kození Excitotoxicita Neurodegenerace

Smrt srdeční a nervové buňky: Ischemicko-reperfusn reperfusní poškozen kození Excitotoxicita Neurodegenerace MUDr. Jan Pláteník, PhD. Ischemické poškození srdce nebo mozku je celosvětově nejčastější příčinou smrti http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/imagepages/19314.htm 1

Rozlišujte: HYPOXIE (ANOXIE) Nedostatek kyslíku ISCHEMIE Nedostatek kyslíku Průtok krve tkání omezen/zastaven porucha dodávky živin porucha odstraňování zplodin metabolismu Metabolické změny při hypoxii/ischemii Zvýšení degradace glykogenu a glycolysy Laktát se hromadí, ph klesá (acidosa) ATP ubývá buňka má nedostatek energie Adenylátkinasa: ADP + ADP ATP + AMP AMP odbouráván až na Pi a hypoxanthin Iontové gradienty rozvráceny: H + (laktát) Na + (směna Na/H na buněčné membráně) Ca 2+ (selhání ATP-dep. čerpání do ECT a ER, porucha směny Na/Ca na buněčné memrbáně) 2

Degradace purinů Vasodilatační účinek Hromadí se při ischemii Schema z: Harper s Illustrated Biochemistry, 27th edition, McGraw Hill Co., 2006 Xanthinoxidasa /dehydrogenasa: D forma (dehydrogenasa): NAD-dependentní, fyziologicky převládá O forma (oxidasa): O 2 -dependentní, generuje ROS Zdravá buňka udržuje uje velmi strmý Ca 2+ gradient na buněč ěčné/er membráně ECT: Ca 2+ 2.5 mm ICT: Ca 2+ 0.0001-0.001 mm K + ATP ADP ATP ADP Ca 2+ Na + Na + Ca 2+ Na + H + 3

Rozvrat iontových gradientů při ischemii: ECT: ICT: K + ATP ADP ATP ADP Ca 2+ Na + (protože chybí ATP) Na + Ca 2+ Na + H + (vysoké Na v cytosolu) (laktátová acidosa) Proč je vápnv pník k tak důled ležitý? 4

Calcium v buňce: Second messenger důležitý v naprosto všech životních projevech buňky V cytoplasmě jen 0.1-0.2 µm, cca 1 µm je již signál Zdroj signálu je: zvnějšku: ligandem aktivované Ca 2+ kanály napětím řízené Ca 2+ kanály ze zásob v ER: PI3 receptor/kanál ryanodinový receptor/kanál závislý na membránovém potenciálu (kosterní sval) závislý na Ca 2+ (srdce, CNS) Confocal images taken at five-second intervals of a fertilization-induced calcium wave in a Pisaster ochraceus starfish oocyte that was microinjected with 10,000 MW Calcium Green-1 dextran (C-3713). The image was contributed by Stephen A. Stricker, Department of Biology, University of New Mexico. 5

O tom jakou informaci Ca 2+ signál nese, rozhoduje jeho LOKALIZACE FREKVENCE AMPLITUDA (Berridge et al., Nature 1998, 395: 645-648) Kalmodulin (148 AMK) 6

(Pato)biochemické účinky zvýšení intracelulárního kalcia: Aktivace mnoha enzymů: Ca/kalmodulin-dependentní proteinkinasy Některé fosfatasy (calcineurin) Endoteliální a neuronální NO synthasy Kalpainy (Ca-aktivované non-lysosomální proteasy) Fosfolipasy ( poškození membrán, synthesa prostanoidů) Endonukleasy ( fragmentace DNA při apoptose) Svalová kontrakce Uvolnění hormonů a neurotransmitterů Regulace genové exprese Skladba cytoskeletu (vysoké Ca membrane blebbing ) Mitochondrie: Regulace respirace Indukce MPT (mitochondrial permeability transition) Import Ca 2+ do mitochondrie Ca 2+ uniporter: facilitovaná difuse po spádu elektrochemického gradientu, kapacita obrovská Metabolická regulace: Kritické mitochondriální dehydrogenasy jsou stimulovány Ca 2+ : Pyruvátdehydrogenasa Isocitrátdehydrogenasa 2-oxoglutarátdehydrogenasa Takto srdeční mitochondrie reaguje na změny spotřeby ATP (nikoliv deplece ATP!) Sekvestrace/pufrování cytoplazmatického kalcia za určitých okolností 7

Mitochondrial Permeability Transition (MPT) Perseus vs The Kraken by VegasMike (http://www.whiskeyandbeans.com/things-of-interest/release-the-kraken) Mitochondrial Permeability Transition Pore (MPT) Otevření megakanálu ve vnitřní mitochondriální membráně Propustnost pro všechny molekuly < 1500 Da Kolaps potenciálu vnitřní membrány, vyrovnání protonového gradientu a rozpřažení nebo inhibice respirace Zbobtnání mitochondrie 8

3000000 2500000 + JC-1 +Ca 500 um Signal intensity (cps) 2000000 1500000 1000000 500000 630/625 nm 488/593 nm (cps/2.5) 0 200 400 600 800 Time (sec) Speer O et al. J. Biol. Chem. 2003;278:34757-34763 2003 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology 9

Otevření megakanálu (MPT) Spouští: matrix Ca 2+ Stimulují: Oxidanty Depolarizace Anorganický fosfát Inhibují: Protony (nízké ph matrix) Magnesiové ionty ATP a ADP Cyklosporin A Struktura megakanálu: hypotetická (Miller RJ; TINS 21, 1998, 95-97) 10

Funkce MPT: Fyziologické (reversibilní) otevření MPT: Energeticky výhodný eflux Ca 2+ z mitochondrie Kalciová signalizace: Uvolnění Ca 2+ indukované kalciem...mitochondrie jako Ca 2+ signalling storing memory device Patologické (ireversibilní): Buněčná smrt (nekróza a apoptóza) Mechanismus jak jsou staré mitochondrie označeny pro autofagii Reoxygenační poškozen kození 11

Reoxygenační poškození Další poškození ischemické tkáně nastávající až po obnovení průtoku krve Významné zejména po krátké ischemii Pokud je tkáň ischemií zcela zničena, reperfuse už nemůže lokální stav zhoršit, ale může vyplavit toxiny z mrtvé tkáně do cirkulace Multiple organ dysfunction syndrome (MODS) Systemic inflammatory response syndrome (SIRS) Záplava kyslíkových radikálů, NO a eikosanoidů Reoxygenační poškození: Kde je významné? Střevo: trombosa, torze, uskřinuté kýly Srdeční infarkt: trombolytická léčba, angioplastika arytmie, porucha kontraktility ( stunning ) Perinatální asfyxie Hemoragický šok po doplnění krevního objemu Otrava oxidem uhelnatým léčená kyslíkem Spánková apnoe Orgány před transplantací 12

Nedostatek kyslíku ATP ADP AMP adenosin inosin Xanthindehydrogenasa -SH oxidace, nebo Ca-aktivovaná proteolýza Hypoxanthin Reperfuse obnovuje O 2 Xanthinoxidasa Klasické schema ischemicko-reperfusního poškození O 2, H 2 O 2, kyselina močová OH Uvolnění Fe, Cu Podle: J.M.McCord Fed. Proc. 46, 2402, 1987 (upraveno) Xanthinoxidasový model dobře vysvětluje ischemicko-reperfusní poškození střeva u koček Ale lidské srdce neobsahuje žádnou xanthinoxidasu Enzym se nachází pouze v játrech, střevě a laktující mléčné žláze, v malém množství je v cévách vázán na povrchu endotelu Přeměna na O formu je v lidském střevě příliš pomalá Tvorba ROS během reperfuse má jiné zdroje: Mitochondrie (po ischemii jsou více děravé ) Mitochondrial permeability transition (MPT) Leukocyty no-reflow fenomén (ucpání kapilár adherovanými bílými krvinkami 13

MPT je zřejmě hlavní mechanismus reoxygenačního poškození myokardu Ischemie: nízké ph chrání před MPT Reperfuse: v myokardu nastávají podmínky pro MPT koincidencí těchto faktorů: Nadprodukce oxidantů Deplece adeninových nukleotidů Vysoká koncentrace Pi (z degradace ATP) Vysoká koncentrace Ca 2+ Normalizace ph ATP synthasa může fungovat i obráceně 14

Poly(ADP-ribosa)polymerasa (PARP-1) Enzym vázaný na chromatin, aktivovaný (oxidačním) poškozením DNA Štěpí NAD +, přenáší poly(adp-ribosa) na jaderné proteiny Pomáhá v opravách DNA a podporuje přežití buňky Ale je-li DNA poškozena příliš, enzym způsobí depleci NAD + která urychlí buněčnou smrt ( suicide response ) Deplece NAD + je usnadněna jeho uvolněním z mito v důsledku MPT Zdroj obr.: Miwa M et al:roles of Poly(ADP-Ribose) Metabolism in the Regulation of Centrosome Duplication and in the Maintenance of Neuronal Integrity, DNA Surveillance and Repair, Madame Curie Bioscience Database, Landes Biosciences 15

Prevence ischemicko-reperfusního poškození? ŘÍZENÁ HYPOTERMIE MPT inhibitory Cyklosporin A: váže cyklofilin D (součást MPT póru) Antioxidanty PARP-1 inhibitory Imunosupresivní účinek cyklosporinu A není způsoben inhibicí MPT Katzav S, Blood 2004, 103 (7), 2443-51. 16

MPT a apoptosa: Rozší šířený omyl? Jak mitochondrie zabíjí buňku Uvolnění proapoptotických faktorů z intermembránového prostoru: cytochrom c AIF (apoptosis inducing factor) endonukleasa G Smac/Diablo (inhibitor IAPs) Htra2/Omi (serinová proteasa, štěpí IAPs) prokaspázy Narušení buněčné energetiky a produkce ATP (uvolnění cytochromu c, depolarizace) Nadprodukce kyslíkových radikálů 17

Obrázek z: M.O.Hengartner: The biochemistry of apoptosis, Nature 407, 2000, 770-776. Bcl proteiny: Rodina >10 proteinů, prototypický člen: Bcl-2 (B-cell lymphoma... onkogen) Proteiny s antiapoptotickou aktivitou (Bcl-2, Bcl-xL), nebo naopak proapoptotické (Bad, Bax, Bid etc.) 1-4 BH domény... homo/hetero-oligomerizace C-terminální hydrofobní úsek... lokalizace do membrán (vnější mito, jaderná m., ER) Schopnost agregovat a tvořit kanály v membránách - podobnost s bakteriálními toxiny koliciny 18

Bcl-2 Bax Bcl-xL Bak Apaf-1 CytC Casp-9 +datp apoptosom Casp-3 Uvolnění cytochromu c z mitochondrie? MOMP (Mitochondrial Outer Membrane Permeabilisation) 19

Mechanismus uvolnění cytochromu c z mitochondrie? MPT proapoptotické Bcl proteiny (Bax, Bak) zbobtnání matrix ruptura vnější membrány translokace do mito a tvorba kanálů ve vnější membráně Apoptotický signál, stress, poškození buňky atd. MPT Bax, Bak translokace ATP? (MPT reversib., další zdroje energie) MOMP ATP NEKRÓZA APOPTÓZA 20

Patogeneze chorob jako dysregulace apoptózy? Neurodegenerace, ischemie, AIDS: buňky umírají když nemají... Autoimunita, nádory: neumírají buňky, které by měly... Nádorové buňky žijí z glykolýzy a mitochondrie vypínají. Dichloracetát: inhibice PDH kinasy aktivace PDH aktivace mito respirace a produkce oxidantů aktivace apoptotického programu a nádorové buňky hynou (Bonnet S et al.cancer Cell. 2007 Jan;11(1):37-51). 21

Excitotoxicita Většina excitačních synapsí v lidském mozku používá glutamát 22

Ionotropní glutamátové receptory: Ligandem-řízené iontové kanály glutamate Metabotropní glutamátové receptory: Seven-spanning Spřažené s G proteiny 23

Ionotropní glutamátové receptory: Ligandem-řízené iontové kanály glutamate Non-NMDA receptory (AMPA, kainát): Rychlá synaptická transmise, propustné pro Na + NMDA receptory: Dlouhodobé změny v síle synaptického přenosu, propustné pro Na + a Ca 2+ Glutamátové receptory a indukce LTP (long-term potentiation) 1. Nízká frekvence impulzů: pouze AMPA receptory aktivní Bliss & Collingridge, Nature 1993, 361: 31-39) 24

Glutamátové receptory a indukce LTP (long-term potentiation) 2. Vysoká frekvence: AMPA i NMDA receptory aktivní...nmda receptor: coincidence detector Bliss & Collingridge, Nature 1993, 361: 31-39) Synaptická plasticita: Síla synaptického spojení Synaptická aktivita Kovalentní modifikace stávajících proteinů Genová exprese a syntéza nových proteinů (Finkbeiner & Greenberg, J. Neurobiol. 1998, 37: 171-189). 25

Excitotoxicita při mozkové ischemii-reperfusi Deplece ATP kolaps iontových gradientů Ca 2+ nadměrné uvolňování glutamátu Do postsynaptických neuronů proudí Na + a Ca 2+ Na + : osmotické bobtnání, nekróza Ca 2+ : Mitochondriální ROS Oxid dusnatý Poškození pokračuje Ca 2+ -stimulované proteasy Ca 2+ -stimulované fosfolipasy eikosanoidy Později buněčná smrt (apoptóza nebo nekróza) Glu transportery využívaj vají iontových gradientů na buněč ěčné membráně Depolarizace membrány transport glutamátu tu se můžm ůže e obrátit! Glu 3Na+ H + K + Zdroj obr.: Liu Y-P et al: A possible therapeutic strategy for CNS repair: To blockade calcium regulation of glutamate aspartate transporter regulation in astrocytes (http://research.ncku.edu.tw/re/articles/e/20081128/3.html) 26

Zdroj obr.: B. Halliwell & J.M.C. Gutteridge: Free Radicals in Biology and Medicine, 4 th edition, Oxford University Press 2007 Obecné mechanismy neurodegenerace 27

Alzheimerova Nemoc (AN) Demence = získaná a progresivní porucha všech vyšších kognitivních funkcí Nejčastější ze všech neurodegenerativních chorob (USA: 30% ve věku 65 let nebo víc) Nejasné oddělení od vaskulární demence (chronická ischemie mozku) a změn při normálním stárnutí mozku Difúzní ztráta neuronů, v patologii je charakteristické: Senilní plaky: extracelulárně, jádro z agregovanéhoβ-amyloid peptidu (Aβ) Tangles : vlákna uvnitř neuronů tvořená z hyperfosforylovaného proteinu tau Epidemiologie: Většina případů sporadická, ale dědičnost silně ovlivňuje predispozici (např. polymorfismy apolipoproteinu E) Familiární formy (s časným začátkem): mutace v APP nebo v presenilinech (ovlivňují tvorbu Aβ z APP), také M. Down (trisomia 21 kde je gen pro APP) Negativní asociace s dosaženou úrovní vzdělání a pravidelnou fyzickou aktivitou Účinná léčba dosud není Parkinsonova nemoc (PN) Progresivní porucha hybnosti, pomalost pohybů (bradykinesia), klidový třes, obtížný začátek pohybu (akinesia), svalová rigidita Druhá nejčastější neurodegenerativní choroba (5% ve věku 85 let nebo víc) Selektivní smrt neuronů v substantia nigra (SN) nedostatek dopaminu ve striatu symptomy Pathologická anatomie: Lewyho tělíska (ve zbývajících SN neuronech, obsahují agregovaný α-synuklein), ale není specifické Epidemiologie: téměř vždy sporadické, familiární formy s časným začátkem jsou velmi vzácné, někdy též způsobeno toxiny (např. MPTP) Léčba: modulace dopaminergní transmise (L- DOPA+Carbidopa atd.) v zásadě funguje, ale s vedlejšími účinky a účinek léčby se s časem vytrácí. Experimentální terapie transplantací dopaminprodukujících buněk do mozku pacienta 28

Mechanismy smrti neuronů u AN, PN a dalších neurodegenerativních chorob jsou komplexní a jen částečně probádané, přesto lze uvést několik obecnějších rysů: Porucha funkce mitochondrií Zvýšení oxidačního poškození Poruchy ubiquitin-proteasomového systému Hromadění abnormálních agregovaných proteinů Změny v metabolismu železa Excitotoxicita Zánět Podle: B. Halliwell & J.M.C. Gutteridge: Free Radicals in Biology and Medicine, 4 th edition, Oxford University Press 2007 Obecné mechanismy neurodegenerace 1: Porucha funkce mitochondrií Alzheimer: Mito poruchy popsány: aktivit cytochromoxidasy, pyruvátdehydrogenasy a α-ketoglutarátdehydrogenasy Mitochondrie jsou jedním z cílů toxicity Aβ Parkinson: Poruchy v Komplexu I nalezeny specificky v nemocné SN v současné době považováno za jeden z hlavních mechanismů patogenese PN SN neurony jsou zřejmě zvlášť citlivé k působení Komplex I toxinů: MPTP (příměs v heroinu, v neuronech metabolizován na MPP + ) u narkomanů Pokusy na zvířatech s rotenonem (pesticid) takové toxiny mohou být v prostředí velmi rozšířeny (MPTP: 1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin, MPP + : 1-methyl-4-fenylpyridinium) 29

Obecné mechanismy neurodegenerace 2: Zvýšení oxidačního poškození Alzheimer: Přesvědčivé důkazy pro lokální oxidační stres již na počátku onemocnění Původ ROS: Aβ peptid (základní mechanismus jeho toxicity) jak přímo, s katalýzou přechodnými kovy, tak nepřímo (indukce ROS-generujících enzymů, účinek na mito ) Aktivace mikroglie senilními plaky, včetně AGE-RAGE interakce Parkinson: Přesvědčivé důkazy pro lokální oxidační stres, ale vztah příčina/důsledek poněkud nejasný. Deplece GSH může být jeden důležitý a časný děj. Původ ROS: Metabolismus dopaminu (jak jeho neřízená kovy-katalyzovaná autoxidace, tak katabolismus monoaminooxidasami generuje radikály) proto asi jsou SN neurony zvláště náchylné k oxidačnímu stresu! Porucha mitochondrií (např. způsobená MPP + ) Možnost uvolnění železa z neuromelaninu Aktivace glie Obecné mechanismy neurodegenerace 3: Poruchy ubiquitin-proteasomu Alzheimer: Aktivita proteasomu nízká Mutantní ubiquitin (generovaný chybami transkripce) Některé oxidované/abnormální proteiny (vč. Aβ a tau) mohou proteasom zacpávat Parkinson: Některé vrozené formy: Mutace v genu pro parkin (E3 ligasa pro ubiquitinaciα-synukleinu) Mutace v UCHL1 (ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1) enzym důležitý pro recyklaci ubiquitinu Aktivity proteasomu a UCHL1 jsou nízké i u sporadických forem PN Takové poruchy obecně podporují hromadění vadných proteinů a také oxidační stres (porucha odstraňování oxidovaných proteinů) 30

Obecné mechanismy neurodegenerace 4: Abnormální agregované proteiny Alzheimer: Amyloidβpeptid (Aβ) je aberantní produkt štěpení APP jeho hromadění je považováno za základní mechanismus patogenese AD Neurotoxické jsou především rané, ještě rozpustné Aβ agregáty Produkce ROS je hlavním mechanismem neurotoxicity Zralé plaky nejsou přímo neurotoxické, ale indukují zánětlivou odpověď mikroglie Parkinson: Hromaděníα-synukleinu přispívá ke smrti neuronů: Mutace v genu proα-synuklein způsobuje jednu formu familiární PN Zvýšená exprese normálního α-synukleinu také vede k PN (pokusy na zvířatech, též jedna vzácná familiární forma) Ale: ne každý případ PN má Lewyho tělíska, a existuje také stav s Lewyho tělísky, ale bez PN Obecné mechanismy neurodegenerace 5: Změny v metabolismu železa Alzheimer: Stopy Cu nebo Fe jsou nezbytné jako katalyzátory agregace Aβ jak ve zkumavce, tak in vivo Aβ s vázanou mědí přímo generuje ROS Plaky hromadí Cu, Fe (také Zn, snad i Al) v redoxně aktivních formách Parkinson: Fe se hromadí v nemocné SN, ale je to relativně pozdní děj Kovy katalyzují autoxidaci dopaminu ROS + neuromelanin bohatý na Fe Možné uvolnění redoxně aktivního Fe z neuromelaninu (stará, zajímavá ale nepotvrzená teorie) 31

Obecné mechanismy neurodegenerace 6: Excitotoxicita Myšlenka pomalé excitotoxicity : I fyziologická stimulace glutamátem může být toxická pro neuron pokud je porušena jeho produkce energie Pokud formulováno tímto způsobem, může být významné v patogenesi mnoha chronických neurodegenerativních chorob Příliš málo glutamátu ale škodí také Určitá úroveň nervové aktivity je nezbytná pro přežití nervových buněk Kultivace neuronů in vitro: přídavky glutamátu/kcl v určité (rané) fázi vývoje kultury brání apoptóze NMDA receptor je napojen na signalizaci růstových faktorů (Ras/MAPK etc.) Antiapoptotické signální dráhy se překrývají se signalizací synaptické plasticity 32

Ontogenese nervového systému JP 33

Mozkový infarkt Centrální léze (anoxie): Rychlá nekróza, příliš mnoho glutamátu Penumbra (hypoxie): Opožděná buněčná smrt, spíše apoptotická Příliš málo glutamátu v důsledku ztráty aferentace? A proto všechny klinické testy s inhibitory NMDAR selhaly? Young et al., Nature Med., 1999, 5: 448-453 : Krysy chované v obohaceném prostředí: stimulace neurogenese a pokles spontánní apoptosy v hippokampu (o 45 %) v hippokampu vyšší exprese neurotrofických růstových faktorů GDNF a BDNF po podání kainátu méně křečí, vyšší odolnost proti jeho excitoxicitě 34

USE IT http://www.ximnet.com.my/thelab/archive/archive_post_d.asp?mth=8&yr=2005 OR LOSE IT 35