Univerzita Karlova v Praze. 2. lékařská fakulta. Bakalářská práce Anna Cinkajzlová

Univerzita Karlova v Praze 2. lékařská fakulta Bakalářská práce 2011 Anna Cinkajzlová

Univerzita Karlova v Praze 2. lékařská fakulta Ústav biologie a lékařské genetiky Anna Cinkajzlová Molekulárně cytogenetická diagnostika strukturních chromozomových aberací metodou FISH (se zaměřením na subtelomerické přestavby) Bakalářská práce Praha 2011

Autor práce: Anna Cinkajzlová Vedoucí práce: RNDr. Eduard Kočárek, Ph.D. Oponent práce: MUDr. Aleš Panczak, CSc. Datum obhajoby: 2011

Bibliografický záznam Cinkajzlová, Anna. Molekulárně cytogenetická diagnostika strukturních chromozomových aberací metodou FISH(se zaměřením na subtelomerické přestavby). Praha: Karlova univerzita, 2. lékařská fakulta, Ústav biologie a lékařské genetiky, 2011. 69 s. Vedoucí bakalářské práce RNDr. Eduard Kočárek, Ph.D. Anotace Bakalářská práce se zabývá především strukturními přestavbami subtelomerických oblastí, které patří mezi nejčastější příčiny mentální retardace. Tyto aberace se klinicky projevují jako syndromy s definovaným specifickým fenotypem nebo nespecifickým fenotypem s různým stupněm mentální retardace asociované s dysmorfickými rysy a opožděným vývojem. Text stručně popisuje nejčastější syndromy způsobené subtelomerickými aberacemi a zároveň uvádí problematiku preklinické selekce u případů s nespecifickým fenotypem. V další části jsou rozebrány metodické možnosti stanovení subtelomerických přestaveb. Praktická část se soustředí výhradně na metody fluorescenční in situ hybridizace a multiplex ligation-dependent probe amplification, které patří mezi nejčastěji využívané vyšetřovací techniky. Annonation Bachelor thesis deals with the structural rearrangements of subtelomeric regions, which comprise the most significant causes of mental retardation. Subtelomeric aberrations clinically manifest themselves as syndromes with defined specific phenotype or unspecific phenotype with different degree of mental retardation associated with dysmorphic features and developmental delay. The text briefly describes both the most common syndromes caused by subtelomeric aberrations and the problematic preclinic selection in the cases of unspecific phenotype. Further the text elaborates on various methods of the analysis of subtelomeric aberrations. The practical part focuses solely on the methods fluorescence in situ hybridization and multiplex ligation-dependent probe amplification which both belong to the most commonly applied technics. Klíčová slova: strukturní aberace-submikroskopické přestavby-subtelomerické aberace- FISH-MLPA Keywords: structural aberrations- submicroscopic rearrangements-subtelomeric aberrations-fish-mlpa

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala samostatně pod vedením RNDr. Eduarda Kočárka, Ph.D. podle literárních pramenů a odborných zdrojů citovaných v referenčním seznamu. Současně prohlašuji, že stejná práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne 9. května 2011 ------------------------------------------------------ podpis

Poděkování Děkuji RNDr. Eduardu Kočárkovi, Ph.D., z Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. lékařské fakulty UK a FN Motol, za odborné vedení mé práce. Dále děkuji MUDr. Pavlu Tesnerovi, z Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. lékařské fakulty UK a FN Motol, za bližší seznámení s metodou FISH a za umožnění přístupu k fluorescenčnímu mikroskopu. Také děkuji RNDr. Petře Hedvičákové, z Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. lékařské fakulty UK a FN Motol, za uvedení do problematiky metody MLPA a jejího využití při analýze subtelomerických úseků. Na závěr bych ráda poděkovala Prim. MUDr. Markétě Havlovicové, z téhož ústavu, za umožnění přístupu k základním informacím o pacientech. Práce byly podpořeny grantem GAUK č. 264811, jehož hlavním řešitelem je MUDr. Pavel Tesner.

OBSAH 1. Teoretický úvod...9 1. 1. Strukturní chromozomové aberace...9 1. 1. 1. Typy strukturních chromozomových aberací...10 1. 2. Submikroskopické aberace chromozomů...11 1. 3. Subtelomerické aberace...12 1. 3. 1. Struktura subtelomerických regionů...14 1. 3. 2. Subtelomerické aberace s nespecifickým fenotypem...14 1. 3. 3. Subtelomerické aberace se specifickým fenotypem...15 1. 3. 4. Porovnání výtěžnosti vyšetření subtelomerických úseků u vybraných studií..18 1. 4. Metodické možnosti vyšetření subtelomerických aberací...22 1. 4. 1. Základní cytogenetické vyšetření...23 1. 4. 1. 1. Metoda HRT (High Resolution Technique)...23 1. 4. 2. Metody založené na hybridizaci...24 1. 4. 2. 1. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH)...24 1. 4. 2. 2. Komparativní genomová hybridizace (CGH)...26 1. 4. 2. 3. Array CGH...27 1. 4. 3. Metody založené na polymerázové řetězové reakci...27 1. 4. 3. 1. Primed in situ labelling (PRINS)...28 1. 4. 3. 2. Kvantitativní PCR v reálném čase (real time PCR)...28 1. 4. 3. 3. MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)...28 1. 4. 3. 4. MAPH (multiplex amplifiable probe hybridization)...29 2. Cíle práce...30 3. Materiál a metodika...31 3. 1. Soubor pacientů...31 3. 2. Fluorescenční in situ hybridizace...32 3. 2. 1. Roztoky a jejich příprava...32 3. 2. 2. Sondy...33 3. 2. 3. Pomůcky...35 3. 2. 4. Pracovní postup...35 3. 2. 5. Úprava nasnímaného obrazu na konkrétním příkladu...38 3. 3. MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification)...41 3. 3. 1. Sondy...41

3. 3. 2. Pomůcky...42 3. 3. 3. Pracovní postup...43 3. 3. 4. Hodnocení a závěr analýzy na konkrétním příkladu...46 4. Výsledky...48 4. 1. Výsledky analýzy FISH...48 4. 2. Srovnání kvality signálů jednotlivých subtelomerických sond...48 4. 3. Příklady výsledků metody FISH...50 4. 4. Příklady výsledků metody MLPA...52 5. Diskuse...54 5. 1. Kritéria k výběru pacientů a význam pozitivní diagnózy...54 5. 2. Technické a diagnostické možnosti metody FISH...55 5. 3. Technické a diagnostické možnosti metody MLPA...56 5. 4. Porovnání metod FISH a MLPA...56 6. Závěr...58 7. Referenční seznam...59 8. Seznam příloh...66 9. Přílohy...67

SEZNAM ZKRATEK CGH comparative genomic hybridization CTNND2 δ-catenin DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindol DNA deoxyribonukleová kyselina EDTA etylendiaminotetraoctová kyselina EHMT1 euchromatin histon methyl transferáza 1 FISH fluorescenční in situ hybridizace FITC fluorescein isothiokyanát HRT high resolution technique htert telomerázová reverzní transkriptáza IQ inteligenční kvocient MAPH multiplex amplifiable probe hybridization MLPA multiplex ligation-dependent probe amplification PCR polymerázová řetězová reakce PI propidium jodid PRINS primed in situ labelling SEMAF semaphorin F SSC saline sodium citrate (pufr obsahující chlorid sodný a citrát sodný) SSCT saline sodium citrate + Tween 20 (pufr obsahující chlorid sodný, citrát sodný a detergent Tween 20) TAR telomere associated repeats TAS telomere-asociated-sequence ÚBLG Ústav biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol

1. TEORETICKÝ ÚVOD Mentální retardace může mít různou etiologii, která zůstává až u 50 % případů neobjasněná. [Winnepenninckx et al., 2003] Jedna z prvních studií zabývajících se idiopatickou mentální retardací prokázala podíl submikroskopických aberací subtelomerických regionů přibližně u 7 % pacientů s těžkou a středně těžkou mentální retardací a u 0,5 % pacientů s lehkou mentální retardací. [Knight et al., 1999] V těchto případech je mentální retardace asociována s opožděným vývojem a nespecifickými dysmorfickými rysy. [de Vries et al., 2001] 1. 1. Strukturní chromozomové aberace Strukturní chromozomové aberace měnící strukturu chromozomu vznikají na podkladě nesprávné reparace chromozomálních zlomů či nerovnoměrného crossingoveru. Tyto změny se mohou vytvářet spontánně nebo v případě zlomů působením klastogenů látek, které katalyzují přerušení fosfodiesterových vazeb v řetězcích DNA (deoxyribonukleové kyseliny). Klastogenem je například ionizační záření, některé chemické látky a viry. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] Zlomy se klasifikují jako jednořetězcové a dvouřetězcové, přičemž dvouřetězcové se dále rozdělují na posunuté nebo zarovnané podle toho, jestli vznikají na různých či protilehlých místech řetězců DNA. [Rosypal, 2002] Frekvence strukturních aberací v populaci odpovídá hodnotě 1/ 300-400 novorozenců. Intrachrozomové aberace zasahují jeden chromozom, větší počet chromozomů zasahují pak aberace interchrozomové. Podle množství chromozomového materiálu můžeme strukturní aberace rozdělit na balancované a nebalancované přestavby. Balancované přestavby značí strukturní odchylky bez změněného množství genetického materiálu, a tudíž i bez abnormálního fenotypového projevu. Zařazujeme zde inverze a reciproké translokace. U balancované přestavby existuje riziko postižení potomků. Nebalancované přestavby souvisí s nadbytkem či absencí genetického materiálu, a tedy i s odpovídajícím patologickým fenotypem. Do této skupiny řadíme delece, duplikace, marker chromozomy a translokace zodpovídající za zmnožení či ztrátu úseků chromozomů. [Kočárek, 2007] 9

Strukturní přestavby mohou být přítomny ve všech buňkách organismu nebo jen u části buněk ve formě mozaiky. Rozsah jednotlivých aberací se různí od postižení jednoho genu až po skupinu genů, jež může zahrnovat i celé raménko chromozomu. Od toho se odvíjí diagnostika základní cytogenetická vyšetření dovolují rozlišit aberace o minimálním rozsahu 2 000-3 000 kb, kdežto pro aberace menšího rozsahu je vhodné užití molekulárně cytogenetických metod dovolujících identifikaci i tzv. submikroskopických aberací (viz oddíl 1. 2). [Nussbaum et al., 2004] 1. 1. 1. Typy strukturních chromozomových aberací Delece Za deleci označujeme ztrátu úseku chromozomu. Rozeznáváme terminální a intersticiální deleci, podle toho, zda došlo ke ztrátě koncové či vnitřní části chromozomu. Následkem delece může být haploinsuficience jednoho a více genů, která odráží neschopnost jedné kopie genetického materiálu zachovat normální biologické funkce. Klinické příznaky pak odpovídají množství deletovaného materiálu. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] Duplikace Jedná se o přítomnost dvou kopií segmentu chromozomu. Tento segment může představovat část genu, celý gen i skupinu genů intersticiálního nebo terminálního úseku chromozomu. Patologický fenotyp je pak případně vyvolán nadbytkem produktu. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] Translokace Translokace je přesun či vzájemná výměna částí chromozomů mezi alespoň dvěma chromozomy. Translokace rozlišujeme tandemové (nereciproké), reciproké a robertsonské. Tandemová translokace představuje přesun segmentu jednoho chromozomu na druhý, zatímco při reciproké translokaci dochází ke vzájemné výměně úseků mezi dvěma chromozomy. Méně časté jsou komplexní reciproké translokace postihující více chromozomů nalézané například u některých typů nádorů. Zvláštní případ translokací tvoří robertsonské fúze, kde dochází ke sloučení akrocentrických chromozomů v centromerických oblastech po odtržení krátkých ramének. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] 10

Inverze Vzniká v rámci jednoho chromozomu. V chromozomu se tvoří na dvou místech zlomy, úsek mezi nimi je přetočen o 180 a opět zabudován působením reparačních mechanismů. Pokud se vytváří zlom na obou raméncích, pak invertovaný úsek obsahuje centromeru a vzniká inverze pericentrická. Opakem je inverze paracentrická, u níž vznikají zlomy na jednom raménku, které nezasahují do oblasti centromery. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] Marker chromozomy Malé, často nadpočetné, strukturálně abnormální chromozomy zpravidla neidentifikovatelné základními cytogenetickými metodami. K jejich bližšímu určení se využívají modifikace metody fluorescenční in situ hybridizace. Marker chromozomy mají zachovanou centromeru a části dlouhých nebo krátkých ramének o různých délkách. Abnormální fenotyp závisí na množství zachovaného euchromatinu. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] Kruhové chromozomy Kruhový neboli ring chromozom je vytvářen odtržením koncových částí ramének a jejich následným spojením vlivem reparačních mechanismů. Fenotyp koliduje s množstvím deletovaného materiálu. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] Izochromozomy Izochromozom je tvořen stejným typem ramének (dvěma dlouhými nebo dvěma krátkými raménky). Při jeho vzniku se uplatňuje porucha dělení centromery v druhém meiotickém dělení nebo translokace celých ramének mezi homologními chromozomy. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek, 2007] 1. 2. Submikroskopické aberace chromozomů Submikroskopické aberace chromozomů jsou popisovány jako stavy způsobené chromozomálními přestavbami postihující malé počty genů, které zpravidla nemohou být detekované pomocí základních cytogenetických metod. Z tohoto důvodu bývají někdy nazývány aberacemi kryptickými. K jejich rozlišení a identifikaci se používají 11

citlivější molekulárně cytogenetické techniky založené na analýze DNA, například metody fluorescenční in situ hybridizace a další. Nejčastějšími submikroskopickými aberacemi jsou mikrodelece, méně často i jiné přestavby typu mikroamplifikací či mikroduplikací a translokací malých segmentů. Tyto přestavby vznikají následkem nerovnoměrného crossing-overu, kde mezi homologickými chromozomy nedochází k výměně stejně dlouhých úseků DNA. Příčinou může být rozdílný počet opakování v repetitivních sekvencích sousedících s danými genovými lokusy. Některé syndromy mohou vznikat na základě uniparentální dizomie a podstatnou roli může hrát i genomový imprinting, kdy výsledný patologický fenotyp závisí na původu deletovaného parentálního chromozomu. [Nussbaum et al., 2004; Kočárek et al., 2011] Mikrodelece jako příčiny mikrodelečních syndromů postihují terminální úseky krátkých či dlouhých ramének, intersticiální a subtelomerické úseky chromozomů. [Seemanová, 2002] Fenotyp pak odpovídá haploinsuficienci jednoho genu nebo skupině přilehlých genů ( contiguous gene syndromes ). Většina mikrodelečních syndromů má vymezen minimální kritický region, jehož delece zodpovídá za charakteristický fenotypový projev syndrom mnohočetných malformací, mentální retardaci a charakteristické abnormální rysy. [Kočárek et al., 2011] 1. 3. Subtelomerické aberace První ucelenější studie určující kryptické subtelomerické aberace jako možnou příčinu mentální retardace byla uvedena v roce 1993. [Wilkie, 1993] Nicméně už předtím byly představeny případy α-talasemií doprovázené mentální retardací a dysmorfickými rysy i případy některých mikrodelečních syndromů (konkrétně syndromů Cri du Chat, Wolf-Hirschorn a Miller-Dieker), v jejichž nálezech byly identifikovány submikroskopické přestavby v oblasti subtelomerických úseků. [Altherr et al., 1991] O dva roky později v roce 1995 byla vydána jedna ze stěžejních prací, která jednak potvrzovala subtelomerické aberace jako příčinu mentální retardace a jednak poukazovala na vysoké procento výskytu těchto aberací, jenž by je řadila jako druhou nejčastější příčinu mentální retardace po Downově syndromu. Současně došlo k rozvoji detekčních metod. Technika první studie analýza DNA polymorfismů identifikovala genotyp jedince na základě jeho vazby s daným polymorfismem, vyžadovala však vzorky i od obou rodičů a přes svou náročnost skýtala pouze 50 70 % úspěšnost. Tuto 12

techniku nahradila metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH), pro kterou byla v roce 1996 představena screeningová alternativa, obsahující kompletní sadu sond pro jednotlivé subtelomerické úseky (blíže viz oddíl 1. 4.). [Knight, Flint 1995] Završením byla do té doby nejrozsáhlejší studie, využívající právě tuto alternativu FISH, prokazující 7,4 % podíl subtelomerických přestaveb u 284 pacientů s těžkou a středně těžkou mentální retardací a 0,5 % podíl u 182 pacientů s lehkou mentální retardací. Tím potvrdila výskyt subtelomerických aberací jako jedné z významných příčin idiopatické mentální retardace. [Knight et al., 1999] Mentální retardace postihuje 2 3 % populace a je definována jako hodnota inteligenčního kvocientu (IQ) menší než 70. [Hélias-Rodzewicz et al., 2002] Rozlišujeme lehkou (IQ 50 69), středně těžkou (IQ 35 49), těžkou (IQ 34 21) a hlubokou mentální retardaci (IQ nižší než 20). Jednotlivé stupně se liší omezením logického, abstraktního a mechanického myšlení, komunikační schopností a pamětí. [Mentální retardace, 2010] Ačkoli zůstává až polovina případů neobjasněná, předpokládá se, že mentální retardace je způsobena v 50 % environmentálními faktory a v 50 % genetickými faktory, z čehož podíl přestaveb subtelomerických úseků by měl představovat 5 10 %. [Winnepenninckx et al., 2003] Subtelomerické aberace mohou být příčinou syndromů se specifickým klinickým projevem nebo se prezentují nespecifickým fenotypem s různým stupněm postižení, což je více časté. [Koolen et al., 2004] U těchto případů bývá mentální retardace zpravidla doprovázena prenatálně opožděným vývojem a dysmorfickými rysy. Z tohoto důvodu lze postižené zachytit již prenatálně ultrazvukem, zvláště pak u rodin s prokázaným výskytem subtelomerických přestaveb. [Faas et al., 2008] Mezi nejčastější strukturní chromozomální aberace v nálezech postižených patří především intersticiální nebo terminální delece krátkých či dlouhých ramének, duplikace a v menší míře nereciproké translokace subtelomerických úseků (viz tabulka 1. 3. 4. 2.). Vzhledem k tomu, že subtelomerické oblasti jsou bohaté na geny, mohou delece i duplikace velmi malých úseků zapříčinit vážné patologické následky. Z tohoto důvodu patří naprostá většina diagnostikovaných přestaveb těchto úseků mezi aberace submikroskopické. Zároveň všechny nalezené přestavby nemusí být zodpovědné za patologický fenotyp (to se týká především duplikací). [Rooms et al., 2005] 13

1. 3. 1. Struktura subtelomerických regionů Telomery obsahují charakteristické hexamerní sekvence (TTAGGG) v mnohonásobných kopiích zahrnující 5 15 kb terminální oblasti chromozomů. Obecně množství repetic těchto úseků odráží počet replikací buňky a působení vnějších faktorů jako je stres či oxidativní poškození. [Riethman et al., 2005] Vysoký stupeň podobnosti jednotlivých telomerických regionů může být příčinou nerovnoměrných rekombinací mezi nehomologními chromozomy během meiózy ( cross-talk ), na jejichž podkladě mohou vznikat delece či duplikace v subtelomerických úsecích. [Rooms et al., 2005] Subtelomerické oblasti tvoří přechod mezi telomerou a samotnou kódující sekvencí v regionu hrubě definovaném jako terminální 500 kb DNA každého chromozomu. [Kočárek, 2011; Riethman et al., 2005] Rozhraní mezi subtelomerickým regionem a telomerou je charakteristické přítomností repetitivní sekvencí označovaných jako TAR (telomere associated repeats), případně TAS (telomere-asociated-sequence). [Kočárek, 2011; Sýkorová, 2006] Subtelomerické regiony jsou hodnoceny na základě množství subtelomerických repetic, segmentálních duplikací, satelitních sekvencí a (TTAGGG) n -like úseků, které představují jednak těsně k telomerám přiléhající úseky TAR a jednak tzv. ostrůvky (TTAGGG) n -like sekvencí. Segmentální duplikace mohou být typické pro danou subtelomerickou oblast nebo mohou být stejné s pericentrickými repetitivními regiony, popřípadě s intersticiálními repetitivními lokusy. [Riethman, 2008] Na rozdíl od telomer subtelomerické oblasti obsahují geny, nepodléhají degradaci a svým uspořádáním, délkou i organizací jsou specifické u jednotlivých chromozomů. [Riethman et al., 2005; Maříková, 2006] Společně se svými asociovanými proteiny udržují stabilitu a tvoří nezbytnou součást chromozomů pro jejich přesnou replikaci. [Riethman, 2008] 1. 3. 2. Subtelomerické aberace s nespecifickým fenotypem Fenotyp postižených je velice heterogenní. Závisí na velikosti, původu a umístění chromozomální přestavby, případně na počtu a funkci zúčastněných genů. [Hélias-Rodzewicz et al., 2002] Z tohoto důvodu De Vries et al. vytvořili studii [de Vries et al., 2001], ve které porovnávali frekvenci klinických projevů postižených s prokázanou subtelomerickou aberací a kontrolní skupinou. Na základě této práce bylo navrženo schéma využívající nejčastěji se vyskytující příznaky jako kritéria pro preklinickou selekci postižených s nespecifickým fenotypem. Každé kritérium je 14

ohodnoceno určitým počtem bodů, přičemž celkový součet u subtelomerických aberací by měl splňovat cut off 3. Hodnotí se přítomnost následujících klinických projevů: Prenatálně započatý opožděný vývoj nízká porodní váha, hypotonie a mikrocefalie. Předčasný porod a vícečetné potraty. Dvě a více dysmorfií obličeje asymetrický obličej, hypertelorismus, abnormální utváření nosu a uší, oční anomálie. Non-faciální dysmorfie a růstové abnormality abnormální utváření končetin a prstů, vady srdce, hypospadie a kryptorchismus. Rodinný výskyt mentální retardace pozitivní až u 50 % případů, možné balancované přestavby u rodičů. Přítomnost a stupeň mentální retardace. Specificita a senzitivita (tj. počet správně pozitivních, respektive správně negativních případů z celkového počtu vyšetřovaných) této preklinické selekce odpovídá až 95 %. Sami autoři považují za signifikantní nález prenatálně započatý opožděný vývoj a pozitivní rodinou historii pro mentální retardaci. [de Vries et al., 2001] Pozdější práce tyto kritéria zkráceně shrnují pod označení MR/DD/NDF popřípadě MR/DD/NDF/MM, z anglických mental retardation, developmental delay, nonspecific dysmorphic features a multiple miscarriages. [Jalal, 2003] Většina studií si navíc určuje za kritérium i negativní cytogenetické vyšetření metodu G-pruhování s rozlišitelností odpovídající 450 550 pruhům. 1. 3. 3. Subtelomerické aberace se specifickým fenotypem Tyto subtelomerické aberace se prezentují jako dobře definované syndromy s charakteristickými projevy, na jejichž podkladě mohou být rozpoznány. Většina z těchto syndromů je submikroskopických, i když některé případy syndromů Wolf- Hirschorn či Cri du Chat mohou být odhalitelné pomocí základních cytogenetických metod. [de Vries et al., 2001] Z proběhlých studií vyplývá, že případů subtelomerických přestaveb se specifickým fenotypem je méně než případů s fenotypem nespecifickým. 15

1p36 deleční syndrom Vzniká na podkladě terminální nebo intersticiální delece, v menší míře komplexem přestaveb zahrnující více jak jednu deleci s duplikací, inverzí nebo inzercí, popřípadě derivací chromozomu 1. Syndrom se manifestuje mentální retardací, hypotonií, abnormalitami mozku, nerozvinutím řeči, brachy/kamptodaktylií, malými chodidly, dále postižení mohou trpět epilepsií, vrozenými vadami srdce, poruchami zraku a sluchu. Klasická kraniofaciální dysmorfie se projevuje mikro/brachycefalií, pozdním uzavřením fontanely, epikanty, enoftalmem, hypoplazií střední části obličeje, dlouhým philtrem, výraznou bradou a abnormálně utvářenými ušní boltci. [Battaglia, Shaffer, 2008] 1qter deleční syndrom Jde o distální deleci dlouhého raménka chromozomu 1. Jeho klinický projev odpovídá 1q43-1q44 delečnímu syndromu. [Schefels et al., 1996] Projevuje se těžkou mentální retardací bez rozvinuté řeči, prenatálně započatým růstovým opožděním, těžkou postupující mikrocefalií, abnormalitami corpus callosum, srdečními poruchami, hypospadií, gastroesofageálním refluxem a charakteristickými obličejovými rysy: malým nosem, vyhlazeným dlouhým philtrem, plnou a kulatou tváří. [De Vries et al., 2001] Wolf-Hirschornův syndrom Podkladem je terminální mikrodelece krátkého raménka 4, konkrétně aberace kritické oblasti 4p16.3. [Battaglia et al., 2002] Původně byly popisovány dva rozdílné syndromy s podobným fenotypem, Pitt-Rogers-Danksův syndrom a Wolf- Hirschornův syndrom, ale pozdější studie prokázaly, že se jedná o různé formy téhož onemocnění. Pitt-Rogers-Danksův syndrom měl oproti Wolf-Hirschornově syndromu méně závažný klinický fenotyp, který se prezentoval později. [Kant et al., 1997] Postižený má typické kraniofaciální rysy, mikrocefalii, psychomotorickou retardaci, hypotonii, epilepsii, vrozené srdeční vady, skeletální poruchy, méně často poruchy sluchu, rozštěpy rtu/patra, malformaci močového systému, strukturální abnormality mozku. Kraniofaciální dysmorfie bývá popisována jako helma řeckého válečníka pro svůj typický projev vysoké čelo, hypertelorismus, epikanty, strabismus, nos se širokým kořenem a převislou špičkou, krátké philtrum a dysplastické, nízce uložené ušní boltce. Populační výskyt je 1/ 30 000. [Battaglia et al., 2002; Seemanová, 2002] 16

Cri du Chat syndrom Je projevem terminální delece krátkého raménka 5, méně často intersticiální mikrodelece kritického regionu 5p15.2. Za typický fenotyp zodpovídá ztráta funkce tří genů pro Semaphorin F (SEMAF), δ-catenin (CTNND2) a telomerázovou reverzní transkriptázu (htert). Charakteristickými znaky postižených novorozenců je křik podobný kočičímu, nízká porodní váha, hypotonie, mikrocefalie, kulatá tvář, hypertelorismus, epikanty, divergentní strabismus, mikrognacie a nízce nasedající ušní boltce. Méně časté jsou srdeční a neurologické abnormality, poruchy ledvin, syndaktylie, hypospadie a kryptorchismus. [Mainardi, 2006] V pozdějším věku se manifestuje těžká psychomotorická retardace, postižení mohou být agresivní se sklonem k sebepoškozování. Dospělí mají štíhlou, souměrnou postavu a trojúhelníkovou tvář. Presenilní projevy jsou patrné už po 20. roce života. Frekvence výskytu v populaci se udává 1/ 15 000 1/ 50 000. [Seemanová, 2002] 6p deleční syndrom Vzniká na základě delece krátkého raménka chromozomu 6, která postihuje kritický region 6p24. Studie Anderlid et al. [Anderlid et al., 2003] uvádí, že je možno rozeznat terminální deleci od intersticiální podle klinického fenotypu. Intersticiální delece se projevuje méně specificky, zatímco u terminální delece nalézáme těžší fenotyp zahrnující abnormality přední oční komory, progresivní ztrátu sluchu a nerozvinutí řeči. Tento deleční syndrom se dále manifestuje mentální retardací, defekty srdce a ledvin, krátkým krkem, brachy/mikrocefalií, abnormálně utvářenými prsty, anomálií genitálu a faciální dysmorfií, zahrnující hypertelorismus, epikanty, široký kořen nosu, vyhlazené philtrum a hypoplasii střední části obličeje. [Law et al., 1998] Kleefstrův syndrom Jedná se o deleci dlouhého raménka chromozomu 9 v oblasti 9q34.3, kde sídlí gen pro euchromatin histon methyl transferázu 1 (EHMT1). Postižení mají těžkou mentální retardaci, brachy/mikrocefalii, hypotonii, makroglosii, plochý obličej s hypertelorismem, nízce postaveným srostlým obočím, hypoplasií střední části obličeje a nosem s rozšířenými nosními dírkami. V menší míře se prezentuje obezita, srdeční poruchy, abnormálně utvářený genitál, hypotyreóza, epilepsie a anomálie mozku. [Kleefstra et al., 2005] 17

Miller-Diekerův syndrom Vzniká na podkladě terminální delece 17. chromozomu v kritické oblasti 17p13.3. Charakteristická pro tento syndrom je malformace mozku lisencefalie projevující se agyrií či pachygyrií (tj. vymizením, respektive zbytněním mozkových závitů). Kraniofaciální dysmorfie zahrnuje mikrocefalii s bitemporálním zúžením, zvrásněné čelo, malý nos, mikrognacii a převislý horní ret. Dále se vyskytují poruchy srdce, epileptické záchvaty, motorická a hluboká mentální retardace. Přežití jedinců je výrazně zkráceno. V 10 20 % nalézáme balancovanou translokaci u jednoho z rodičů. Frekvence výskytu v populaci odpovídá 1/ 10 000. [van Tuinen et al., 1988; Seemanová, 2002] Syndrom Phelan-McDermidův Podkladem je ztráta regionu 22q13.3, která může vzniknout následkem prosté delece, translokace nebo jiné strukturální přestavby zahrnující dlouhé raménko chromosomu 22. U postižených je těžká hypotonie při narození, celkový opožděný vývoj, normální nebo urychlený růst a nerozvinutá řeč. Dysmorfie jsou méně specifické dolichocefalie, dlouhé oční řasy, velké nebo neobvyklé utváření ušních boltců, plné tváře, špičatá brada, velké ruce a dysplastické nehty. Později se může vyvinout chování podobné autismu. Postižení vzniká poruchou genu SHANK 3, který kóduje strukturální protein v post-synaptické membráně. [Phelan, 2008] 1. 3. 4. Porovnání výtěžnosti vyšetření subtelomerických úseků u vybraných studií Tato část je určena především pro ilustraci výskytu subtelomerických aberací a případné podložení čí vyvrácení některých dat v předchozím textu. K vypracování tohoto oddílu bylo použito šest studií různých časových období zahrnující vyšetření minimálně sta postižených s odlišným stupněm mentální retardace pocházejících z různých zemí (Korea [Park et al., 2008], Holandsko [Koolen et al., 2011], Německo [Auber et al., 2009], Čína [Wu et al., 2010], Dánsko [Sogaard et al., 2005], Velká Británie [Knight et al., 1999]). To zajišťuje alespoň minimální různorodost, která by měla přispět k větší hodnověrnosti prezentovaných dat. Tabulka 1. 3. 4. 1. uvádí celkový přehled počtu vyšetřených a z toho počet případů s pozitivním nálezem subtelomerické aberace převedené na procentuální zastoupení. Z uvedené hodnoty celkového procentuálního zastoupení pozitivních případů můžeme souhlasit s předpokladem o 5 10 % podílu subtelomerických 18

přestaveb jako příčině mentální retardace. [Winnepenninckx et al., 2003] Současně lze z procentuálního zastoupení pozitivních případů v jednotlivých zemích reprezentovanými dílčími studiemi usuzovat i na možně chybný závěr korejské studie, který předpokládá, že subtelomerické přestavby nejsou jednou z častých příčin mentální retardace u dětských pacientů v Koreji [Park et al., 2008]. Národnost či rasa vyšetřovaných zjevně nehrála větší roli v přítomnosti či nepřítomnosti subtelomerických aberací u dalších studií. Pro lepší přehlednost jsou hodnoty počtu vyšetřovaných a pozitivních případů zpracovány v grafu (obrázek 1. 3. 4. 1.). Tabulka 1. 3. 4. 1. Celkový počet vyšetřených a počet pozitivních případů Studie Počet vyšetřených Počet pozitivních případů Počet pozitivních případů [%] Park et al. [2008] 100 1 1 Koolen et al. [2004] 210 14 6,7 Auber et al. [2009] 296 17 5,7 Wu et al. [2010] 451 23 5,1 Sogaard et al. [2009] 132 9 6,8 Knight et al. [1999] 466 22 4,7 Celkem 1655 86 5,2 Obrázek 1. 3. 4. 1. Celkový počet vyšetřených a počet pozitivních případů 600 500 451 466 400 300 200 100 0 100 Park et al. [2008] 210 296 132 1 14 17 23 9 22 Koolen et al. [2004] Auber et Wu et al. Sogaard al. [2009] [2010] et al. [2009] Knight et al. [1999] Počet vyšetřených Počet pozitivních případů Tabulka 1. 3. 4. 2. uvádí zastoupení delecí, duplikací a translokací ve vzorku pozitivních případů u jednotlivých studií. Počet aberací u dílčích studií není vždy roven 19

počtu pozitivních případů a to z toho důvodu, že nálezy některých pacientů obsahovaly kombinace dvou delecí nebo kombinace delece s duplikací, které jsou v tabulce započítány zvlášť. Proto neodpovídá ani celkový součet pozitivních případů součtu jednotlivých aberací. Z tabulky je patrný dvojnásobně vyšší výskyt delecí oproti výskytu duplikací či translokací. Pro lepší posouzení zpracovaných dat je opět přiložen graf (obrázek 1. 3. 4. 2.). Tabulka 1. 3. 4. 2. Zastoupení pozitivních případů a jednotlivých aberací Studie Počet pozitivních případů Delece Duplikace Translokace Park et al. [2008] 1 1 0 0 Koolen et al. [2004] 14 10 4 0 Auber et al. [2009] 17 10 10 0 Wu et al. [2010] 23 21 7 0 Sogaard et al. [2009] 9 4 0 5 Knight et al. [1999] 22 9 0 13 Celkem 86 55 21 18 Obrázek 1. 3. 4. 2. Zastoupení pozitivních případů a jednotlivých aberací 30 25 20 15 10 5 0 23 21 17 14 10 10 10 7 4 1 1 0 0 0 0 0 Park et al. [2008] Koolen et al. [2004] Auber et al. [2009] Wu et al. [2010] 22 13 9 9 4 5 0 0 Sogaard et al. [2009] Knight et al. [1999] Počet pozitivních případů Počet delecí Počet duplikací Počet translokací Pro úplnost jsou dále zařazeny grafy (Obrázky 1. 3. 4. 3. / 4.), které prezentují data získaná z vyšetření subtelomerických aberací metodou MLPA (multiplex ligationdependent probe amplification, konkrétně SALSA MLPA kit P070 Human Telomere-5 a SALSA MLPA kit P036-E1 Human Telomere-3) provedených na Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol (ÚBLG). [Hedvičáková, nepublikovaná data] 20

Obrázek 1. 3. 4. 3. graf uvádí celkové počty vyšetřených a pozitivních případů převedené na procentuální zastoupení v období mezi lednem 2008 a březnem 2011. Z tohoto grafu lze také potvrdit předpokládaný 5 10 % výskyt subtelomerických přestaveb u postižených s mentální retardací v české populaci. Obrázek 1. 3. 4. 3. Celkový počet vyšetřených pacientů a počet pozitivních případů s nálezem subtelomerické aberace od roku 2008 do března 2011 na ÚBLG 5,35% celkový počet vyšetřených: 728 počet pozitivních případů: 39 94,65% Obrázek 1. 3. 4. 4. (graf) prezentuje počty vyšetřených a počty pozitivních případů v jednotlivých letech. Nejvyšší podíl pozitivních případů nalézáme v roce 2008, což je dáno zřejmě nemožností správné indikace vyšetření u dříve nediagnostikovaných případů. Po převedení na procenta by výskyt subtelomerických aberací odpovídal 11 %. Obrázek 1. 3. 4. 4. Záchyt subtelomerických aberací metodou MLPA od roku 2008 do března 2011 na ÚBLG 300 250 200 200 240 249 150 celkový počet vyšetřených počet pozitivních případů 100 50 0 39 22 12 2 3 2008 2009 2010 2011 21

1. 4. Metodické možnosti vyšetření subtelomerických aberací Jak už bylo dříve uvedeno mezi nejčastější aberace subtelomerických úseků patří delece a duplikace různého rozsahu v terminálních či intersticiálních úsecích chromozomů. Od toho se odvíjí i potřeba dostatečně citlivých diagnostických metod. Pomocí základního cytogenetického vyšetření, jehož citlivost se uvádí 3 5 Mb, můžeme odhalit pouze rozsáhlé strukturní aberace, např. terminální delece krátkých ramének chromozomu 5 u některých případů syndromu Cri du Chat. [Rooms et al., 2005] Z tohoto důvodu je vhodná indikace molekulárně cytogenetických metod s vyšší rozlišitelností. Nejširší uplatnění má zde metoda fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a její různé modifikace. Ty dovolují vyšetření určitých subtelomerických úseků pomocí FISH s lokus specifickými sondami nebo dávají celkový přehled o komplexních strukturních přestavbách u vyšetření metodou multicolor FISH. [Kočárek, 2007] Pro screening subtelomerických úseků byla v roce 1996 představena metoda multiprobe FISH, která dovoluje současné vyšetření subtelomerických sekvencí v jedné reakci. Aplikací 41 sond v průměrné vzdálenosti 300 kb od telomerických úseků je možné vyhodnotit případné aberace na jednotlivých raméncích chromozomů vyjma krátkých ramének akrocentrických chromozomů. Pro náročnost svého zpracování a následného zhodnocení bývá nahrazována. [Erjavec-Škerget et al., 2006] Metody FISH jsou vhodné k vyšetření balancovaných i nebalancovaných přestaveb a diagnostice mozaik. [Rooms et al., 2005] Techniky MAPH a MLPA (z anglického multiplex amplifiable probe hybridization a multiplex ligation-dependent probe amplification) umožňují screeningové vyšetření úseků na všech koncích dlouhých i krátkých ramének chromozomů v jedné reakci. Současně jsou dostupné soupravy metody MLPA k vyšetření většího počtu lokusů v subtelomerických úsecích daného chromozomu, což je vhodné k upřesnění lokalizace aberace. [Rooms et al., 2005; SALSA MLPA KIT P036- E1 Human Telomere-3, 2011] Metody MAPH ani MLPA však nelze použít k vyšetření balancovaných strukturních aberací a mozaik. V případě pozitivního nálezu vyžadují potvrzení jinou metodou. Pro svou jednoduchost a přesnost MLPA nahrazuje multiprobe FISH. [Rooms et al., 2005] Metoda CGH (z anglického Comparative genomic hybridization) a především její modifikace CGH-array představují spolehlivou diagnostiku subtelomerických 22

aberací, včetně určení velikosti přestavby. Tyto metody nejsou vhodné pro vyšetření balancovaných přestaveb. Pro svou vysokou pořizovací cenu zpravidla nebývají využívány ke screeningu subtelomerických aberací. [Rooms et al., 2005] K vyšetření subtelomerických přestaveb lze užít i metody PRINS (Primed in situ labelling) a kvantitativní polymerázovou řetězovou reakci v reálném čase (real-time PCR). [Erjavec-Škerget et al., 2006] Jejich užití však není časté, a proto další text uvádí pouze stručný popis. 1. 4. 1. Základní cytogenetické vyšetření Postup základního cytogenetického vyšetření zahrnuje správný odběr, separaci a kultivaci buněk, vyhotovení preparátu chromozomů s jeho následným obarvením. Pro vizualizaci se využívá několika speciálních barvicích postupů, které využívají vazbu barviva na histony DNA. Nejpoužívanější barvicí postup tzv. G-pruhování je založeno na krátkodobé expozici chromozomů v trypsinu a dobarvení roztokem Giemsa- Romanowski. Roztok trypsinu způsobí částečnou degradaci proteinových složek, které se po obarvení projeví jako charakteristické pruhy jednotlivých chromozomů karyotypu. Kvalita vyšetření se hodnotí podle počtu dosažených pruhů od nepřítomného pruhování po nejvyšší kvalitu 850 pruhů. Další barvicí postupy (Q-pruhování, R-pruhování a C- pruhování) se hodí zejména pro doplnění diagnostiky. Základní cytogenetické vyšetření je vhodné pro vyšetření numerických a rozsáhlých strukturních aberací. [Kočárek, 2007] 1. 4. 1. 1. Metoda HRT (High Resolution Technique) Metoda HRT je speciální kultivační postup, který slouží k získání chromozomů v méně kondenzovaném stavu, což se s výhodou využívá pro analýzu strukturních přestaveb menšího rozsahu. Princip této metody zahrnuje synchronizaci buněčného dělení a zastavení mitózy již v prometafázi. [Nussbaum et al., 2004] Do kultivačního média se přidají syntetické analogy bází (např. fluorouridin) nebo sloučeniny blokující syntézu nukleotidů (např. metotrexát), čímž se dosáhne zástavy buněčného cyklu v S- fázi. Po centrifugaci a odstranění média se dodá nové médium obsahující bromdeoxyuridin, který se v dalších buněčných cyklech zařazuje do DNA namísto deoxytymidinu a snižuje tím kondenzaci chromozomů. Ve chvíli, kdy se většina buněk nachází v prometafázi, se přidá kolcemid. Další postup je shodný s metodou G- pruhování. [Kočárek et al., 2011] 23

1. 4. 2. Metody založené na hybridizaci Hybridizační techniky jsou založeny na komplementárním navázání dvou řetězců nukleových kyselin, z nichž jeden řetězec prezentuje vyšetřovaný úsek DNA, popřípadě RNA, a ten druhý řetězec aplikované sondy. Sondy jsou uměle připravené úseky nukleových kyselin o průměrné délce 200 400 bp sloužící k detekci komplementárních úseků vyšetřovaných sekvencí. Mohou být značeny přímo enzymem, radioaktivním izotopem a flourochromem nebo nepřímo haptenem s následnou detekcí značenou protilátkou. Přímé značení je výhodné kvůli rychlosti a citlivosti reakce, nepřímé kvůli možnosti zesílení konečného signálu. Nejvýznamnějším zástupcem hybridizačních technik je metoda fluorescenční in situ hybridizace. [Kočárek, 2007] 1. 4. 2. 1. Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) Fluorescenční in situ hybridizace pracuje na principu navázání fluorescenčně značených sond ke komplementárním úsekům vyšetřované DNA přímo na preparátech v původním biologickém materiálu tj. in situ. V místě hybridizace sondy vzniká specifický signál, který se následně detekuje pomocí fluorescenčního mikroskopu. Sondy mohou být značeny přímo fluorochromem či nepřímo haptenem s detekcí fluorescenčně značenou protilátkou. Jako zdroj vyšetřované DNA využívá FISH interfázní jádra nebo metafázní chromozomy fixované na sklíčku. [Kočárek, 2007; Šťastná et al., 2008] Při podezření na určitý syndrom se obvykle aplikují dvě sondy, které hybridizují s rozdílnými lokusy. Vyšetřovací sonda je komplementární ke kritickému regionu předpokládaného syndromu a nepřítomnost či nadbytek jejího signálu svědčí o deleci či amplifikaci DNA v daném lokusu. Kontrolní sonda hybridizuje s rozdílným lokusem, případně centromerou a slouží k potvrzení přítomnosti vyšetřovaného chromozomu. Typy sond a jejich užití: Satelitní sondy hybridizují s repetitivními sekvencemi v oblasti centromer, telomer či jiných úseků. Využívají se k detekci aneuploidií chromozomů a identifikaci marker chromozomů. Lokus specifické sondy hybridizují se specifickými sekvencemi DNA, které představují jednotlivé geny, jejich části nebo popřípadě skupiny genů. Slouží pro diagnostiku submikroskopických aberací (včetně subtelomerických přestaveb) a některých nádorových onemocnění. 24

Celochromozomové (malovací) sondy hybridizují se sekvencemi celých chromozomů nebo jejich částí. Lze je použít k identifikaci původu marker chromozomů, strukturních aberací a komplexních chromozomálních přestaveb. V rutinní analýze se nevyužívají k vyšetření interfázních jader. [Kočárek, 2007; Šťastná et al., 2008] Základní pracovní protokol FISH Tento protokol je obecně platný, nicméně může podléhat určitým modifikacím (závisejících např. na typu, délce a koncentraci sondy či koncentraci dalších složek). Přesný doporučený postup přikládá výrobce k dané sondě. [Šťastná et al., 2008] 1. Příprava preparátu Pokud chceme získat maximálně kondenzované chromozomy, přidáme nejprve roztok kolcemidu, který porušuje dělící vřeténko a tím zastavuje dělení buněk v metafázi. Buňky získané kultivací hypotonizujeme, aby nabobtnaly a došlo ke ztenčení jejich membrány, zcentrifugujeme, fixujeme směsí metanolu a kyseliny octové. Takto upravené buňky se kapou na podložní sklo. 2. Denaturace sondy a vzorku DNA Probíhá zpravidla za vyšší teploty 70 75 C v prostředí formamidu látky, která destabilizuje vodíkové můstky mezi bázemi, čímž nemusí být použita tak vysoká denaturační teplota. Denaturace sondy a vzorku DNA může probíhat odděleně i společně. 3. Hybridizace sondy a vzorku DNA Navozují se reasociační podmínky při kterých dochází k navázání sondy ke komplementárním úsekům vyšetřované DNA. Hybridizace probíhá v termostatu při teplotě 37 C. Doba je dána typem sondy od 30 minut až po 24 hodin. 4. Odstranění nespecifických signálů Nespecifické signály vznikají v místech ne zcela komplementárního navázání sondy. K odstranění těchto signálů se využívá roztok formamidu nebo (dnes častěji) horký roztok o nízké koncentraci solí. 25

5. Counterstaining K podbarvení neboli nespecifickému obarvení vyšetřovaných chromozomů případně interfázních jader se nejčastěji využívá DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) či PI (propidium jodid). 6. Mikroskopické hodnocení Výsledné hodnocení se provádí fluorescenčním mikroskopem napojeným na počítačový software. Fluorescenční mikroskop pracuje na principu excitace. Rtuťová výbojka emituje UV záření, které prochází excitačním filtrem na preparát. Světlo v preparátu vybudí přestup elektronů fluorochromu na vyšší energetické hladiny. Při návratu elektronů na původní energetické hladiny dochází k emisi záření, které je po usměrnění bariérovým filtrem pozorováno v objektivu. Je nutné kombinovat specifické typy filtrů s užitými fluorescenčními barvivy. [Kočárek, 2007; Šťastná et al., 2008] 1. 4. 2. 2. Komparativní genomová hybridizace (CGH) Komparativní genomová hybridizace je molekulárně cytogenetická metoda umožňující detekci chromozomálních přestaveb genomu v jedné reakci. Toho lze výhodně využít především v nádorové cytogenetice a diagnostice mentálních poruch neznámé etiologie. [Schubert et al., 2005] Reakce probíhá na podložním skle s referenčními metafázními chromozomy, na které se aplikuje izolovaná vyšetřovaná DNA značená fluorochromem a současně referenční DNA značená odlišným fluorochromem. Po denaturaci se nechá proběhnout hybridizace, při níž dochází ke kompetici o komplementární vazebná místa na chromozomech mezi vyšetřovanou a referenční DNA. Následuje odmytí nespecifických signálů a counterstaining. Nakonec se pomocí fluorescenčního mikroskopu připojenému k počítačovému softwaru kvantitativně vyhodnotí intenzita signálu obou fluorochromů podél každého chromozomu. Delece ve vyšetřovaném materiálu se projeví jako zvýšený signál fluorochromu referenční DNA, naopak amplifikace se projeví zvýšením signálu fluorochromu vyšetřované DNA. [Houldsworth, Chaganti, 1994] K výhodám této metody patří možnost vyšetření interfázních chromozomů, k nevýhodám, že nelze zjistit balancované translokace nebo jiné změny, u kterých nedochází k deleci či amplifikaci genetického materiálu. [Kočárek, 2007] 26

1. 4. 2. 3. Array CGH Array CGH se používá k diagnostice nebalancovaných strukturálních a numerických chromozomových abnormalit. [Evangelidou et al., 2010] Různě značené DNA (vyšetřovaná a referenční) hybridizují s velkým počtem úseků DNA (sond) o známé sekvenci. Každá tato sonda má své přesné umístění na skle ve formě tečky. Hodnocení je obdobné jako u metody CGH podle převažujícího signálu fluorochromu vyšetřované nebo referenční DNA můžeme usuzovat na deleci či amplifikaci DNA ve vyšetřovaném materiálu. [Picard et al., 2005; Kočárek, 2007] Tato metoda může být pro svou citlivost využita i k diagnostice submikroskopických aberací.[rooms et al., 2005] 1. 4. 3. Metody založené na polymerázové řetězové reakci Polymerázová řetězová reakce (PCR) je molekulární metoda sloužící k enzymatické amplifikaci DNA. Na vymezení vybraného úseku DNA se využívají primery. Primery jsou krátké oligonukleotidové úseky nukleových kyselin tvořené sekvencí komplementární s počáteční a konečnou oblastí amplifikovanému fragmentu DNA. Další nezbytnou složku zahrnuje termostabilní enzym DNA polymeráza, který připojuje nové nukleotidy na 3 OH konce primerů komplementárně podle templátu a zajišťuje tak elongaci nově vznikajících nukleotidových řetězců. Nukleotidy se získávají rozkladem deoxynukleosidtrifosfátů přítomných v reakční směsi. Celá reakce probíhá ve vhodném pufru. Jeden cyklus se sestává z těchto tří teplotně odlišných kroků: Denaturace vyšetřované dsdna na jednovláknové řetězce je dána působením teploty 92 96 C. Nasedání neboli annealing primerů probíhá při teplotě 40 65 C (přesná teplota závisí na typu primerů, uvádí se o 5 C nižší než je Tm primerů). Elongace nukleotidových vláken působením DNA polymerázy vyžaduje teplotu 70 74 C, doba a přesná teplota je závislá na délce amplifikovaného úseku a typu DNA polymerázy. Proces PCR reakce probíhá v termocykleru, jenž dovoluje rychlé a přesné změny teplot. Celý postup PCR tvoří 20 35 cyklů. Konečný produkt se dělí pomocí elektroforézy na agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. [Kočárek, 2007; Šťastná et al., 2008] 27

1. 4. 3. 1. Primed in situ labelling (PRINS) Metoda PRINS v sobě kombinuje FISH s PCR. K vyšetření se využívají speciální komůrky pro nanášení roztoku na preparát obsahující DNA-polymerázu, nukleosidtrifosfáty, z nichž je část fluorescenčně značená a primer, který se váže ke komplementární sekvenci chromozomu. Po denaturaci DNA a hybridizaci primeru, dochází k jeho enzymatickému namnožení. Díky zabudování některých fluorescenčně značených nukleosidtrifosfátů je možné výsledek vyhodnotit fluorescenčním mikroskopem jako u klasické FISH. [Kočárek, 2007] 1. 4. 3. 2. Kvantitativní PCR v reálném čase (real time PCR) Metoda kvantitativní PCR v reálném čase vyžaduje speciální termocykler vybavený detektorem k měření změn intenzity fluorescence. Principem této metody je sledování kinetiky PCR. Jedna z modifikací využívá fluorescenčně značenou sondu nasedající k sekvenci umístěné mezi místy, k nimž hybridizují protisměrně orientované primery. Během elongace řetězců dochází k postupnému odbourávání sondy za zvýšení fluorescence v roztoku. Tato intenzita fluorescence je kontinuálně detekována a odpovídá tak nárůstu amplikonů. [Kočárek, 2007] 1. 4. 3. 3. MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) Metoda MLPA je jednoduchá, rychlá a přesná technika, která v sobě pojí hybridizaci, PCR a elektroforézu. [Sellner, Taylor, 2004] Vyšetřovaná DNA zde hybridizuje s párem sond, které v případě nepřítomnosti aberace po navázání k cílové sekvenci těsně přiléhají. Obě sondy se skládají ze specifické sekvence a univerzální sekvence pro primer, při čemž jedna sonda obsahuje navíc sekvenci ( stuffer sequence ) o variabilní délce, která umožní rozlišení PCR produktů elektroforézou. Hybridizace probíhá v roztoku, kde po komplementárním navázání sond k příslušným sekvencím vyšetřované DNA jsou oba těsně naléhající řetězce propojeny fosfodiesterovou vazbou působením enzymu ligázy. Pouze takto ligované sondy mají z každé strany ohraničení univerzálními sekvencemi pro primery a mohou být následně amplifikovány metodou PCR. Na metodu PCR navazuje kapilární popřípadě gelová elektroforéza sloužící k rozdělení produktů podle jejich délek. Konečným výstupem je graf, na kterém podle plochy a výšky píku odečítáme případnou deleci či amplifikaci DNA ve vyšetřovaných úsecích. 28

Základní protokol metody MLPA: Denaturace rozrušení vodíkových vazeb mezi řetězci dsdna, vzorek DNA se denaturuje 5 min při 98 C a ochlazením vzorků na 25 C. Hybridizace po napipetování hybridizační směsi obsahující sondy, probíhá hybridizace nejprve 1 min při 95 C, poté 16 20 hod při 60 C. Ligace po přidání ligační směsi, se napipetuje enzym ligáza, který propojí hybridizované sondy. Ligace probíhá 15 min při 54 C, následně je ligáza inaktivována působením teploty 98 C po dobu 5 min. PCR reakce namnožení ligovaných sond ve vhodném pufru s přídavkem směsi na PCR, reakce zahrnuje celkem 35 cyklů skládajících se ze tří teplotních kroků: 30 s při 95 C, 30 s při 60 C, 60 s při 72 C. Konec reakce je dán teplotou 72 C po dobu 20 min. Separace fragmentů kapilární nebo gelovou elektroforézou. Hodnocení číselných dat a grafického výstupu. Metoda MLPA oproti metodě MAPH dovoluje diagnostiku mutací menšího rozsahu a současně je její postup i méně náročný. [General MLPA Protocol, 2011; Kočárek, 2007] Vzhledem ke své relativní jednoduchosti a snadnému hodnocení má nezastupitelný význam ve screeningu subtelomerických aberací. [Rooms et al., 2005] 1. 4. 3. 4. MAPH (multiplex amplifiable probe hybridization) MAPH podobně jako metoda MLPA využívá hybridizaci, PCR a elektroforézu. Princip metody spočívá v aplikaci souboru sond o různých délkách na jednořetězcové molekuly DNA fixované k nylonové membráně. Během následné hybridizace dochází ke komplementárnímu navázání řetězců sond k vyšetřovaným úsekům DNA. V dalším kroku se nespecificky navázané sondy odstraní z membrány promytím. Hybridizované sondy jsou z komplementárních úseků získány a namnoženy metodou PCR. Poněvadž jsou sondy ohraničeny shodnou sekvencí, probíhá jejich amplifikace metodou PCR v jednom kroku pomocí univerzálních primerů. Následuje rozdělení PCR produktu elektroforézou (kapilární, gelovou) podle délek sekvencí. Výsledek je opět kvantifikován ve formě grafu, kde podle plochy a výšky jednotlivých píků můžeme usuzovat na případnou aberaci vyšetřované sekvence. [White, 2002; Sellner, Taylor, 2004] 29

2. CÍLE PRÁCE Práce vychází z vyšetření provedených v molekulárně cytogenetické laboratoři a v molekulárně biologické laboratoři Ústavu biologie a lékařské genetiky 2. LF UK a FN Motol (ÚBLG). Práce si klade následující cíle: 1) Shrnout současné poznatky o subtelomerických přestavbách, jejich fenotypovém vyjádření a možnostech jejich laboratorního vyšetření. 2) Prakticky ověřit (na vzorcích od konkrétních pacientů) využití metody FISH k analýze subtelomerických aberací. 3) Ověřit využití metody MLPA v rutinním laboratorním provozu k analýze subtelomerických aberací. 4) Posoudit vhodnost metod FISH a MLPA k vyšetření pacientů se suspektními subtelomerickými aberacemi, srovnat tyto metody, jejich výhody a možná omezení. 30

3. MATERIÁL A METODIKA 3. 1. Soubor pacientů Tabulka 3. 1. 1. uvádí přehled vyšetřených pacientů metodou FISH. Všichni pacienti byli indikováni k molekulárně cytogenetické analýze subtelomerických přestaveb klinickým genetikem z genetické poradny Ústavu biologie a lékařské genetiky. Ve všech případech byli pacienti vyšetřeni v cytogenetické laboratoři základní chromozomovou analýzou (G-pruhováním), která však neprokázala žádné abnormality v karyotypu. Podle konkrétního nálezu, respektive kvality a množství materiálu pak lékař z genetické poradny doporučil (po konzultaci s vedoucími cytogenetické a molekulárně laboratoře) buď vyšetření metodou FISH nebo metodou MLPA. Tabulka 3. 1. 1. Pacienti vyšetření metodou FISH Pacient Pohlaví Věk v době vyšetření Důvod indikace a předchozí nálezy Vyloučení přítomnosti euchromatinu Pacient č. 1 Žena, XX 26 let na 22p (po nálezu tmavého satelitu při zpracováním metodou G- pruhování) Pacient č. 2 Muž, XY 37 let Poruchy reprodukce, nález pericentrické inverze chromozomu 9 Pacient č. 3 Žena, XX 30 let Poruchy reprodukce, opakované spontánní potraty U každého pacienta indikovaného k vyšetření metodou FISH bylo připraveno a vyšetřeno celkem 23 preparátů. Na každý preparát byla zpravidla aplikována dvojice rozdílně značených sond, které nasedají na subtelomerické sekvence dlouhého a krátkého raménka příslušného chromozomu. Celkem bylo tedy vyšetřeno 69 preparátů. Kromě toho byly pod vedením Dr. Hedvičákové vyšetřeny vzorky DNA od 9 dalších pacientů s idiopatickou mentální retardací. Bližší údaje o těchto pacientech nejsou uváděny, neboť v době psaní práce jejich vyšetření nebylo zcela uzavřeno. Hlavním účelem mé participace na analýzách MLPA bylo získání základních poznatků o této metodě a podkladů pro srovnání MLPA a FISH. 31

3. 2. Fluorescenční in situ hybridizace Obecné přiblížení principu fluorescenční in situ hybridizace i s popisem základního protokolu bylo uvedeno v teoretickém úvodu (oddíl 1. 4. 2. 1.). V praktické části je popsán doporučený postup lokus specifické FISH včetně přípravy potřebných roztoků, hybridizační směsi a pomůcek pro analýzu subtelomerických aberací v daných oblastech u vyšetřovaných vzorků. K analýze metodou FISH se využívají čerstvě nakapané nativní preparáty lymfocytů periferní krve získané kultivací s přídavkem fytohemaglutininu. Cytogenetické preparáty se připravují z fixovaných buněčných suspenzí. Ty se kapou na předem připravená podložní skla. Denaturace vzorku DNA a sondy zde probíhá společně (eventuelně je možné užít i postup s oddělenou denaturací). Po denaturaci následuje hybridizace sondy a vyšetřované DNA, která probíhá jeden den v termostatu nastaveném na 37 C. Dalším krokem je odstranění nespecifických signálů působením horkého roztoku o nízké koncentraci solí zde reprezentovaným 0,4xSSCT s přídavkem detergentu (saline sodium citrate + Tween 20) o teplotě 73 C. Poslední krok zahrnuje nespecifické obarvení roztokem DAPI. Takto připravený preparát lze odečítat pomocí fluorescenčního mikroskopu. Fluorescenční mikroskop BX51 firmy Olympus využitý ke snímání obrazů preparátu je epifluorescenční. Excitační světlo po průchodu excitačním filtrem je odraženo dichroickým zrcadlem podle své vlnové délky a dopadá přes objektiv na preparát. Výsledné emisní světlo z preparátu prochází objektivem, dichroickým zrcadlem, který vymezí světlo podle jeho vlnové délky a nakonec přes emisní filtr do objektivu (případně do připojené kamery). 3. 2. 1. Roztoky a jejich příprava K přípravě dalších roztoků je nejprve nutný základní roztok 20xSSC (saline sodium citrate), který se připravuje navážením 173,5 g chloridu sodného a 88, 2 g dihydrátu citrátu sodného s následným rozpuštěním v 900 ml destilované vody. Po rozpuštění se nechá roztok uložený přes noc v chladničce, druhý den se změří a upraví ph na hodnotu ph 7. Roztok musí být označen přesným časem a datem výroby, složením roztoku, jménem laboranta připravující roztok a podmínky, za nichž byl roztok připraven. Skladujeme v chladničce při teplotě cca 5 C po dobu šesti měsíců. Tento roztok se dodává připravený z lékárny. 32

Námi dodržený postup pro přípravu jednotlivých roztoků se od protokolu výrobce, tj. firmy Abbott-Vysis mírně lišil jednak výsledným objemem některých roztoků (Abbott-Vysis například uvádí přípravu 2x SSC na 1 l roztoku) a jednak tím, že komerční protokol počítá s uskladněním všech (i naředěných) roztoků po dobu až 6 měsíců. My jsme si oproti tomu na jednotlivé analýzy připravovali roztoky čerstvé a v objemu potřebném k jednomu postupu. Ředění potřebných roztoků před samotnou analýzou: Roztok 2x SSC o ph 7 7,5: 10 ml 20xSSC 90 ml destilované vody Roztok 0,4x SSCT (0,4x SSC s 0,3 % detergentem) o ph 7 7,5: 1 ml 20x SSC 49 ml destilované vody 150 µl detergentu (Tween 20) Alkoholové roztoky o koncentracích: 80 % ethanol 96 % ethanol 100 % ethanol Jednotlivé alkoholové roztoky jsou v potřebných koncentracích dodány lékárnou nebo mohou být případně naředěny z absolutního alkoholu podle křížového pravidla. 3. 2. 2. Sondy Všechny použité lokus specifické sondy byly dodány britskou společností Cytocell. Sondy se aplikují jako součást roztoku, který obsahuje hybridizační roztok s formamidem a destilovanou vodu. Značení sond bylo vždy použito tak, aby na krátkém raménku byla sonda značená FITC (fluorescein isothiokyanát) a na dlouhém raménku sonda značená Texas red. 33

Tabulka 3. 2. 2. 1. Specifikace sond využitých k vyšetření subtelomerických úseků Chromozom Sonda Lokus Vzdálenost od telomery [kb] 1 1p CEB 108/ T7 300 1q 1qtel 19 80 2 2p 2ptel 27 330 2q 2qtel 47 240 2q NP VIJ-YRM 2112 240 3 3p 3ptel 25 450 3q 3qtel 06 450 4 4p 4ptel 04 73 4q 4qtel 11 275 500 5 5p 5ptel 48 Neznámá 5q 5qtel 70 245 6 6p 6ptel 48 300 6q 6qtel 54 280 7 7p --- 255 7q --- 8 8 8p 8ptel 91 250 8q 8qtel 11 170 9 9p 9ptel 30 600 9q 9qtel 33 65 10 10p 10ptel 45 320 10q 10qtel 24 270 11 11p 11ptel 03 125 11q 11qtel 38 65 12 12p 12ptel 27 Neznámá 12q 12qtel 87 190 13 13q 13qtel 56 170 14 14q 14qtel 01 200 15 15q WI-5214 300 16 16p 16ptel 05 160 16q 16qtel 48 200 17 17p 17ptel 80 60 17q 17qtel 13 90 18 18p VIJ-YRM 2102 220 18q 18qtel 11 290 19 19p 19ptel 29 250 500 19q 19qtel 82 Neznámá 20 20p 20pthy 33 180 20q 20qtel 14 50 21 21q 21qtel 07 175 22q 22qtel 31 120 34

X/ Y Xp Yp --- 160 Xq Yp --- 182 a 88 3. 2. 3. Pomůcky Přístroj Automatické pipety Vodní lázeň Ohřívací ploténka SD 160 Termostat Micra 18 Mikroskop BX51 Výrobce Biohit Proline Applied Biosystems Stuart ISCO Olympus 3. 2. 4. Pracovní postup A) Příprava preparátu Preparáty lymfocytů se získávají ze třídenní kultivace periferní krve po stimulaci fytohemaglutininem. Periferní krev je pro tento účel odebrána předepsaným způsobem z alkoholem desinfikovaného místa do zkumavky s heparinem lithným. Ke konci kultivace se přidává kolcemid vřeténkový jed, jehož působením se zastaví dělení buněk v metafázi mitózy. Suspenze buněk se slije, zcentrifuguje a po slití supernatantu hypotonizuje 0,075 M roztokem chloridu draselného. Po opětovné centrifugaci se buňky fixují směsí methanolu a ledové kyseliny octové v poměru 3:1. Suspenze fixovaných buněk se kape pomocí automatické pipety v množství 10 µl nejlépe na střed čistého, navlhčeného a namraženého podložního skla. Z nakapaného preparátu se nechá odpařovat fixační směs methanolu a ledové kyseliny octové po dobu 1 2 minut. Zaschnutý preparát se prohlíží mikroskopem ve fázovém kontrastu. Vyhotovený preparát by měl být kvalitní s dostatečným počtem dobře rozprostřených mitóz, bez fragmentů cytoplasmy. Takové vhodné místo se pomocí diamantového popisovače označí křížkem na spodní straně skla. Připravené v pouzdru uložené preparáty se uchovávají v chladničce. Pro vyšetření subtelomerických aberací je nutné připravit 23 preparátů, na které se aplikuje vždy dvojice sond, z nichž každá hybridizuje se subtelomerickými sekvencemi krátkého nebo dlouhého raménka daného chromozomu. 35

B) Vlastní postup FISH Vyhotovené preparáty se po vyjmutí z chladničky nejprve proplachují 2 minuty v roztoku 2x SSC o laboratorní teplotě. Preparát se odvodníme alkoholovou řadou o vzestupné koncentraci (80 %, 96 %, 100 %), přičemž teplota jednotlivých alkoholových roztoků odpovídá laboratorní teplotě. V každé kyvetě se preparát se odvodňuje po dobu 1 2 minut. Poté se skla nechají oschnout na vzduchu při laboratorní teplotě. Na křížkem označené místo preparátu napipetujeme automatickou pipetou roztok sondy v množství podle velikosti krycího sklíčka. Pokud se roztok vyjme z chladničky, je třeba jej ohřát na laboratorní teplotu. Pro krycí sklíčko o velikosti 15 x 15 mm pipetujeme 5 µl celkového objemu roztoku sondy (3,5 µl hybridizačního roztoku, 0,5 µl sondy, 1 µl destilované vody). Roztok sondy si připravíme smísením v mikrozkumavce nebo nakapeme jednotlivé objemy přímo na preparát a jemně je promícháme několika nasátími do mikropipety. K práci s hybridizační směsí je nutné nosit rukavice, protože obsahuje silně žíravý a teratogenní formamid. Krycí sklíčko opatrně přiložíme k podložnímu tak, aby nedošlo k jeho zlomení nebo nevznikly vzduchové bubliny. Případné vzduchové bubliny vytlačíme jemným tlakem pinzety. Okraje krycího sklíčka orámujeme vulkanizačním roztokem, který necháme zaschnout 5 minut na ploténce o teplotě 37 C. Přeneseme sklo na ploténku předehřátou na teplotu 75 C na dobu 5 minut. V této fázi dochází ke společné denaturaci vyšetřovaného vzorku DNA a aplikované sondy. Po denaturaci preparát vložíme do vlhké komůrky. Vlhká komůrka se uloží v termostatu nastaveného na 37 C do druhého dne. V tomto kroku dochází k hybridizaci sondy ke komplementárním oblastem vyšetřované DNA. Po skončení doby hybridizace opatrně odstraníme tuhý vulkanizační roztok i se sklíčkem tak, aby nedošlo k poškození buněk. K odstranění nespecifických signálu preparát ponoříme přesně na 2 minuty do roztoku 0,4x SSCT předehřátého na teplotu 73 C. 36

Po vyjmutí preparátu z předešlého roztoku, ihned přeneseme do roztoku 2x SSC o laboratorní teplotě na dobu 1 3 minut. Následně vytažené sklo otřeme po okrajích, necháme okapat a volně oschnout. Automatickou pipetou naneseme 8 10 µl roztoku DAPI a opatrně přikryjeme preparát krycím sklíčkem vhodných rozměrů. Poté, co se ponechá preparát několik minut v temnu, je připraven k mikroskopickému odečtení. Roztok DAPI je potenciální karcinogen, proto při manipulaci s ním používáme rukavice. C) Mikroskopická hodnocení K mikroskopickému odečítání je nutné zapnout excitační lampu obsahující výbojku, která emituje ultrafialové světlo k vybuzení elektronů na vyšší energetické hladiny. Současně musí mikroskop být opatřen specifickými filtry pro fluorochromy, jimiž jsou označeny použité sondy. Zde je to sada pro DAPI, FITC a Texas red. Spustíme software ISIS firmy Metasystems pro nasnímání a úpravu obrazů mitóz (interfázních jader) s aplikovanými sondami u jednotlivých vyšetřovaných. Otevřeme FISH modul pro obrazové analýzy, s příslušnou databází a vytvoříme (či najdeme) v seznamu složku daného pacienta. V tuto chvíli vyjmeme preparát z tmavé komůrky, zkontrolujeme údaje pacienta zapsaného v databázi a na sklíčku. Pokud obojí souhlasí, umístíme sklíčko do posuvné svorky mikroskopu, zvedneme stolek mikroskopu makrošroubem a doostříme mikrošroubem. Po nastavení filtru na DAPI, nejprve zkontrolujeme kvalitu preparátu objektivy menšího zvětšení. Pak použijeme objektiv se 100 násobným zvětšením za užití imerzního oleje na odečítání nepřítomnosti, amplifikace či translokace hybridizačního signálu značícího vyšetřovanou sekvenci. Pro hrubou orientaci je vhodné si prohlédnout přítomnost signálů na preparátu vizuálně za postupného posouvání filtrů před samotným automatickým snímáním kamerou a hodnocením pomocí počítače. K automatickému nasnímání se v programu klikne na ikonu Capture. Obraz v počítači doostříme pomocí mikrošroubu mikroskopu, případně snížíme průchod světla či clonou zmenšíme zorné pole. Následně klikneme do pravé 37

části obrazovky, čímž zahájíme postupné automatické snímání obrazů preparátu nastavenými filtry. Jednotlivé obrazy se v počítači následně složí do jednoho. Výsledný obraz se před uložením popíše číslem sondy, popřípadě též jiným identifikačním číslem a výsledným molekulárně cytogenetickým nálezem. Poté se obraz upravuje, nejprve kliknutím na ikonu Lower threshold se upraví pozadí u jednotlivých fluorochromů, následně kliknutím na ikonu Upper threshold se zaostří jednotlivé signály a nakonec se případně opět upraví pozadí pomocí ikony Lower threshold. Dále je možné vymazat rušivé artefakty pomocí ikony Region. Konečný upravený obrázek se uloží do složky pacienta. Pro vyšetření subtelomerických aberací (bez specifického fenotypu) jsme hodnotili přítomnost signálů u všech chromozomů. Celkem se hodnotí minimálně 5 mitóz, zpravidla však 10 15. Při absenci mitóz je vhodné vyšetřit 200 interfázních jader. Pokud by se subtelomerická aberace vyskytovala v mozaice, bylo by nutné vyšetřit 500 mitóz či interfázních jader. D) Závěr analýzy Po stanovení molekulárně cytogenetické diagnózy je vyhotoven protokol a zpracována výsledková zpráva, k níž přikládáme vytištěný reprezentativní obrázek či obrázky dokumentující výsledky vyšetření. Tato zpráva se po schválení vedoucím cytogenetické laboratoře zasílá do genetické poradny indikujícímu lékaři. Nasnímané obrázky dokumentující výsledek vyšetření jsou nadále archivovány v paměti počítače, samotný preparát lze ponechat v chladničce při teplotě 5 C po dobu půl roku pro případná další vyšetření. Buněčná suspenze, eventuálně preparáty, které nebyly použity k hybridizaci, můžeme ponechat v mrazícím boxu při teplotě -20 C. O době jejich uložení nebo dalším užití rozhoduje indikující lékař, popřípadě vedoucí laboratoře. 3. 2. 5. Úprava nasnímaného obrazu na konkrétním příkladu K této části byl použit nasnímaný obraz mitózy s aplikovanými sondami na subtelomerické sekvence krátkého a dlouhého raménka chromozomu 19 od pacienta č. 2 indikovaného pro vyšetření FISH. 38

Obrázek 3. 2. 5. 1. vzniká po automatickém nasnímání zaostřeného preparátu přes jednotlivé filtry s následným složením. Na první pohled jsou patrné signály na vyšetřovaných chromozomech (homologické chromozomy označené šipkami) a současně rušivé artefakty, které v případě přílišné intenzity mohou po úpravě pozadí znemožňovat správné zaostření, případně i odečtení signálu. Obrázek 3. 2. 5. 1. Nasnímaný obraz bez úprav Po postupné úpravě pozadí u jednotlivých fluorochromů pomocí funkce Lower threshold a po zaostření signálů funkcí Upper threshold, jsou stále patrné rušivé artefakty (viz šipky na obrázku 3. 2. 5. 2.). Tyto artefakty jsou vlastně signály tvořené sondou nespecificky navázanou jednak mimo chromozomový materiál (levá horní část snímku), jednak navázanou i na chromozomy. Tento arteficiální signál lze v tomto případě jasně odlišit od specifických signálů tím, že nepokrývá shodné lokusy obou sesterských chromatid (příkladem je červený signál uprostřed a zelený signál v dolní části snímku). V tomto případě použijeme k jejich vymazání funkci Region. Je vhodné tuto funkci užít vždy pro konkrétní fluorochrom, ve kterém artefakt vydává emitované světlo. Poté opět upravíme pozadí, popřípadě zaostříme signály, čímž získáme výsledný obraz (obrázek 3. 2. 5. 3). 39

Obrázek 3. 2. 5. 2. Obraz mitózy po základní úpravě Obrázek 3. 2. 5. 3. prezentuje obraz mitózy s vyšetřovanými chromozomy, který může být přiložen k výsledkové zprávě. Z tohoto obrazu, kde jsou signály dobře patrné, jednoznačně usuzujeme na neprokázanou aberaci, zde konkrétně v subtelomerických úsecích chromozomu 19 v lokusech 19ptel 29 (zelený signál) a 19qtel 82 (červený signál), ke kterým nasedají použité vyšetřovací sondy. Obrázek 3. 2. 5. 3. Výsledný obraz s neprokázanými subtelomerickými aberacemi na chromozomu 19 (19ptel zelený signál a 19qtel červený signál) 40

3. 3. MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) Obecný princip metody MLPA včetně základního postupu byl v teoretické části této práce (oddíl 1. 4. 3. 3.). V praktické části je pak popsán přesný protokol společný pro SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3 a SALSA MLPA KIT P070-B1 Human Telomere-5 od nizozemské společnosti MRC-Holland, využívaný na ÚBLG. Obě tyto soupravy, slouží ke screeningu subtelomerických aberací, ale liší se obsaženými sondami a tudíž i vyšetřovanými sekvencemi (blíže viz oddíl 3. 3. 1.). To je vhodné pro přesnější diagnostiku aberací, respektive pro zjištění lokalizace a velikosti zasaženého úseku. Postup metody MLPA využívá předem izolovaného vzorku DNA, ke kterému se po denaturaci přidá hybridizační směs obsahující sondy. Po proběhnutí hybridizace (druhý den) se aplikuje ligační směs. V tomto kroku se enzymaticky doplňují fosfodiesterové vazby u komplementárně navázaných sond. Ligované sondy jsou po dodání polymerázové směsi namnoženy pomocí PCR reakce. Produkty PCR reakce se nakonec rozdělí pomocí sekvenátoru, který pracuje na principu kapilární elektroforézy. 3. 3. 1. Sondy Sondy se aplikují jako součást hybridizační směsi, která obsahuje 1,5 µl MLPA pufru a 1,5 µl směsi sond. Tabulka 3. 3. 1. 1. Specifikace vyšetřovacích sond SALSA MLPA KIT P070-B1 Human Telomere-5 Chromozom Lokus Gen Lokus Gen 1 01q44 SH3BP5L 01p36.33 TNFRSF18 2 02q37.3 ATG4B 02p25.3 ACP1 3 03q29 KIAA0226 03p26.3 CHL1 4 04q35.2 FRG1 04p16.3 PIGG 5 05q35.3 GNB2L1 05p15.33 CCDC127 6 06q27 TBP 06p25.3 IRF4 7 07q36.3 VIPR2 07p22 UNC84A 8 08q24.3 RECQL4 08p23.3 FBXO25 9 09q34.3 EHMT1 09p24.3 DOCK8 10 10q26.3 ECHS1 10p15.3 ZMYND11 11 11q25 IGSF9B 11p15.5 BET1L 12 12q24.33 ZNF10 12p13.33 JARID1A 13 13q34 CDC16 13q11 PSPC1 14 14q32.3 MTA1 14q11.2 PARP2 15 15q26.3 TM2D3 15q11.2 NDN 16 16q24.3 GAS8 16p13.3 DECR2 41

17 17q25.3 SECTM1 17p13.3 RPH3AL 18 18q23 CTDP1 18p11.32 THOC1 19 19q13.43 CHMP2A 19p13.3 PPAP2C 20 20q13.33 UCKL1 20p13 ZCCHC3 21 21q22.3 S100B 21q11.2 HSPA13 22 22q13.33 ARSA 22q11.1 IL17RA X Xq28 VAMP7 Xp22.33 SHOX Y Yq11.21 DDX3Y --- --- Tabulka 3. 3. 1. 2. Specifikace vyšetřovacích sond SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3 Chromozom Lokus Gen Lokus Gen 1 01p36.33 TNFRSF4 01q44 SH3BP5L 2 02p25.3 ACP1 02q37.3 CAPN10 3 03p26.3 CHL1 03q29 BDH1 4 04p16.3 PIGG 04q35.2 TRIML2 5 05p15.33 PDCD6 05q35.3 GNB2L1 6 06p25.3 IRF4 06q27 PSMB1 7 07p22.3 ADAP1 07q36.3 VIPR2 8 08p23.3 FBXO25 08q24.3 ZC3H3 9 09p24.3 DMRT1 09q34.3 EHMT1 10 10p15.3 DIP2C 10q26.3 PAOX 11 11p15.5 RIC8B 11q25 NCAPD3 12 12p13.33 SLC6A12 12q24.33 ZNF10 13 13q11 PSPC1 13q34 F7 14 14q11.2 CCNB1IP1 14q32.33 MTA1 15 15q11.2 MKRN3 15q26.3 ALDH1A3 16 16p13.3 POLR3K 16q24.3 GAS8 17 17p13.3 RPH3AL 17q25.3 TBCD 18 18p11.32 USP14 18q23 C18orf22 19 19p13.3 CDC34 19q13.43 CHMP2A 20 20p13 SOX12 20q13.33 OPRL1 21 21q11.2 RBM11 21q22.3 PRMT2 22 22q11.21 BID 22q13.33 RABL2B X Xp22.33PAR SHOX Xq28PAR VAMP7 Y Yq11.21 DDX3Y --- --- 3. 3. 2. Pomůcky Přístroj Automatické pipety Thermal cycler 2720 Vortex TTS 2 Sekvenátor 3130 Genetic Analyzer Výrobce Eppendorf Applied Biosystems IKA Applied Biosystems; Hitachi 42

3. 3. 3. Pracovní postup A) Izolace DNA Krev pro izolaci DNA se odebírá předepsaným způsobem z dezinfikovaného místa do zkumavky s EDTA (etylendiaminotetraoctovou kyselinou). Krev ve zkumavce se promíchá a přidá se roztok RBC-Lysis Solution, který způsobí lýzu červených krvinek. Po inkubaci a centrifugaci se aplikuje roztok Cell Lysis Solution. Vzorek promícháme pomocí vortexu a necháme inkubovat. V lyzátu následně vysrážíme proteiny roztokem Protein Precipitation Solution, opět promícháme pomocí vortexu a vzorek zcentrifugujeme. Po opatrném přelití supernatantu se aplikuje 100 % isopropanol. V tuto chvíli jsou patrné shluky DNA, které se přenesou do nové mikrozkumavky a propláchnou se etanolem. DNA rozpustíme v roztoku Hydration solution a necháme inkubovat. Poté se spektrofotometricky změří koncentrace. Vzorky DNA uchováváme v chladničce. Izolace DNA se na ÚBLG provádí na obdobném principu pomocí analyzátoru AutoGenFlex Star firmy AutoGen. B) Reakce MLPA Pro analýzu si připravíme mikrozkumavky o objemu 0,2 ml a řádně je označíme jménem pacienta. Připravujeme si dvě mikrozkumavky na vzorek DNA od jednoho pacienta, po jedné pro každou z vyšetřovacích souprav. K celému postupu má být použito 5 µl roztoku DNA o výsledné koncentraci 50 100 ng. My jsme pipetovali 1 µl izolované DNA příslušného pacienta a 4 µl destilované vody. Následně zahájíme denaturaci v předem nastaveném termocykleru. Denaturace probíhá po dobu 5 minut při teplotě 98 C. Ke konci této reakce jsou vzorky zchlazeny na teplotu 25 C. Mezitím připravíme hybridizační směs. Do každé mikrozkumavky má přijít 1,5 µl MLPA pufru a 1,5 µl směsi sond. Pro daný počet vzorků jsme si celé objemy odměřili najednou, promíchali pomocí vortexu a následně do každé mikrozkumavky napipetovali 3 µl roztoku. 43

Nejprve necháme proběhnout inkubaci 1 minutu při 95 C kvůli možné částečné renaturaci, která mohla proběhnout ve vzorku během pipetování hybridizační směsi. Samotná hybridizace probíhá 16 20 hodin (přes noc) při teplotě 60 C. Poté připravíme ligační směs: do každé mikrozkumavky napipetujeme 3 µl pufru Ligase-65 buffer A, 3 µl pufru Ligase-65 B a 25 µl destilované vody. Promícháme pomocí vortexu, přidáme 1 µl enzymu ligázy (Ligase-65) a opět promícháme několika nasátími automatickou pipetou. Celou ligační směs je možné připravit v jednom kroku odměřením objemů jednotlivých roztoků v množství odpovídající počtu vzorků. Pokud ligační směs s ligázou stojí, je vhodné ji uchovávat na ledu. Vzorky po proběhlé hybridizaci se zchladí na teplotu 54 C. Při této teplotě do mikrozkumavek aplikujeme 32 µl ligační směsi a obsah mikrozkumavek promícháme automatickou pipetou. Nastavíme termocykler pro ligační reakci, tj. na 15 minutovou inkubaci při teplotě 54 C (v této fázi dochází k provázání hybridizovaných sond fosfodiesterovou vazbou). Ligační reakce je zakončena inaktivací enzymu ligázy působením teploty 98 C po dobu 5 minut a následným zchlazením vzorků na 15 C. Připravíme si nové mikrozkumavky, které řádně popíšeme. Poté si odměříme roztoky na směs PCR, smísením 4 µl pufru SALSA PCR a 26 µl destilované vody, případně si smícháme celé objemy pro všechny vzorky v jednom kroku. Po promíchání na vortexu přeneseme 30 µl PCR směsi do připravených mikrozkumavek. Ze zchlazených vzorků napipetujeme 10 µl objemu do nových mikrozkumavek s PCR směsí a promícháme. Zbylé množství vzorku uchováváme v chladničce pro případ dalšího užití. Dále přidáme do zkumavek 10 µl polymerázové směsi. Polymerázová směs obsahuje 2 µl SALSA PCR-primerů, 2 µl SALSA enzymového dilučního pufru, 5,5 µl destilované vody a 0,5 µl enzymu polymerázy (SALSA Polymerase). Po smíchání jednotlivých objemů promícháme obsah pomocí automatické pipety. Polymerázovou směs případně uchováváme na ledu. Zkumavky umístíme do termocykleru a promícháme obsah automatickou pipetou. Termocykler nastavíme na PRC reakci, zahrnující 35 cyklů se třemi 44

teplotními kroky: 30 sekund při 95 C, 30 sekund při 60 C a 60 sekund při 72 C. V této fázi dochází k namnožení ligovaných sond, protože jen ty obsahují na obou koncích komplementární oblasti pro univerzální primery. PCR reakce je zakončena 20 minutovou inkubací při 72 C s následným zchlazením vzorků na 15 C. Produkty PCR reakce se dále separují. C) Separace PCR produktu Produkt PCR jsme dělili pomocí sekvenátoru. Přes software Gene Mapper si zadáme název analýzy, popis umístění vzorků v destičce, případně zadáme další komentáře a navolíme protokol analýzy. Připravíme destičky, do kterých si napipetujeme 1 µl vzorku, 10 µl formamidu a 0,5 µl velikostního standartu ROX-500. Pomocí softwaru Data Collection navolíme záznam, jehož analýzu chceme provést. Destičky uzavřeme gumovou zátkou a umístíme do zásobníku sekvenátoru. V případě, že dojde ke správnému umístění, změní ukazatel polohy barvu ze žluté na zelenou. V panelu nástrojů klikneme na ikonu, čímž spustíme analýzu. D) Hodnocení a závěr analýzy Výsledkem analýzy je jednak grafický záznam, kde píky reprezentují jednotlivé vyšetřované úseky, jednak číselný záznam udávající hodnoty specifické pro vyšetřované sekvence. Grafický záznam můžeme dále upravovat. Výsledný grafický výstup je vhodný pro orientační odečtení nálezu, kde především podle výšky píku můžeme usuzovat na případnou deleci či duplikaci v daném úseku. Číselný záznam exportujeme do dalšího softwaru pro hodnocení dané vyšetřovací soupravy. Tento software je volně dostupný na internetových stránkách http://www.ngrl.org.uk/manchester/publications/mlpa-spreadsheet. Po zadání dat výšek a ploch hodnocených píků do příslušných kolonek získáme graf. Podle tohoto grafu lze jednoznačně diagnostikovat případnou aberaci. 45

Pokud dostaneme pozitivní výsledek, sám výrobce doporučuje tento nález verifikovat. V případě pozitivního výsledku u obou vyšetřovacích souprav další vyšetření není nutné. Pro potvrzení se užívají metody FISH a CGH-array. 3. 3. 4. Hodnocení a závěr analýzy na konkrétním příkladu K tomuto oddílu byly použity materiály dostupné z internetové stránky http://www.mlpa.com, konkrétně z protokolu pro vyšetřovací soupravu [SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3, 2011] a výsledný graf negativního vzorku byl poskytnut z Ústavu biologie a lékařské genetiky. Obrázek 3. 3. 4. 1. prezentuje grafický výstup ze sekvenátoru. Na tomto záznamu jsou viditelné jednotlivé píky prezentující vyšetřované subtelomerické oblasti, na které nasedají sondy a současně jsou přítomny i rušivé píky. Zde se konkrétně jedná o vyšetření oblastí soupravou SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3. Po odstranění rušivých píků (viz šipka), získáme hodnoty pouze pro píky prezentující vyšetřované subtelomerické sekvence, s kterými dále pracujeme. Obrázek 3. 3. 4. 1. Grafický záznam ze sekvenátoru [SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3, 2011] Software dostupný z http://www.ngrl.org.uk/manchester/publications/mlpaspreadsheet je vlastně aplikací pro program Microsoft Excel, který po zadání hodnot pěti kontrolních vzorků automaticky zpracuje výsledky od jednotlivých pacientů. Výsledkem po zadání příslušných dat je graf, z něhož je možné jednoznačně potvrdit či 46

vyvrátit přítomnost subtelomerické aberace. Pro každou z vyšetřovacích sad je nutné použít specifický software, s tím, že je možné si vybrat i z několika verzí dané aplikace. O kvalitě tohoto softwaru mimo jiné svědčí odkazy na stránkách výrobce vyšetřovacích souprav MLPA. Obrázek 3. 3. 4. 2. prezentuje již konečný výstup vyšetření. Jednotlivé sloupce zastupují vyšetřované oblasti. Referenční hodnoty jsou od 0,8 do 1,2. Vyšší či nižší výsledky vypovídají o prokázané aberaci. Obrázek 3. 3. 4. 2. Výsledný graf (výsledek bez prokázané subtelomerické aberace), z archivu Dr. Hedvičákové 47

4. VÝSLEDKY 4. 1. Výsledky analýzy FISH Tabulka 4. 1. 1. uvádí nálezy pacientů s podezřením na subtelomerickou přestavbu po vyšetření metodou FISH. Z této tabulky je na první pohled zřejmý negativní nález cytogenetického vyšetření u všech tří pacientů. Tabulka 4. 1. 1. Nálezy pacientů indikovaných na vyšetření metodou FISH Pacient Pohlaví Věk v době vyšetření Výsledek vyšetření Pacient č. 1 Žena, XX 26 let Neprokázána subtelomerická aberace. Pacient č. 2 Muž, XY 37 let Neprokázána subtelomerická aberace. Pacient č. 3 Žena, XX 30 let Neprokázána subtelomerická aberace. 4. 2. Srovnání kvality signálů jednotlivých subtelomerických sond Tabulka 4. 2. 1. prezentuje způsob hodnocení kvality detekovaných signálů a zvolená kritéria pro toto hodnocení. Data uvedená v tabulce 4. 2. 1. jsou podkladem pro interpretaci odečtených signálů u jednotlivých pacientů zaznamenaných v tabulce 4. 2. 2., kde jsou signály dále specifikovány typem sondy a fluorochromem použitého k jejímu značení. Pro bližší specifikaci vyšetřovaného lokusu včetně uvedení vzdálenosti vyšetřované sekvence od telomery odkazuji na tabulku 3. 2. 2. 1. umístěnou v předchozím textu. Tabulka 4. 2. 1. Způsob hodnocení kvality signálů a zvolená kritéria Hodnocení Zvolená kritéria ++++ Velmi jasný signál, dobře hodnotitelný i při vizuálním pozorování. Slabší signál, hůře vizuálně hodnotitelný, po automatickém nasnímání +++ viditelný i bez počítačové úpravy. Signál vizuálně nehodnotitelný, po automatickém nasnímání a základní ++ počítačové úpravě dobře patrný. Signál vizuálně nehodnotitelný, slabý i po automatickém nasnímání a po + počítačové úpravě slabý. Signál vizuálně ani po automatickém nasnímání a počítačové úpravě - nepřítomný. 48

Tabulka 4. 2. 2. Hodnocení kvality signálů u jednotlivých pacientů (2q NP nepolymorfní sonda na subtelomerickou oblast chromozomu 2q) Chromozom Sonda Fluorochrom Kvalita signálu Pacient č. 1 Kvalita signálu Pacient č. 2 Kvalita signálu Pacient č. 3 1 1p FITC +++ +++ +++ 1q Texas red ++ +++ +++ 2 2p FITC ++ ++ ++ 2q NP Texas red ++ ++ ++ 3 3p FITC ++ ++ ++ 3q Texas red ++ +++ ++ 4 4p FITC ++ +++ ++ 4q Texas red +++ ++++ +++ 5 5p FITC +++ +++ ++ 5q Texas red ++++ ++++ +++ 6 6p FITC ++ +++ ++ 6q Texas red +++ +++ +++ 7 7p FITC ++ ++ ++ 7q Texas red ++ +++ ++ 8 8p FITC +++ ++ ++ 8q Texas red ++++ +++ +++ 9 9p FITC ++ + ++ 9q Texas red ++++ ++ +++ 10 10p FITC ++ ++ ++ 10q Texas red +++ ++ +++ 11 11p FITC +++ ++ ++ 11q Texas red +++ +++ +++ 12 12p FITC ++ ++ +++ 12q Texas red ++ +++ ++ 13 13q Texas red +++ ++++ ++ 14 14q Texas red +++ + +++ 15 15q Texas red +++ +++ +++ 16 16p FITC ++ + ++ 16q Texas red +++ ++ +++ 17 17p FITC +++ ++++ ++ 17q Texas red ++++ ++++ ++++ 18 18p FITC ++ + + 18q Texas red ++ + + 19 19p FITC + +++ ++ 19q Texas red +++ ++ ++ 20 20p FITC + + + 20q Texas red ++ + + 49

21 21q Texas red ++ ++ + 22 22q Texas red ++ + ++ X/ Y Xp Yp FITC +++ ++ ++ Xq Yp Texas red ++++ +++ +++ 4. 3. Příklady výsledků metody FISH V tomto oddíle jsou zařazeny ukázky obrázků automaticky nasnímaných mitóz po počítačové úpravě. První tři obrázky představují dobře hodnotitelné mitózy se silnou intenzitou snímaných signálů. Obrázek 4. 3. 1. reprezentuje obraz mitózy pacienta č. 1, na kterou byly aplikovány vyšetřovací sondy na dlouhá i krátká raménka chromozomu 5 konkrétně k lokusům 5ptel 48 a 5qtel 70. Obrázek 4. 3. 2. představuje obraz mitózy pacienta č. 2 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi chromozomu 1 v lokusech CEB 108/ T7 a 1qtel. Obrázek 4. 3. 3. prezentuje výsledný obraz mitózy pacienta č. 3 s aplikovanou vyšetřovací sondou k dlouhým raménkům chromozomu 15 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi tohoto chromozomu v lokusech WI-5214. Obrázek 4. 3. 1. Obraz mitózy pacienta č. 1 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi chromozomu 5 (lokus 5ptel 48 zelený signál a lokus 5qtel 70 červený signál) 50

Obrázek 4. 3. 2. Obraz mitózy pacienta č. 2 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi chromozomu 1 (lokus CEB 108/ T7 zelený signál a 1qtel 19 červený signál) Obrázek 4. 3. 3. Obraz mitózy pacienta č. 3 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi na dlouhých raménkách chromozomu 15 (lokus WI-5214 červený signál) 51

Obrázek 4. 3. 4. představuje hůře zpracovatelný obraz mitózy, konkrétně od pacienta č. 3 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi chromozomu 8 v lokusech 8ptel 91 (zelený signál) a 8qtel 11 (červený signál). Na obrázku je patrná silná intenzita fluorescence interfázních jader, která jednak neumožňovala lepší zpracování pozadí u DAPI, což se projevuje vytrácením chromozomů v pravé dolní části a jednak jsou na těchto jádrech patrné i rušivé signály nespecificky navázané sondy značené pomocí FITC, jejichž intenzita znemožňovala lepší zpracování signálů specificky navázaných sond na krátkých raménkách. Obrázek 4. 3. 4. Obraz mitózy pacienta č. 3 s neprokázanými subtelomerickými aberacemi chromozomu 8 (lokus 8ptel 91 zelený signál a 8qtel 11 červený signál) 4. 4. Příklady výsledků metody MLPA Vzhledem k absenci výsledků vyšetřovaných pacientů z důvodů uváděných v dřívějším textu jsou v této části prezentovány pouze negativní výsledky převzaté z vyšetření provedených na ÚBLG. Konkrétně se jedná o negativní výsledky pacientů z analýzy metodou MLPA po vyšetření soupravami SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3 a SALSA MLPA KIT P070-B1 Human Telomere-5 určených ke screeningu subtelomerických aberací. 52

Obrázek 4. 4. 1. Negativní výsledek po vyšetření soupravou SALSA MLPA KIT P036- E1 Human Telomere-3, z archivu Dr. Hedvičákové Obrázek 4. 4. 2. Negativní výsledek po vyšetření soupravou SALSA MLPA KIT P070- B1 Human Telomere-5, z archivu Dr. Hedvičákové 53

5. DISKUSE 5. 1. Kritéria k výběru pacientů a význam pozitivní diagnózy V teoretické části práce jsou prezentovány základní poznatky o strukturních chromozomových aberacích se zvláštním důrazem na submikroskopické přestavby subtelomerických úseků. V souvislosti s tím uvádím i principy preklinické selekce pacientů s nespecifickým fenotypem podle de Vries et al. [de Vries et al., 2001]. Vzhledem k množství negativních případů prezentovaných v oddíle 1. 3. 4. vyvstává otázka, zda jsou všechna kritéria této selekce zvolena zcela vhodně (příkladem může být hodnocení faciální stigmatizace, která podléhá ryze subjektivnímu hodnocení bez možnosti přesné definice normy, což ve svém závěru zdůrazňuje studie Park et al. [Park et al., 2008]), a zda by do budoucna nebylo přínosné stanovit jiná kritéria, popřípadě upravit či rozšířit stávající tak, aby bylo možné zúžit množství pacientů s nesprávnou indikací k vyšetření subtelomerických aberací. Zároveň bych ráda upozornila i na relativnost prezentovaných dat v jedné z prvních studií, která uvádí výskyt subtelomerických chromozomových abnormalit u 7,4 % pacientů s těžkou a středně těžkou mentální retardací a u 0,5 % pacientů s lehkou mentální retardací [Knight et al., 1999]. Nicméně pokud čísla přepočteme na celý soubor pacientů, získáme číslo 4,7 % (viz oddíl 1. 3. 4.), které neodpovídá ani předpokládanému 5 10 % výskytu subtelomerických aberací u populace s mentální retardací [Winnepenninckx et al., 2003]. Další otázkou také zůstává, jak velký význam má diagnóza subtelomerické přestavby pro pacienta samotného a do jaké míry je pro něho toto zjištění přínosem. Vzhledem k tomu, že léčba patologických stavů vyvolaných chromozomovými změnami je v současnosti nemožná, má identifikace subtelomerické přestavby význam jako součást diferenciální diagnostiky (tj. při vyloučení jiných možných příčin mentální aberace). Zásadnější význam může mít jen u familiárních případů, kdy je některý z rodičů postiženého dítěte přenašečem balancované přestavby a partneři uvažují o nové graviditě. V tomto případě umožní znalost konkrétní subtelomerické přestavby její poměrně spolehlivou prenatální či preimplantační diagnostiku (např. [Phupong et al 2007]). 54

5. 2. Technické a diagnostické možnosti metody FISH Jednou z nejběžnějších metod využívaných k diagnostice subtelomerických aberací je klasická FISH s lokus specifickými sondami. Na každý chromozom se aplikuje zpravidla dvojice sond: sonda k vybranému subtelomerickému lokusu dlouhých ramének a sonda k vybranému subtelomerickému lokusu krátkých ramének (s výjimkou akrocentrických chromozomů 13, 14, 15, 21, 22). Pokud není podezření na konkrétní subtelomerickou aberaci, musí být u případů s nespecifickým fenotypem zpracovány a vyhodnoceny preparáty pro každý chromozom zvlášť, jak tomu bylo u indikovaných pacientů v této práci. Nevýhody současné aplikace a časově nákladné manipulace s velkým počtem sond a skel u vyšetření těchto pacientů se snažily zmírnit některé firmy (například v této práci uváděná firma Cytocell) zavedením screeningové alternativy zvané multiprobe-t FISH. Tato modifikace pracuje na principu lokus specifické FISH, ale využívá současné aplikace většího počtu sond, které jsou navázány na speciální krycí sklo. Vzorek se pipetuje na jednotlivé očíslované plošky (přičemž každá ploška odpovídá jednomu chromozomu) speciálního skla, ke kterému se přitiskne krycí sklo se sondami a s předem aplikovaným hybridizačním roztokem. Brzy se však zjistilo, že i tato modifikace má značná omezení. Náročnost multiprobe-t FISH se projevuje jak při jejím zpracování, tak i ve způsobu hodnocení, kde pro odečtení aberace daného chromozomu je určena poměrně malá plocha jedné plošky skla. Relevantní výsledky lze získat také pouze tehdy, je-li dostupný velmi kvalitní vzorek s vysokým mitotickým indexem bez fragmentů cytoplasmy. [Chromoprobe Multiprobe-T System, 2008; Erjavec-Škerget et al., 2006] Nelze pominout ani relativní finanční náročnost, neboť cena kitu pro jedno vyšetření metodou multiprobe-t FISH se příliš neliší od souhrnné ceny jednotlivých aplikovaných sond při klasické lokus specifické FISH [Kočárek, osobní sdělení]. Z těchto důvodů se multiprobe-t FISH na pracovišti ÚBLG v současné době nepoužívá. U odečítaných preparátů byl zpravidla patrný slabší signál sond značených fluorochromem FITC aplikovaných na krátká raménka chromozomů. Tento signál (na rozdíl od sond značených fluorochromem Texas Red) často nebyl viditelný při vizuálním prohlížení preparátů za použití specifického filtru pro FITC (viz tabulka 4. 2. 2.). Z tohoto důvodu musela být valná většina mitóz nasnímána automaticky do počítače, kde byly signály dobře viditelné. Nabízí se otázka, zda rozdílná intenzita 55

signálů není podmíněna rozdílnou délkou sond. Podle materiálů dodávaných výrobcem je však délka všech aplikovaných sond přibližně stejná a pohybuje se okolo 100 kb. [Oncology and Constitutional FISH Probe Catalogue, 2011] Bližší informace o délce jednotlivých sond výrobce neuvádí, takže reálný vztah mezi délkou sondy a intenzitou signálu nelze s využitím dostupných dat věrohodně posoudit. Současně se mi osvědčilo automatické snímání mitóz, které se nenacházely v blízkosti interfázních jader. Interfázní jádra často vydávala poměrně silnou fluorescenci, po jejíž zpracování funkcemi Lower a Upper threshold se ztrácely signály vyšetřovacích sond či pomocí DAPI nespecificky obarvené chromozomy (viz obrázek 4. 3. 4.). 5. 3. Technické a diagnostické možnosti metody MLPA Jak už bylo uvedeno v dřívějším textu, metoda MLPA v sobě pojí principy hybridizačních technik a polymerázové řetězové reakce s konečným elektroforetickým dělením produktů. [Sellner, Taylor, 2004] Hlavní předností této metody je možné vyšetření všech subtelomerických oblastí v jedné reakci za spotřeby malého množství vzorku DNA v množství 50 100 ng/ 5 µl roztoku. [General MLPA Protocol, 2011] Za možnou výhodu lze také považovat automatizovaný postup, který dovoluje minimální manipulaci se vzorky při jejich zpracování a tudíž, při dodržení přesných instrukcí, zamezení vzniku náhodných chyb. 5. 4. Porovnání metod FISH a MLPA Ke spolehlivému porovnání obou metod by bylo nezbytné analyzovat vzorky od většího počtu pacientů, přičemž každý by musel být vyšetřen oběma technikami. Vzhledem k časovému omezení mé práce, k malému počtu pacientů i k finanční nákladnosti analýzy FISH nebylo takové srovnání možné. Proto údaje vycházejí pouze z aktuálních analýz, prováděných na ÚBLG v době zpracování bakalářské práce. Přesto z nashromážděných poznatků lze odvodit některé obecnější závěry. Vzhledem k minimálně třídenní kultivaci vzorků periferní krve a dalším postupu při přípravě preparátů pro metodu FISH se zdá metoda MLPA, využívající izolaci DNA ke svému dalšímu postupu, v samém počátku výhodnější pro svou menší časovou náročnost. Nicméně s ohledem na to, že počet indikací k subtelomerickým aberacím 56

s nutností rychlého vyšetření (např. u prenatálních vzorků) je zanedbatelný, nemá tato časová úspora zřejmě větší význam pro samotného pacienta. Při porovnání časového hlediska u zpracování jednoho vzorku (s odmyšlením přípravy preparátů, respektive izolace DNA) nevzniká na první pohled prvenství ani jedné z metod. Pokud ale vezmeme v úvahu indikaci subtelomerické aberace s nespecifickým fenotypem, musíme u metody FISH zvlášť analyzovat subtelomerické úseky každého chromozomu, zatímco u metody MLPA zpracováváme pořád jeden vzorek, čímž vzniká značná časová úspora. Časová úspora vzniká i u samotného konečného hodnocení, kde metoda FISH vyžaduje odečtení každého preparátu zvlášť, zatímco z grafického výstupu sekvenátoru u metody MLPA může zkušený pracovník před dalším hodnocením získaných dat orientačně stanovit výskyt aberace u některého z chromozomů. Výhodou metody MLPA je také daleko vyšší citlivost, neboť sondy pro tuto techniku pokrývají úseky DNA o rozsahu 100 500 nukleotidů. [SALSA MLPA KIT P036-E1 Human Telomere-3, 2011] Tak je možné zachytit i relativně malé delece či duplikace. Naproti tomu sondy pro FISH pokrývají sekvence až tisíckrát delší o průměrném rozsahu 100 kb viz oddíl 5. 2. [Oncology and Constitutional FISH Probe Catalogue, 2011]. Z toho vyplývá, že delece či duplikace úseků menšího rozsahu nemusí být analýzou FISH s lokus specifickými sondami vůbec zachyceny. Na druhou stranu je potřebné zdůraznit nutnost dodatečné verifikace pozitivního nálezu u metody MLPA, které metoda FISH nevyžaduje. Další výhodou analýzy FISH je možnost diagnostiky balancovaných translokací a získání lepšího přehledu o celkové struktuře vyšetřovaných chromozomů, což metoda MLPA nedovoluje. Analýzu MLPA také nelze využít k diagnostice mozaik s podílem aberantních buněk nižším než 50 %. [MLPA User manual, 2010] 57

6. ZÁVĚR Cílem práce bylo nejen získaní teoretických poznatků zejména o subtelomerických aberacích, ale především osvojení praktických dovedností v laboratorní diagnostice těchto chromozomových abnormalit metodami FISH a MLPA. Na základě získaných poznatků z vyšetření pacientů těmito analýzami je porovnávám v oddíle 5. V tomto oddíle také upozorňuji i na některé dílčí metodické problémy související zejména s technikou FISH využívající lokus specifické sondy (například na rozdílnou intenzitu a s tím spojenou hodnotitelnost fluorescenčních hybridizačních signálů, dále na časovou, technickou i finanční náročnost). Vzhledem k argumentům uvedeným v oddíle 5. musím souhlasit s některými pracemi (např. [Erjavec-Škerget, 2006]) a uznat tak, že metoda MLPA je pro rutinní diagnostiku subtelomerických přestaveb vhodnější než analýza FISH. Jednak kvůli značné časové úspoře, která je významná vzhledem k počtu pacientů s podezřením na subtelomerickou aberaci s nespecifickým fenotypem, jednak kvůli své vyšší citlivosti, jednoduššímu postupu a možnosti automatizace. O tom, že metoda FISH je v rutinní diagnostice subtelomerických přestaveb na ústupu, hovoří i fakt, že v období od října 2010 do dubna 2011 byl k vyšetření touto analýzou na ÚBLG indikován jen velmi malý počet pacientů (z tohoto důvodu nebylo možné získat pro tuto práci více dat). Nicméně i tak si technika FISH jistě udrží své nezastupitelné místo na poli laboratorní diagnostiky, zejména u případů s balancovanými přestavbami (viz oddíl 5. 1.), u pacientů se složitějšími aberacemi (kdy je třeba získat přehled chromozomové lokalizace jednotlivých lokusů), u vzácných případů s výskytem subtelomerických aberací v mozaice a také při objasnění či potvrzení některých výsledků analýzy MLPA. 58

REFERENČNÍ SEZNAM ALTHERR, Michael R. et al. Molecular Confirmation of Wolf-Hirschhorn Syndrome with a Subtle Translocation of Chromosome 4. Am. J. Hum. Genet. 1991, 49, s. 1235 1242. [citováno 2011 04-03]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1702407/?tool=pubmed> ANDERLID, Britt-Marie et al. Cryptic subtelomeric 6p deletion in a girl with congenital malformations and severe language impairment. European Journal of Human Genetics. 2003, 11, s. 89 92. [citováno 2010 12-07]. Dostupný z WWW: http://www.nature.com/ejhg/journal/v11/n1/full/5200907a.html> AUBER, Bernd et al. Identification of subtelomeric genomic imbalances and breakpoint mapping with quantitative PCR in 296 individuals with congenital defects and/or mental retardation. Molecular Cytogenetics 2009, 2, (stránkování neuvedeno). [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2660352/?tool=pubmed> BATTAGLIA, Agatino et al. Wolf-Hirschhorn syndrome [online]. University of Washington, Seattle: GeneReviews, 2002.[citováno 2010 11-19]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk1183/ BATTAGLIA, Agatino; SHAFFER, Lisa G. 1p36 Deletion Syndrome [online]. University of Washington, Seattle: GeneReviews, 2008.[citováno 2010 11-17]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/nbk1191/#del1p36.diagnosis ERJAVEC-ŠKERGET, Alenka et al. Subtelomeric Chromosome Rearrangements in Children with Idiopathic Mental Retardation: Applicability of Three Molecular-cytogenetic Methods. Croat Med J. 2006, 47, s. 841 50. [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2080485/?tool=pubmed> EVANGELIDOU, Paola et al. Clinical application of whole-genome array CGH during prenatal diagnosis: Study of 25 selected pregnancies with abnormal ultrasound findings or apparently balanced structural aberrations. Molecular Cytogenetics. 2010, 3, (stránkování neuvedeno). [citováno 2010 12-29]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc3002366/?tool=pubmed> 59

FAAS, Brigitte H. W. et al., Detection of cryptic subtelomeric imbalances in fetuses with ultrasound abnormalities. European Journal of Medical Genetics 2008, 51, s. 511 519. [citováno 2010 11-17]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18691679> General MLPA Protocol for DNA Detection & Quantification [online]. MRC- Holland, 2011. [citováno 2011 03-30]. Dostupný z WWW: http://www.mlpa.com/webforms/webformmain.aspx?tag=wl2zcji\rcgan QgZPuTixtCplCA1mmwJoFo/xHPnTgc / HÉLIAS-RODZEWICZ, Z. et al. Subtelomeric rearrangements detected by FISH in three of 33 families with idiopathic mental retardation and minor physical anomalies. J Med Genet. 2002, 39, s. 1 9. [citováno 2010 11-17]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1735238/?tool=pubmed> HOULDSWORTH, Jane; CHAGANTI, R. S. K. Comparative Genomic Hybridization: An Overview. American Journal of Pathology. 1994, 6, s. 1253 1260. [citováno 2010 12-29]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1887496/> Chromoprobe Multiprobe- T System [online]. Cytocell, 2008. [citováno 2011 04-25]. Dostupný z WWW: www.amplitech.net/pdf/multiprobes/cms- T.pdf JALAL, Syed M. et al. Utility of subtelomeric fluorescent DNA probes for detection of chromosome anomalies in 425 patients. Genetics in Medicine: 2003, 5, s. 28 34. [citováno 2010 11-16]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12544473> KANT, Sarina G. et al. Pitt-Rogers-Danks syndrome and Wolf-Hirschhorn syndrome are caused by a deletion in the same region on chromosome 4p16.3. JMed Genet 1997, 34, s. 569 572. [citováno 2010 11-20]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1050997/?tool=pubmed> KLEEFSTRA, T. et al. Disruption of the gene Euchromatin Histone Methyl Transferase1 (Eu-HMTase1) is associated with the 9q34 subtelomeric deletion syndrome. J Med Genet. 2005, 42, 299 306. [citováno 2010 12-27]. Dostupný 60

z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1736026/?tool=pubmed> KNIGHT, Samantha J. L. et al. Subtle chromosomal rearrangements in children with unexplained mental retardation. [citováno 2010 11-05]. The Lancet. 1999, 354, s. 1676 1681. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10568569> KNIGHT, Samantha J. L.; FLINT, Jonathan. Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis. J Med Genet. 2000, 37, s. 401 409. [citováno 2011 04-03]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1734614/?tool=pubmed> KOČÁREK, Eduard. Molekulární biologie v medicíně. 1. vydání, Brno: Národní centrum ošetřovatelství a nelékařských zdravotnických oborů, 2007. 218 s. ISBN 97880 7013-450 4. KOČÁREK, Eduard; PÁNEK, Martin; NOVOTNÁ, Drahuše. Klinická cytogenetika I.: úvod do klinické cytogenetiky, vyšetřovací metody v klinické cytogenetice. 2. vydání. Praha: Karolinum, 2011, s. 136. ISBN 978 80-246 1880-7 KOOLEN, D. A. et al., Screening for subtelomeric rearrangements in 210 patients with unexplained mental retardation using multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA). Med Genet 2004, 41, s. 892 899. [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1735655/?tool=pubmed> LAW, Caroline J.; FISHER, Andrew M.; TEMPLE, I. Karen. Distal 6p deletion syndrome: a report of a case with anterior chamber eye anomaly and review of published reports. J Med Genet. 1998, 35, s. 685 689. [citováno 2010 12-07]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1051400/?tool=pubmed> 61

MAINARDI, Paola Cerruti. Cri du Chat syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases 2006, 1, s. (stránkování neuvedeno). [citováno 2010 11-26].Dostupný z WWW: http://www.ojrd.com/content/1/1/33> MAŘÍKOVÁ, H., Telomery a Telomerasa: Jejich vztah k buněčnému stárnutí a rakovině. Locomotor system 2006, 16, s. 162 170. [citováno 2010 12-27]. Dostupný z WWW: http://www.pojivo.cz/pu/pu_34_2009.pdf> Mentální retardace. [online]. Wikipedia, 2010. [citováno 2010 11-17]. Dostupný z WWW: http://cs.wikipedia.org/wiki/ment%c3%a1ln%c3%ad_retardace> MLPA User manual [online]. The Leeds Teaching Hospitals, 2010 [citováno 2011 04-25]. Dostupný z WWW: http://www.pathology.leedsth.nhs.uk/pathology/departments/genetics/cytogen etics/bloodsamples.aspx NUSSBAUM, Robert L.; MCINNES, Roderick R.; WILLARD, Huntington F. Thompson and Thompson: Klinická genetika. 1. vydání. Praha: Triton, 2004. 426 s. ISBN 80 7254-475 6. Oncology and Constitutional FISH Probe Catalogue [online]. United Kingdom: Cytocell, 2011 [citováno 2011 04-27]. Dostupný z WWW: http://www.cytocell.com/files/cytocell%202011_2012_catalogue.pdf PARK, Hyun-Kyung et al. Screening of Subtelomeric Rearrangements in 100 Korean Pediatric Patients with Unexplained Mental Retardation and Anomalies Using Subtelomeric FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). J Korean Med Sci 2008, 23, s. 573 578. [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2526410/?tool=pubmed> PHELAN, Mary C. Deletion 22q13.3 syndrome. Orphanet Journal of Rare Diseases 2008, 3, (stránkování neuvedeno). [citováno 2010 12-28]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2427010/?tool=pubmed> 62

PHUPONG, Vorapong et al. Prenatal exclusion of subtelomeric deletion 1p by fluorescent in situ hybridization. Archives of Gynecology and Obstetrics 2007, 4, s. 237 240. ISSN: 0932 0067 PICARD, Franck et al. A statistical approach for array CGH data analysis. BMC Bioinformatics. 2005, 6, (stránkování neuvedeno). [citováno 2010 12-29]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc549559/?tool=pubmed> RIETHMAN, H.; AMBROSINI, A.; PAUL, S. Human subtelomere structure and variation. Chromosome Research 2005, 13, s. 505 515. [citováno 2011 01-07]. Dostupný z WWW: http://www.springerlink.com/content/g002442066366w35/> RIETHMAN, H., Human subtelomeric copy number variations. Cytogenet Genome Res 2008, 123, s. 244 252. [citováno 2011 01-07]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2731494/> ROSYPAL, Stanislav. Úvod do molekulární biologie, 3. díl. 3. vydání, Brno:GRAFEX, 2002. 297 s. ISBN 80 902562-2 8. ROOMS, Liesbeth; REYNIERS, Edwin; KOOY, R. Frank, Subtelomeric Rearrangements in the Mentally Retarded: A Comparison of Detection Methods. HUMAN MUTATION 2005, 25, s. 513 524. [citováno 2011 01-07]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=subtelomeric%20rearra ngements%20in%20the%20mentally%20retarded%3a%20a%20comparison %20of%20Detection%20Methods.%20> SALSA MLPA KIT P036-E1 HUMAN TELOMERE-3. [online]. MRC- Holland, 2011. [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: www.mlpa.com> SEEMANOVÁ, Eva. Mikrodeleční syndromy. Časopis lékařů českých. 2002, 12, s. 363 370. [citováno 2010 11-19]. Dostupný z WWW: http://ublg.lf2.cuni.cz/index.php/cs/ke-stazeni/category/15> SELLNER, Loryn N.; TAYLOR, Graham R. MLPA and MAPH: New Techniques for Detection of Gene Deletions. Human Mutation 2004, 23, s. 413 419. [citováno 2010 12-30]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15108271 63

SCHEFELS, J.; KELLER-ROTTGER, E.; ESSER, K.-J. Terminal deletion of chromosome 1 a recognizable condition. Eur J Pediatr 1996, 155, s. 720 724. [citováno 2010 11-17]. Dostupný z WWW: http://resources.metapress.com/pdfpreview.axd?code=l280632j4v487j03&size=largest> SCHUBERT, Falk et al. CGH-Profiler: Data mining based on genomic aberration profiles. BMC Bioinformatics. 2005, 6, (stránkování neuvedeno). [citováno 2010 12-29]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1183191/?tool=pubmed> SOGAARD, Marie et al. Subtelomeric study of 132 patients with mental retardation reveals 9 chromosomal anomalies and contributes to the delineation of submicroscopic deletions of 1pter, 2qter, 4pter, 5qter and 9qter. BMC Medical Genetics 2005, 6, (stránkování neuvedeno). [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1174871/?tool=pubmed> SÝKOROVÁ, Eva. Obvyklé a neobvyklé telomery. Informační listy, Genetická Společnosti Gregora Mendela 2006, 30, s. 6 12. [citováno 2010 12-27]. Dostupný z WWW: www.gsgm.cz/files/il_gsgm_30_2006.pdf> ŠŤASTNÁ, Sylvie et al. Vybrané vyšetřovací metody v molekulární genetice a cytogenetice. Sborník, Praha.: Ústav dědičných metabolických poruch VFN, 2008. 50 s. VAN TUINEN, Peter et al. Molecular Detection of Microscopic and Submicroscopic Deletions Associated with Miller-Dieker Syndrome. Am. J. Hum. Genet. 1988, 43, s. 587 596. [citováno 2010 12-27]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1715542/?tool=pubmed> DE VRIES, Bert B. A. et al. Clinical studies on submicroscopic subtelomeric rearrangements: a checklist. J Med Genet. 2001, 38, s. 145 150. [citováno 2010 11-05]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1734836/?tool=pubmed 64

DE VRIES, Bert B. A. et al. Submicroscopic subtelomeric 1qter deletions: a recognisable phenotype? J Med Genet 2001, 38, s. 175 178. [citováno 2010 11-17]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1734828/?tool=pubmed> WHITE, Stefan, et al. Comprehensive Detection of Genomic Duplications and Deletions in the DMD Gene, by Use of Multiplex Amplifiable Probe Hybridization. Am. J. Hum. Genet. 2002, 71, s. 365 374. [citováno 2010 12-30]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc379168/?tool=pubmed WILKIE, Andrew O. M. Detection of Cryptic Chromosomal Abnormalities in Unexplained Mental Retardation: A General Strategy Using Hypervariable Subtelomeric DNA Polymorphisms. Am.]. Hum. Genet.. 1993, 53, s. 688 701. [citováno 2011 04-03]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc1682421/?tool=pubmed> WINNEPENNINCKX, Birgitta; ROOMS, Liesbeth; KOOY, R. Frank. Mental Retardation: A review of the genetic causes. The British Journal of Developmental Disabilities. 2003, 96, s. 29 44. [citováno 2011 02-23]. Dostupný z WWW: http://www.bjdd.org/new/96,29 44.htm> WU, Ye et al. Research article Submicroscopic subtelomeric aberrations in Chinese patients with unexplained developmental delay/mental retardation. BMC Medical Genetics 2010, 11, (stránkování neuvedeno). [citováno 2011 03-23]. Dostupný z WWW: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc2892449/?tool=pubmed> 65

SEZNAM PŘÍLOH Příloha č. 1. Příklady pozitivních nálezů metody MLPA...67 Příloha č. 2. Příklad pozitivního nálezu metody FISH...69 66

PŘÍLOHY Příloha č. 1. Příklady pozitivních nálezů metody MLPA Obrázek 1. Výsledek metody MLPA s nálezem duplikace subtelomerické oblasti 5p (chlapec; 46,XY; narozen v roce 2002; indikace na vyšetření subtelomerických aberací z důvodu stigmatizace a autismu; z archivu Dr. Hedvičákové). Obrázek 2. Výsledek metody MLPA s nálezem delece subtelomerické oblasti 2q (chlapec; 46,XY; narozen v 2010; indikace na vyšetření subtelomerických aberací z důvodu vrozené vývojové vady mozku a stigmatizace; z archivu Dr. Hedvičákové). 67

Obrázek 3. Výsledek metody MLPA s nálezem duplikace 4q (dívka; 46 XX; narozena v roce 2008; indikace na vyšetření subtelomerických aberací z důvodů středně těžké mentální retardace a stigmatizace; z archivu Dr. Hedvičákové) Obrázek 4. Výsledek metody MLPA s nálezem delece 10q (dívka; 46, XX; narozena v roce 2010; indikace na vyšetření subtelomerických aberací z důvodů stigmatizace, psychomotorické retardace, vrozené srdeční vady, stenózy plicnice a poruše růstu; z archivu Dr. Hedvičákové) 68

Příloha č. 2. Příklad pozitivního nálezu metody FISH Obrázek 1. Výsledek metody FISH s nálezem delece 2q (plod; vyšetření materiálu získaného kultivací amniocytů; prokázaná delece nemusí mít kauzální význam, v současnosti je považována za polymorfismus; z archivu Dr. Kočárka) 69