Odborný redaktor: Prof. MUDr. Robert Bardfeld, CSc.

REFERÁTOVÝ VÝBĚR Z REVMATOLOGIE č. 1/2003 Odborný redaktor: Prof. MUDr. Robert Bardfeld, CSc. Vydává: Národní lékařská knihovna, Sokolská 54, 121 32 Praha 2 ISSN 0034-2882 Svazek 43 Literární a technická redakce: publikační oddělení NLK tel. 296 181 802 Do čísla 1/2003 přispěli: Prof. MUDr. R. Bardfeld, CSc. MUDr. S. Hrnčířová MUDr. O. Kryštůfková Doc. MUDr. M. Kučera, CSc. Seznam excerpovaných časopisů Journal of Rheumatology Zeitschrift főr Rheumatologie Transplantation Proceedings J.Rheum. Z.Rheum. Transplant.Proc. Obsah: Referáty ze zahraniční literatury Přehledné články Školicí akce v revmatologii

Systematické roztřídění referátů A. Klinika 1. Revmatoidní artritida 2. Juvenilní chronická artritida 3. Reaktivní artritidy, revmatická horečka 4. Séronegativní spondartritidy, ankylozující spondylitida 5. Infekční a jiné artritidy 6. Dna a jiné krystalické artropatie 7. Osteoartróza kloubů a páteře 8. Difuzní choroby pojiva, systémové vaskulitidy 9. Nemoci svalstva 10. Nemoci kostí, osteoporóza 11. Mimokloubní revmatismus, fibromyalgie B. Etiopatogeneze C. Diagnostika D. Laboratorní výsledky 1. Imunologie, sérologie 2. Hematologie, morfologie 3. Biochemie 4. Rtg a jiné zobrazovací metody 5. Kloubní tekutiny 6. Experimentální studie E. Terapie 1. Analgetika 2. Nesteroidní antirevmatika 3. Léky modifikující chorobu (DMARDs) 4. Kortizonoidy 5. Farmakoterapie dny a hyperurikemie 6. Farmakoterapie osteoporózy 7. Ostatní farmakoterapie (SYSADOA) 8. Imunoterapie 9. Lokální terapie (intraartikulární injekce, masti, gely) 10. Fyzikální terapie a rehabilitace 11. Revmatochirurgie 12. Jiné

R E F E R Á T Y A. KLINIKA 2. Juvenilní chronická artritida 1. TAKKEN, T., HEMEL, A., van der NET, J. a ost.: Aerobní vytrvalost dětí s juvenilní idiopatickou artritidou: systematický přehled. /Aerobic fitness in children with juvenile idiopathic arthritis: A systematic review./ J.Rheum., 29, 2002, č. 12, s. 1643-1647. Juvenilní idiopatická artritida (JIA) je běžně mezinárodně navrhovaný název pro klasifikaci chronické dětské artritidy. Diagnóza je potvrzena, je-li začátek artritidy před 16. rokem věku, je-li trvání příznaků delší než 6 týdnů a jsou-li jiné známé příčiny vyloučeny. Dá se rozlišit 7 zřetelných subtypů JIA. Děti s JIA bývají méně fyzicky zdatné než zdravé děti. Projevy této kloubní nemoci, jako je vleklá bolest a ztuhlost kloubu, synovitida a deformita, jsou někdy přičítány nízkým úrovním tělesné aktivity. V literatuře existují neshody, pokud jde o tzv. aerobní fyzickou zdatnost nemocných s JIA. Smyslem tohoto rozboru bylo určit, zda je aerobní fyzická zdatnost měřená během stupňovaného maximálního cvičebního testu u dětí s JIA odlišná při srovnání se zdravými dětmi a zda by tento rozdíl mohl být klinicky významný. Systematický průzkum literatury byl proveden s použitím MED- LINE, CINAHL, EMBASE a SPORTDiscus. Vhodné tituly byly konfrontovány a data z těchto publikací byla extrahována. Maximální spotřeba kyslíku (VO 2peak ; in ml.kg -1.min. -1 ) během maximálního cvičebního testu (až do volního vyčerpání) byla použita jako základní výsledek pro tento rozbor. Výsledky: v literatuře bylo identifikováno celkem 9 studií. Údaje z 5 studií (144 pacientů) byly dány do metaanalýzy. VO 2peak nemocných JIA byl 21,8 % (95 % CI 13.7, 29.9) nižší, než tento u zdravých dětí (p < 0.0001). Závěry: průzkum autorů této práce ukázal, že děti nemocné JIA mají mírné až těžké oslabení ve svých VO 2peak, jsou-li srovnány se zdravými dětmi, což ukazuje na významně nižší tělesnou zdatnost. Toto postižení fyzické zdatnosti může být zapříčiněno atrofií

svalových vláken. Toto by však mělo být ověřeno fyziologickými studiemi svalstva při JIA. Nemocným JIA by se měl doporučovat dlouhodobý cvičební program, směřující ke zlepšení tělesné zdatnosti, jakož i ke snížení možnosti vývoje svalové atrofie. (27 citací) Bardfeld 6. Dna a jiné krystalické artropatie 2 MÖCKEL, G., PERKA, C., BUTTGEREIT, F.: Tumorózní kalcinóza. /Tumoröse Kalcinose./ Z.Rheum., 61, supl., 2002, č. 1, s. I/60. Idiopatická tumorózní kalcinóza je řídce se vyskytující onemocnění nejasné etiologie. Častěji je pozorováno ve vztahu k renální insuficienci. Jsou popisováni 2 nemocní na hemodialýze, u nichž vzniklo těžké omezení kloubní hybnosti. Bylo zjištěno masivní ukládání kalcia periartikulárně, jako následek sekundárního hyperparatyreoidismu. U obou nemocných byla zpočátku aplikována léčba medikamenty, vážícími fosfáty, byla modifikována hemodialýza a zlepšena (upravena) dieta. Kalcinóza však progredovala. U jednoho nemocného byla provedena subtotální paratyreoidektomie. Bezprostředně po zákroku došlo během 4 týdnů k rychlému úbytku kalciových depozit na pravém rameni, levém loketním a zápěstním kloubu. Avšak na pravém kyčelním kloubu kalcinóza narůstala dále; pomocí MRT byl zjištěn její rozsah 12 x 12 x 19 cm. Biopsií byla potvrzena tumorózní kalcinóza. Později došlo k recidivě kalcinózy na rameni a na SI kloubech. Druhý nemocný chirurgický zákrok na příštítných tělíscích odmítl. Renální osteopatie, kombinace osteomalacie (nedostatek kalciferolu) a osteoklasie (nadprodukce parathormonu), může při produktu kalciumfosfátu 5,8 mmol/l vést k mimokloubním osifikacím. Ústup kalciových depozit u nemocných s tumorózní kalcinózou byl popsán, včetně autory uvedeného nemocného, jen ojediněle. Při vzniku otoku měkkých tkání v okolí kloubu je třeba provést rtg vyšetření (ev. následně MRT), aby byla ev. diagnostikována tumorózní kalcinóza. Pokud jsou tyto nálezy pozitivní, je třeba vyšetřit kalciumfosfátový metabolismus a renální funkce.

V terapii je vhodné nejprve aplikovat látky vážící fosfáty, u hemodialyzovaných upravit dialýzu a dietu. Při nedostatečném efektu této terapie by měla být provedena subtotální paratyreoidektomie. Při lokální excizi kalcifikačních mas je vysoké riziko recidiv. Kučera 7. Osteoartróza kloubů a páteře 3 BUTTGEREIT, F.: Molekulární mechanismus osteoporózy indukované glukokortikoidy. /Molecular mechanism of glucocorticoid-induced osteoporosis./ Z.Rheum., 61, supl. 1, 2002, č. 1, s. I/34. Ztráty kostní masy při dlouhodobém podávání kortikoidů jsou obvyklé a klinicky relevantní. Glukokortikoidy přímo působí negativně na osteoblasty a osteocyty; zvýšená aktivita osteoklastů vede ke snížení remodelace kosti, snížení reparace jejích mikropoškození a pravděpodobně ke zvýšené kostní resorpci. Efekt PTH je v přítomnosti glukokortikoidů výraznější; vitamin D hraje méně významnou roli při vzniku osteoporózy indukované glukokortikoidy. Glukokortikoidy jsou antagonisté funkcí pohlavních žlaz a inhibují osteoanabolické působení pohlavních hormonů. Vzrůstá eliminace Ca ledvinami, snižuje se jeho reabsorpce v tubulech. To vede k negativní bilanci Ca a tím k sekundárnímu hyperparatyreoidismu. Všechny tyto efekty působení glukokortikoidů jsou již dlouhodobě pokládány za zprostředkované na molekulární úrovni, zvláště v genomech. V poslední době se zjišťuje tzv. rychlý efekt glukokortikoidů; ten není kompatibilní s výše uvedenými mechanismy působení glukokortikoidů. Nejde o genonomický efekt. Je zprostředkován interakcí glukokortikoidů s biologickou membránou buněk, buď vazbou na jejich membránové receptory, nebo fyzikálně-chemickou interakcí. Je možné, ale ještě nedostatečně prokázané, že tyto efekty hrají roli v patogenezi osteoporózy indukované glukokortikoidy. Kučera 9. Nemoci svalstva

4 PONGRATZ, D.: Dermatomyositis, polymyositis, myositis s inkluzivními tělísky aktuální aspekty diagnostiky a terapie. /Dermatomyositis, Polymyositis, Einschlusskörpermyositis Aktuelle Aspekte der Diagnostik und Therapie./ Z.Rheum., 61, 2002, supl. č. 1, s. I/36. Tři hlavní skupiny myozitid, vzniklých na imunitním podkladě, jsou dermatomyozitida (DM), idiopatická polymyozitida (PM) a myozitida s inkluzivními tělísky (IBM). Lze je odlišit histologicky (biopsií), zčásti také podle nálezu autoprotilátek (MAA). U DM lze zjistit v histologickém nálezu perifascikulární změny; infiltráty se zde skládají především z B a CD4 lymfocytů. Příležitostně se zjistí vaskulitida malých cév a imunohistologickými metodami uloženiny C5 B9 komplementu. Za patogenní agens PM se považují cytotoxické CD 8 lymfocyty. Ty pronikají do ještě nenekrotizovaných svalových vláken. Dochází také k expresi antigenů MHC 1. Vznik IBM je vyvoláván tvorbou filament v jádrech a jejich vyplavením do cytoplazmy s následnou cytotoxickou chronickou myozitickou reakcí. Vedle morfologické klasifikace myozitid pomáhá v diagnostice také nález antigenů. Jejich prostřednictvím lze odlišit syndromy spojené s myozitidou od myozitid autoimunitních. Vzdor získaným poznatkům není terapie imunitních myozitid zcela jednotná. Aplikují se glukokortikoidy a imunosupresiva. Pokud tato léčba není dostatečně účinná nebo vzniknou nežádoucí účinky či při rychle progredující IBM, těžké formě DM s autoprotilátkami Mi 2 a subakutní PM s autoprotilátkami SRP, se aplikují nebo k dosavadní terapii přidávají imunoglobuliny (IVIC terapie). Odpovídající studie o aplikaci imunofarmak proti jednotlivým imunogenním cytokinům nejsou ještě uzavřeny. Předneseno na 31. kongresu Německé společnosti pro revmatologii 18. 21. srpna 2002. Kučera C. DIAGNOSTIKA

5 DÖRNER, T.: Diferenciálně diagnostické aspekty sicca symptomatologie. /Differential-diagnostische Aspekte der Sicca- Symptomatik./ Z.Rheum., 61, 2002, supl. č. 1, s. I/32-I/33. Sicca symptom se může vyskytnout u řady interních a revmatických onemocnění. Sicca syndrom je chronické progredující autoimunitní onemocnění exokrinních žlaz. Je buď primární, nebo jej zjišťujeme jako sekundární u řady dalších autoimunitních chorob, jako např. u revmatoidní artritidy, systémového lupus erythematodes, progresivní systémové sklerodermie a u překryvného syndromu, primární biliární cirhózy, autoimunitní hepatitidy, sclerosis multiplex, myastenia gravis, autoimunitní tyreoiditidy, smíšené kryoglobulinemie a dalších. Nutno odlišit sicca symptomatologii, která se zjistí u onemocnění, která nejsou autoimunitního původu, jako např. fibromyalgie, deprese, sarkoidóza, infekce působené viry HI a hepatitidy C. Zjistí se také u syndromu štěp versus hostitel a allogenní transplantace kostní dřeně, a to poměrně často. Sicca symptomatologii může vyvolat také aplikace řady více než 300 léků. K rozlišení sicca-syndromu a sicca symptomů u ostatních onemocnění neautoimunitních lze užít průkazu autoprotilátek proti komplexu Ro/La nebo histologického nálezu biopsie ze rtů. Hlavní komplikací sicca syndromu (primárního) je vznik nonhodgkinovského lymfomu, jehož časné stadium je předmětem aktuálního výzkumu. Předneseno na 31. kongresu Německé společnosti pro revmatologii, 18. 21. srpna 2002. Kučera E. TERAPIE 12. Jiné 6 WULFFRAAT, M., de KLEER, I., BRINKMAN, D. a ost.: Transplantace autologních kmenových buněk u nezvládnutelné juvenilní idiopatické artritidy: nynější výsledky a perspektivy. /Autologous stem cell transplantation for refractory juvenile idiopathic

arthritis: Current results and perspectives./ Transplantation Proceedings, 34, 2002, č. 7, s. 2925-2926. Chronická zánětlivá autoimunitní onemocnění, jako je dětská systémová juvenilní idiopatická artritida (JIA nebo Stillova nemoc), mohou představovat vážnou destruktivní a dokonce životu nebezpečnou nemoc. Nynější léčba zahrnuje stále silnější imunosupresivní léky nebo jejich kombinace. Vedlejší účinky prolongované imunosuprese a závažnost rezistentní nemoci vybídly klinické a vědecké pracovníky, aby hledali nové možné způsoby léčení. Byla navržena transplantace autologních kmenových buněk (auto-sct) jako možná léčba těžkých autoimunitních nemocí, jako je revmatoidní artritida, sclerosis multiplex, systémová skleróza a systémový lupus erythematosus. Od roku 1996 podstoupilo auto-sct více než 500 pacientů s různými autoimunitními nemocemi a mezi nimi velmi omezený počet dětí. Zkušenost s auto-sct při dětských revmatických nemocech je velmi omezená. V centru, kde pracují autoři, léčili 18 dětí s těžkou nebo polyartikulární JIA. Kritériem pro zařazení byla nepochybná progresivní aktivita nemoci přes použití vysokých dávek kortikosteroidů (> 0,3 mg/kg/den nutné pro zvládnutí příznaků), metotrexátu, cyklosporinu, cyklofosfamidu a anti-tnf (byl-li vhodný). Do EBMT registru bylo nahlášeno 43 pacientů s JIA z 12 evropských transplantačních center. První zkušenost s dětmi s těžkou JIA, které byly léčené pomocí auto-sct, byla publikována již dříve. Autoři této práce podávají zprávu o rozšíření studie v Nizozemí, která teď zahrnuje 18 dětí s JIA, jež byly sledovány od 6 do 58 měsíců. Studie byla zahájena v roce 1997. Z těchto dětí mělo 15 systémovou JIA a 3 polyartikulární JIA. Všechny měly progresivní aktivitu nemoci trvající déle než 3 roky. Klinickými charakteristikami byly u všech dětí průběh polyartritidy s erozemi, osteoporózou, opožděným vzrůstem, jakož i s obdobími skákající horečky a vyrážkou. Většina trpěla vedlejšími účinky v souvislosti s podáváním steroidů. Průměrný časový interval mezi diagnózou a transplantací byl 6 let (rozmezí 24 až 137 měsíců). Výsledky sledování: 8 pacientů nemuselo užívat žádné léky po dobu 24 až 58 měsíců sledování a měli více než 50% pokles skóre CHAQ, dále globální odhad lékařem a otok kloubů. FW a CRP se vrátily k normě. U 4 dětí byla jen částečná odpověď s 30% zlepšením

nemoci. Dále 4 pacienti vykazovali úplný relaps nemoci za 3 až 8 měsíců po auto-sct a byla jim zase nasazena antirevmatika. Zbylých 7 vykazovalo více než 50% zlepšení. Dva nemocní zemřeli na syndrom aktivace makrofágů (MAS). První z nich měl tento syndrom indukovaný virem EBV 4 měsíce pro auto-sct. V době infekce tímto virem byla u pacienta JIA v remisi. Další případ fatálního MAS nastal 18 dní po transplantaci, zatímco byl stále v kompletní aplazii. Výskyt MAS při JIA po auto-sct může být způsoben deplecí T-buněk rezultující při neadekvátním řízení aktivace makrofágů. Závěr: Auto-SCT indukuje u této skupiny těžce nemocných pacientů velmi signifikantní a bezlékovou remisi nemoci, a to u většiny nemocných, nicméně vede také k významnému riziku vývoje fatálního MAS. Proto je nutno identifikovat faktory, které mohou predisponovat jednotlivce k MAS, jako je virová infekce. Dále se doporučuje méně hluboká deplece T-buněk, dohled na systémovou nemoc před transplantací, jakož i pomalé snižování dávky steroidů po auto-sct. Bardfeld 7 GROMNICA-IHLE, E.: Antikoagulační terapie u antifosfolipidového syndromu postup v obvyklých a v problematických situacích. /Antikoagulation bei Anti- Phospholipid-Syndrom - das Vorgehen in der Standard und in der Problemsituation./ Z.Rheum., 61, 2002, č. 1, supl., s. I/28. Optimální terapii antifosfolipidového syndromu (APS) nelze jednoznačně určit, chybí větší studie. U nemocných s akutními cévními uzávěry možno užít fibrinolýzy (pokud není v daném případě kontraindikována). Pak je vhodné a úspěšné u flebotrombóz navázat dlouhodobé podávání antikoagulancií, kumarinových derivátů. Po vynechání této antikoagulační terapie dochází k retrombózám během prvního roku. U arteriálních trombóz s vysokými titry ACLA a LA je třeba rovněž počítat s recidivujícími trombotickými komplikacemi. Je třeba zvážit antikoagulační léčbu s cílem zabránit agregaci trombocytů. Problémem je současný vznik (výskyt) trombocytopenie a trombózy. Doporučuje se při hodnotách trombocytů 50-100 Gpt/l snažit se o dosažení INR v mezích 2-3. Při poklesu trombocytů pod 50 Gpt/l podávat kortikoidy. Při rezistenci na aplikaci kortikoidů byl

popsán pozitivní efekt Dapsonu, Danazolu a chlorochinu na počet trombocytů. Při vzniku katastrofického APS je možno aplikovat fibrinolýzu a plazmaferézu. U žen s aborty v anamnéze a s pozitivním nálezem apl se doporučuje následující postup: při zjištění gravidity užívat acidum acetylosalicylicum 75 mg/den. Při objevení srdečních tonů dítěte přidat nefrakcionovaný heparin (např. 5000 j/12 hod.). Aplikaci kyseliny acetylosalicylové možno ukončit ve 34. týdnu těhotenství, v heparinizaci pokračovat. Pokud není tato léčba účinná nebo pokud přetrvává trombocytopenie rezistentní na kortikoidy, je možno aplikovat vysoké dávky imunoglobulinů i.v. spolu s nízkými dávkami kyseliny acetylosalicylové. Ženy s nálezy apl nemají užívat antikonceptiva obsahující estrogeny. Předneseno na 31. kongresu Německé revmatol. společnosti, 18.- 21. srpna 2002. Kučera PŘEHLEDNÉ ČLÁNKY DIABETES MELLITUS I. TYPU AUTOIMUNITNÍ INZULITIDA (Nové možnosti léčby či oddálení manifestace onemocnění?) Kučera, M., Kratochvíl, P., Carvátová, J. Diabetes mellitus I. typu (DM I.) je v současné době pokládán za autoimunitní inzulitidu (AII), při níž dochází k postupné destrukci β buněk (B buněk) produkujících inzulin a k postupnému vývoji onemocnění. Doba od počátků scestné imunitní reakce až po trvalou klinickou a laboratorní manifestaci DM I. se odhaduje na měsíce až roky. DM I. vzniká u disponovaných osob, u nichž lze obvykle prokázat nálezy určitých typů HLA systému, zakódovaných v genech. Uvádí se spojení s HLA DR 3 a DR 4; v poslední době podle nálezů pomocí molekulární genetiky je zdůrazňována především asociace s HLA DQ 2 (alely DQB1 0201) a DQ 8 (alely DQB1 0302).

Dispozice ke vzniku DM I. je zakódována v genech také mimo HLA systém (non-hla), a to především v oblasti lokusu pro inzulin. Naopak osoby se zakódovaným HLA DR2 a DQ 6 (alela DQB1 0602) údajně k DM I. nedisponují. Vznik AII možno podle literárních údajů rozdělit na: 1. fázi, kdy na genetickém podkladě dochází působením mechanismů (patol. stavů, chorob), ke spuštění autoimunitní reakce (AII), 2. fázi probíhající inzulitidy (AII) bez klinické a laboratorní symptomatologie DM I., a to i v období zátěžových stavů (nízký počet destruovaných β buněk), 3. fázi porušené glukózové tolerance, kdy při závažných onemocněních, psychických stresech, ev. dalších zátěžích organismu lze zjistit přechodné laboratorní i klinické příznaky DM (obvykle mírné); destruován je již výraznější počet β buněk, 4. fázi manifestního DM I., kdy je zničeno kolem 80 % β buněk. Imunologické změny při AII. Scestný imunologický děj je patrně vyvolán některými pro organismus patogenními procesy (mechanismy). Uvažuje se o virových onemocněních, působených viry coxackie, chřipky, parotitidy, rubeoly, adenoviry, dále pohlavními hormony v pubertě, graviditě, o vlivech toxických, nutričních, dalších závažných onemocněních, psychických stresech apod. Předpokládá se geneticky zakódovaná dispozice (viz výše). Nejprve dochází k infiltraci β buněk prezentujícími antigeny (APC) a aktivovanými TH lymfocyty, především TH 1, produkujícími prozánětlivé cytokiny (uváděny především interferon gama - INF γ a tumor nekrotizující faktor - TNF). Prozánětlivé cytokiny působí progresi AII, aktivují další T lymfocyty, vyvolávají další expresi HLA antigenů na povrch buněk, aktivují makrofágy a adhezivní molekuly. Jako hlavní antigeny, které se uplatňují při vzniku AII, jsou označovány dekarboxyláza kyseliny glutamové, tyrozinová fosfatáza a inzulin, proti nimž vznikají protilátky (GADA, ICA, IA, IA-2, IA-A). Podle některých autorů nepůsobí tyto protilátky patogenně, ale slouží jako markery AII, což by znamenalo, že k poškození beta buněk imunokomplexy nedochází.

Vzhledem k autoimunitnímu původu DM I. vznikla myšlenka léčit toto onemocnění imunosupresivy, cyklosporinem A, azathioprinem, prednisonem, antithymocytovým sérem, monoklonálními protilátkami proti CD3. Zatím jde o celkem ojedinělé pokusy. Vhodnost této léčby před ev. zavedením do praxe by bylo nutné řádně ověřit na dostatečně velkých sestavách. (Zásah do imunitního systému je obtížný a rizikový.) Pokud by se tato léčba osvědčila, tj. významně oddálila nutnost aplikovat inzulin, prodloužila by se doba pro vznik komplikací, zejména těch, které vznikají až po řadě let od začátku choroby. Domníváme se, že by nebylo vhodné užít kortikoidy pro jejich nepříznivý vliv na glycidový metabolismus. Rovněž agresivní imunosupresiva typu cyklofosfamidu by nebyla vhodná. K tomuto léčebnému pokusu by bylo možno užít mírně až středně působící imunomodulans, které nebývá provázeno nebezpečnými nežádoucími účinky, které lze poměrně snadno odstranit. Domníváme se, že k tomuto léčebnému pokusu ovlivnit inzulitidu by byl v našich podmínkách vhodný cyklosporin A (např. prep. Consupren, fy IVAX). Cyklosporin A se osvědčil v léčbě řady autoimunitních chorob, především revmatoidní a psoriatické artritidy, systémového lupus erythematodes.

ZÁKLADNÍ BUNĚČNÉ A MOLEKULÁRNÍ PRINCIPY REMODELACE KOSTI U REVMATOIDNÍ ARTRITIDY Obsah MUDr. Olga Kryštůfková Revmatologický ústav Praha Atestační práce 1. Postižení kosti u revmatoidní artritidy 2. Remodelace kosti 3. Osteoklast 4. Osteoblast 5. RANKL/RANK/OPG molekuly regulující diferenciaci a aktivitu osteoklastů 5.1 RANKL (RANK ligand) 5.2 RANK (receptor aktivující nukleární faktor kappa B) 5.3 OPG (osteoprotegerin) 6. Intracelulární signalizace po vazbě RANK 7. Zvířecí k/o modely 8. RANKL/OPG v synoviální tkáni revmatoidní artritidy 8.1 Cytokiny ovlivňující expresi RANKL a přenos signálu jím indukovaného 8.2 Cílené ovlivnění osteoklastogeneze u zvířecích modelů artritidy 8.3 Klinické studie

9. Závěr 10. Literatura 11. Seznam použitých zkratek 1. Postižení kosti u revmatoidní artritidy Revmatoidní artritida (RA) je chronické, zánětlivé, destruktivní onemocnění kloubů s progresivním průběhem, vedoucí k závažným poruchám hybnosti, mimokloubním i celkovým projevům. Snižuje kvalitu života a zkracuje život v průměru o 5-10 let. Kromě změn měkkých tkání spojených se synovitidou dochází k projevům lokálního i systémového účinku zánětlivého procesu na kostní remodelaci s převahou resorpce zprostředkované osteoklasty. Pro toto onemocnění jsou charakteristické 3 základní typy postižení kosti (obr. 1). /20/: Obr. 1 Základní typy kostního postižení u revmatoidní artritidy 1) Fokální zánět bezprostředně postihuje subchondrální a juxtaartikulární kost. V tomto případě proliferující synoviální tkáň s aktivovanými fibroblasty a s infiltrátem zánětlivých buněk (lymfocyty, plazmatické buňky, aktivované makrofágy, dendritické buňky) tvoří pannus, který invazivně prorůstá do přilehlé kosti za

vzniku lokální osteolýzy. Tak vzniká charakteristický obraz cystických kostních erozí, prokazatelný při rentgenovém vyšetření. Častý nález mnohojaderných buněk s fenotypovými znaky osteoklastů na rozhraní kost-pannus vedl k předpokladu přímé účasti buněk derivovaných z pannu na resorpci kosti. Tyto osteoklasty se diferencují z prekurzorů monocyto-makrofágové linie pod vlivem růstových faktorů, cytokinů a v důsledku signálů iniciovaných mezibuněčným kontaktem s aktivovanými buňkami proliferující synoviální tkáně. /45/ 2. Juxtaartikulární osteoporóza je dalším typem postižení kosti u RA. Postihuje kostní tkáň přilehlou k oblasti zánětem postižených kloubů. Histologickým vyšetřením této kostní tkáně byl zjištěn zvýšený výskyt osteoklastů, osteoidu a resorpčních povrchů. Tento nález je provázen známkami zvýšeného kostního obratu. Lokální shluky zánětlivých buněk v kostní dřeni obsahují makrofágy a lymfocyty, které jsou aktivovány prozánětlivými mediátory ze synoviální tkáně a účastní se osteoklastogeneze. Snížení mobility při synovialitidě postiženého kloubu se též podílí na lokální kostní ztrátě. /19/ 3. Třetím typem postižení kosti u RA je generalizovaná osteoporóza spojená se zvýšeným rizikem zlomenin krčku femuru a obratlových těl. Bylo prokázáno, že generalizovaný úbytek kostní hmoty je signifikantní především na počátku onemocnění RA a závisí na aktivitě základního zánětu. /21/ Uvažuje se o systémovém účinku prozánětlivých cytokinů uvolněných ze synoviální tkáně do cirkulace. U tohoto typu postižení kosti je však také nutno zohlednit vliv některých léků užívaných při léčbě RA (a to zvláště kortikoidů), dále pak věk, pohlaví nemocných a hormonální nerovnováhu na úrovni hladin estrogenů. Při absenci léčby kortikoidy se podle histologických nálezů v kostní biopsii na výsledném stavu více podílí snížení kostní novotvorby. Při vysoké aktivitě RA se však zvyšují i biochemické známky kostní resorpce v korelaci s hladinami CRP. Při terapii kortikoidy se na celkovém úbytku kostní hmoty více podílí zvýšení kostní resorpce v souvislosti s prodlouženým přežíváním osteoklastů. Nedostatek estrogenů je provázen zvýšenou diferenciací osteoklastů. /6/ 2. Remodelace kosti

Obr. 2 Vliv osteotropních faktorů na remodelaci kosti Novotvorba a remodelace kosti zahrnuje syntézu kostní matrix osteoblasty, která je v rovnováze s resorpcí kosti osteoklasty. Jde o fyziologický proces, který se uplatňuje v průběhu růstu, reparace mikrotraumat a při udržování homeostázy vápníku. Za patologických podmínek, při osteoporóze a vývoji kostních erozí, převáží osteoresorpce nad novotvorbou. Osteoresorpce je indukována kalcitropními hormony (parathormon, kalcitriol, kalcitonin), prozánětlivými cytokiny (IL-11, IL-6, TNFα, IL-1, IL-17), prostaglandiny a glukokortikoidy. /10/ Tyto faktory (s výjimkou kalcitoninu) nepůsobí na diferenciaci a aktivaci osteoklastů přímo, ale prostřednictvím aktivace osteoblastů, které tvoří molekuly regulující osteoklastogenezi: RANKL (ligand pro receptor aktivující nukleární faktor kappa B) a osteoprotegerin (OPG). Rovnováha mezi osteoresorpcí a novotvorbou kosti je bezprostředně řízena poměrnou koncentrací těchto molekul v mikroprostředí kosti (obr. 2). 3. Osteoklast

Osteoklast je obrovská mnohojaderná buňka (má v průměru 4-20 jader), která vzniká v mikroprostředí kosti fúzí myeloidních prekurzorů, ze kterých je odvozena jak linie monocytomakrofágová, tak linie osteoklastů (obr. 3). Je možné navodit diferenciaci osteoklastů i z cirkulujících monocytů, splenocytů a některých tkáňových makrofágů. Obr. 3 Diferenciační schéma osteoklastogeneze /6/ Osteoklast má dobře vyvinutý Golgiho komplex kolem každého jádra, četné lysozomální vezikuly, charakteristické polarizované uspořádání intracelulárních organel a zónu prstovitých výběžků, které tvoří hrubý kartáčový lem, orientovaný směrem k resorbované kosti. Vyzrálé osteoklasty lze identifikovat průkazem tartarát rezistentní kyselé fosfatázy (TRAP), kalcitoninového receptoru (CTR), vitronektinového receptoru (integrin αvβ3, CD51/CD61), p60 c-src,

cathepsinu K a na základě jejich schopnosti vytvářet resorpční jamky na kostních a dentinových površích. Osteoklasty vylučují kyselou fosfatázu, kolagenázu a další proteolytické enzymy, které natráví kostní matrix a uvolňují zvápenatělou kostní hmotu. Diferenciace a aktivace osteoklastu je indukována vazbou molekuly RANK (receptor aktivující nukleární faktor kappa B) exprimované na povrchu prekurzorové buňky a jejího ligandu RANKL. K této vazbě dochází buď mezibuněčným kontaktem s aktivovaným osteoblastem, případně jinou buňkou nesoucí na povrchu tento ligand, nebo vazbou rozpustné formy RANKL (srankl). K proliferaci, diferenciaci a vývoji do plně aktivní osteoklastové buňky je zapotřebí přítomnosti růstového faktoru M-CSF (faktor stimulující kolonie makrofágů), který je v kosti tvořen osteoblastovými/stromálními buňkami. /75/ Další osud osteoklastu je určen poměrem RANKL a OPG. Pokud převáží v prostředí OPG, vyváže molekuly RANKL a osteoklast zanikne apoptózou, díky absenci aktivačních a protiapoptotických signálů. /36/ 4. Osteoblast Osteoblasty se diferencují ze společných mezenchymálních progenitorů (tzv. pluripotentních mezenchymových kmenových buněk). Během maturace získávají charakteristické fenotypové znaky. Patří mezi ně vysoká aktivita intracelulární alkalické fosfatázy. Osteoblasty také exprimují receptory pro různé hormony (VDR pro 1α,25 dihydroxyvitamin D3, PTHR pro parathormon, receptory pro estrogen a pro glukokortikoidy), které regulují jejich diferenciaci. Parathormon, PTHrP (parathormon related peptid), prostaglandin E2 a IL-1 (interleukin 1) indukují diferenciaci osteoblastů signalizační cestou proteinové kinázy A (PKA). Prostřednictvím signální molekuly gp 130 (130 kda glykoprotein) je osteoblastogeneze stimulována cytokiny IL-11, IL-6 a cytokiny nadrodiny IL-6 (LIF leukemia inhibitory factor, OSM oncostatin M a CNTF ciliary neutrotrophic factor). /31, 56/ Diferenciace osteoblastů je ovlivněna také řadou lokálních faktorů, jako BMPs (bone morphogenic proteins), leptiny, TGF-β, hedgehogs a transkripční faktory (core-binding factor α-1, Cbfa1). /72/ BMPs jsou na extracelulární úrovni inhibovány specifickými inhibitory, jako noggin a chondrin. Exprese TGF-β a Cbfa1 v osteoblastech je regulována glukokortikoidy. Hlavní funkcí osteoblastu je tvorba mineralizované kostní hmoty. Mají životnost 1-

10 týdnů. Po skončení formativní fáze přestavby kosti se některé osteoblasty mění v buňky lemující kost, některé z nich mizí apoptózou a řada z nich se změní v osteocyty obklopené osteoidem. /10/ Obr. 4 Osteoblastová/stromální buňka Funkční osteoblasty a jejich prekurzory jsou nezbytné pro diferenciaci osteoklastů z progenitorových buněk. Z experimentů in vitro byla odvozena existence hypotetického membránového faktoru, který indukuje diferenciaci osteoklastů (ODF, SOFA). /56, 12/ Později bylo prokázáno (viz níže), že osteoblasty jsou, pod vlivem osteotropních faktorů, zdrojem růstového faktoru M-CSF, RANKL a osteoprotegerinu (OPG). Poměr exprese RANKL a OPG byl experimentálně modulován 1α,25(OH) 2 D 3, PGE 2 a PTH. /46/ Na modelech PTHR1 - / - a VDR - / - k/o myší bylo prokázáno, že stimulace osteoblastů parathormonem a vitaminem D zprostředkuje diferenciaci osteoklastů v ko-kultivačních experimentálních systémech in vitro. /40, 77/ Tvorba OPG je snižována glukokortikoidy. Porucha diferenciace osteoblastů vede k útlumu osteoklastogeneze snížením exprese RANKL. Při ko-kultivaci buněk kalvy myší s poruchou vyzrávání osteoblastů (Cbfal - / - a + / - k/o) s normálními splenocyty byly získány osteoklasty se sníženou schopností resorbovat kost. Exprese RANKL mrna ve vzorcích kosti Cbfal - / - a + / - k/o embryí nebyla

detekovatelná, nebo byla snížená. /18/ V přítomnosti prozánětlivých cytokinů (IL-11, IL-6, TNFα, IL-1, IL-17) produkovaných aktivovanými T lymfocyty a synoviocyty je indukována vyšší exprese RANKL osteoblasty u zánětlivých onemocnění. /34/ Tab. 1 Přehled účinku osteotropních faktorů na tvorbu RANKL a OPG v experimentálních podmínkách. /34/ Stimulace produkce OPG Stimulace produkce RANKL 17-β-estradiol PTH/PTHrP 1α,25(OH) 2 D 3 1α,25(OH) 2 D 3 TNFα, IL-1 TNFα, IL-1, IL-6, IL-11, IL-17 TNFβ1 bmp glukokortikoidy, PGE 2 inhibice produkce OPG inhibice produkce RANKL PTH/PTHrP TGFβ1 glukokortikoidy, PGE 2 Účinek těchto faktorů na osteoklastogenezi je duální, některé stimulují, jiné inhibují RANKL či OPG a výsledný poměr osteoresorpce a novotvorby záleží na výsledném poměru RANKL/OPG (tab. 1). 5. RANKL/RANK/OPG molekuly regulující diferenciaci a aktivitu osteoklastů Klíčový mechanismus koordinující osteoblastogenezi a osteoklastogenezi je založen na interakci tří recentně objevených molekul z rodiny TNF ligandů a receptorů, jejichž doporučené názvosloví je RANK, RANKL a OPG. /5/ Při zkoumání biologických mechanismů osteoklastogeneze bylo v různých experimentálních systémech nejprve zjištěno, že pro tvorbu osteoklastů je nutný kontakt mezi buňkami osteoblastové a hematopoetické linie. Byla vytvořena hypotéza, že osteoblastové či stromální buňky po stimulaci osteotropními faktory (např. vitamin D, PTH, IL-11, IL-6, IL-1, PGE 2 ) exprimují na svém povrchu faktor, který indukuje vývoj osteoklastů z prekurzorů monocytomakrofágové linie. Tento hypotetický faktor byl nezávislými skupinami označen

jako SOFA (stromal osteoclast forming activity) nebo ODF (osteoclast differentiation factor). /12, 56/ Nejprve však byly během roku 1997 dvěma nezávislými skupinami klonovány cdna kódující identický protein, který inhiboval osteoresorpci a tvorbu osteoklastů in vivo i in vitro. Simonet a ost. identifikovali nový protein během výzkumu sekvencí proteinů krysího střeva. /54/ Jeho aplikace krysám zvyšovala kostní denzitu u normálních i ovarektomizovaných krys. Přidání ke tkáňovým kulturám snižovalo množství aktivních osteoklastů v závislosti na dávce. Injekční aplikace krysám snižovala hladinu kalcia v séru. Vzhledem k osteoprotektivní schopnosti byla tato nová molekula pojmenována OPG osteoprotegerin (akronym slov osteo + protegere). Paralelně Tsuda a ost. izolovali ze supernatantu kultur linie lidských embryonálních plicních fibroblastů protein, který inhiboval tvorbu osteoklastů: OCIF osteoclastogenesis inhibitory factor. /66, 74/ Nezávisle na těchto osteologických studiích byl dalšími dvěma skupinami izolován identický protien při studiu imunokompetentních buněk, pojmenovaný podle systému, ve kterém byl prokázán, TR1 (TNF receptor-like molecule 1) a FDCR-1 (follicular dendritic cell receptor-1). /64, 78/ Další experimenty vedly k identifikaci ligandu pro OPG exprimovaného na buňkách myelomonocytární linie, který se na OPG specificky vázal, inaktivoval jeho biologickou funkci, a byl proto pojmenován OPGL (osteoprotegerin ligand) /36/, a který splňoval kritéria pro SOFA/ODF tím, že indukoval diferenciaci osteoklastů. Ten byl nejprve nalezen na lidských fibroblastech jak v membránové, tak solubilní formě r. 1998 a později se ukázalo, že je identický s molekulami TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine) /71-75/ a RANKL (receptor aktivující nukleární faktor kappa B ligand). /3/ TRANCE byl klonován (1997) při hledání genu regulujícího apoptózu na T lymfocytech a jeho exprese je indukována vazbou T buněčného receptoru (TCR). Tento receptor je přítomen také na dendritických buňkách (DC), jeho aktivace inhibuje apoptózu DC. RANKL byl zjištěn jako vazebná molekula receptoru aktivujícího NFkB (RANK), který byl již dříve objeven při výzkumu TNF receptorů typu I. V souvislosti s účastí v diferenciaci osteoklastů byl

pojmenován též ODAR (Osteoclast differentiation and activation receptor). /26/ Tab. 2 Nomenklatura molekul regulujících diferenciaci a aktivitu osteoklastů její synonyma. /55, 5/ (*názvosloví doporučené 1998 TNF konferencí) Funkce Termín Synonyma Ligand RANKL (RANK ligand) *TNFSF-11 (TNF SOFA (Stromal osteoclast forming activity) ODF (Osteoclast differentiation factor) OPGL (Osteoprotegerin ligand) TRANCE (TNF-related activation-induced cytokine superfamily 11) Receptor RANK (Receptor aktivující nukleární faktor kappa B) ODAR (Osteoclast differentiation and activation receptor) *TNFRSF-11A (TNF Vazebný receptor superfamily receptor 11A) OPG (Osteoprotegerin) *TNFRSF-11B (TNF superfamily receptor 11B) OCIF (Osteoclastogenesis inhibitory factor) TR1 (TNF receptor-like molecule 1) FDCR-1 (Follicular dendritic cell receptor 1) Podle názvosloví doporučeného 1998 TNF konferencí jsou tyto molekuly označeny jako TNFSF-11 (TNF superfamily 11), TNFSF- 11A a TNFSF-11B (viz tab. 2). Americkou společností pro výzkum kosti a minerálů (ASBMR) však bylo doporučeno v osteologických studiích používat již zažité názvosloví RANKL, RANK a OPG. /5/ 5.1 RANKL (RANK ligand)

V kostní tkáni se vyskytuje jako transmembránový protein, který je tvořen trimolekulárním komplexem exprimovaným stromálními buňkami kostní dřeně a osteoblastovými buňkami. Rozpustná forma vzniká enzymatickým odštěpením homotrimeru od transmembránové části metaloproteinázou-disintegrin TACE (TNFα konvertující enzym) nebo přímou sekrecí. Má zachovanou kapacitu vázat RANK (obr. 5) a je z hlediska potenciace osteoklastogeneze biologicky funkční (44). Aktivované, fibroblastům podobné synoviocyty jsou významným zdrojem RANKL u revmatoidní artritidy. /53/ Je také významně exprimován chondrocyty a primitivními mezenchymálními buňkami. V imunitních orgánech byl zjištěn v lymfatických uzlinách, thymu a v lymfatických střevních placích. Exprese RANKL na CD4 + a CD8 + T lymfocytech je indukována vazbou TCR. Byl prokázán v extraskeletální tkáni ledvin, srdce, mozku, svalů a kůže /34/ a na nezralých CD4 - /CD8 - lymfocytech. Indukuje diferenciaci a aktivaci osteoklastů a prodlužuje jejich přežití. Hraje klíčovou roli v přežití a aktivaci DC a T lymfocytů a v organogenezi lymfatických uzlin. Jeho tvorba je pozitivně řízena tzv. osteoresorpčními faktory: 1α25(OH) 2 D 3, PTH/PTHrP, IL-11, IL- 6, TNFα, IL-1, IL-17, glukokortikoidy a PGE 2. 5.2 RANK (receptor aktivující nukleární faktor kappa B) Je exprimován myeloidními progenitorovými buňkami, preosteoklasty i vyzrálými osteoklasty, chondrocyty, dendritickými buňkami T a B buněčnými liniemi, epiteliálními buňkami prsní žlázy a buňkami trofoblastu jako membránový heterotrimér. Po jeho vazbě s ligandem RANKL dochází v kosti k diferenciaci, aktivaci preosteoklastových buněk v plně funkční osteoklasty a k prodloužení jejich přežití. /14, 27/ V dendritických buňkách (DC) přenáší signál RANKL T lymfocytů indukující aktivaci, produkci cytokinu IL-12, který též indukcí antiapoptotických faktorů prodlužuje přežití DC. Interakce RANK (na DC) RANKL (na T lymfocytech) má podobný účinek jako interakce CD40 (na DC) CD40L (na T lymfocytech), avšak dochází k ní v pozdní fázi aktivace. 5.3 OPG (osteoprotegerin)

Jde o rozpustný, inhibující vazebný decoy receptor pro RANKL. V prostředí kosti je stvořen především stromálními buňkami kostní dřeně a osteoblasty ve formě homodiméru. /28, 54/ Poprvé byl izolován ze supenatantů linie embryonálních plicních fibroblastů stimulovaných 1α,25(OH) 2 D 3, PTH nebo IL-11 /66/, poté byla prokázána současná produkce RANKL i OPG synoviálními fibroblasty po stimulaci 1α,25(OH) 2 D 3. /57/ Existuje jedna literární zpráva o indukci sekrece OPG i fibroblastům podobnými synoviálními buňkami, izolovanými z revmatoidní synovie po stimulaci IL-1 a TNFα in vitro. /79/ Obr. 5 RANKL, RANK a OPG a jejich vliv na diferenciaci a aktivaci osteoklastů OPG byl zjištěn v dalších, extraskeletálních tkáních (aorta a velké tepny, plíce, srdce, střevo, ledviny, thymus, slezina). Osteoprotegrin se účastní modulace osteoklastogeneze kompetitivní inhibicí vazby RANKL na RANK, což vede k inhibici aktivace osteoklastů a zkrátí jejich přežití. Mimo skelet je předpokládána kompetitivní inhibice vazby TRAIL na receptory exprimované T lymfocyty a dendritickými buňkami a inhibice apoptózy těchto buněk

indukované TRAIL. /13, 3, 71/ Je však také možná OPG mediovaná interference antiapoptotickým vlivem T buněk na dendritické buňky zprostředkovaným interakcí molekul RANKL a RANK. /30/ OPG zřejmě také působí proti rozvoji kalcifikací velkých tepen. Jeho tvorba je stimulována estrogeny, 1α,25(OH) 2 D 3, TNFα, IL-1 a TGFβ1. 6. Intracelulární signalizace po vazbě RANK Po vazbě ligandu na receptor RANK jsou aktivovány adaptorové molekuly TRAF6 a c-src (obr. 6). Obr. 6 Intracelulární signalizace po vazbě RANK Dále dochází k aktivaci signálních cest JNK (Jun N terminal kinase a transkripčních faktorů c-fos/c-jun) a NF-k B (nukleární faktor kappa B), které jsou důležité pro diferenciaci a aktivaci osteoklastu. Aktivace signální cesty proteinové kinázy B (PKB/Akt) zprostředkuje antiapoptotické signály a reorganizaci cytoskeletu osteoklastu. /25/ Na úrovni inhibice signálních cest omezuje osteoklastogenezi zpětnovazebný vliv interferonů. Interferon γ (IFN-γ) tvořený T lymfocyty inhibuje přenos signálu ubikvitinilací a proteolytickou degradací TRAF6. /4, 62/ Interferon β (IFN-β) parakrinně sekretovaný

osteoklasty inhibuje JNK cestu inhibicí exprese transkripčního faktoru c-fos. /2, 59, 60/ 7. Zvířecí k/o modely Za fyziologických podmínek závisí osteoklastogeneze při remodelaci kosti na rovnováze mezi signalizací RANKL-RANK a tvorbou biologicky aktivního OPG. Tyto mechanismy fyziologické remodelace kosti byly doloženy studiemi in vitro /37/ i na modelech knock/out (k/o) myší, kdy jeden z genů je mutován nebo deletován. Fenotyp těchto k/o myší se řídí tím, která úroveň vyzrávání osteoklastu byla v modelu vyřazena z funkce (obr. 7). Těmito modely je ověřena vývojová linie osteoklastů a doložena nezbytnost, případně zastupitelnost solubilních, transmembránových i intracelulárních faktorů, které se na indukci osteoklastogeneze podílejí. PU.1 - / - myši mají defektní transkripční faktor myeloidní linie, chybí jim osteoklasty i buňky monocyto-makrofágové linie. Tento defekt se fenotypově projeví osteopetrózou. Homozygotní myši umírají na těžké infekce, protože nemají funkční makrofágy. /65/ Podobnou poruchu mají op/op - / - myši, které mají mutaci genu pro M- CSF. Ta se fenotypově projeví osteopetrózou, která se upraví po systémovém podání M-CSF, případně spontánně při dostatečné tvrobě GM-CSF, vzhledem k redundanci účinku M-CSF a GM-CSF na osteoklastogenezi. M-CSF není tedy nezbytný pro vývoj osteoklastů. Tyto myši mají také poruchu ve vyzrávání makrofágů, protože M-CSF je nezbytný pro proliferaci myeloidních progenitorů a k diferenciaci monocytomakrofágové linie. /16, 76/ Nezastupitelnost diferenciačního faktoru RANKL byla ověřena modelem RANKL - / - myší, které mají těžkou osteopetrózu, zpomalení růstu a defekt erupce zubů. /35, 68/ Podobný fenotyp mají k/o RANK - / - myši. Mají osteopetrózu, zpomalení růstu a erupce zubů a jejich buňky jsou rezistentní na kalcitropní a osteoklastogenní podněty (PTH/PGHrP, VitD). /35/ RANK i RANKL k/o modely mají poruchu ve vyzrávání lymfatických uzlin a B lymfocytů, což ilustruje imunologickou funkci těchto molekul.

Obr. 7 Příklady k/o modelů myší a jejich fenotypů OPG - / - myši mají v homozygotním stavu osteoporózu, deformity kostní a fraktury. /35/ V heterozygotním stavu (OPG + / - ) jsou osteopenické. /10/ Hyperexprese OPG způsobuje u transgenních myší osteopetrózu s normální erupcí zubů a prodloužením kostí vzniklou na podkladě inhibice endosteálních, nikoliv periostálních osteoklastů. /54/ Delece transkripčních faktorů osteoklastů se fenotypově projeví osteopetrózou. Myši c-fos - / - a NF-κB - / - nemají osteoklasty. /17, 22/ TRAF6 - / - a c-src - / - tvoří osteoklasty, které nejsou plně funkční. /9, 41/ TRAF6 je tedy nezastupitelný v aktivaci osteoklastů. K jejich vyzrávání zřejmě přispívají i jiné faktory nebo ostatní TRAF adaptorové molekuly. Defekt v transkripčním faktoru cbfa1 osteoblastů se projeví u cbfa1 - / - osteoporózou a cbfa1 + / - osteopenií. /31/ Úlohu T lymfocytů v osteoklastogenezi ilustruje model k/o myší CTLA-4 - / - (cytolytic T-lymphocyte associated molecule-4), které mají spontánně aktivované T lymfocyty a mají sklon k agresivně

probíhajícím lymfoproliferativním a autoimunitním onemocněním. Při trvalé vysoké aktivaci T lymfocytů mají těžkou osteoporózu. /35/ Podobně se zřejmě podílí imunitní systém na rozvoji osteoporotických komplikací humánních onemocnění s chronickou systémovou aktivací T lymfocytů (autoimunitní onemocnění, virové infekce, místní záněty s progresí do kostních struktur, kostní metastázy, reakce na kostní implantáty, artritidy). /28/ 8. RANKL/OPG v synoviální tkáni revmatoidní artritidy V revmatoidní synovii je místní poměr RANKL/OPG modifikován expresí RANKL a tvorbou jeho solubilní formy aktivovanými T lymfocyty a fibroblastům podobnými buňkami synoviální tkáně (fibroblast like synoviocytes FLS). /35/ Exprese RANKL je navíc indukována místně tvořenými prozánětlivými cytokiny. Infiltrující T lymfocyty jednak exprimují membránový i solubilní RANKL, ale také indukují tvorbu prozánětlivých cytokinů sekrecí IFNγ a IL-17 a mezibuněčným kontaktem s FLS a MLS. Tyto buňky exprimují nebo indukují expresi RANKL a také tvoří cytokiny, které působí aditivně s RANKL. /50/ Pod vlivem místní nadprodukce RANKL dochází k osteoklastogenezi diferenciací buněk prekurzorové myeloidní a makrofágové linie (obr. 8). Experimentálně byla indukována fúze tzv. makrofágům podobných buněk revmatoidní synoviální tkáně (MLS) v mnohojaderné buňky in vitro po inkubaci s RANKL a M-CSF. Tyto buňky ztrácely charakteristický monocytární znak CD14 a exprimovaly fenotypové znaky specifické pro osteoklasty (TRAP, vitronektinový receptor, CTP). Podobně diferencovaly do buněk nesoucích fenotyp osteoklastů MLS nebo mononukleární buňky periferní krve v ko-kultuře pouze s revmatoidními FLS za přítomnosti M-CSF. /61/ Dalším in vitro průkazem diferenciace revmatoidních synoviocytů (MLS) do osteoklastů byla indukce mnohojaderných buněk nesoucích znak monocyto-makrofágové linie CD68 při kokultivaci MLS s RANKL pozitivními FLS. /27, 55/ Synoviální fibroblasty jsou navíc zdrojem růstového faktoru M- CSF a dalších cytokinů (IL-6, IL-15, IL-1), které perpetuují osteoklastogenezi aktivací osteoblastových/stromálních buněk /57/, které tvoří RANKL i M-CSF. FLS také indukují destruktivní změny

chrupavky působením enzymů metaloproteináz, serinových proteáz a cathepsinů. V experimentu na krysím modelu adjuvantní artritidy se ukázalo, že OPG působí také chondroprotektivně, tedy je možné, že interakce RANK-RANKL se podílí i na destrukci chrupavky při artritidě. /35/ Přidání IL-1 a TNFα in vitro do kultury k fibroblastům podobným synoviocytům izolovaným z revmatoidní synovie zvyšovalo jejich spontánní sekreci OPG. /79/ Obr. 8 Podíl aktivovaných buněk zánětlivé synoviální tkáně na indukci osteoresorpce Makrofágům podobné synoviální buňky (MLS) produkují TNFα a IL-1, které jsou významným aktivačním podnětem pro preosteoklastové buňky i aktivní osteoklasty. /50, 67/ Ukazuje se, že systém tří klíčových molekul řídících remodelaci kosti je také součástí kostimulačních signálů, potřebných k aktivaci T lymfocytů a při jejich dalším vývoji do Th1/Th2 fenotypu a k indukci

tvorby cytokinů a chemokinů. Důležitou roli má systém RANK/RANKL/OPG i ve vztahu k dendritickým buňkám (DC), které exprimují na buněčné membráně RANK umožňující interakci s T lymfocyty. Místní i systémová aktivace T lymfocytů a jejich spolupráce s dendritickými buňkami tedy může být podkladem lokálních i celkových projevů osteopenie u revmatoidní artritidy. /34/ 8.1 Cytokiny ovlivňující expresi RANKL a přenos signálu jím indukovaného Jak již bylo výše řečeno, interleukiny IL-1, IL-11, IL-17 a komplex IL-6 a jeho rozpustného receptoru (IL-6/sIL-6R) přítomné v revmatoidní synoviální tkáni uplatňují svůj osteoklastogenní účinek indukcí exprese RANKL po vazbě na specifické receptory osteoblastových/stromálních buněk. Prozánětlivé cytokiny TNFα, IL-1 podporují indukci exprese RANKL na osteoblastových (stromálních) buňkách, ale i na FLS a T lymfocytech v RA synoviální tkáni. Byla uvažována přímá indukce diferenciace osteoklastů TNFα za přítomnosti M-CSF nezávisle na systému RANKL-RANK a jeho blokádě OPG. /33/ Další práce však tuto teorii nepotvrdily a byla dokázána nutnost přítomnosti permisivních hladin RANKL pro iniciaci diferenciace osteoklastů. Nicméně byl prokázán jednoznačný aditivní účinek TNFα pro osteoklastogenezi. /38, 39/ Interferon γ (INF-γ) tvořený T lymfocyty omezuje účinek vazby RANKL na receptor preosteoklastové buňky inhibicí přenosu signálu ubikvitinilací a proteolytickou degradací adaptorové molekuly TRAF6. /4, 62/ Interferon β (IFN-β) parakrinně sekretovaný osteoklasty zpětnovazebně brzdí RANKL-RANK indukovanou signalizaci zprostředkovanou cestou JNK, takže inhibuje expresi transkripčního faktoru c-fos. /2, 59, 60/ 8.2 Cílené ovlivnění osteoklastogeneze u zvířecích modelů artritidy Na krysích modelech adjuvantní artritidy (AdA, indukované aplikací mykobakteria tuberkulózy v adjuvans) a kolagenem indukované artritidy (CIA, indukované podkožní injekcí kolagenu II. typu) byl doložen protektivní efekt osteoprotegerinu. Synovitida obou modelů je provázená vysokou produkcí TNFα a v místech erozí jsou

přítomné osteoklasty exprimující TRAP a CTR. V synoviocytech a infiltrujících buňkách modelů krysí AdA i CIA byla prokázána RANKL mrna in situ hybridizací v oblastech erozivních změn, bohatých na osteoklasty. /15, 35, 49/ Rekombinantní OPG při podání testovaným krysám v počátku onemocnění AdA či CIA zabránil vzniku destruktivních změn, aniž by byla ovlivněna zánětlivá složka artritidy. /1, 35/ Protektivní účinek OPG byl na dávce závislý (obr. 9). Také podání fúzovaného proteinu Fc-OPG v krysím CIA modelu výrazně redukovalo přítomnost osteoklastů a zamezilo rozvoji erozí. /51/ Obr. 9 Model krysí, adjuvans indukované artritidy s rozvojem destrukcí subchondrální (s), trabekulární (t) i kortikální kosti (c) s bohatým mononukleárním infiltrátem (*) a vznikem pannu (šipka). Při léčbě OPG na počátku artritidy (obr. c, vpravo) jsou nadále přítomny zánětlivé změny, provázené infiltrátem, ale nedojde k akumulaci osteoklastů a ke vzniku destrukcí. Slibné výsledky dávaly též experimenty kombinující podání osteoprotegerinu s anticytokinovou terapií neutralizující TNFα

(stnfri solubilní TNF receptor I) nebo Il-1α a Il-1β (IL-1Ra rekombinantní antagonista receptoru pro interleukin 1) AdA krysám. /8/ V těchto případech bylo dosaženo větší redukce kostních erozí než u zvířat léčených pouze anticytokinovou terapií, závislé na dávce obou přípravků použitých v kombinaci. Další experiment byl založen na snížení tvorby RANKL a prozánětlivého cytokinu IL-17 geneticky indukovanou nadprodukcí IL-4 v modelu myší CIA, která předešla poškození chrupavky i kosti. /42/ Na úrovni intracelulární signalizace byla cíleně potlačena tvorba artritických destrukcí csk genovou terapií suprimující src kinázu v experimentálním modelu AdA. /58/ 8.3 Klinické studie Dosavadní poznatky o podílu interakcí molekul RANK, RANKL a OPG na patogenezi kostního poškození jsou podložené především experimenty in vitro a studiemi na zvířecích modelech. Klinické studie se začínají objevovat v posledních dvou letech. Sérové hladiny OPG ve zdravé populaci se pohybují v hodnotách ng/ml. Ve studii srovnávající hladiny OPG v séru 346 zdravých mužů (ve věku 23-90 let) a 304 zdravých žen (ve věku 21-93 let) bylo zjištěno, že hladina OPG v séru stoupá s věkem u mužů i žen. Ženy před menopauzou měly OPG vyšší než muži mladší 50 let, zatímco nebyly rozdíly v hladinách OPG mezi ženami po menopauze a muži věku 50 a více let. Byla zjištěna závislost hladin OPG na hladinách pohlavních hormonů. OPG negativně koreloval s hladinou biologicky dostupného testosteronu a kostní denzitou a pozitivně s markery kostní resorpce u mužů. U zdravých žen nebyly v této studii zjištěny korelace mezi hladinami estrogenu nebo testosteronu a OPG. /32/ U 73 žen po menopauze (věku 61-76 let), které měly osteoporózu, byly nalezeny vyšší hladiny OPG proti kontrolám věkem srovnatelným. /73/ V první klinické studii jednorázová aplikace rekombinantního osteoprotegerinu, v dávce 3 mg/kg subkutánně, snižovala hladiny markeru kostní resorpce (močového N-telopeptidu NTX) v průměru po dobu 6 týdnů u žen po menopauze (n = 10). V kratším sledování podání OPG snižovalo exkreci NTX v závislosti na dávce OPG (0,1-