Vysoké učení technické v Brně Fakulta strojního inženýrství Ústav mechaniky těles, mechatroniky a biomechaniky

Vysoké učení technické v Brně Fakulta strojního inženýrství Ústav mechaniky těles, mechatroniky a biomechaniky Ing. Michal Pásek, PhD. Využití výpočtového modelování ve výzkumu elektrofyziologických dějů u srdečních buněk Computational modelling in the research of electrophysiological processes in cardiac cells Teze habilitační práce Obor: Aplikovaná mechanika Brno 21

Klíčová slova: výpočtové modelování, srdeční buňka, transverzálně-axiální tubulární systém, propafenon, haloperidol Keywords: computer modelling, cardiac cell, transverse-axial tubular system, propafenone, haloperidol Fakulta strojního inženýrství Vysokého učení technického v Brně Michal Pásek, 21 ISBN: 978-8-214-4187-3 ISSN: 1213-418X

OBSAH 1 Úvod.. 5 2 Modelování elektromechanické aktivity u srdečních buněk... 5 2.1 Historie vzniku a vývoje modelů...... 5 2.2 Nové experimentální poznatky... 7 2.3 Matematický popis transverzálně-axiálního tubulárního systému v modelech srdečních komorových buněk... 9 2.3.1 Struktura modelů..... 1 2.3.2 Elektrická interakce mezi povrchovou a tubulární membránou... 11 2.3.3 Zastoupení iontových proudů v povrchové a tubulární membráně... 12 2.3.4 Iontová difuze mezi extracelulárním a tubulárním prostorem. 13 2.4 Modelování a analýza funkce transverzálně axiálního tubulárního systému u srdečních komorových buněk... 13 2.4.1 Elektrofyziologické děje v buněčných modelech s TATS... 13 2.4.2 Velikost iontově-koncentračních změn v TATS.... 18 2.4.3 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na iontové proudy... 19 2.4.4 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na koncentrační změny Ca 2+ v buňce. 21 2.4.5 Shrnutí výsledků... 23 3 Modelování účinku farmak na membránové proudy srdečních buněk... 23 3.1 Historie vzniku a vývoje modelů... 23 3.2 Modelování účinku propafenonu na membránový proud I Na 24 3.2.1 Experimentální základ. 24 3.2.2 Matematický popis interakce propafenonu s I Na -kanály..... 27 3.2.3 Modelování blokády membránového proudu I Na propafenonem.... 29 3.2.4 Interpretace mechanizmu blokády... 3 3.3 Modelování účinku haloperidolu na membránový proud I to 31 3.3.1 Experimentální základ... 31 3.3.2 Matematický popis interakce haloperidolu s I to -kanály.. 33 3.3.3 Modelování blokády membránového proudu I to haloperidolem. 34 3.3.4 Interpretace mechanizmu blokády... 35 4 Závěr... 36 5 Soubor publikací zahrnutých do habilitační práce.... 37 6 Literatura... 38 7 Seznam vybraných symbolů..... 4 3

Ing. Michal Pásek, Ph.D. Michal Pásek získal akademický titul Ing. na Fakultě strojního inženýrství Vysokého učení technického v Brně v roce 1995 po absolvování pětiletého studia v oboru Aplikovaná mechanika. Po ukončení inženýrského studia byl ve stejném roce přijat do doktorského studijního programu v oboru Inženýrská mechanika. Hlavním záměrem jeho doktorského studia bylo využití metod výpočtového modelování pro simulaci biologických procesů. Již od samého začátku tohoto studia začal aktivně spolupracovat s Laboratoří celulární elektrofyziologie Fyziologického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně, kde probíhal výzkum zaměřený na objasnění role membránových kanálů a přenašečových systémů v regulaci kontraktility srdečních buněk vedený manželi Šimurdovými. Během doktorského studia byl Michal Pásek zapojen do řešení dvou grantových projektů (GAČR 16/96/652 a GAČR 35/97/43), v rámci kterých sestavil několik modelů elektromechanické aktivity srdečních buněk a dva modely interakce specifických farmak (propafenon, 4-aminopyridin) s membránovými kanály. Vzhledem k úzké návaznosti této teoretické práce na práci experimentální se v této době (1995-1999) účastnil také mnoha experimentálních měření jejichž cílem bylo vyšetření vlivu některých kardioaktivních látek na charakteristiky membránových proudů u izolovaných srdečních buněk. Doktorské studium ukončil v r. 1999 obhajobou disertační práce na téma Výpočtové modelování fyziologických procesů na srdečních buňkách (blokáda membránových kanálů). V r. 1999 se Michal Pásek stal vědeckým pracovníkem brněnské pobočky Ústavu termomechaniky AVČR a o rok později získal vedlejší pracovní poměr (odborný asistent) na Ústavu fyziologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně. Právě kombinace experimentálního a výpočtového zázemí, které tyto instituce poskytují, mu vytvořila podmínky pro pokračování v experimentálně-teoretickém výzkumu elektrofyziologických procesů na srdečních buňkách. Od roku 2 se podílel na řešení několika výzkumných záměrů (AVZ 276919, AVZ 276514, MŠMT J7/98:14114, MŠMT MSM2162242). V roce 22 získal postdoktorandský grant (GAČR 24/2/D129) a v roce 24 grant od Britské fyziologické společnosti (Junior Fellowship). Hlavním předmětem jeho vědecké aktivity bylo výpočtové modelování fyziologické funkce membránového transverzálně-axiálního tubulárního systému u srdečních komorových buněk a modelování interakce vybraných farmak s membránovými kanály srdečních buněk.v roce 23 absolvoval zahraniční stáž v Laboratoři celulární bioenergetiky na Univerzitě Josepha Fouriera v Grenoblu a od roku 25 čtyři zahraniční stáže na Ústavu fyziologie a farmakologie University v Bristolu. Dlouhodobě spolupracuje s několika zahraničními pracovišti z nichž nejvýznamnější je spolupráce s institutem INSERM v Lyonu (Dr. Georges Christé) a s Ústavem fyziologie a farmakologie University v Bristolu (Prof. Clive H. Orchard). Od roku 25 je členem Britské fyziologické společnosti. Stěžejní výsledky jeho dosavadní vědecké práce byly představeny na 62 převážně mezinárodních vědeckých konferencích (89 příspěvků) a v pracích publikovaných in extenso v 19 recenzovaných (z toho 15 impaktovaných) vědeckých časopisech. Své pedagogické zkušenosti Michal Pásek uplatňuje na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity v Brně, kde je od r. 2 zapojen do výuky fyziologie. V rámci demonstrací také seznamuje studenty s využitím matematických modelů ve výzkumu biofyzikálních dějů u srdce a u srdečních buněk. 4

1 ÚVOD Výzkum v oblasti elektrofyziologie a biomechaniky srdečního svalu zaznamenal v posledních dvou desetiletích pozoruhodný rozvoj. Vedle stále hlubšího objasňování buněčných procesů zodpovědných za elektrickou a mechanickou aktivitu srdce bylo značné úsilí věnováno také hledání příčin vzniku a možností účinné léčby srdečních onemocnění. Základem obou přístupů byly experimentální práce na izolovaných buňkách nebo multicelulárních preparátech, které podávaly informace nezbytné pro vysvětlení buněčných elektrofyziologických dějů a jejich vztahů k mechanické odezvě. Kromě jiných objevů klíčového významu byly v tomto období získány také nové poznatky o dějích probíhajících v srdečních buňkách na molekulární úrovni. Ukázalo se, že heterogenita srdeční tkáně z hlediska rozložení transportních systémů je podstatně větší než se dříve předpokládalo. Nové poznatky zde vedly k hlubšímu pochopení specifických projevů vazby mezi excitací a kontrakcí a také k porozumění mechanizmů vzniku poruch srdečního rytmu. K nejčastějším srdečním onemocněním v naší populaci patří nepravidelná srdeční aktivita (srdeční arytmie). Podáním specifických látek je možné narušené elektrické vlastnosti srdečních buněk korigovat tak, aby jejich přirozená odolnost proti vzniku nepravidelných excitací byla obnovena. Na druhé straně, některá farmaka používaná pro léčbu zcela jiných onemocnění mohou svými vedlejšími účinky vznik srdečních arytmií podpořit a v některých případech zavinit i předčasnou smrt. Vyšetření vlivu těchto látek na elektrickou aktivitu srdečních buněk a na funkci membránových transportních systémů (zprostředkovávajících přenos iontů mezi buňkou a vnějším prostředím) má z tohoto důvodu nezastupitelný význam pro klinickou praxi. Nedílnou součástí zmíněného výzkumu je výpočtové modelování. Využívá znalostí biofyzikálních principů k formulaci matematických modelů a následně k realizaci simulací, které testují správnost navržených hypotéz a zjevují komplexnost a vzájemnou podmíněnost studovaných jevů. Právě simulace, provedené od r. 2 na vlastních matematických modelech, výrazně přispěly k vysvětlení výsledků elektrofyziologických měření realizovaných v Laboratoři celulární elektrofyziologie na Fyziologickém ústavu Lékařské fakulty Masarykovy university v Brně a v laboratořích našich zahraničních partnerů (Ústav fyziologie a farmakologie university v Bristolu, institut INSERM v Lyonu). Tyto experimentálně-simulační studie byly zaměřeny do dvou oblastí celulární srdeční elektrofyziologie. Hlavním cílem bylo vysvětlení specifických vlastností transverzálně-axiálního tubulárního systému u srdečních komorových buněk a objasnění jejich významu pro elektrickou a mechanickou buněčnou aktivitu. Dalším záměrem bylo objasnění mechanizmu účinku vybraných farmak (propafenon, haloperidol, perfenazin aj.) na membránové kanály. Stěžejní experimentální údaje a výsledky výpočtového modelování publikované od r. 21 v recenzovaných převážně impaktovaných pracích (kap. 5) jsou shrnuty v následujícím textu. 2 MODELOVÁNÍ ELEKTROMECHANICKÉ AKTIVITY U SRDEČNÍCH BUNĚK 2.1 HISTORIE VZNIKU A VÝVOJE MODELŮ Historie vzniku matematických modelů popisujících elektrofyziologické děje u srdečních buněk [1] je úzce spojena s rozvojem metod pro měření jejich biofyzikálních projevů. Hlavním mezníkem, který podnítil rozvoj měření elektrických buněčných projevů, byl objev metody, umožňující měřit napětí na buněčné membráně prostřednictvím skleněných mikroelektrod (Ling a Gerard) v roce 1949. Následovala řada experimentálních prácí, jejichž cílem bylo vyšetření a objasnění elektrických vlastností excitabilních buněk. Nejvýznamnějšími z nich byly práce 5

anglických badatelů A. L. Hodgkina a A. F. Huxleyho na membránách nervových vláken sépie (Hodgkin a Huxley, 1952a; 1952b) završené prvotním kvantitativním popisem (Hodgkin a Huxley, 1952c). Tento popis zahrnoval formalizaci tří základních iontových složek (I Na, I K, I Cl ) celkového membránového proudu (I m ) a odvození vztahu pro výpočet změn membránového napětí (V m ) na měřeném axonu sépie. Za tuto experimentální a teoretickou práci byla zmíněným badatelům společně s australským neurofyziologem J. C. Ecclesem v roce 1963 udělena Nobelova cena. První pokus o uplatnění Hodgkin-Huxleyho formalizmu u srdečních buněk provedl začátkem šedesátých let anglický elektrofyziolog D. Noble. Ukázal, že s jistou modifikací tohoto kvantitativního popisu lze simulovat také průběh základních membránových proudů a akčního napětí (AN) u Purkyňových vláken - specializovaných buněk vodivého systému srdce (Noble, 1962). Struktura jeho modelu je znázorněna na obr.1. V roce 1969 publikoval společně s R. W. Tsienem průlomovou práci, která představovala matematický popis repolarizace Purkyňova vlákna (Noble a Tsien, 1969b), který byl již navržen na základě experimentálních výsledků získaných u srdečních buněk (Noble a Tsien, 1968; 1969a). I Na I K1 I K2 I an intracellular space [Na + ] i [Ca 2+ ] i [K + ] i extracellular space [Na + ] e [Ca 2+ ] e [K + ] e sarcolemma Obr. 1 Struktura prvního modelu Purkyňova vlákna publikovaného v roce 1962. Model zahrnoval následující iontové proudy: sodíkový přechodný proud (I Na ), draslíkový časově nezávislý proud (I K1 ), draslíkový zpožděný proud (I K2 ) a aniontový proud (I an ). Převzato z [1]. S nárůstem experimentálních výsledků v 7-tých letech začala etapa vývoje modelů, jejichž cílem bylo simulovat změny intracelulární vápníkové koncentrace ([Ca] i ) a objasnit jejich vztah k vazbě mezi excitací a kontrakcí. První, spíše však popisný model tohoto druhu navrhli Bassingthwaighte a Reuter v roce 1972. Další komplexnější model, který ukazoval roli vápníkového proudu (I Ca ) v procesu utváření akčního napětí u Purkyňova vlákna, byl publikován v roce 1975 (McAllister et al.). O dva roky později byl navržen model srdeční komorové buňky (Beeler a Reuter, 1977), který již umožňoval simulovat změny [Ca] i během akčního napětí a jejich zpětný vliv na průběh I Ca. I přes svoji jednoduchost dokázal tento model adekvátně rekonstruovat výsledky experimentálních měření jako např. pomalé zotavování membránových proudů z inaktivace, frekvenční závislost trvání AN a oscilace klidového membránového napětí. Velkým přínosem pro hlubší objasnění intracelulárních dějů se stal následný zdokonalený model elektrické aktivity Purkyňova vlákna, který v roce 1985 publikovali DiFrancesco a Noble. Tento model byl oproti předcházejícím obohacen o popis funkce membránových výměnných mechanizmů (proteiny zodpovědné za proudy I NaCa a I NaK ) a sarkoplazmatického retikula (SR). Poprvé zde také byly začleněny formulace umožňující simulovat experimentálně pozorované změny všech podstatných iontových koncentrací v cytoplazmě ([Na + ] i, [K + ] i, [Ca 2+ ] i ) při různých koncentračních hladinách 6

extracelulárních iontů či blokádě proudu I NaK. Modifikace tohoto modelu provedená za účelem simulace vazby mezi excitací a kontrakcí u síňových myocytů králíka byla publikována v roce 1987 (Hilgemann a Noble). Ačkoliv koncepce modelů navržených v 7-tých a 8-tých letech zůstala zachována dodnes, vytrvalá snaha o rekonstrukci nových experimentálních výsledků vyžadovala upřesnění či zavedení popisu nových buněčných mechanizmů. V sérii modelů elektrické aktivity komorových buněk publikovaných skupinou prof. Rudyho (Luo a Rudy, 1991; Luo a Rudy, 1994; Zeng et al., 1995) byl modifikován popis draslíkových proudů a intracelulárního vápníkového transportu. Simulace na těchto modelech umožnily studovat vliv extracelulární draslíkové koncentrace na trvání AN, podmínky vzniku nepravidelné buněčné aktivity a vliv nově zavedených komponent draslíkového zpožděného proudu (I Kr a I Ks ) na průběh repolarizace a zotavování AN u komorových buněk. Další významnou modifikací modelů bylo zavedení intracelulárních kompartmentů (Nordin, 1993; Nygren et al., 1998) zohledňujících nehomogenní rozložení koncentrace Ca 2+ v cytoplazmě během buněčné aktivity. Klíčová interakce mezi vápníkovými kanály typu L v povrchové membráně a vápníkovými kanály v membráně SR (tzv. ryanodinovými receptory) iniciující přechodný nárůst cytoplazmatické koncentrace Ca 2+ a následnou kontrakci byla ve stejném období detailněji formulována v modelu komorové buňky morčete (Jafri et al., 1998). Adaptace tohoto modelu na srdeční komorové buňky psa, potkana a myši byly následně publikovány v pracích autorů: Winslow et al. (1999), Pandit et al. (21) a Bondarenko et al. (24). V roce 24, Shannon et al. modifikovali strukturu těchto modelů zavedením dalšího subintracelulárního kompartmentu v modelu komorové buňky králíka. Tato změna umožnila přesněji simulovat gradient Ca 2+ pod buněčnou membránou, a tedy i průběh proudů zodpovědných za transmembránový přenos Ca 2+ během buněčné aktivity. Závěrem je třeba zmínit též modely zahrnující lokální řízení uvolňování Ca 2+ ze zásobních prostor SR (Rice et al., 1999; Greenstein a Winslow, 22; Hinch et al., 24; Greenstein et al., 26) navržené pro studium specifických detailů vazby excitace-kontrakce. Velká složitost a výpočtová náročnost těchto modelů však prozatím ztěžuje jejich širší využití. 2.2 NOVÉ EXPERIMENTÁLNÍ POZNATKY Jak vyplývá z historie vývoje modelů, vedle zpřesňování a doplňování prvků membránového transportního systému byla velká pozornost věnována matematickému popisu iontověkoncentračních změn, ke kterým dochází v intracelulárním prostoru během buněčné aktivity (Beeler a Reuter, 1977; DiFrancesco a Noble, 1985; Hilgemann a Noble, 1987; Jafri et al., 1998; Shannon et al., 24 a další). Cílem této snahy bylo objasnit buněčné děje zahrnuté ve vazbě mezi excitací a kontrakcí. Z řady experimentálních a modelových prací je dnes již zřejmé, že hlavním iniciátorem buněčné kontrakce je přechodné zvýšení cytoplazmatické koncentrace iontů Ca 2+, ke kterému dochází po aktivaci proudu I Ca a následném vyplavení iontů Ca 2+ ze zásobáren SR (Bers, 22 - přehled; Soeller a Cannell, 24 - přehled). Další práce ukázaly, že membránový transport iontů způsobuje v omezeném mezibuněčném prostoru významné iontově-koncentrační změny (např. Attwell et al., 1979; Bers 1983), které zpětně ovlivňují transmembránový iontověkoncentrační gradient, aktivitu iontových přenašečů, a tedy i velikost iontových toků přes buněčnou membránu. Touto zpětnou vazbou tedy dochází k ovlivnění buněčné elektrické aktivity, iontově-koncentračních změn v cytoplazmě a finálně i kontrakce (Šimurda et al., 1992; 1996). Ve své práci publikované v roce 1986 nastínil D.M. Bers hypotézu, že transmembránový přenos Ca 2+ probíhá především ve speciálních invaginacích buněčné membrány, které prostupují nitro srdečních komorových buněk. Přes závažnost této hypotézy nebyla v 8-tých letech tomuto 7

membránovému komplexu, který byl vzhledem ke svému tvaru a prostorové orientaci v buňce nazván systémem transverzálně-axiálních tubulů (TATS, Forbes et al., 1984), věnována větší pozornost. Otázka iontového transportu v TATS a jeho důsledků pro buněčnou elektrickou aktivitu a vazbu excitace-kontrakce byla oživena až sérií elektrofyziologických prací publikovaných v 9-tých letech (Yasui et al., 1993; Tourneur et al., 1994; Yao et al., 1997; Shepherd a McDonough, 1998), ze kterých vyplynulo, že během buněčné aktivity dochází také v TATS k významným změnám iontových koncentrací. Měření průběhu změny klidového membránového napětí po rychlé změně extracelulární koncentrace draslíku ([K + ] e ) stejně jako měření proudu I Ca a přechodných změn [Ca 2+ ] i po rychlé změně extracelulární koncentrace vápníku ([Ca 2+ ] e ) (Yao et al., 1997) zřetelně ukazovaly, že iontová difuze v TATS komorových buněk potkana a králíka je značně omezena a že vyrovnávání tubulárních iontových koncentrací ([Ca 2+ ] t, [K + ] t, [Na + ] t ) s koncentracemi extracelulárními vyžaduje relativně dlouhý čas řádu stovek milisekund (obr. 2). Obdobná měření na komorových buňkách morčete (Shepherd a McDonough, 1998, obr. 3-4) vedla k podobným závěrům. A) B) e e Obr. 2 Vliv rychlého snížení extracelulární koncentrace Ca 2+ z 1.8 mm ( normal [Ca 2+ ] e ) k nulové hodnotě na velikost I Ca u srdečních komorových buněk potkana a králíka. I Ca byl aktivován 2 ms trvajícím napěťovým pulzem z -4 mv na mv v různých časech (1, 2, 3, 5 a 1 ms) po změně [Ca 2+ ] e. A: Průběhy I Ca registrované ve vyznačených časech po změně [Ca 2+ ] e. B: Závislosti velikosti I Ca na době trvání nulové koncentrace [Ca 2+ ] e. Proud je normalizován k velikosti I Ca při [Ca 2+ ] e = 1.8 mm. Převzato z publikace Yao et al. (1997). První přímá měření průběhu změn [Ca 2+ ] t po rychlé změně [Ca 2+ ] e u buněk morčete publikovali ve stejném období Blatter a Niggli (1998). Z jejich analýzy vyplynulo, že iontově-koncentrační změny v hlubších částech TATS mohou být oproti extracelulárním zpožděny dokonce až o několik sekund. Paralelně probíhající výzkum mikrostruktury TATS, který byl založen převážně na elektronové mikroskopii (Page, 1978; Forbes, 1984; Forbes, 1988; Sommer, 1992) přinesl důležité informace o struktuře a lokalizaci TATS uvnitř buněk. Práce, které provedli Amsellem et al. (1995) a Soeller a Cannell (1999) na komorových buňkách morčete a potkana poskytly navíc údaje umožňující 8

provést prostorovou rekonstrukci TATS (obr. 3) a přesnější odhad parametrů nezbytných pro jeho matematický popis. Ukázalo se, že tubulární membrána u savců může tvořit víc jak 5% celkové plochy buněčné membrány zatímco objem TATS pouze 2-4% celkového buněčného objemu. K dovršení celkového obrazu o významu TATS přispěly též experimentální práce, které dokumentovaly, že podstatná část membránového transportního systému je lokalizována právě v tubulární membráně. Zdokonalená technika měření a nové experimentální metody jako osmotická detubulace jasně ukazovaly, že některé z iontových proudů, které hrají zásadní roli ve vazbě excitace-kontrakce, mají svůj původ převážně v TATS. Jedná se zejména o I Ca (Kawai et al., 1999), I NaCa a I NaK (Despa et al., 23). A) B) 2 µm 5 µm Obr. 3 3D rekonstrukce TATS v segmentu srdeční komorové buňky morčete (A) a potkana (B). Převzato z publikací Amsellem et al. (1995) a Soeller a Cannell (1999). Tato nová odhalení zcela změnila dosavadní převažující názory na funkci TATS a otevřela cestu pro jeho další experimentálně-teoretický výzkum, jehož cílem bylo zodpovědět následující otázky: (i) Jak velké jsou iontově-koncentrační změny v TATS během buněčné aktivity? (ii) Mohou tyto koncentrační změny významně ovlivnit membránové iontové proudy a membránové akční napětí? (iii) Mohou tyto koncentrační změny významně ovlivnit intracelulární iontovou rovnováhu a buněčnou kontrakci? (iv) Jak rozdílné jsou iontově-koncentrační změny v TATS a jejich důsledky u různých druhů zvířat? (v) Jaký vliv by měla redukce TATS, ke které dochází v patologických podmínkách, na funkci srdečních komorových buněk? 2.3 MATEMATICKÝ POPIS TRANSVERZÁLNĚ AXIÁLNÍHO TUBULÁRNÍHO SYSTÉMU V MODELECH SRDEČNÍCH KOMOROVÝCH BUNĚK Základem teoretické části výzkumu funkce TATS u srdečních komorových buněk je matematický popis tohoto membránového systému a jeho integrace s kvantitativním modelem buněčné elektromechanické aktivity. První průkopnická práce představující kvantitativní integraci TATS s modelem srdeční komorové buňky byla publikována v r. 23 [2]. Objasnění velikosti a významu iontově koncentračních změn v tubulárním systému u různých druhů zvířat si však vyžádalo sestavení modelů respektujících mezidruhové rozdíly. Tato potřeba vedla k vytvoření 9

modelu srdeční komorové buňky potkana [3] a morčete [4] se specifickými parametry TATS odvozenými z již dostupných experimentálních dat. Struktura těchto modelů, vymezení rozdílů mezi parametry TATS a způsob kvantitativní integrace TATS s popisem buněčné elektromechanické aktivity jsou obsahem následujících kapitol. 2.3.1 Struktura modelů Struktura sestavených modelů srdečních komorových buněk [2, 3, 4] zahrnujících kvantitativní popis TATS je znázorněna na obr. 4. Lze konstatovat, že tato struktura stejně jako matematický popis jsou rozšířením již zmíněných modelů autorů Jafri et al. (1998) a Pandit et al. (21). Mezi podstatné strukturální prvky modelů s TATS patří: povrchová a tubulární buněčná membrána s iontovým transportním systémem, cytoplazma obsahující intracelulární ionty Ca 2+, Na + a K +, absorbující a uvolňovací kompartment sarkoplazmatického retikula (NSR, JSR), subintracelulární kompartment ([Ca 2+ ] ss ) reprezentující úzký prostor v němž dochází k interakci mezi Ca-kanály buněčné membrány a Ca-kanály JSR, intracelulární pufry Ca 2+ (kalmodulin, troponin a kalsekvestrin) a vnitřní prostor TATS obsahující tubulární ionty. Základní geometrické parametry modelu buňky potkana [3] a morčete [4] včetně parametrů TATS odvozených z mikroskopických analýz buněčné mikrostruktury u těchto druhů (Amsellem et al., 1995; Satoh et al., 1996; Soeller a Cannell, 1999) specifikuje tab.1. Z uvedených údajů vyplývá, že z celkové plochy buněčné membrány reprezentuje tubulární membrána u modelu potkana 56% a u modelu morčete 52.6%. Naproti tomu, objem TATS tvoří u těchto modelů pouze 3.3% a 2.9% celkového buněčného objemu. intracellular space surface membrane currents NSR J up [Na + ] i [Na + ] e B [Ca 2+ ] i [Ca 2+ ] e I Ca,s B JSR B [Ca 2+ ] ss I Ca,t J rel [K + ] i tubular membrane currents [Na + ] t [Ca 2+ ] t [K + ] t tubular space [K + ] e subspace extracellular space Obr. 4 Obecné strukturální schéma modelů komorových buněk s TATS publikovaných v pracích [2, 3, 4]. Silné oboustranné šipky v povrchové a tubulární membráně reprezentují povrchový a tubulární iontový transport. Černá tečkovaná oboustranná šipka reprezentuje iontovou difuzi mezi extracelulárním prostorem a prostorem TATS. Tenké černé šipky ukazují intracelulární transport Ca 2+. NSR, JSR a B označují absorbující a uvolňovací část sarkoplazmatického retikula a intracelulární Ca 2+ pufry. Plné obdélníky v membráně JSR označují ryanodinové Ca-kanály uvolňující Ca 2+ z JSR do úzkého subintracelulárního prostoru. Převzato z [6]. 1

potkan morče V c [µm 3 ] 12739 14362 V TATS [µm 3 ] 42.38 416.49 S c [µm 2 ] 1 1688 S TATS [µm 2 ] 565 5623 Tab. 1 Základní geometrické parametry modelu komorové buňky potkana a morčete včetně parametrů TATS. V c a S c označují celkový objem buňky a celkovou plochu buněčné membrány. V TATS a S TATS označují objem TATS a plochu tubulární membrány. Údaje převzaty z [3] a [4]. 2.3.2 Elektrická interakce mezi povrchovou a tubulární membránou Elektrickou interakci mezi povrchovou a tubulární membránou znázorňuje obr. 5. TATS byl popsán jako samostatný kompartment oddělený od povrchové membrány a propojený s extracelulárním prostorem přes náhradní elektrický odpor tubulárního systému (R st ). Příspěvek jednoho tubulu k R st byl popsán jako odpor válcového vodiče, jehož délka a poloměr jsou dány polovinou efektivní délky (l t ) a středním poloměrem (r t ) tubulu. Specifický odpor odpovídá extracelulárnímu roztoku (ρ ext = 83.3 Ω cm). Z elektrického hlediska reprezentuje TATS paralelní kombinaci všech tubulů (n t ) vycházejících z povrchové membrány. Náhradní odpor TATS je tak určen vztahem: R st = ρ ext l t / (2 π r t 2 n t ). surface membrane tubular membrane I m R el I ms I mt intracellular space I is I Cs I it I Ct V ms ionic transport s C s ionic transport t C t V mt R st extracellular space Obr. 5 Schéma elektrické interakce mezi povrchovou a tubulární membránou. V ms, I ms, I is, I Cs, C s a V mt, I mt, I it, I Ct, C t označují elektrické napětí, celkový proud, iontový proud, kapacitní proud a elektrickou kapacitu povrchové (s) a tubulární (t) membrány. R el a R st označují sériový odpor mikroelektrody a odpor TATS. I m je stimulační proud. Převzato z [3]. 11

Odpor cytoplazmy, která propojuje povrchovou a tubulární membránu na intracelulární straně elektrického okruhu byl vzhledem ke svému specifickému odporu (ρ int 253 Ω cm (Daut, 1982; Cooklin et al., 1998)) a podstatně většímu elektricky vodivému prostoru zanedbán. Jak vyplývá ze schématu elektrické interakce (obr. 5), I m je roven součtu celkových proudů procházejících přes povrchovou membránu (I ms ) a membránu TATS (I mt ): I m = I ms + I mt. V režimu vnuceného proudu current clamp je kromě krátkého intervalu stimulace I m =. Mezi membránami tedy cirkuluje společný proud (I circ ): I circ = I ms = -I mt = (V ms - V mt ) / R st V režimu vnuceného napětí voltage clamp nabývá naopak I m určité velikosti, kterou lze vyjádřit z napěťového úbytku na sériovém odporu (R el ): I m = (V el - V ms )/R el. 2.3.3 Zastoupení iontových proudů v povrchové a tubulární membráně Modelování fyziologické funkce komorových buněk je kriticky závislé na správném nastavení velikostí jednotlivých iontových proudů v povrchové a tubulární membráně. Z experimentálních prací publikovaných v nedávné době (Frank et al., 1992; Yasui et al., 1993; Iwata et al., 1994; Tourneur et al., 1994; Shepherd a McDonough,1998; Kawai et al., 1999; Christé, 1999; Clark et al., 21; Komukai et al., 22; Yang et al., 22; Thomas et al., 23; Despa et al., 23, Rasmussen et al., 24) vyplynulo, že zastoupení některých bílkovin zodpovědných za transport iontů v TATS stejně jako velikosti některých iontových proudů v tubulární membráně vykazují významné rozdíly ve srovnání s membránou povrchovou. V matematických modelech je toto zjištění zohledněno prostřednictvím parametru f x,t, který definuje procentuální zastoupení (frakce) jednotlivých druhů transportních bílkovin v TATS. Pro model komorové buňky potkana a morčete jsou tyto parametry spolu s odkazy na příslušné experimentální práce specifikovány v tab. 2 a 3. Frakce transportních bílkovin v TATS u modelu komorové buňky potkana proud f x,t [%] literatura proud f x,t [%] literatura I Na 56 - I Na,b 56 - I Ca 87 a I Ca,b 56 - I Kto 56 b I Kb 56 - I Kss 76 b I NaCa 81 c,d I K1 56 b I NaK 59 d I f 56 - I pca 56 - Tab. 2 Procentuální vyjádření frakcí transportních bílkovin v tubulární membráně (f x,t ) u modelu komorové buňky potkana [3]. Rozdíl 1 - f x,t udává frakce transportních bílkovin v povrchové membráně. Reference: (a) Kawai et al. (1999), (b) Komukai et al. (22), (c) Yang et al. (22), (d) Despa et al. (23). Hodnoty bez citací (56 %) vychází z předpokladu rovnoměrného rozložení příslušných proteinů po celé buněčné membráně. 12

Frakce transportních bílkovin v TATS u modelu komorové buňky morčete proud f x,t [%] literatura proud f x,t [%] literatura I Na 57 a I K(ATP) 52.6 d,e I Ca,L 64 a I Naps 52.6 - I K,L 64 a I ns(ca) 52.6 - I Kr 52.6 b I Nab 52.6 - I Ks 52.6 b I Cab 52.6 - I K1 8 c I NaCa 52.6 f I Kp 52.6 - I NaK 52.6 g I K(Na) 52.6 - I pca 2 - Tab. 3 Procentuální vyjádření frakcí transportních bílkovin v tubulární membráně (f x,t ) u modelu komorové buňky morčete [4]. Rozdíl 1 - f x,t udává frakce transportních bílkovin v povrchové membráně. Reference: (a) Shepherd and McDonough (1998), (b) Rasmussen et al. (24), (c) Christé (1999), (d) Yasui et al. (1993), (e) Tourneur et al. (1994), (f) Kieval et al. (1992), (g) McDonough et al. (1996). Hodnoty bez citací (52.6 %) vychází z předpokladu rovnoměrného rozložení příslušných proteinů po celé buněčné membráně. 2.3.4 Iontová difuze mezi extracelulárním a tubulárním prostorem Klíčovým parametrem určujícím rychlost výměny iontů K +, Na + a Ca 2+ mezi extracelulárním a tubulárním prostorem v buněčných modelech jsou časové konstanty τ K,t, τ Na,t a τ Ca,t. Tyto konstanty závisí na geometrických vlastnostech TATS (průměr a délka tubulů, složitost tubulární sítě aj.), které u různých druhů zvířat vykazují významné odlišnosti. Z tohoto důvodu vyžadují specifické nastavení podle příslušných experimentálních dat. U modelu komorové buňky potkana a morčete byly hodnoty těchto konstant (tab. 4) nastaveny tak, aby umožnily rekonstruovat experimentální výsledky ukazující změny klidového membránového napětí (V m ) nebo membránových proudů (I Na a I Ca ) po rychlé změně extracelulárních iontových koncentrací [K + ] e, [Na + ] e a [Ca + ] e (Yao et al., 1997, Shepherd a McDonough, 1998). potkan morče τ K,t = 15 ms τ Na,t = 15 ms τ Ca,t =5 ms τ K,t = 2 ms τ Na,t = 2 ms τ Ca,t = 24 ms Tab. 4 Časové konstanty iontové výměny mezi tubulárním a extracelulárním prostorem v modelu srdeční komorové buňky potkana [3] a morčete [4]. 2.4 MODELOVÁNÍ A ANALÝZA FUNKCE TRANSVERZÁLNĚ AXIÁLNÍHO TUBULÁRNÍHO SYSTÉMU U SRDEČNÍCH KOMOROVÝCH BUNĚK 2.4.1 Elektrofyziologické děje v buněčných modelech s TATS Během aktivity srdečních buněk dochází v buněčné membráně k otevírání a zavírání iontových kanálů. Přenos iontů přes buněčnou membránu doprovázející tento proces a následná změna 13

membránového elektrického náboje způsobuje charakteristické změny membránového napětí zvané akční napětí (AN). Průběhy ustálených AN simulované na modelu srdeční komorové buňky potkana při různých frekvencích stimulace a jejich srovnání s příslušnými experimentálními záznamy [3] vystihuje obr. 6. Charakteristickou vlastností komorových kardiomyocytů potkana, kterou model reprodukuje, je rozšiřování AN s rostoucí stimulační frekvencí. Vyšetření časových průběhů iontových proudů procházejících povrchovou a tubulární membránou stejně jako změn iontových koncentrací v intracelulárním a tubulárním prostoru bylo na modelu provedeno po ustálení (minimální doba stimulace 6 s) při frekvenci stimulace 5 Hz (fyziologická tepová frekvence potkana v klidu). Dynamické změny těchto veličin jsou společně s průběhy AN znázorněny na obr. 7. A) B) Obr. 6 Ustálená akční napětí u komorové buňky potkana pří frekvenci stimulace.33, 1, 2, 2.5 a 3.33 Hz. A: Superponované experimentální záznamy, B: Superponované průběhy z modelu. Převzato z [3]. Jak vyplývá z obr. 7A, AN povrchové a tubulární membrány jsou na rozdíl od iontových proudů téměř identická. Tato shoda je důsledkem velké prostorové konstanty TATS (přibližně 24 µm) ve srovnání s délkou jednotlivých tubulů (střední délka 6.87 µm (Soeller a Cannel, 1999)) [2] a vysvětluje monoexponenciální pokles kapacitních proudů experimentálně měřených během napěťových pulzů. Zřetelný rozdíl mezi velikostí iontových proudů v povrchové a tubulární membráně je způsoben rozdílnými frakcemi příslušných transportních bílkovin v obou částech membrány (tab. 2) a do jisté míry také změnami iontových koncentrací v TATS během stimulačního cyklu. Simulaci časových proměn iontových koncentrací v intracelulárních kompartmentech a v TATS u modelu potkana ukazuje obr. 7B. Nejvýznamnější změny v cytoplazmě vykazuje koncentrace Ca 2+ (viz [Ca 2+ ] i ), která se na začátku AN rychle zvyšuje a posléze, během repolarizace, navrací ke své diastolické hodnotě. Hlavní příčinou tohoto přechodného zvýšení je vyplavení iontů Ca 2+ ze zásobáren sarkoplazmatického retikula (viz pokles [Ca 2+ ] JSR ) aktivované proudy I Ca,t a I Ca,s. Diastolická hladina [Ca 2+ ] i stanovená na konci cyklu ([Ca 2+ ] i,end =.23 µm) je v zobrazeném ustáleném stavu několikanásobně zvýšená oproti klidové hodnotě [Ca 2+ ] i ([Ca 2+ ] i,rest =.24 µm). Tento rozdíl odráží experimentálně pozorovanou intracelulární kumulaci Ca 2+, ke které dochází 14

A) B) Obr. 7 Základní elektrofyziologické děje v modelu komorové buňky potkana při frekvenci stimulace 5 Hz (klidová tepová frekvence potkana). A: Akční napětí a membránové proudy. Plná čára označuje děje v povrchové membráně a tečkovaná čára děje v tubulární membráně. Horizontální linie vyznačují nulové hladiny membránového napětí a proudů. B: Intracelulární a tubulární iontové koncentrace. Horizontální plné linie vyznačují nulovou hladinu intracelulární koncentrace [Ca 2+ ] i a velikost extracelulárních koncentrací [Ca 2+ ] e, [K + ] e a [Na + ] e. Horizontální tečkované linie ukazují klidové hladiny iontových koncentrací [Ca 2+ ] i, [Ca + ] t a [K + ] t. Převzato z [3]. 15

při zvyšování frekvence buněčné stimulace (Frampton et al., 1991 aj.). Paralelně s nárůstem [Ca 2+ ] i,end došlo též k významnému vzestupu diastolické hladiny [Na + ] i ([Na + ] i,end = 19.43 mm versus [Na + ] i,rest = 4.52 mm) a k poklesu diastolické hladiny [K + ] i ([K + ] i,end = 124.94 mm versus [K + ] i,rest = 14 mm). Přechodné změny [Na + ] i a [K + ] i během ustáleného stimulačního cyklu se však ukázaly být malé a z hlediska vlivu na buněčné elektrofyziologické děje nepodstatné. Tubulární koncentrace Ca 2+ se na začátku AN rychle snižovala (viz průběh [Ca 2+ ] t ), a to v důsledku aktivace I Ca,t a částečně také vlivem kladné polarity I NaCa,t, během které jsou ionty Ca 2+ přenášeny z TATS do cytoplazmy. Po inaktivaci I Ca,t se její hladina pozvolně vracela k hodnotě [Ca 2+ ] e (1.2 mm), k čemuž vedle difuze Ca 2+ z extracelulárního prostoru do TATS zásadně přispělo obrácení polarity I NaCa,t a aktivní odčerpávání Ca 2+ z cytoplazmy do TATS přes tubulární Ca-pumpu (I pca,t ). Vedle změn koncentrace Ca 2+ se v TATS ukázaly významné také změny koncentrace K + (viz průběh [K + ] t ). Nárůst [K + ] t během AN byl vyvolán aktivací draslíkových proudů I Kto,t, I Kss,t a I K1,t. Následné odeznění I Kto,t a I Kss,t, obrácení polarity I K1,t a aktivita I NaK,t byly naopak zodpovědné za pozdější snižování [K + ] t a její pokles pod úroveň [K + ] e ke konci cyklu. Analogické simulace byly provedeny také na modelu morčete [4]. Srovnání simulovaných a experimentálně získaných průběhů AN při různé frekvenci stimulace ukazuje obr. 8. Na rozdíl od srdečních buněk potkana dochází s rostoucí stimulační frekvencí u buněk morčete ke zužování AN (Wang et al., 1988). Analýza tohoto jevu na modelu ukázala, že toto zužování je způsobeno zejména frekvenčně závislou kumulativní inaktivací I Ca a rychlejším nástupem draslíkových proudů (I Kr a I Ks ), které se po ukončení repolarizace při vyšší rychlosti stimulace nestačí plně deaktivovat [4]. Časové proměny iontových proudů I Ca, I NaCa a I NaK, které jsou nejvýznamnější z hlediska vazby excitace-kontrakce a udržení intracelulární iontové rovnováhy, jsou společně s průběhy AN a [Ca 2+ ] i znázorněny na obr. 9. Obdobně i zde se projevily rozdíly mezi povrchovou a tubulární složkou membránových proudů dané jak odlišnými frakcemi příslušných transportních bílkovin v obou částech buněčné membrány (tab. 3) tak i iontově-koncentračními změnami v TATS. Pro stimulační frekvenci 4 Hz (fyziologická tepová frekvence morčete v klidu) jsou ustálené iontově-koncentrační změny v TATS ilustrovány na obr. 1. Za významné lze opět považovat přechodné snižování [Ca 2+ ] t na začátku AN (důsledek toku Ca 2+ z TATS do cytoplazmy přes I Ca,t a I NaCa,t ) a trvalé zvýšení hladiny [K + ] t nad hodnotu [K + ] e (důsledek toku K + z cytoplazmy do TATS přes I Kr,t, I Ks,t, I Kp,t a I K1,t ). A) B) experiment model Obr. 8 Ustálená akční napětí u komorové buňky morčete pří frekvenci stimulace 1, 2, 3, 4 a 5 Hz. A: Superponované experimentální záznamy převzaté z práce Wang et al. (1988) B: Superponované průběhy z modelu. Převzato z [4]. 16

Obr. 9 Akční napětí, intracelulární koncentrace [Ca 2+ ] i a membránové proudy I Ca (I CaL ), I NaCa a I NaK simulované na modelu komorové buňky morčete při stimulaci z klidového stavu a po dosažení ustáleného stavu při frekvenci stimulace 2, 4 a 6 Hz. Plná čára označuje děje v povrchové membráně a tečkovaná čára děje v tubulární membráně. Převzato z [4]. Obr. 1 Ustálené koncentrační změny Ca 2+, K + a Na + v TATS během stimulačního cyklu simulované na modelu komorové buňky morčete při frekvenci dráždění 4 Hz (klidová tepová frekvence morčete). Horizontální tečkované linie označují hladiny příslušných iontových koncentrací v klidovém stavu ([Ca 2+ ] t,rest = 1.79 mm, [K + ] t,rest = 5.46 mm, [Na + ] t,rest = 14 mm) a hladiny iontových koncentrací v extracelulárním prostoru ([Ca 2+ ] e = 1.8 mm, [K + ] e = 5.4 mm, [Na + ] e = 14 mm). Převzato z [4]. 17

2.4.2 Velikost iontově-koncentračních změn v TATS Velikost iontově-koncentračních změn v TATS byla u obou modelů vyšetřena v rozsahu stimulačních frekvencí 1-6 Hz (obr. 11) [3, 4, 5]. Odčerpávání iontů Ca 2+ z TATS u modelu potkana výrazně převažovalo nad jejich akumulací a zvyšování stimulační frekvence vedlo k nárůstu jeho maximální úrovně ze 7% na 14.5% (viz [Ca 2+ ] t - obr. 11A horní graf, vztaženo k hladině [Ca 2+ ] e ). Koncentrace [K + ] t současně oscilovala mezi nárůstem v rozsahu 2.7 4.1% a poklesem v rozsahu.4 1.3% (viz [K + ] t - obr. 11A spodní graf, vztaženo k hladině [K + ] e ). A) B) Rat [Ca 2+ ] t (%) 4-4 -8-12 -16 1 2 3 4 5 6 [Ca 2+ ] t (%) 4-4 -8-12 -16 Guinea pig 1 2 3 4 5 6 [K + ] t (%) 4 3 2 1-1 1 2 3 4 5 6 stimulation frequency (Hz) 1 2 3 4 5 6 Obr. 11 Frekvenční závislost ustálených koncentračních změn [Ca 2+ ] t a [K + ] t u modelu srdeční komorové buňky potkana (A) a morčete (B). Procentuální velikosti změn jsou vztaženy k hladinám extracelulárních koncentrací (potkan: [Ca 2+ ] e = 1.2 mm, [K + ] e = 5.4 mm; morče: [Ca 2+ ] e = 1.8 mm, [K + ] e = 5.4 mm). Převzato z [5]. [K + ] t (%) 4 3 2 1 stimulation frequency (Hz) U modelu komorové buňky morčete vykazovala koncentrace [Ca 2+ ] t jak pokles tak i nezanedbatelný nárůst (viz [Ca 2+ ] t - obr. 11B horní graf). Maximální přechodné snížení [Ca 2+ ] t o 13.8% bylo pozorováno při stimulační frekvenci 1 Hz, zatímco maximální přechodné zvýšení o 4.8% se ukázalo při stimulační frekvenci 2 Hz. Při dalším zvyšování stimulační frekvence obě koncentrační změny klesaly až na 6.1% a 1.3% při 6 Hz. Koncentrace [K + ] t mezitím vykazovala trvalý nárůst (viz [K + ] t - obr. 11B spodní graf), který v závislosti na stimulační frekvenci dosahoval maximálních hodnot 2.9-4%. Z uvedených simulací vyplynulo, že během aktivity dochází v TATS komorových buněk savců k významným iontově-koncentračním změnám z nichž převažuje snižování [Ca 2+ ] t a zvyšování [K + ] t [3, 4, 5]. Přes tuto společnou vlastnost obou modelů se však ukázaly významné rozdíly ve 18

velikosti a frekvenční závislosti těchto změn. Zatímco přechodné snižování [Ca 2+ ] t u modelu potkana vykazovalo při zrychlování stimulace nárůst ze 7% na 14.5% u modelu morčete byl pozorován jeho pokles z 13.8% na 6.1%. Hlavní příčinou těchto rozdílů byly odlišné vlastnosti membránového transportního systému u obou modelů určující velikost a frekvenční závislost iontového transportu přes tubulární membránu. 2.4.3 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na iontové proudy Jak vyplynulo z řady doposud publikovaných experimentálních prací (Kawai et al. 1999; Komukai et al. 22; Despa et al. 23; Brette et al. 24 aj.), tubulární složky klíčových iontových proudů, které spouštějí buněčnou kontrakci (I Ca ), udržují intracelulární iontovou rovnováhu (I NaCa ) nebo způsobují buněčnou repolarizaci (I Kto, I Kr, I Ks aj.), jsou podstatně větší než jejich ekvivalenty v povrchové membráně. Výsledky provedených simulací [3, 4, 5] ilustrované v předcházející kapitole ukázaly, že tyto proudové složky vedou k významným změnám iontových koncentrací v TATS. Dalším z dílčích cílů naší práce bylo vyšetřit zpětný vliv těchto koncentračních změn na průběh membránových proudů během fyziologické aktivity komorových buněk. U modelu komorové buňky potkana byly pro tento účel porovnány náboje přenesené membránovými proudy během.2 s trvajícího stimulačního cyklu před (ustálený stav při stimulační frekvenci 5 Hz) a bezprostředně po fixaci tubulárních iontových koncentrací na extracelulárních hladinách (tab. 5) [3]. Výsledky porovnání ukázaly, že zamezení iontověkoncentračních změn v TATS vede k významnému nárůstu přenesených nábojů Q Ca, Q Kto, Q Kss a Q K1, a tedy ke zvýšení příslušných proudů I Ca, I Kto, I Kss a I K1. Vedle těchto změn došlo také ke snížení náboje Q NaCa v důsledku omezení záporné a posílení kladné fáze proudu I NaCa. V uvedeném modelu tedy koncentrační změny v TATS snižovaly transmembránový tok Ca 2+ do buňky a výtok K + z buňky. A) B) Tab. 5 Účinek fixace iontových koncentrací v TATS na velikost nábojů přenesených membránovými proudy u modelu komorové buňky potkana. (A) Iontové náboje přenesené přes buněčnou membránu během jednoho cyklu při frekvenci stimulace 5 Hz. Horní řádek ukazuje hodnoty z modelu s koncentračními změnami v TATS v ustáleném stavu a spodní řádek hodnoty z téhož modelu bezprostředně po fixaci tubulárních iontových koncentrací na extracelulárních hladinách. (B) Procentuální vyjádření změn přenesených nábojů po fixaci tubulárních iontových koncentrací. Převzato z [3]. 19

Podobná analýza byla provedena také na modelu komorové buňky morčete, avšak s tím rozdílem, že velikosti nábojů přenesené membránovými proudy za přítomnosti či při absenci iontově-koncentračních změn v TATS byly počítány vždy po dosažení ustáleného stavu, a to při frekvencích stimulace 1, 4 a 6 Hz. Porovnávány byly pouze vybrané nábojové složky přenesené přes tubulární membránu (Q CaL,t, Q NaCa,t, Q K,t a Q K1,t ), které vykazovaly vysokou citlivost na změny iontových koncentrací v TATS. Tato analýza byla navíc provedena pro dvě varianty modelu (tab. 6A a 6B) [4]. V první byla použita základní časová konstanta τ Ca,t = 24 ms (tab. 4), umožňující rekonstruovat dynamiku změn amplitudy I Ca po rychlém zvýšení extracelulární koncentrace Ca 2+ z.45 mm na 1.8 mm (Shepherd a McDonough, 1998). Ve druhé byla tato konstanta zvýšena na hodnotu 1.3 s zohledňující podstatně pomalejší rychlost výplachu Ca 2+ z TATS, kterou u komorových buněk morčete pozorovali Blatter a Niggli (1998). Jak je z tab. 6A a 6B patrné, změny iontových koncentrací v TATS vedly k významnému snížení přenesených nábojů Q CaL,t, Q K,t a Q K1,t, a tedy i proudů I CaL,t, I K,t a I K1,t při všech třech stimulačních frekvencích u obou variant modelu. Náboj Q NaCa,t vykazoval naopak zvýšení, které ve všech případech odráželo pokles kladné a nárůst záporné fáze proudu I NaCa,t. Zvýšení časové konstanty τ Ca,t z 24 ms na 1.3 s způsobilo podstatný nárůst popsaného účinku (s výjimkou náboje Q K1,t ), a to v důsledku nárůstu iontověkoncentračních změn v TATS. Celkový účinek těchto změn v modelu komorové buňky morčete byl tedy konzistentní s účinkem v modelu komorové buňky potkana a vedl k poklesu jak transmembránového toku Ca 2+ do buňky tak i výtoku K + z buňky. A) B) Tab. 6 Procentuální vyjádření změn velikosti nábojů přenesených tubulárními proudy I CaL,t ( Q CaL,t ), I NaCa,t ( Q NaCa,t ), I K,t ( Q K,t = Q Kr,t + Q Ks,t ) a I K1,t ( Q K1,t ) během jednoho stimulačního cyklu v ustáleném stavu po zavedení iontově-koncentračních změn v TATS u modelu komorové buňky morčete (vztaženo k velikostem ustálených nábojů přenesených příslušnými proudy v modelu s tubulárními iontovými koncentracemi fixovanými na extracelulárních hladinách: [Ca 2+ ] e = 1.8 mm, [K + ] e = 5.4 mm, [Na + ] e = 14 mm). (A) Výsledky pro základní nastavení časové konstanty Ca 2+ výměny mezi tubulárním a extracelulárním prostorem (τ Ca,t = 24 ms, Shepherd a McDonough, 1998). (B) Výsledky pro τ Ca,t = 1.3 s (Blatter a Niggli, 1998). Převzato z [4]. Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na membránové proudy byl vyšetřován také během vnucených napěťových pulzů. Výsledky simulací publikované v naší prvotní studii [2] ukázaly, že negativní hodnoty proudu I K1 během hyperpolarizačních pulzů na napětí -1 mv až -16 mv 2

způsobují značné snížení koncentrace K + v TATS a následkem toho pokles I K1 kopírující změny [K + ] t. Podobné odezvy I K1 byly zjištěny během hyperpolarizačních pulzů aplikovaných u komorových buněk kočky (Harvey a Ten Eick, 1988). V jiných experimentech na komorových buňkách myší (Clark et al., 21) bylo po ukončení depolarizačních pulzů (z -8 mv na -3 až 5 mv) pozorováno pomalé doznívání celkového membránového proudu připisované poklesu proudu I K1 v jeho záporné fázi během snižující se akumulace K + v TATS. Tento fenomén byl rekonstruován také na modelu [2] po zahrnutí přechodného draslíkového proudu I Kto (repolarizační proud zodpovědný za akumulaci K + v TATS během depolarizace myších komorových buněk) do matematického popisu membránového transportu. 2.4.4 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na koncentrační změny Ca 2+ v buňce Výsledky výpočtového modelování vlivu iontově-koncentračních změn v TATS na membránové proudy komorových buněk ukázaly, že tyto změny snižují transmembránový tok Ca 2+ do buňky a výtok K + z buňky [3, 4]. Sekundárním efektem bylo také zvýšení transmembránového toku Na + do buňky. Hlavním a fyziologicky zajímavým důsledkem náhlé eliminace těchto změn (provedeno fixací tubulárních iontových koncentrací na hladinách iontových koncentrací v extracelulárním prostoru) při pravidelné stimulaci obou buněčných modelů byl postupný vzestup intracelulárních zásob Ca 2+ v sarkoplazmatickém retikulu ([Ca 2+ ] NSR ) a následně nárůst maximální úrovně přechodného zvyšování koncentrace Ca 2+ v cytoplazmě ([Ca 2+ ] i,max ) [3, 4]. Pro model komorové buňky potkana stimulovaný proudovými pulzy s frekvencí 1 a 5 Hz je tento účinek ilustrován na obr. 12 a po dosažení ustálených stavů na obr. 13. Obr.12 Koncentrační změny Ca 2+ v NSR ([Ca 2+ ] NSR ) a v cytoplazmě ([Ca 2+ ] i ) simulované na modelu komorové buňky potkana před (ustálený stav při frekvenci stimulace 1 a 5 Hz - tečkovaná čára) a po náhlé fixaci tubulárních iontových koncentrací na extracelulárních hladinách (plná čára). Převzato z [3]. Ačkoliv při stimulační frekvenci 1 Hz bylo ustálené zvýšení iontových koncentrací [Ca 2+ ] NSR,end (hladina [Ca 2+ ] NSR na konci cyklu) a [Ca 2+ ] i,max poměrně malé (obr. 13-1 Hz), při stimulační frekvenci 5 Hz, která odpovídá klidové tepové frekvenci potkana, způsobilo potlačení iontověkoncentračních změn v TATS jejich nárůst o 18.34% (.28 mm) a 24.5% (.28 µm, obr. 13-5 Hz) [3]. Lze tedy předpokládat, že v rozsahu fyziologické tepové frekvence potkana (5 8 Hz) mohou iontově-koncentrační změny v TATS významně snížit intracelulární náplň Ca 2+ u jeho komorových buněk a v konečném důsledku i sílu srdečního stahu. 21

[Ca 2+ ]t [Ca2+ ]i [Ca2+ ]NSR 1 Hz 5 Hz Obr. 13 Ustálené koncentrační změny Ca 2+ v NSR ([Ca 2+ ] NSR ), v cytoplazmě ([Ca 2+ ] i ) a v TATS ([Ca 2+ ] t ) u modelu komorové buňky potkana před (tečkovaná čára) a po fixaci iontových koncentrací v TATS na extracelulárních hladinách (plná čára) při frekvenci stimulace 1 a 5 Hz. Převzato z [3]. Na modelu komorové buňky morčete byly obdobné simulace provedeny jak pro velikost časové konstanty τ Ca,t 24 ms (tab. 4) tak i pro její vyšší hodnotu 1.3 s (vysvětleno v kap. 2.4.3). Výsledný účinek iontově-koncentračních změn v TATS na hladinu [Ca 2+ ] NSR,end a [Ca 2+ ] i,max (obr. 14) [4] byl však nižší než u modelu komorové buňky potkana [3, 5], což odráželo rozdíly ve vlastnostech membránového transportního systému a v parametrech TATS u obou druhů. Je tedy zřejmé, že výsledný rozsah iontově-koncentračních změn v TATS a jejich schopnost modulovat buněčnou aktivitu bude vykazovat významné odlišnosti v závislosti na zastoupení a charakteristikách transportních bílkovin v tubulární membráně stejně jako na geometrických parametrech TATS u různých druhů zvířat [4, 5, 7]. 1 Hz 6 Hz Obr. 14 Účinek iontově-koncentračních změn v TATS na hladinu [Ca 2+ ] v NSR ([Ca 2+ ] NSR ) a na velikost ustálených přechodných změn [Ca 2+ ] v cytoplazmě ([Ca 2+ ] i ) u modelu komorové buňky morčete při frekvenci stimulace 1 a 6 Hz. Plná čára reprezentuje výsledky z modelu s iontovými koncentracemi v TATS fixovanými na extracelulárních hladinách. Přítomnost iontověkoncentračních změn v TATS u modelu s časovou konstantou τ Ca,t = 24 ms (čárkovaná čára) a 13 ms (tečkovaná čára) vedla k poklesu hladiny [Ca 2+ ] NSR a následně ke snížení velikosti změn [Ca 2+ ] i. Převzato z [4]. 22

2.4.5 Shrnutí výsledků Srdeční komorové buňky obsahují hustou síť membránových tubulů zvanou transversálněaxiální tubulární systém (TATS). Z nedávných experimentálních prací vyplynulo, že klíčové složky membránového transportního systému zodpovědné za iniciaci buněčné kontrakce a za udržení intracelulární iontové rovnováhy se nachází převážně v membráně TATS (Brette a Orchard, 23 - přehled) a že rychlost iontové výměny mezi TATS a extracelulárním prostorem je značně omezena (Yao et al., 1997; Shepherd a McDonough, 1998; Blatter a Niggli, 1998). Vyšetření fyziologických důsledků funkce TATS prostřednictvím matematických modelů vyústilo v řadu následujících poznatků: Během elektrické aktivity komorových buněk dochází v omezeném prostoru TATS k významným změnám iontových koncentrací (pokles [Ca 2+ ] t o 7 2 %, nárůst [K + ] t o 2 4 %) [2, 3, 4], jejichž velikost a frekvenční závislost se u různých druhů zvířat liší v závislosti na specifických vlastnostech membránového transportního systému [4, 5]. Kumulativní účinek změn tubulárních iontových koncentrací (především přechodného snižování [Ca 2+ ] t ) může vést k významnému poklesu intracelulární náplně Ca 2+ a ke snížení přechodných koncentračních změn Ca 2+ v cytoplazmě, které určují sílu buněčné kontrakce [3, 4, 7]. Změny elektrického napětí mezi povrchovou a tubulární membránou jsou velmi rychle vyrovnávány (během 2 µs) v důsledku silné elektrické vazby mezi oběma membránami. AN obou membránových subsystémů jsou proto téměř identická [4, 6]. 3 MODELOVÁNÍ ÚČINKU FARMAK NA MEMBRÁNOVÉ PROUDY SRDEČNÍCH BUNĚK 3.1 HISTORIE VZNIKU A VÝVOJE MODELŮ Historie modelů popisujících mechanizmus účinku farmak na membránové proudy srdečních buněk není příliš dlouhá. Její rozvoj byl podmíněn až rostoucími znalostmi o struktuře a funkci jednotlivých membránových kanálů stejně jako vzrůstajícím množstvím experimentálních výsledků charakterizujících interakci těchto kanálů s vyšetřovanými látkami. Situaci v této oblasti komplikuje skutečnost, že působení řady farmak na membránový transportní systém závisí nejen na koncentraci účinné látky, ale také na membránovém napětí (např. [11, 12, 13]) a na historii buněčné elektrické aktivity (např. Šimurdová et al. 1997). Snaha o vysvětlení této komplexní závislosti vedla k návrhu hypotézy modulovaného receptoru, kterou v roce 1977 formuloval Hille a nezávisle také Hondeghem a Katzung. Tato hypotéza předpokládá, že: (i) afinita molekul farmak ke kanálovému receptoru stejně jako rychlost s jakou se tyto molekuly k receptoru vážou závisí na aktuálním stavu kanálu; (ii) vazba molekul farmak ke kanálovému receptoru ovlivňuje rychlost přechodů mezi jednotlivými stavy kanálu, a tedy proces zvaný vrátkování kanálu. Od 8-tých let minulého století byla v souladu s touto hypotézou sestavena již řada modelů, které vysvětlovaly mechanizmus interakce farmakologicky účinných látek z různými druhy membránových kanálů (Hondeghem a Katzung, 1984; Brennan et al., 29). Kvantitativní popis těchto interakcí je zpravidla odvozen z kinetických schémat vrátkování a blokády kanálů, které jsou navrhovány na základě experimentálních dat a vystihují předpokládané stavy, kterými kanály při interakci s molekulami látky prochází. Charakteristiky příslušných membránových proudů získané z experimentů v kontrolních podmínkách a za působení farmak jsou také podkladem pro stanovení rychlostních konstant mezistavových přechodů u těchto schémat. Ty pak určují vlastnosti vrátkování a blokády kanálů v modelech. 23