MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV CHEMIE Plazmonové rezonanční vlastnosti kovových nanočástic v koloidních roztocích pro SERS aminokyselin Bakalářská práce David Přichystal Vedoucí práce: Mgr. Dušan Hemzal, Ph.D Brno 2015

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: David Přichystal Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav chemie Plazmonové rezonanční vlastnosti kovových nanočástic v koloidních roztocích pro SERS aminokyselin Chemie Biofyzikální chemie Mgr. Dušan Hemzal, Ph.D Akademický rok: 2014/2015 Počet stran: 50 Klíčová slova: Ramanova spektroskopie; SERS; SERRS; laditelný laser; nanočástice; rhodamin 6G; aminokyseliny

Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree Programme: Field of Study: Supervisor: David Přichystal Faculty of Science, Masaryk University Department of chemistry Plasmon Resonance Properties of Metallic Nanoparticles in Colloidal Solutions for SERS of Amino Acids Chemistry Biophysical Chemistry Mgr. Dušan Hemzal, Ph.D Academic Year: 2014/2015 Number of Pages: 50 Keywords: Raman spectroscopy; SERS; SERRS; tunable laser; nanoparticles; rhodamine 6G; amino acids

Abstrakt Cílem této bakalářské práce je vylepšení Ramanova spektrometru o možnost využít kontinuálně laditelný laserový zdroj a aplikovat ho pro měření povrchem zesíleného rezonančního Ramanova rozptylu (SERRS) rhodaminu 6G v koloidních roztocích s různou morfologií nanočástic. Velikost a tvar nanočástic jsou hlavními faktory ovlivňujícími jejich plazmonové rezonanční vlastnosti, které jsou majoritní příčinou zesílení Ramanova rozptylu. Plazmonová rezonance silně závisí na vlnové délce záření, tudíž je užitečné využít laditelný laser pro lepší chápání SERS efektu a získání největších možných zesílení sledováním korelace mezi absorpčními spektry a SERS zesílením. Dále se práce také věnuje měření SERS spekter nízkých koncentrací některých aminokyselin. Abstract The goal of this bachelor thesis is to upgrade Raman spectrometer with possibility of using tunable laser source and apply it for detection of surface enhanced resonance Raman scattering (SERRS) of rhodamine 6G in colloidal solutions with different nanoparticle morphology. Size and shape of nanoparticles are main factors affecting their plasmon resonance properties, which are major reason for Raman scattering enhancement. Plasmon resonance strongly depends on excitation wavelength, therefore it is useful to use tunable laser for better understanding of SERS effect and for obtaining strongest enhancement by monitoring correlations between absorption spectra and SERS enhancement. Furthermore, this thesis deals with measuring SERS spectra of some amino acids in low concentrations.

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Mgr. Dušanu Hemzalovi, Ph.D za čas, který mi věnoval, cenné rady, připomínky k práci a především za ochotu, trpělivost a možnost vypracovat tuto práci na Ústavu fyziky kondenzovaných látek. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno, 29. května 2015 David Přichystal

Obsah Seznam použitých zkratek... 1 Úvod... 2 Teoretická část... 3 1 Ramanova spektroskopie... 3 1.1 Historie a rozvoj metody... 3 1.2 Vibrační stavy molekul... 3 1.3 Rozptyl světla... 5 1.4 Instrumentace... 9 1.5 Pokročilé metody Ramanovy spektroskopie... 10 2 SERS... 12 2.1 Elektromagnetický mechanismus zesílení... 12 2.2 Mechanismus zesílení přenosem náboje... 20 2.3 SERS substráty... 21 Experimentální část... 23 Seznam použitých chemikálií... 23 3 Příprava roztoků nanočástic... 24 3.1 Postup přípravy koloidů zlata a stříbra... 24 3.2 Charakterizace koloidů zlata a stříbra... 25 4 SERRS spektroskopie s kontinuálně laditelným laserem... 28 4.1 Instrumentace... 28 4.2 Příprava vzorků a měření... 31 4.3 Výsledky a diskuze... 33 5 SERS některých aminokyselin... 43 5.1 Příprava vzorků... 43 5.2 Výsledky... 43 Závěr... 48 Literatura... 49

Seznam použitých zkratek AgNPs AuNPs NPs RRS SEF SERS SERRS WS SERES TERS UV VIS NIR LSPR LFIEF EF CT AFM STM SEM TEM AOTF AMK PVP PVA SDS stříbrné nanočástice zlaté nanočástice nanočástice rezonanční Ramanův rozptyl povrchem zesílená fluorescence povrchem zesílený Ramanův rozptyl (spektroskopie) povrchem zesílený rezonanční Ramanův rozptyl (spektroskopie) povrchem zesílená Ramanova excitační spektroskopie se skenem vlnových délek hrotem zesílený Ramanův rozptyl (spektroskopie) ultrafialová oblast spektra viditelná oblast spektra blízka infračervená oblast spektra lokalizovaná povrchová plazmonová rezonance faktor zesílení intensity lokálního pole faktor zesílení přenos náboje mikroskopie atomových sil skenovací tunelovací mikroskopie skenovací elektronová mikroskopie transmisní elektronová mikroskopie akusticko-optický laditelný filtr aminokyselina polyvinylpyrolidon polyvinylalkohol dodecylsulfát sodný

Úvod V současné době získává Ramanova spektroskopie stále zvyšující se popularitu, a to zejména díky moderní instrumentaci a pokročilejším modifikacím této metody, které výrazně snížily meze detekce pro získání vibračních spekter dokonce až na takovou úroveň, že je možné v některých případech analyzovat ultrastopové koncentrace látek či jednotlivé molekuly. To představuje konkurenci pro již zavedené postupy detekování nízkých koncentrací látek, protože vibrační spektrum poskytuje mnohem obsáhlejší strukturní informaci a je pro každou molekulu jedinečné. Zvýšení citlivosti pomocí těchto technik mělo za následek proniknutí Ramanovy spektroskopie, původně využívané především v analýze pevných látek nebo při organické syntéze, do oborů jako je biologie, analytická chemie nebo forenzní analýza. Zejména v biologickém výzkumu a aplikacích byl zaznamenán velký narůst využitelnosti Ramanovy spektroskopie díky možnosti studia látek ve fyziologických koncentracích. Jednu z těchto pokročilých metod představuje povrchem zesílený Ramanův rozptyl, kdy zvýšení efektivity rozptylu plyne převážně z optických vlastností kovových nanostruktur, zejména jejich plazmonové rezonance. Ke správnému plánování experimentů a dosažení největších zesílení vibračních spekter je důležité správně pochopit a prakticky ověřit vztahy mezi morfologií nanostruktury, její plazmonovou rezonancí, použitou excitační vlnovou délkou a SERS zesílením. Ačkoli literatura, zabývající se SERS spektroskopií, je poměrně obsáhlá, experimentálně zaměřených prací na tuto problematiku není hlavně kvůli složité instrumentaci mnoho a často jsou výsledky těchto experimentů sporné. V této bakalářské práci bylo cílem sestavit optickou soustavu, která by umožnila využít jako excitační zdroj pro měření Ramanova rozptylu kontinuálně laditelný laser a následně detekovat signál pomocí komerčního Ramanova spektrometru. Po optimalizaci a posouzení účinnosti tohoto systému byl navržen a proveden experiment, který se zabývá korelací mezi plazmonovou rezonancí a SERS zesílením pro různé morfologie stříbrných nanočástic s využitím postupně se měnící excitační vlnové délky přes část viditelného spektra. Vedlejším cílem bylo získat spolehlivá vibrační spektra některých aminokyselin v nízkých koncentracích. Práce je rozdělena na teoretickou a experimentální část. V teoretické části jsou probrány principy Ramanova rozptylu a povrchem zesíleného Ramanova rozptylu. Experimentální část se zabývá přípravou nanočástic s předem definovanou morfologií a jejich charakterizací, popisem soustavy a experimentu pro měření s excitací laditelným laserem. Závěrem jsou popsány postupy pro měření SERS spekter aminokyselin a jejich ukázky.

Teoretická část 1 Ramanova spektroskopie 1.1 Historie a rozvoj metody V roce 1923 rakouský fyzik A. Smekal poprvé předpověděl tzv. neelastický rozptyl světla. Tento jev roku 1928 pozorovali experimentálně C. V. Raman a K. S. Krishnan v Indii a téměř současně a nezávisle na nich G. Landsberg a L. Mandelštam v Rusku. Raman využil elementární optické nástroje, slunce jako zdroj světla a svůj zrak jako detektor. Ve výsledku pozoroval, že malá část rozptýleného záření má pozměněnou barvu (frekvenci) vzhledem k záření, kterým ozařoval vzorek. Za tento objev získal roku 1930 Nobelovu cenu a efekt, který objevil, byl nazván po něm jako Ramanův rozptyl. 1,2 Postupem času byly komponenty instrumentace v Ramanově spektroskopii vylepšovány, důraz byl kladen především na vývoj lepších excitačních zdrojů monochromatického záření. Byly vyvinuty lampy různých prvků (bismut, olovo, zinek), které však byly nedostačující kvůli nízké intenzitě světla. Vhodnější se ukázaly být rtuťové lampy. V roce 1952 byl představen první komerční rtuťový zdroj pro Ramanovu spektroskopii, největší rozvoj však nastal až s vyvinutím prvních laserů v roce 1962. 3 V současné době nalézá tato metoda spolu se svými složitějšími modifikacemi uplatnění v mnoha odvětvích, např. v chemických a biologických disciplínách, fyzice kondenzovaných látek, geologii, archeologii, umění, farmacii, forenzní analýze atd. 1.2 Vibrační stavy molekul Na molekulu může být pohlíženo jako na soubor N jader a M elektronů. Potom má systém M + N částic 3(N + M) stupňů volnosti pro popis jeho pohybu. Protože jádra jsou mnohem těžší a elektrony se rychle přizpůsobují jakémukoliv pohybu jader, zavádí se tzv. Bornova- Oppenheimerova aproximace, kdy se řeší Schrödingerova rovnice elektronů ve fixním poli jader, a pohyb jader odděleně. Pro popis pohybu atomů tedy poté zbývá 3N stupňů volnosti. Tři z 3N stupňů volnosti odpovídají translačnímu pohybu molekuly jako celku a další tři náleží úhlům natáčení molekuly vůči osám v prostoru. Zbývá tedy 3N 6 (pro lineární molekuly 3N 5) vibračních stupňů volnosti (normálních vibračních módů). Takto se celková energie molekuly rozdělí do elektronového, vibračního, rotačního a translačního příspěvku. 4,5 Nejjednodušším případem je diatomická molekula, která má pouze jeden vibrační mód, při kterém se mění délka vazby. Potenciální energie takového oscilátoru se dá pro malé výchylky aproximovat harmonickým potenciálem V = 1 2 k(r r 0) 2, 1.1 3

kde k je silová konstanta vazby, r je vzdálenost mezi atomy a r 0 je rovnovážná vzdálenost mezi atomy v minimu energie. Pokud pro tento potenciál vyřešíme Schrödingerovu rovnici, získáme povolené hladiny vibrační energie E υ = (υ + 1 ) hcν 1.2 2 ν = 1 2πc k μ, 1.3 kde υ je vibrační kvantové číslo (0, 1, 2, ), ν je vlnočet (převrácená hodnota vlnové délky), μ je efektivní hmotnost jader. Jelikož harmonická aproximace je poněkud hrubé zjednodušení, pro přesnější výpočet vibračních energií se využívá také tzv. Morseho potenciál. Vzdálenosti mezi vibračními stavy při harmonické aproximaci jsou ekvidistantní, naproti tomu u Morseho křivky hladiny energie konvergují. 5 Obr. 1.1: Křivka Morseho potenciální energie (plná čára) a křivka harmonického potenciálu (přerušovaná čára) pro diatomickou molekulu s vyznačenými vibračními stavy (převzato a upraveno z 6 ) Poměr počtu molekul, nacházejících se v určitých dvou nedegenerovaných vibračních stavech, je úměrný rozdílu energií těchto stavů a teplotě podle Boltzmannova rozdělení N n = exp [ (E n E m ) ], 1.4 N m kt kde N n (resp. N m) je počet molekul ve vibračním stavu n (resp. m), E n (resp. E m) je energie stavu n (resp. m), k je Boltzmannova konstanta a T je termodynamická teplota. 4

1.2.1 Typy vibrací V polyatomických molekulách je situace složitější. Pro správnou interpretaci Ramanových spekter je zapotřebí si uvědomit, že dvě nebo více vazeb, které jsou v molekule blízko u sebe a mají podobné energie, mohou interagovat, a tudíž ve spektru identifikujeme vibrace skupin atomů, které jsou těmito vazbami spojeny. Například ve spektru oxidu uhličitého neuvidíme oddělené valenční vibrace vazeb C=O, ale symetrickou a asymetrickou valenční vibraci a deformační vibraci (obr. 1.2). 2 Při valenčních vibracích se mění délky vazeb a při deformačních vibracích dochází ke změnám vazebných nebo torzních úhlů. Vibrace větších skupin atomů se často pojmenovávají podle vzhledu vibrace, např. nůžkové, kývavé, kroutivé, deštníkové nebo tzv. dýchání kruhu u aromátů. Dále se vibrace dělí podle symetrie na symetrické a asymetrické. Obr. 1.2: Kuličkový model tří vibračních módů oxidu uhličitého (převzato a upraveno z 2 ) Ramanova spektroskopie je spolu s infračervenou spektroskopií hlavním nástrojem pro analýzu vibrační struktury molekul. Frekvence vibrací molekuly jsou pořád stejné, ať měříme infračervené či Ramanovo spektrum, avšak intenzity se dramaticky mění pro každý vibrační mód podle výběrových pravidel každé z obou metod. 3 1.3 Rozptyl světla Při interakci elektromagnetického záření s hmotou může být záření absorbováno nebo rozptylováno. Po absorpci fotonu může u některých molekul docházet k následné emisi (fluorescenci nebo fosforescenci) fotonu, který v důsledku nezářivých přechodů ztratil část energie. K tomu, aby došlo k emisi fotonu, musí být nejprve absorbován dopadající foton a molekula se tak dostane do excitovaného elektronového stavu. Děj tedy probíhá ve dvou oddělených krocích. Roztyl světla zahrnuje také dva fotony, ale oproti emisi se liší v tom, že není potřeba dostat molekulu absorpcí fotonu do excitovaného elektronového stavu, tudíž se jedná o proces okamžitý. To umožňuje používání takových vlnových délek, při kterých neexistují žádné elektronové přechody, tudíž nemůže docházet k žádné absorpci ani fluorescenci, která jinak komplikuje měření Ramanových spekter. Nicméně, rozptyl světla je velmi slabý děj v porovnání s ostatními procesy. 1 5

Rozptyl světla může být dále klasifikován do dvou skupin: Elastický rozptyl, kdy dopadající a rozptýlený foton mají stejné energie. Tento proces je často nazýván jako Rayleighův rozptyl. Při tomto ději nedochází k žádnému přenosu energie mezi molekulou a interagujícím fotonem, tento druh rozptylu je tedy z pohledu vibrační struktury molekul nezajímavý (obr. 1.3). Elastický rozptyl mohou vykazovat i větší objekty, např. nanočástice (známý jako Mieho rozptyl). Neelastický rozptyl, kdy rozptýlený foton má odlišnou energii od energie dopadajícího fotonu. Energetický rozdíl mezi dopadajícím a rozptýleným fotonem koresponduje s přechodem mezi dvěma stavy v molekule. Pokud se jedná o rotační nebo vibrační přechody, pak mluvíme o Ramanově rozptylu. Ramanův rozptyl je proti Rayleighovu rozptylu mnohem vzácnější jev, jenž postihuje pouze jeden foton z přibližně 10 6 10 8 rozptýlených fotonů. Podle toho, zda k rozptylu dochází ze základního vibračního stavu nebo z prvního excitovaného vibračního stavu, se jedná buď o Stokesovu, nebo anti- Stokesovu větev (obr. 1.3) Ramanova rozptylu. V prvním případě dopadající foton předá energii molekule a rozptýlený foton energii ztratí, při anti-stokesově rozptylu naopak molekula, nacházející se ve vyšším vibračním stavu, předá energii rozptýlenému fotonu a navrátí se do základního vibračního stavu. Za pokojové teploty bude častěji nastávat Stokesův rozptyl, protože většina molekul je v základním vibračním stavu (rovnice 1.4). 1,2 Obr. 1.3: Zjednodušené Jablonského diagramy pro Rayleighův rozptyl, anti-stokesovu a Stokesovu větev Ramanova rozptylu (převzato a upraveno z 1 ) 6

1.3.1 Odvození podle klasické teorie a výběrová pravidla V této části bude odvozena teorie Ramanova a Rayleighova rozptylu, při které jsou elektromagnetické záření i vlastnosti molekuly popsány pomocí klasické fyziky. Ačkoli klasická teorie nedokáže popsat všechny aspekty Ramanova a Rayleighova rozptylu, poskytuje nám užitečný vhled do vlastností rozptylu, například frekvenční závislost a také základy výběrových pravidel. Pro přesnější popis je třeba využít kvantovou teorii. 7 Velikost intenzity elektrického pole E elektromagnetického záření se mění v závislosti na čase t podle rovnice E = E 0 cos ω 0 t, 1.5 kde E 0 je velikost amplitudy a ω 0 je (úhlová) frekvence záření laserového svazku. Pokud je tímto zářením ozářena molekula, indukuje se dipólový moment o velikosti p = αe = αe 0 cos ω 0 t. 1.6 Konstanta úměrnosti α se nazývá polarizovatelnost, jedná se obecně o tenzorovou veličinu. Pokud molekula vibruje harmonicky s frekvencí ω m, vychýlení jader je popsáno jako u = u 0 cos ω m t, 1.7 kde u 0 je amplituda výchylky jádra. Pro malé výchylky lze pomocí Taylorova rozvoje napsat α jako lineární funkci u, α = α 0 + ( α ) u. 1.8 u 0 V této rovnici α 0 je polarizovatelnost v rovnovážné pozici, a ( α/ u) 0 je míra změny α při změně u. Dosazením rovnice 1.8 do rovnice 1.6 získáme p = α 0 E 0 cos ω 0 t + ( α u ) 0 ue 0 cos ω 0 t, 1.9 a po dalším dosazení rovnice 1.7 do rovnice 1.9 můžeme napsat: p = α 0 E 0 cos ω 0 t + ( α u ) 0 u 0E 0 cos ω 0 t cos ω m t. 1.10 S využitím goniometrické identity cos(x + y) + cos(x y) = 2 cos x cos y může být druhý člen v rovnici 1.10 přepsán takto p = α 0 E 0 cos ω 0 t + + 1 2 ( α u ) 0 u 0E 0 [cos(ω 0 + ω m )t + cos(ω 0 ω m )t]. 1.11 První člen rovnice 1.11 reprezentuje oscilující dipól, který vyzařuje světlo o frekvenci totožné s frekvencí laserového svazku ω 0, jedná se tedy o Rayleighův rozptyl. Druhý člen 7

potom reprezentuje Ramanův rozptyl, kde se frekvence laserového záření buď zvýší o frekvenci vibrace molekuly ω m, a potom se jedná o anti-stokesův rozptyl, nebo se sníží, což odpovídá Stokesovu rozptylu. 3 Jak vyplývá z předchozího odvození, změna polarizovatelnosti ( α/ u) 0 při daném vibračním módu musí být nenulová, aby k Ramanovu rozptylu vůbec mohlo docházet. Aktivní vibrace jsou tedy pouze ty, při kterých se mění polarizovatelnost molekuly a to je základní výběrové pravidlo pro Ramanovu spektroskopii. Další výběrová pravidla vychází z aplikace teorie grup symetrie na molekulové vibrace. Jedním z nich je například tzv. princip alternativního zákazu, který říká, že pokud molekula má střed symetrie, žádný vibrační mód nemůže být aktivní zároveň v infračerveném a Ramanově spektru. Obecně vzato, ke změně polarizovatelnosti obvykle dochází spíše při symetrických vibracích. 5 1.3.2 Ramanský posun a Ramanovo spektrum Protože v Ramanově vibrační spektroskopii se používají lasery o různých vlnových délkách ve viditelné nebo NIR (blízká infračervená z anglického near infrared) oblasti, bylo by nevýhodné používat jednotky vlnové délky nebo absolutního vlnočtu. Proto se zavedl tzv. Ramanský posun, který je definován jako rozdíl energie rozptýleného fotonu a energie fotonu laseru. Běžně se vyjadřuje v jednotkách vlnočtu, značí se ν (obvykle v jednotkách [cm -1 ]). Zavedením této veličiny můžeme porovnávat spektra od různých laserů přímo, protože Ramanský posun laseru je vždy roven nule a Stokesova část spektra má poté kladné hodnoty posunu. Ramanský posun přímo odpovídá vlnočtu vibračních módů, které se vyskytují ve spektru. Ramanovo spektrum je pak závislost intenzity rozptýleného záření na Ramanském posunu. Na obrázku 1.4 můžeme vidět Ramanské spektrum rhodaminu 6G se Stokesovou i anti-stokesovou větví. Obr. 1.4: Ramanovo spektrum rhodaminu 6G (převzato a upraveno z 1 ) Jednotlivé píky ve spektru odpovídají aktivním vibračním módům molekuly. Ramanovo spektrum je jako celek pro každou sloučeninu naprosto unikátním tzv. vibračním otiskem prstu (fingerprint), který umožňuje identifikaci látek a mnoho dalších aplikací. 1 8

1.4 Instrumentace Ramanův spektrometr sestává ze čtyř hlavních částí: zdroj excitačního záření (v současnosti obvykle laser) místo pro ozáření vzorku a sběr signálu monochromátor detektor a počítačové zpracování dat Lasery se ukázaly jako velmi výhodné excitační zdroje díky jejich vysoké intenzitě a zároveň monochromatičnosti záření. U disperzních spektrometrů jsou nejčastější lasery s vlnovou délkou ve viditelné oblasti, nejběžnějšími jsou Ar + laser (514,5 nm) a He-Ne laser (633 nm). Ve spektrometru se používají tzv. notch nebo edge filtry, které odfiltrují nežádoucí a majoritní Rayleighův rozptyl. Disperzní spektrometr využívá jako selektor vlnových délek difrakční mřížku, rozdělené záření se poté detekuje pomocí (chlazené) křemíkové CCD kamery. Kromě disperzních byly vyvinuty i spektrometry s Fourierovou transformací (FT), které obvykle fungují v NIR oblasti spektra (pulsní Nd:YAG laser, 1064 nm). Ty jsou výhodné zejména díky potlačení fluorescence látek. Na rozdíl od disperzního spektroskopu, kde se po rozkladu záření detekují jednotlivé frekvence zvlášť, zde se detekuje získaný signál přímo, tudíž získáme závislost intenzity na čase, která je poté převedena pomocí Fourierovy transformace na závislost intenzity na frekvenci. 3 Velkým přínosem bylo zavedení mikroskopu jakožto integrální části Ramanova přístroje. Mikroskop umožňuje přesně zaměřovat laserový svazek na konkrétní část vzorku nebo na velmi malé vzorky, zároveň fokusace laserového svazku značně zvyšuje efektivitu rozptylu pro absorbující vzorky. V kombinaci s piezo-skenerem je možné mapovat povrchy vzorků a získávat tak chemickou informaci s prostorovým rozlišením v jednotkách mikrometrů. 2 Obr. 1.5: Schematické znázornění disperzního Ramanova spektrometru v kombinaci s mikroskopem (převzato z 2 ) 9

1.5 Pokročilé metody Ramanovy spektroskopie Jak bylo řečeno dříve, neelastický rozptyl světla je velice málo pravděpodobný děj. I přes používání moderní instrumentace, která mnohonásobně zkrátila dobu potřebnou pro získání spekter a umožnila měření velmi malých objemů vzorku, je nutné mít relativně vysoké koncentrace látek v roztoku. Citlivost metody je tedy poměrně malá, což je komplikací zejména v biologických aplikacích, kdy je kladen důraz na měření ve fyziologických podmínkách. Výzkum v oblasti Ramanova rozptylu však přinesl značné množství intenzifikačních technik, které umožňují snížit mez detekce až o několik řádů. Do dnešní doby už bylo publikováno mnoho prací, kdy byla získána vibrační spektra jednotlivých molekul. 8 Tyto techniky představují konkurenci pro již zavedené metody (fluorescenční spektroskopie), protože kromě kvantitativní informace poskytují také informace kvalitativní či strukturní v podobě vibračního spektra. V této kapitole budou stručně popsány nejznámější speciální techniky Ramanovy spektroskopie. Rezonanční Ramanova spektroskopie (RRS) spočívá v použití takového excitačního zdroje, jenž má vlnovou délku v oblasti, kde analyt absorbuje záření, tedy v molekule dochází k elektronovým přechodům. Neelastický rozptyl potom neprobíhá pouze přes virtuální hladinu, nýbrž přes (první) excitovaný stav, který je výše v energii (obr. 1.6). Tato skutečnost může vést k zesílení intenzit těch Ramanských pásů, které jsou asociovány s totálně symetrickými vibračními módy. Faktor zesílení může dosahovat hodnoty až 10 6. Zvýšení intenzity rozptylu pochází pouze od látky, která absorbuje záření (chromofor), což je užitečné zejména v biologii, protože chromofory se často vyskytují v aktivních místech biomolekul a také aromatické aminokyseliny i báze nukleových kyselin absorbují v UV oblasti spektra. RRS však není efektivní pro všechny látky, zároveň fluorescence je zde často kvůli přímé absorpci favorizována a může úplně znemožnit získání spekter. Záleží pak na relativní efektivitě rozptylu a fluorescence konkrétní látky. 2,9 Obr. 1.6: Diagram pro průběh rezonančního Ramanova rozptylu (převzato a upraveno z 2 ) 10

Povrchem zesílený Ramanův rozptyl (SERS Surface-Enhanced Raman Scattering) je jev, s jehož pomocí je možno zesílit Ramanský signál o mnoho řádů intenzity (až 10 10 ). Amplifikace signálu zde pochází hlavně z tzv. plazmonové rezonance kovových nanostruktur (koloidní roztok, zdrsněné povrchy), která výrazně zesiluje elektromagnetické pole v blízkosti kovu. Potom molekuly adsorbované na kovovém povrchu reagují na toto zesílené pole a dojde i k zesílení rozptylu světla. Kovové povrchy mohou také velmi účinně zhášet fluorescenci adsorbovaných molekul. SERS bude více do detailu rozebrán v kapitole 2. Hrotem zesílený Ramanův rozptyl (TERS Tip-Enhanced Raman Scattering) je poměrně průlomová metoda vycházející z metody SERS, kterou kombinuje se skenovací tunelovací mikroskopií (STM Scanning Tunneling Microscopy) nebo s mikroskopií atomových sil (AFM Atomic Force Microscopy). U většiny spektroskopických technik jsou získaná data průměrem přes poměrně velký počet molekul a prostorové rozlišení je malé, naproti tomu AFM (STM) poskytuje vynikající prostorové rozlišení (pod difrakční limit světla), ale úplně zde chybí chemická či strukturní informace. TERS, jako jedna z mála metod, umožňuje získání jak skvělého prostorového rozlišení, tak velmi lokalizované chemické informace v podobě vibračního spektra. Typický TERS experiment je založen na fokusaci laserového svazku na kovový AFM nebo STM hrot, na jehož konci, který je v bezprostřední blízkosti vzorku, dochází k plazmonové rezonanci, tedy k zesílení elektromagnetického pole v malé oblasti pod hrotem. Z této oblasti (s rozlišením AFM hrotu) se pak selektivně budí Ramanský signál. 10 13 Obr. 1.7: AFM topografie molekuly RNA, TERS spektra naměřená z různých pozic hrotu, spektra z pozic 1 7 odpovídají molekule RNA, pozice 8 odpovídá pouze substrátu (převzato a upraveno z 13 ) 11

2 SERS Povrchem zesílený Ramanův rozptyl pyridinu na stříbrné elektrodě pozoroval poprvé Fleischmann v roce 1974. 14 Zpočátku bylo zesílení Ramanova rozptylu chybně přisuzováno zvýšení koncentrace adsorpcí na povrch elektrody. Správnější interpretace přišla v roce 1977 a bylo uznáno, že tento jev vzniká hlavně díky speciálním vlastnostem nanostruktur některých kovů a jejich interakci s elektromagnetickým zářením. 15,16 Od té doby vzniklo poměrně velké množství teoretických přístupů k tomuto fenoménu, ale žádný není zcela uspokojivý pro všechny aspekty SERS. Obecně je však přijato, že tyto interpretace spadají do dvou skupin, a to do elektromagnetického mechanismu zesílení a mechanismu zesílení přenosem náboje. Oba mechanismy budou probrány v této kapitole. Jednou z hlavních charakteristik SERSu je jeho multidisciplinární povaha. Hranice metody sahají od fyziky pevných látek, plasmoniky, nanotechnologie až po chemii a biologii. Z tohoto důvodu je potřeba mít široký teoretický základ a vědět o možnostech a limitacích metody před její aplikací. 2.1 Elektromagnetický mechanismus zesílení 2.1.1 Optické vlastnosti kovů Optické vlastnosti materiálů jsou charakterizovány dielektrickou funkcí (permitivitou) ε(ω) nebo známějším indexem lomu n(ω). Obě veličiny závisí na frekvenci ω (vlnové délce λ) záření. Různé materiály mají proto různou odezvu na elektromagnetické záření s určitou frekvencí. Pro průhledné materiály používané v optice je permitivita kladné reálné číslo, avšak často je permitivita při dané frekvenci číslo komplexní a materiál není průhledný. Mezi takové materiály patří i kovy. Jakmile známe reálnou i imaginární část dielektrické funkce pro určitý materiál, můžeme vypočítat elektromagnetické vlastnosti materiálu v různých geometriích pomocí Maxwellových rovnic nebo jejich aproximací. Pro začátek uvažujme hladký planární povrch stříbra nebo zlata, na který kolmo dopadá elektromagnetická vlna. Jedním parametrem, který nás zajímá z hlediska SERS, je zvýšení nebo snížení elektrického pole. Proto se zavádí tzv. faktor zesílení intenzity lokálního pole (LFIEF Local Field Intensity Enhancement Factor), LFIEF(r, ω) = E(r, ω) 2 / E 0 (r, ω) 2. 2.1 Ten udává poměr velikosti intenzity elektrického pole E(r,ω) v určitém bodě r v přítomnosti objektu vzhledem k intenzitě E 0(r,ω), kterou by záření mělo v témže místě bez objektu. V případě planárního povrchu nás bude zajímat LFIEF přímo na povrchu kovu (obr. 2.1). 12

Obr. 2.1: Modelový případ rozhraní vzduch kov (Ag a Au), na které kolmo dopadá elektromagnetická vlna, závislost LFIEF na vlnové délce na povrchu kovu (převzato a upraveno z 10 ) Můžeme si všimnout, že LFIEF má ve viditelné oblasti pro zlato i stříbro hodnotu menší než jedna. To znamená, že na povrchu kovu je intenzita typicky utlumována. Pouze v oblasti kolem 300 nm dosahuje LFIEF stříbra větší hodnoty. Je tedy patrné, že žádné optické procesy závisející na intenzitě elektrického pole nemohou být zesíleny, tudíž se tyto dva kovy mohou zdát z hlediska SERS v porovnání s jinými materiály nezajímavé. Opak je ale pravdou, klíčové vlastnosti pro využitelnost kovů se objeví, až když začneme uvažovat různé tvary s nanorozměry. 10 2.1.2 Model jednotlivé sférické nanočástice Jako modelový příklad pro SERS efekt můžeme uvažovat jednotlivou sférickou kovovou nanočástici s funkcí permitivity ε(ω), uloženou v médiu s permitivitou ε m, na kterou dopadá elektromagnetická vlna a jejíž průměr je mnohem menší než vlnová délka světla (kolem 10 nm). Tento systém je zobrazen na obrázku 2.2 s grafem závislosti LFIEF na vlnové délce v bodě A pro zlatou i stříbrnou částici. 13

Obr. 2.2: Schematické znázornění modelového příkladu kovové (Ag a Au) nanočástice v elektrickém poli elektromagnetické vlny a graf závislosti vypočteného LFIEF na vlnové délce záření (převzato z 10 ) Modelový LFIEF na povrchu nanočástice v bodě A dosahuje mnohem vyšších hodnot oproti planárnímu povrchu kovu v předchozím příkladu. elektrického pole na povrchu částice je popsána rovnicí: 10 E r = E 0 cos θ + g ( a3 r 3) E 0 cos θ, 2.2 kde E r je intenzita elektrického pole ve vzdálenosti r od povrchu částice, a je poloměr částice, θ je velikost úhlu od osy směru elektrického pole a g je konstanta vypočtená z permitivit takto: g = ( ε(ω) ε m ε(ω)+2ε m ). 2.3 Při určitých hodnotách permitivit dosahuje g faktor maximální hodnoty. Protože permitivita dielektrického média ε m je často hodnota blízká jedné, g faktor dosáhne maxima, když se reálná část funkce permitivity kovu ε(ω) bude rovnat hodnotě -2. Protože tato funkce závisí na frekvenci záření, hodnota -2 bude splněna jen pro určitou frekvenci. Při této frekvenci dochází k tzv. dipolární lokalizované povrchové plazmonové rezonanci (LSPR Localized Surface Plasmon Resonance), která je důvodem zvýšení hodnoty LFIEF na povrchu částice. LSPR si můžeme jednoduše představit jako oscilující dipól elektronového oblaku na krátkou vzdálenost mimo povrch částice (Obr. 2.3). 2 14

Obr. 2.3: Schématický diagram znázorňující vznik lokalizovaného povrchového plazmonu na povrchu kovové nanočástice (převzato z 17 ) Frekvence záření, která způsobuje plazmovou rezonanci, je nanočásticí silně absorbována a proto lze pro klasifikaci LSPR využít absorpční spektroskopii. Pokud se LSPR vyskytuje ve viditelné oblasti spektra, roztoky nanočástic jsou barevné. Absorpce světla kovovými nanočásticemi a excitace povrchového plazmonu je považována za nejdůležitější vlastnost, která umožňuje vznik SERS efektu a poskytuje teoretický základ pro rozvoj mechanismu elektromagnetického zesílení, který je majoritním příspěvkem k celkovému zesílení Ramanových spekter. 4 2.1.3 Vliv velikosti a tvaru na plazmonovou rezonanci LSPR sférických nanočástic v absorpčním spektru poskytuje obvykle absorpční pás, který se dá charakterizovat absorpčním maximem. Poloha tohoto maxima, tedy vlnová délka záření, při které bude vznikat LSPR a dojde k zesílení pole, nebude záviset pouze na optických vlastnostech kovu (dielektrická funkce). Zcela zásadní vliv zde hraje také velikost a tvar nanočástic. Efekty velikosti a tvaru na podobu LSPR se dají kvalitativně shrnout následovně. Při zvětšování částic se LSPR obvykle posunuje k vyšším vlnovým délkám (červený posun). Zároveň dochází k utlumování a rozšíření absorpčního pásu a LFIEF na povrchu částice se také zmenšuje. Pro velikosti typicky kolem 100 nm dipolární LSPR úplně vymizí. Dalším důsledkem nárůstu velikosti částic je vznik nových rezonančních módů, které se při malých velikostech vůbec nevyskytují. Tyto módy se nazývají multipolární rezonance a nejdůležitější roli hraje obvykle kvadrupólová rezonance. Pro jiné geometrické útvary bude často existovat více LSPR módů než v případě koule. Například pro nanotyčky (nanorods) budou typicky vznikat dvě dipolární LSPR odpovídající kratšímu a delšímu rozměru. Z vlivu velikosti plyne, že LSPR odpovídající delšímu rozměru nanotyčky bude posunuta k větším vlnovým délkám (Obr. 2.3). Složitější tvary vykazují často složitou prostorovou distribuci zesílení pole a zároveň různá místa na povrchu objektu mohou mít maximální LFIEF pro různé vlnové délky. Obrovské zesílení pole vzniká zejména na ostrých koncích objektu. 10 Tento efekt může být sledován nejen 15

v elektromagnetických výpočtech, ale také experimentálně při SERS měřeních. Obrázek 2.4 ukazuje SEM fotky zlatých sférických a zlatých hvězdicovitých nanočástic a SERS spektra malachitové zeleně s oběma typy částic. Je patrné, že nanohvězdy vykazují mnohem vyšší signál, a to hlavně díky členitému povrchu s ostrými konci. Obr. 2.3: UV-VIS spektra zlatých nanotyček s rostoucí délkou (délku ovlivňuje koncentrace Ag + iontů při syntéze) a odpovídající TEM snímky dvou velikostí (převzato a upraveno z 18 ) Obr. 2.4: SEM snímek zlatých sférických nanočástic (a) a zlatých nanohvězd (b) a SERS spektra malachitové zeleně pro oba typy částic (převzato a upraveno z 19 ) 16

2.1.4 Vázané plazmonové rezonance Velmi důležitý efekt z hlediska plazmonových rezonancí a zesílení pole se objeví, vezmemeli v potaz dva nebo více interagujících nano-objektů. Při velmi těsné blízkosti mezi objekty dochází ke vzniku tzv. vázaných plazmonových rezonancí, díky kterým se mohou měnit nebo vznikat nová LSPR maxima, zároveň LFIEF může v různých místech dosahovat dramaticky vyšších hodnot oproti jednotlivé částici. Pokud budou dvě sférické částice ve vzdálenosti několika svých průměrů nebo větší, mohou být považovány za dva nezávislé problémy jednotlivých částic. Jakmile se však začnou přibližovat, pole produkované jejich indukovaným dipólem začne interagovat. Tato interakce může zesílit nebo oslabit elektrické pole v určitých regionech. Při zkracování vzdálenosti mezi částicemi dochází v malém prostoru mezi nimi k velmi prudkému zvyšování hodnoty LFIEF, který dosahuje pro mezeru velikosti 1 nm mezi Ag nanočásticemi hodnot kolem 10 6, což je mnohonásobně víc než pro jednotlivou nanočástici. Tohoto efektu se využívá nejčastěji pro SERS, protože jednotlivé nanočástice ve většině případů nezesilují pole dostatečně pro zvýšení Ramanova rozptylu. Místa s obrovskou hodnotou LFIEF mezi interagujícími nanočásticemi se nazývají aktivní místa (hot spots) a v koloidním roztoku se vytvářejí přímo analytem nebo přídavkem vhodných elektrolytů. 1,10 Zesílení může být kromě LFIEF vyjádřeno také tzv. faktorem zesílení (EF enhancement factor), který vyjadřuje kolikrát je silnější Ramanský signál v přítomnosti nanočástic a s určitou aproximací lze vyjádřit takto EF~[LFIEF(r, ω)] 2. 2.4 17

Obr. 2.5: (a) Schematická konfigurace modelového systému dvou zlatých sférických nanočástic s průměrem 25 nm oddělených mezerou o velikosti g ozářených elektromagnetickou vlnou s polarizací ve směru osy z a vlnovým vektorem ve směru osy x. (b) Extinkční koeficienty jako funkce vlnové délky (absorpční spektra) pro systém s měnící se velikostí mezery. (c) SERS faktor zesílení EF pro systém s měnící se velikostí mezery (převzato a upraveno z 1 ) 2.1.5 Zhášení fluorescence Při měření Ramanových spekter se často stane, že spektra není možné získat kvůli fluorescenci analytu. Obzvlášť při měření rezonančních spekter, tedy s použitím excitačního zdroje, který leží v absorpční oblasti analytu, je fluorescence velkým problémem, protože místo rezonančně zesílených spekter nezískáme spektra žádná. SERS přináší částečné řešení tohoto problému díky kovovým nanostrukturám, které mohou velmi efektivně zhášet fluorescenci molekul v blízkosti povrchu kovu. Potom je možné měřit SERS spektra i v absorpční oblasti analytu, která přináší další zesílení díky rezonanci. Metoda je často nazývána jako povrchem zesílená rezonanční Ramanova spektroskopie (SERRS Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy). Faktory zesílení mohou dosahovat hodnot až 10 14. Fluorescence může být za určitých podmínek také zesilována povrchem kovu, pak se mluví o povrchem zesílené fluorescenci (SEF Surface Enhanced Fluorescence). Rozhodujícím faktorem pro proces, který bude ve spektru dominovat, je vzdálenost analytu od povrchu nanostruktur. Sloučenina absorbující excitační vlnovou délku 18

a následně fluoreskující bez přítomnosti nanostruktur, se bude chovat stejně i v přítomnosti nanostruktur pokud bude daleko od povrchu. Ramanův signál bude o několik řádu slabší a bude utopen ve fluorescenčním pozadí. Jakmile se analyt dostane blíže k povrchu ( 10 nm), bude vystaven slabému zesílení lokálního pole, ale efektivnější fluorescence bude stále dominovat, může být také zesílena (SEF). Při vzdálenosti několika nm od povrchu bude Ramanův rozptyl těžit z většího zesílení pole, fluorescence už nebude tak efektivní a ve spektru uvidíme SERS signál ležící na fluorescenční pozadí. Pokud se analyt dostane k povrchu velmi blízko ( 1 nm), fluorescence už je velmi efektivně zhášena nezářivou deexcitací prostřednictvím elektronových přeskoků do kovu, a Ramanův rozptyl dosáhne vysoké intenzity (obr. 2.6). 10 Zbytková slabá fluorescence se ale může často ve spektrech vyskytovat, i když silně spektrálně modifikovaná. Tento jev se nazývá jako tzv. SERS kontinuum. 20 Obr. 2.6: Schematické zobrazení relativních intenzit fluorescence a SERSu pro molekulu v různých vzdálenostech od povrchu kovu při použití excitační vlnové délky, při které molekula absorbuje a následně fluoreskuje (převzato z 10 ) 2.1.6 SERS excitační spektroskopie SERS excitační spektroskopie se skenem vlnových délek (WS SERES Wavelength-Scaned Surface Enhanced Raman Excitation Spektroscopy) je založena na zjišťování SERS zesílení pro několik různých excitačních vlnových délek. Tato technika byla uznána za velmi užitečný nástroj pro důkaz a lepší pochopení elektromagnetického mechanismu SERS 19

zesílení. Nicméně zjevnou limitací této metody je to, že počet datových bodů (vlnových délek) je určen laditelností laserového zdroje (nebo použitím více laserů) a detekčním systémem. Tyto instrumentální nároky vedly k tomu, že publikací zabývajících se WS SERES není mnoho a často trpí nízkou hustotou datových bodů nebo limitovaným pokrytím spektra, například použitím jen tří laserů s vlnovými délkami 532 nm, 633 nm a 785 nm. Dalším častým nedostatkem bylo použití substrátů s nedostatečnou charakterizací distribuce drsnosti struktur. Jiné studie nezahrnují charakterizaci lokalizované plazmonové rezonance (LSPR) substrátu pomocí absorpčních spekter, která umožňuje přímé porovnání excitačních profilů SERS zesílení přímo s lokalizací LSPR. 21 SERS zesílení primárně plyne z LSPR nanostruktur ušlechtilých kovů. Z tohoto důvodu by mělo zesílení silně záviset na excitační vlnové délce a absorpčním spektru nanostruktur, které určuje polohu LSPR. Nicméně výsledky experimentálních studií zabývajících se korelací SERS faktorů zesílení pro různé vlnové délky s UV-VIS spektry jsou často sporné. Každopádně pečlivý a systematický výzkum tohoto tématu je kritický pro vylepšení pochopení SERS. Zejména při agregaci koloidů s různou velikostí NPs a disperzitou, kdy dochází k velké změně LSPR ve viditelném spektru, je důležité zvolit správnou vlnovou délku excitace, která může výrazně zvýšit efektivitu SERS. Obecným předpokladem je, že největší SERS zesílení bude pozorováno při použití vlnové délky takové, která je maximem LSPR substrátu. Tato korelace však nemusí být pravdivá, zejména pokud má substrát více LSPR maxim, které mají různou prostorovou distribuci elektromagnetického pole. 22 25 WS SERES je hlavní náplní experimentální části této bakalářské práce. 2.2 Mechanismus zesílení přenosem náboje Mechanismus zesílení přenosem náboje (CT charge transfer) neboli chemický mechanismus zesílení vzniká, jestliže se vytvoří vazba mezi analytem a kovovým povrchem. Chemické zesílení se zpravidla dělí do několika kategorií rozdělených podle síly interakce mezi elektronovou strukturou analytu a kovu. První obecný případ mechanismu přenosu náboje zahrnuje transfer elektronů z Fermiho hladiny kovu do nejnižšího neobsazeného molekulového orbitalu (LUMO) adsorbátu a naopak (obr. 2.7). Tím může dojít ke zvýšení polarizovatelnosti molekuly, což vede k zesílení Ramanova rozptylu. Evidence tohoto jevu byla získána hlavně z elektrochemických experimentů. Druhým přístupem k CT jevu je vznik nových elektronových stavů komplexu kov-analyt, jehož Ramanův rozptyl může mít rezonanční charakter, tudíž je zesílen. Chemické zesílení je omezeno pouze na první adsorbovanou povrchovou vrstvu analytu, kdežto elektromagnetické zesílení klesá s třetí mocninou vzdálenosti od povrchu. Mechanismus zesílení CT je minoritním efektem pro pozorování SERS efektu, příspěvek k celkovému zesílení se pohybuje kolem faktoru 10 100. 2,4,10,26 20

Obr. 2.7: Energetický diagram zobrazující Fermiho energetickou hladinu kovu a mezeru mezi HOMO a LUMO orbitaly adsorbované molekuly (převzato z 4 ) 2.3 SERS substráty Literatura věnující se SERS spektroskopii často mluví o SERS substrátech, což je v zásadě jakákoliv kovová nanostruktura, která produkuje SERS zesílení. Substráty mohou být rozděleny do tří hlavních skupin: kovové částice (obvykle nanočástice) v roztoku (koloidní roztok) planární kovové struktury, jako například seskupení kovových nanočástic připravených na planárním substrátu (sklo, křemík, kovy atd.) kovové elektrody Existuje mnoho typů fabrikace vysoce sofistikovaných planárních substrátů, které poskytují vysokou uniformitu částic různých tvarů a velikostí, a které dosahují silného SERS zesílení. Jejich příprava je však poměrně složitá. Komerční substráty pro velmi sensitivní detekce metodou SERS jsou nejčastěji založeny právě na těchto substrátech. Kovové elektrody zase umožňují ovlivňovat adsorpci analytu pomocí vloženého potenciálu. Koloidní roztoky nanočástic, nejčastěji tvořené stříbrem nebo zlatem, jsou velmi často používány jako SERS substráty hlavně díky jejich jednoduché a levné přípravě, a také jednoduché charakterizaci. Volba vhodného substrátu závisí na konkrétní aplikaci a je klíčovým faktorem pro velikost zesílení a reprodukovatelnost. 2.3.1 Příprava, vlastnosti a charakterizace roztoků nanočástic Nanočástice jsou objekty o rozmezí velikostí 1 100 nm. Metody jejich přípravy se zpravidla dělí na fyzikální a chemické. Mezi fyzikální patří např. laserová ablace, kdy se na kovový plíšek fokusuje laserový svazek o velmi vysoké intenzitě. Takto vzniklé nanočástice většinou nemají dobrou tvarovou uniformitu, ale jejich výhoda spočívá v tom, že jsou chemicky čisté. Chemické metody syntézy jsou většinou založeny na redukci kationtů kovu ve formě rozpuštěné soli pomocí vhodného redukčního činidla. NPs mohou v roztoku 21

existovat především díky elektrostatické nebo sterické repulzi. To normálně vyžaduje přítomnost stabilizačního činidla, které pokryje povrch NPs a zabrání koloidu v agregaci. Nejběžnější koloidy využívají citrát trisodný zároveň jako redukční i stabilizační agens. V současné době existuje díky velkému zájmu o nano-vědy velké množství možností přípravy nanočástic, které umožňují dobré ovládání jejich výsledné velikosti i tvaru. Další typicky používaná redukční činidla zahrnují tetrahydridoboritan sodný, hydrazin, hydroxylamin hydrochlorid, různé redukující cukry nebo kyselinu askorbovou. Pro vylepšení stability NPs se používají syntetické polymery (PVP, PVA), detergenty (SDS) nebo také hovězí sérový albumin (BSA). Přídavek stabilizačního činidla však přináší nevýhody pro SERS měření, konkrétně interferující signál stabilizátoru a možné zhoršení adsorpce analytu na NPs. Nejpoužívanější kovy pro SERS jsou zlato a stříbro, přitom oba kovy mají své výhody i nevýhody. Zlaté NPs mají velmi dobrou stabilitu, jsou biokompatibilní a jsou vhodnější pro měření v NIR oblasti spektra. Naproti tomu stříbrné NPs jsou vhodnější pro viditelnou oblast a faktory zesílení zde dosahují vyšších hodnot. 1,10 Pro charakterizaci morfologie, velikosti a tvaru NPs se nejčastěji využívá elektronová mikroskopie (SEM, TEM) a mikroskopie atomových sil (AFM). Další důležitou vlastností koloidního roztoku je jeho monodisperzita. Ta se stanovuje nejčastěji pomocí dynamického rozptylu světla (DLS Dynamic Light Scattering). Z hlediska SERS měření je nejdůležitější vlastností lokalizovaná povrchová plazmonová rezonance (LSPR), která se zjišťuje jednoduchým měřením UV-VIS-NIR absorpčních spekter. Stabilita NPs v koloidním roztoku závisí na jejich povrchovém náboji. Tuto informaci můžeme získat měřením tzv. zetapotenciálu. 22

Experimentální část Primárním cílem experimentální části této bakalářské práce bylo vylepšení Ramanova spektrometru o kontinuálně laditelný excitační zdroj, který by umožnil detailní experiment zaměřující se na WS SERES a korelaci SERS intenzit s absorpčními spektry, tedy s lokalizací plazmonové rezonance u nanočástic různých velikostí či tvarů. Takový experiment byl proveden na čtyřech morfologiích nanočástic s odlišným absorpčním maximem ve viditelné oblasti. Druhotným cílem bylo získání SERS spekter některých aminokyselin. Seznam použitých chemikálií AgNO 3-99%, Sigma Aldrich Citrát trisodný dihydrát 99%, Sigma Aldrich L-fenylalanin 98%, Sigma Aldrich HAuCl 4 3H 2O 99,9%, Sigma Aldrich H 2O 2 30% roztok, Penta L-histidin 99%, Sigma Aldrich KBr 99%, Sigma Aldrich MgSO 4 7H 2O 98%, Sigma Aldrich NaBH 4 98%, Sigma Aldrich Rhodamin 6G 99%, Sigma Aldrich L-tryptofan 98%, Sigma Aldrich L-tyrosin 98%, Sigma Aldrich 23

3 Příprava roztoků nanočástic 3.1 Postup přípravy koloidů zlata a stříbra Koloidní roztoky stříbrných nanočástic (AgNPs) byly připraveny podle článku, který publikoval J. Frank a kolektiv. 27 Tento způsob přípravy umožňuje kontrolu velikosti nanočástic pomocí změny koncentrace bromidových iontů v roztoku. Peroxid vodíku slouží v reakční směsi jako leptací činidlo a umožňuje ovládání výsledného tvaru nanočástic. Citrát trisodný stabilizuje nanočástice a brání jejich agregaci. Tetrahydridoboritan sodný pak slouží jako samotné redukční činidlo. Nejmenší velikosti těchto nanočástic jsou tvarově kvazi-sférické, s růstem velikosti (snižování koncentrace Br - ) začínají získávat podobu tenkých trojbokých hranolů. Pro přípravu koloidů byly připraveny zásobní roztoky: 1,25 10-2 M citrát trisodný; 3,75 10-4 M AgNO 3; 5 10-2 M H 2O 2; 1 10-3 M KBr; 5 10-3 M NaBH 4. Roztok NaBH 4 je potřeba připravit před syntézou vždy čerstvý, protože se rozkládá ve vodě za uvolňování plynného vodíku. Do zkumavky bylo pipetováno 6 ml citrátu trisodného, 15 ml AgNO 3, 15 ml H 2O 2 a mikropipetou množství KBr (20 80 μl) podle požadované morfologie nanočástic. Přídavky KBr byly pro žlutý roztok 77 μl, pro oranžový roztok 68 μl, pro červený 65 μl a pro fialový 49 μl. Roztok byl promíchán na vortexu, jako poslední krok bylo přidáno 7,5 ml NaBH 4 a směs byla znovu rychle promíchána. Reakce probíhá asi 3 minuty a je možné vizuálně pozorovat změnu barev roztoku při tvorbě nanočástic a jejich růstu. Při přípravě je velmi důležité přesné pipetování, používání čistých nádob (nejlépe na jedno použití) a používání demineralizované vody s co nejnižší vodivostí. Koloidní roztok zlatých nanočástic (AuNPs) byl připraven klasickou metodou podle Turkeviche, při které se vodný roztok kyseliny tetrachlorozlatité redukuje citrátem za zvýšené teploty. 28 Pro syntézu byly připraveny zásobní roztoky: 38,8 M citrát trisodný; 1 10-3 M HAuCl 4. Do kádinky bylo pipetováno 20 ml roztoku HAuCl 4 a roztok byl přiveden k varu za stálého míchání magnetickým míchadlem. Jakmile roztok začal vřít, byly přidány 2 ml zásobního roztoku citrátu trisodného a směs se nechala vřít, dokud nedosáhla temně rudé barvy (asi 10 min). Zahřívání bylo přerušeno a koloidní roztok se nechal pomalu zchladnout na pokojovou teplotu. Výsledkem jsou sférické NPs s poměrně dobrou monodisperzitou a průměrem asi 15 nm. Takto připravené roztoky AgNPs a AuNPs byly charakterizovány pomocí UV-VIS-NIR absorpčního spektrometru Varian Cary 5E. Rozsah měřených vlnových délek byl 350 800 nm. Pro měření SERS spekter byly všechny roztoky AgNPs i AuNPs zahuštěny centrifugací, která byla prováděna vždy pro 12 ml příslušného roztoku na 8500 rpm, doba centrifugace byla pro AgNPs 45 min a pro AuNPs 30 min. Z takto centrifugovaných roztoků byl odebrán supernatant tak, aby vzniklo asi 100 μl zahuštěného roztoku NPs. 24

3.2 Charakterizace koloidů zlata a stříbra Koloidní roztoky NPs byly charakterizovány zejména pomocí UV-VIS absorpční spekstroskopie. Byly také získány SEM snímky některých vzorků. Pro měření SERRS s kontinuálně laditelným laserem (kapitola 4) byly zvoleny 4 roztoky AgNPs s různou barvou (obr. 3.1), tedy s různými maximy LSPR pokrývající absorpční oblast rhodaminu 6G. Maxima LSPR byla zjištěna měřením UV-VIS absorpčních spekter v oblasti 350 800 nm (obr. 3.2). Absorpční maxima byla 450 nm (žlutá), 481 nm (oranžová), 495 nm (červená) a 552 nm (fialová). Obr. 3.1: Fotka použitých roztoků AgNPs pro SERRS s laditelným laserem (kapitola 4), absorpční maxima jsou zleva: 450 nm, 481 nm, 495 nm a 552 nm A 1,2 1 0,8 0,6 450 481 495 552 0,4 0,2 0 350 450 550 650 750 λ [nm] Obr. 3.2: Absorpční spektra čtyř typů AgNPs použitých pro SERRS s laditelným laserem (kapitola 4) Pro měření SERS spekter aminokyselin (kapitola 5) byly použity oba typy koloidních roztoků (AuNPs i AgNPs). AgNPs však byly pouze jedné morfologie, konkrétně byl používán červený roztok, s absorpčním maximem pohybujícím se mezi 480 510 nm (pro běžné SERS měření není posun maxima LSPR o několik nm zásadní). Koloid AuNPs byl také 25

charakterizován na absorpčním spektrometru. Jeho LSPR maximum má hodnotu 521 nm (obr. 3.3). Pro tyto dva typy nanočástic jsou přiloženy i SEM snímky (obr. 3.4 a 3.5). 2 AuNPs AgNPs 1,5 A 1 0,5 0 350 450 550 650 750 λ [nm] Obr. 3.3: Absorpční spektrum koloidů AuNPs a AgNPs použitých pro měření aminokyselin (kapitola 5) Obr. 3.4: SEM snímek AuNPs s maximem LSPR 521 nm (FSI VUT) 1 1 Všechny SEM snímky použité v experimentální části této práce pořídili na Fakultě strojního inženýrství VUT v Brně Mgr. Jan Čupera a doc. Ing. Vít Jan, Ph.D. 26

Obr. 3.5: SEM snímek AgNPs s LSPR maximem 479 nm (FSI VUT) 27

4 SERRS spektroskopie s kontinuálně laditelným laserem 4.1 Instrumentace Konvenční Ramanova spektra byla měřena na ramanském mikrospektrometru Renishaw InVia. Jedná se o disperzní spektrometr s integrovaným mikroskopem Leica, osazený zeleným (Ar +, 514,5 nm) a červeným (He-Ne, 633 nm) laserem, chlazenou křemíkovou CCD kamerou, edge filtry pro každý laser a difrakční mřížkou. Spektrometr funguje v 180 uspořádání, což znamená, že optická cesta pro excitaci je totožná s optickou cestou pro detekci (sběr signálu probíhá přímo z fokusu excitačního svazku). Pro mikroskopii i měření spekter lze využít tři objektivy: 5x, 20x, 50x. Pro možnost využití kontinuálně laditelného laseru pro Ramanovu spektroskopii bylo nutné zkonstruovat optickou cestu, která by umožnila nezávisle ozáření vzorku a následně detekci signálu pomocí mikrospektrometru Renishaw. Tento úkol byl splněn uplatněním 90 uspořádání a na optické lavici byla sestavena optická cesta složená z následujících prvků (obr. 4.1, 4.2 a 4.3): 1. kontinuální laserový zdroj Fianium WhiteLase SC450 High-Power Supercontinuum a AOTF filtr (na obr. 4.1 a 4.2 je pouze AOTF filtr) 2. spojná čočka, +20 D 3. zobrazovací monochromátor Oriel Instrument Cornerstone 0.25 m 4. štěrbina pro prostorovou filtraci svazku 5. měřič intenzity záření Thorlabs PM100USB 6. spojná čočka, +3,5 D 7. zrcátko 8. zrcátko 9. objektiv Nikon 20x s dlouhou pracovní vzdáleností (LWD) 10. vzorek (hranatá kapilára) 11. sběrný objektiv Leica 20x 12. spektrometr Renishaw InVia Podstatné prvky optické soustavy budou dále stručně popsány. 28

Obr. 4.1: Optická soustava pro měření Ramanových spekter laditelným laserem s vyznačenými částmi soustavy Obr. 4.2: Pohled shora na optickou soustavu pro měření Ramanových spekter laditelným laserem 29

Obr. 4.3: Detail na fokusační místo se vzorkem v hranaté kapiláře Fianium WhiteLase SC450 High-Power Supercontinuum je laserový zdroj generující širokopásmové kontinuální bílé záření o vlnových délkách 400 2300 nm. Je založen na nelineárním optickém vlákně, které ze záření o vlnové délce 1064 nm o vysoké intenzitě (Nd:YAG laser) vygeneruje kontinuální spektrum vlnových délek v uvedeném rozmezí. Vlákno je zavedeno do akusticko-optického laditelného filtru (AOTF), který umožňuje výběr vlnové délky, kterou potřebujeme, pomocí počítačového software. Různé vlnové délky mají různou intenzitu záření. Obr. 4.4: Software pro selekci vlnových délek laserového zdroje 30