Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU KADMIA A OLOVA METODOU AAS-ETA 1 Rozsah a účel Tato metoda specifikuje podmínky pro stanovení kadmia a olova v krmivech. Mez stanovitelnosti metody závisí na matrici vzorku stejně jako na použitém přístroji, obvykle dosahované hodnoty jsou 0,05 mg/kg pro kadmium a 0,5 mg/kg pro olovo. 2 Princip Kadmium a olovo se stanoví v mineralizátu vzorku po tlakovém rozkladu metodou atomové absorpční spektrometrie - elektrotermické atomizace. 1 V mineralizátech lze stanovit i další prvky (např. As, Cu, Co a Mo). 2 Mineralizaci vzorku lze provést i jinými způsoby než tlakovým rozkladem. 3 Chemikálie Používají se chemikálie analytické čistoty, pokud není uvedeno jinak. 1 Kyselina dusičná, HNO3, ultračistá, koncentrovaná, obsah nejméně 65 % (w/w), c(hno3) = 14,4 mol/l, hustota přibližně ρ(hno3) = 1,40 g/ml. 2 Kyselina dusičná, HNO3, zředěná 1 : 1 (v/v). Příprava: Smísí se 1 objem kyseliny dusičné (1) a 1 objem vody. 3 Kyselina dusičná zředěná, HNO3, roztok 5% (w/w), ρ(hno3) = 1,0257 g/ml. Příprava: Do vhodné nádoby se odváží 923 g ultračisté vody (10), opatrně se přidá 77 g kyseliny dusičné (1) a obsah se důkladně promíchá. Kyselina se uchovává ve vhodné pečlivě vyčištěné nádobě. 4 Peroxid vodíku, čistoty Suprapur, koncentrace nejméně 30 %, (w/w). 5 Standardní zásobní roztoky prvků Cd, Pb, o koncentraci c = 1000 mg/l. Mohou se používat zásobní jedno- i více- prvkové roztoky v odpovídající kyselině, doporučuje se používat certifikované roztoky. Zásobní standardní roztok je možno používat maximálně 1 rok.
Strana 2 7 Modifikátory matrice. Modifikátor A: Vodný roztok 1% dihydrogenfosforečnanu amonného a 0,6 g/l dusičnanu hořečnatého. Příprava: Do 10ml odměrné baňky se naváží 0,1000 g dihydrogenfosforečnanu amonného s přesností na 0,1 mg, přidají se 3,0 ml roztoku dusičnanu hořečnatého, c = 2 g/l. Roztok se doplní po značku ultračistou vodou (9) a promíchá. Modifikátor B: Vodný roztok 15 g/l palladia a 10 g/l dusičnanu hořečnatého. Příprava: Ve 100ml odměrné baňce se rozpustí 0,259 g hexahydrátu dusičnanu hořečnatého a baňka se doplní ultračistou vodou (9) po značku. Smísí se dva díly roztoku dusičnanu hořečnatého s jedním dílem roztoku dusičnanu paladnatého (c = 10 g/l). Tento směsný roztok obsahuje v 1 ml 1,5 mg Pd a 1,0 mg Mg(NO3)2. 8 Argon, čistota vyšší než 99,99 %. 9 Voda (ultračistá) nebo čistoty stupně 2 podle ČSN EN ISO 3696. 3 Používají se pouze chemikálie se známou čistotou, kvalita vody musí odpovídat stupni 2 podle ČSN EN ISO 3696. 4 Je vhodné použít kyselinu dusičnou (ultračistá kyselina dusičná) přečištěnou podvarovou destilací. 5 Mohou být také použity standardní zásobní roztoky s jinou koncentrací než 1000 mg/l. 6 Kombinace Pd a Mg(NO3)2 je považována za univerzální modifikátor, mohou však být použity i jiné modifikátory. 7 Roztoky modifikátorů se doporučuje používat nejvýše po dobu jednoho týdne. 8 Pro přípravu roztoků modifikátorů se mohou použít komerčně připravené roztoky, např. roztok dusičnanu hořečnatého c = 2 g v 1000 ml 0,2% kyseliny dusičné; roztok Pd(NO3)2 o koncentraci 10 g/l (Analytika Praha). 9 Sklo umyté v myčce se dále čistí takto: Sklo se naplní 5% kyselinou dusičnou (3) a nechá se máčet nejlépe přes noc. Poté se kyselina vylije, sklo se nechá okapat, vypláchne se 3 ultračistou vodou (9) a nechá se usušit. Sklo se přechovává suché v plastových uzavíratelných boxech. 4 Přístroje a pomůcky 1 Laboratorní mlýnek vhodný pro úpravu na velikost částic 1 mm a 0,1 mm. 2 Analytické váhy, s přesností nejméně 1 mg. 3 Zařízení na tlakový rozklad.
Strana 3 4 Atomový absorpční spektrometr s grafitovou kyvetou a korekcí pozadí, vybavený autosamplerem. 5 Dutokatodové výbojky nebo jiné vhodné zdroje záření (EDL-lampy, ultralampy) pro stanovované prvky. 6 Grafitové kyvety, pyrolyticky potažené a nejlépe s platformou z pyrolytického uhlíku. 7 Uzavíratelné plastové nádobky o objemu asi 100 ml. 8 Odměrné baňky o objemu 100 ml, 200 ml, 500 ml a 1000 ml. 9 Elektrická topná deska s kontrolou teploty a zaručeným rovnoměrným ohřevem na celé ploše. Případně mineralizační blok pro tuby o objemu nejméně 200 ml. 10 Spalovací kelímky z platiny, křemene nebo porcelánu. 11 Elektrická muflová pec s kontrolou teploty v rozmezí (450 ± 20) C a s programovatelným teplotním nárůstem. 12 Kádinky o objemu 100 ml, 250 ml, případně mineralizační tuby o objemu 200 ml až 400 ml. 10 U zařízení na tlakový rozklad musí být testována bezpečnost nádob na tlakový rozklad. Nádoby musejí být vyrobeny z kyselinovzdorného materiálu a nesmějí kontaminovat vzorek. Je vhodné použít dělené křemenné držáky, perfluoro-ethylen-propylenové (FEP) držáky nebo perfluoro-alkoxy (PFA) držáky. Křemen se doporučuje proto, že jeho rozkladná teplota leží nad hodnotou 230 C a umožňuje snadnější vyčištění v případě stopové analýzy. 5 Postup 5.1 Mineralizace vzorku 5.1.1 Obecně Pokud je zkušební vzorek minerální sloučenina nebo obsahuje fosfáty, provádí se obvykle tlakový rozklad (5.1.2). Alternativně se může použít postup podle 5.1.4. Pokud zkušební vzorek obsahuje organické látky a neobsahuje fosfáty, ze kterých by vznikaly při spalování nerozpustné produkty, postupuje se podle 5.1.3. Alternativně se může použít postup tlakového rozkladu (5.1.2). 5.1.2 Tlakový mikrovlnný rozklad Počáteční navážka upraveného vzorku se volí podle kapacity rozkladné nádoby a přesně se dodržují pokyny výrobce. Podle typu zařízení a použitých rozkladných nádob se určí teplota a doba rozkladu.
Strana 4 Příklad středotlakého mikrovlnného rozkladu pro zařízení MWS-3 Do teflonové tlakové nádobky se diferenčně naváží asi 0,3 g vzorku s přesností 0,0001 g. Ke vzorku se přidá 5 ml koncentrované kyseliny dusičné (1) a po 30 min se přidá 1 ml peroxidu vodíku (4). Po dalších 30 min stání se teflonové nádobky uzavřou a vloží do mineralizačního zařízení. Parametry teplotního rozkladu jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 1. Parametry teplotního rozkladu. Teplota ( C) 145 180 100 100 Ramp ( C/min) 10 5 1 1 Doba (min) 5 10 10 10 Po skončení mineralizačního programu se teflonové nádobky vyjmou a ponechají vychladnout na laboratorní teplotu. Obsah nádobek se kvantitativně převede do 100ml odměrných baněk a doplní ultračistou vodou (9) po značku. Obsah odměrných baněk se zfiltruje do plastových lahviček, které se uzavřou. Zároveň se provede slepý pokus se všemi činidly a stejným postupem, ale bez navážky vzorku. Mineralizát se příslušně naředí roztokem kyseliny dusičné (3) a dále se postupuje podle 5.3. Příklad vysokotlakého mikrovlnného rozkladu pro zařízení MWS-3 Do rozkladné vysokotlaké nádobky se naváží diferenčním způsobem asi 0,5 g vzorku s přesností 0,0001 g. Ke vzorku se přidá 8 ml koncentrované kyseliny dusičné (1) a 2 ml peroxidu vodíku (4). Nádobky se ponechají stát asi 20 min a po této době se nádobky uzavřou a vloží do mikrovlnného zařízení. Parametry teplotního rozkladu jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2. Parametry teplotního rozkladu. Stupeň rozkladu 1 2 3 4 Maximální teplota rozkladu (º C) 150 190 100 100 Doba, za kterou je dosažena max. teplota (min) 5 5 2 2 Doba, po kterou probíhá rozklad (min) 4 8 10 10 Po skončení mineralizace se nádobky vyjmou z mineralizačního zařízení a nechají na vzduchu zchladit. Obsah nádobek se kvantitativně převede do 25ml odměrných baněk, po vytemperování se doplní po značku ultračistou vodou (9). Po promíchání se obsah odměrných baněk zfiltruje do plastových lahviček, které se uzavřou.
Strana 5 Zároveň se provede slepý pokus se všemi činidly a stejným postupem, ale bez navážky vzorku. Mineralizát se příslušně naředí roztokem kyseliny dusičné (3) a dále se postupuje podle 5.3. 5.1.3 Mineralizace na suché cestě s následnou extrakcí 5% HNO3 Do spalovacího kelímku se naváží asi 5 g připraveného zkušebního vzorku s přesností 1 mg, vloží se do studené pece a teplota se postupně zvyšuje (50 ºC/h) až na 450 ºC. Vzorek se spaluje při této teplotě, dokud se nezíská bílý nebo šedý popel (malé množství uhlíku neruší). Popel se přenese do 250ml kádinky a přidá se 40 ml zředěné kyseliny dusičné (2) a asi 100 ml ultračisté vody (9). Kádinka se přikryje hodinovým sklem a obsah se vaří 30 min na varné desce. Po skončení varu se roztok nechá zchladnout a potom se převede do 250ml odměrné baňky. Kádinka a hodinové sklo se opláchnou několikrát ultračistou vodou (9) do této odměrné baňky. Po vytemperování se odměrná baňka doplní ultračistou vodou (9) po značku. Obsah se promíchá a filtruje se přes skládaný filtr do suché uzavíratelné nádoby z vhodného plastu (7). První podíl filtrátu se použije na vypláchnutí nádoby. Pokud se vlastní stanovení neprovádí ihned je nutno nádobu s filtrátem uzavřít. Zároveň se provede slepý pokus stejným postupem se všemi činidly, ale bez navážky vzorku. 11 Vzorky s vysokým obsahem minerálních látek nelze spalovat v platinových kelímcích. 5.1.4 Mineralizace 5% HNO3 (w/w) Pro stanovení obsahu olova nebo kadmia se tento postup používá v případě, že celkové obsahy Pb nebo Cd v mineralizátu připraveném podle 5.1.2 nebo 5.1.3 překročí hodnoty uvedené v právních předpisech. Pro konečné hodnocení případného překročení stanovených limitů se použijí výsledky po rozkladu 5% kyselinou dusičnou. Do 250ml kádinky se s přesností na 1 mg naváží asi 2 g upraveného vzorku, přidá se 85 ml kyseliny dusičné (3), kádinka se zakryje hodinovým sklem a umístí se na topnou desku. Zahřívá se 30 min od dosažení varu. Po vytemperování na laboratorní teplotu se opláchne hodinové sklo kyselinou dusičnou (3) do kádinky, obsah kádinky se převede do 100ml odměrné baňky a doplní se kyselinou dusičnou (3) po značku. Obsah odměrné baňky se pečlivě promíchá a filtruje se do suché uzavíratelné nádoby z vhodného plastu. Prvním podílem filtrátu se vypláchne jímací nádobka. Zároveň se provede nejméně jeden slepý pokus se všemi činidly a stejným postupem, ale bez navážky vzorku. Dále se postupuje podle 5.3.
Strana 6 12 Mineralizaci je možné provádět v mineralizačních tubách o dostatečném objemu, případně v mineralizačních tubách s vyznačeným objemem 100 ml. V tomto případě se po ukončení mineralizace a vytemperování na laboratorní teplotu mineralizační tuba doplní po značku roztokem kyseliny dusičné (3) a obsah se filtruje výše popsaným postupem. Je třeba počítat s tím, že přesnost objemu mineralizačních tub je nižší než přesnost objemu odměrných baněk. Tato chyba je však v porovnání s celkovou chybou stanovení zanedbatelná. 5.2 Kalibrace přístroje Pro stanovení obsahu kadmia a olova se používá externí kalibrace pomocí kalibračních roztoků, které se připraví vhodným ředěním základních standardních roztoků (5) tak, aby kalibrační křivka pokrývala lineární rozsah měření pro daný prvek nejméně pěti body včetně nulové koncentrace. Na ředění se používá roztok kyseliny dusičné (3). Matrice kalibračních roztoků musí být co nepodobnější matrici analyzovaných mineralizátů vzorků. Pokud je měření ovlivňováno neznámou matricí, je vhodné nahradit externí kalibraci metodou standardního přídavku. 5.2.1 Příklad přípravy kalibračních křivek Kalibrační křivka pro kadmium a olovo Ze základního standardního roztoku (5) se postupným ředěním připraví pracovní standardní roztoky pro přípravu kalibračních roztoků (viz. tab 3 a tab 4). Na ředění se používá roztok kyseliny dusičné (3). Pracovní standardní roztok I pro kadmium a olovo Do 100ml odměrné baňky se odpipetuje 5 ml základního standardního roztoku (5), doplní se roztokem kyseliny dusičné (3) po značku a promíchá. 1 ml roztoku obsahuje 50 μg prvku Pb a 50 μg Cd. Pracovní standardní roztok II pro kadmium a olovo Do 100ml odměrné baňky se odpipetuje 5 ml pracovního standardního roztoku I, doplní se roztokem kyseliny dusičné (3) po značku a promíchá. 1 ml roztoku obsahuje 2,5 μg Pb a 2,5 μg Cd. Pracovní standardní roztok III pro kadmium a olovo Do 500ml odměrných baněk se odpipetuje 20 ml příslušného pracovního standardního roztoku II, doplní se roztokem kyseliny dusičné (3) po značku a promíchá. 1 ml roztoku obsahuje 0,1 μg Pb a 0,1 μg Cd.
Strana 7 Pracovní standardní roztok IV pro kadmium (pro Pb není tato nízká koncentrace potřebná) Do 500ml odměrné baňky se odpipetuje 50 ml příslušného pracovního standardního roztoku III, doplní se roztokem kyseliny dusičné (3) po značku a promíchá. 1 ml roztoku obsahuje 0,01 μg Cd. Tabulka 3. Kalibrační křivka pro měření kadmia. Standard č. 0 1 2 3 4 5 Objem pracovního standardního roztoku IV (ml) 0 5 5 10 20 30 Objem odměrné baňky (ml) 100 200 100 100 100 100 Koncentrace Cd (μg/l) 0 0,25 0,5 1 2 3 Tabulka 4. Kalibrační křivka pro měření olova. Standard č. 0 1 2 3 4 5 Objem pracovního standardního roztoku III (ml) 0 1 5 10 20 30 Objem odměrné baňky (ml) 100 100 100 100 100 100 Koncentrace Pb (μg/l) 0 1 5 10 20 30 13 Pro přípravu kalibrační křivky je možné použít ředění zásobního standardního roztoku o vhodné koncentraci v autosampleru. 5.4 Postup měření 5.4.1 Obecně Pro používaný AAS systém musí být předem stanoveny vhodné analytické čáry, limit detekce, LOQ, preciznost, lineární pracovní oblast a možné interference. 5.4.2 Stanovení Připravené kalibrační roztoky a extrakty (mineralizáty) vzorků se měří při vhodné vlnové délce. Autosampler se naprogramuje na dávkování vzorku do grafitové kyvety, obvyklý dávkovaný objem vzorku je 20 μl. Vyhodnocuje se integrovaná absorbance (plocha píku).
Strana 8 Teplotní program grafitové kyvety obvykle sestává ze 4 kroků: sušení, pyrolýza, atomizace a čištění. Nastavení teplotního programu závisí na použitém přístroji a je třeba ho optimalizovat v souladu s pokyny výrobce a pro měřenou matrici. Tabulka 5. Příklad nastavení parametrů pro přístroj AAnalyst 600 při měření olova a kadmia. Prvek Vlnová délka (nm) Štěrbina (nm) Teplota pyrolýzy ( C) Teplota atomizace ( C) Objem vzorku (μl) Modifikátor (μl) Cd 228,8 0,7 700 1700 20 5 Pb 283,3 0,7 800 1800 20 5 Během atomizace se doporučuje přerušit průtok argonu (8). Vždy je třeba použít účinnou korekci pozadí, použití deuteriové korekce může být nedostatečné vzhledem ke strukturovanému pozadí matrice. Mohou být použity také alternativní vlnové délky, např. pro olovo 217,0 nm, kde je dvojnásobná citlivost, ale také vyšší šum a interference. S každou sérií vzorků se analyzuje interní referenční materiál (IRM). Pokud výsledek obsahu prvku v IRM není v povoleném intervalu, je nutno provést opatření. V každé sérii je dále třeba zařadit alespoň dva slepé pokusy. 6 Výpočet a vyjádření výsledků Koncentrace analytu v roztoku zkušebního vzorku a v roztoku slepého pokusu se vypočte pomocí vyhodnocovacího programu přístroje. Koncentrace prvku ve vzorku se vypočte podle vztahu X prvek = (C V C B ) V F 1000/m Xprvek obsah prvku vyjádřený (mg/kg), CV CB m F V koncentrace příslušného prvku v extraktu vzorku (mg/l), vypočtená z kalibrační rovnice, koncentrace příslušného prvku (mg/l) v roztoku slepého pokusu, hmotnost navážky vzorku (g), faktor ředění, celkový objem filtrátu nebo extraktu (l). 14 Pokud je hodnota slepého pokusu vyšší než přípustná hodnota stanovená v průběhu validace metody, je třeba zjistit příčinu a odstranit ji. V tomto případě není možné vyhodnocení změřených vzorků, stejně jako v případě, že naměřená hodnota IRM neodpovídá požadovaným parametrům.
Strana 9 15 Pokud je (CV CB) nižší než mez detekce, nahradí se tato hodnota pro výpočet hodnotou LOD. 7 Literatura 1 ČSN EN 15550 Krmiva Stanovení Cd a Pb po tlakovém rozkladu metodou AAS s grafitovou píckou. Rok vydání 2011.