Bazofily Trombocyty, erytrocyty a debris FSC

35 Průtoková cytometrie CD19 PE CD3 FITC

36 Průtoková cytometrie Průtokový cytometr BD FACS Canto

37 Chemiluminiscenční imunoanalýza Stanovení specifických IgE, ECP Immulite 2000 Alkalická fosfatáza - detekce tímto enzymem vyvolaného luminiscenčního záření

38 Chemiluminiscenční imunoanalýza Stanovení specifických IgE Advia Centaur Acridium ester emitace světla při oxidaci H 2 O 2 v alkalickém prostředí

39 Kryoglobuliny Imunoglobuliny precipitující v chladu Speciální odběr 3 typy: Typ I. monoklonální kryoglobuliny, paraproteiny IgG, IgM, IgA Typ II. smíšené kryoglobuliny, kombinace paraproteinu s polyklonálním Ig Typ III. polyklonální imunoglobuliny

40 Děkuji za pozornost!