HCV genotypizační test pro použití na systému cobas Pro diagnostické použití in vitro. 240 Tests 960 Tests. 240 Tests 960 Tests

HCV genotypizační test pro použití na systému cobas 4800 Pro diagnostické použití in vitro cobas HCV GT 120 Tests P/N: 06984274190 cobas HCV GT Control Kit 10 Sets P/N: 06984339190 cobas 4800 System Sample Preparation Kit 2 240 Tests 960 Tests P/N: 06979513190 P/N: 06979521190 cobas 4800 System Wash Buffer Kit 240 Tests 960 Tests P/N: 05235863190 P/N: 05235871190 cobas 4800 System Lysis Kit 2 240 Tests 960 Tests P/N: 06979530190 P/N: 06979548190

OBSAH Účel použití Souhrn a výklad testu Základní informace... 4 Důvod pro testování genotypu HCV... 4 Princip testu... 4 Principy postupu... 5 Materiály a činidla Činidla... 6 Požadavky na uchovávání činidel a manipulaci s nimi... 10 Další potřebný materiál... 10 Potřebné vybavení a software, které není součástí dodávky... 11 Bezpečnostní opatření a požadavky na manipulaci Varování a bezpečnostní opatření... 11 Správná laboratorní praxe... 12 Manipulace s činidly... 12 Kontaminace... 12 Integrita... 13 Likvidace... 13 Rozlití a čištění... 13 Odběr, přeprava a uchovávání vzorků... 13 Odběr vzorků... 13 Přeprava, uchovávání a stabilita vzorků... 14 Návod k použití Spuštění testu... 14 Velikost cyklu... 15 Pracovní postup... 15 Výsledky Kontrola kvality a platnost výsledků... 17 Vyhodnocení výsledků... 17 Procedurální omezení... 18 Hodnocení neklinických funkčních parametrů Klíčové funkční charakteristiky... 19 Doplňující informace Hlavní parametry testu... 26 Symboly... 27 Doc. Rev. 1.0 2

Výrobce a distributoři... 28 Obchodní značky a patenty... 28 Autorská práva (Copyright)... 28 Literatura... 29 Revize dokumentu... 30 Doc. Rev. 1.0 3

Účel použití Test cobas HCV GT slouží k amplifikaci nukleové kyseliny in vitro pro kvalitativní identifikaci viru hepatitidy C (HCV) genotypů 1 až 6 a podtypů a a b genotypu 1 v lidské plazmě nebo séru osob s infekcí HCV s použitím systému cobas 4800: přístroje cobas x 480 pro automatické zpracování vzorků a analyzátoru cobas z 480 pro automatickou amplifikaci a detekci. Test cobas HCV GT je určen k použití při výběru osob s chronickou infekcí HCV pro antivirovou terapii a při určování délky trvání terapeutických režimů v souladu s informacemi z předpisu na antivirovou terapii. Souhrn a výklad testu Základní informace Virus HCV je pokládán za hlavní etiologické agens odpovědné za 90 % až 95 % případů hepatitidy v důsledku transfuze. 1-4 HCV je virus s pozitivní jednořetězcovou RNA a genomem o velikosti přibližně 9500 nukleotidů, který kóduje 3000 aminokyselin. Genotypy a subtypy HCV jsou rozšířeny ve světě tak, že ve specifických geografických oblastech převládají různé genotypy. Diverzita genotypů HCV, které se mohou vyskytovat v dané geografické lokalitě, vyžaduje identifikaci infikujícího genotypu předtím, než je pacientovi předepsána antivirová terapie. Důvod pro testování genotypu HCV V minulosti byly pacientům s chronickou infekcí HCV předepsány různé doby trvání terapie pegylovaným interferonem plus ribavirinem po zjištění infikujícího genotypu HCV na základě pravděpodobnosti dosažení trvalé virologické odpovědi na konci antivirové terapie. 5 Pacientům s genotypem 2 a 3 byly předepsány 24 týdny terapie pegylovaným interferonem plus ribavirinem, zatímco u pacientů s genotypem 1 byla úspěšnější terapie po dobu 48 týdnů. Od schválení množství přímo působících antivirových inhibitorů v roce 2011 existují mnohočetné schválené možnosti terapeutických režimů pro každý genotyp 6 s pokyny pro specifickou kombinaci léčiv a trvání terapie. Použití specifického režimu záleží více na místních podmínkách registrace léčiv a náhrady lékařských nákladů platných v daném státě. Obecně se má za to, že je třeba analyzovat genotyp HCV a podtypy genotypu 1 (1a/1b) před zahájením terapie, z čehož vyplyne výběr terapie. Princip testu Test cobas HCV GT slouží ke kvalitativní identifikaci amplifikací nukleových kyselin pomocí systému cobas 4800. Test cobas HCV GT používá polymerázovou řetězovou reakci s reverzní transkripcí v reálném čase (RT-PCR) k identifikaci HCV genotypů 1 až 6 a podtypů 1a a 1b pomocí primerů specifických pro genotypy a podtypy a oligonukleotidových sond značených fluorescenčním barvivem. Test také detekuje HCV bez ohledu na genotyp pomocí primerů a sond ve vysoce konzervativní oblasti genomu HCV, která slouží jako vnitřní kontrola pro monitorování celého procesu přípravy vzorků a RT-PCR. Doc. Rev. 1.0 4

Principy postupu Test cobas HCV GT se zakládá na plně automatické přípravě vzorků (extrakce a purifikace nukleových kyselin), po níž následuje RT-PCR amplifikace a detekce v reálném čase. Systém cobas 4800 sestává z přístroje cobas x 480 pro automatické zpracování vzorků a analyzátoru cobas z 480 pro automatickou amplifikaci a detekci. Software cobas 4800 provádí automatickou správu dat a určuje výsledky všech testů jako jeden nebo více genotypů a podtypů, neurčitý výsledek Indeterminate (HCV RNA je detekována, ale není identifikován genotyp ani podtyp) nebo neplatný výsledek Invalid (HCV RNA není detekována). Výsledky lze prohlížet přímo na obrazovce systému, exportovat nebo vytisknout jako zprávu. Nukleové kyseliny jsou uvolněny ze vzorků pacientů a externích kontrol přidáním proteinázy a chaotropního lytického činidla ke vzorku. Uvolněné nukleové kyseliny se váží na křemičitanový povrch magnetických skleněných částic. Nenavázané látky a nečistoty, jako například denaturované proteiny, buněčný odpad a případné inhibitory PCR jsou odstraněny během následujícího promývání; purifikované nukleové kyseliny jsou eluovány z magnetických skleněných částic elučním pufrem při zvýšené teplotě. Každý vzorek je amplifikován ve třech reakcích RT-PCR v reálném čase. Amplifikace metodou RT-PCR specifickou pro genotyp a podtyp a detekce HCV genotypů 1 až 6 a podtypů 1a a 1b se dosahuje pomocí primerů a sond značených fluorescenčním barvivem, které jsou specifické pro genotyp a podtyp. Každá reakce také obsahuje primery a sondy specifické pro vysoce konzervativní oblast genomu HCV jako vnitřní kontrolu kvůli amplifikaci a detekci HCV bez ohledu na genotyp. Sondy jsou označeny čtyřmi různými fluorescenčními oznamovacími barvivy, což umožňuje současnou detekci HCV a až tří genotypů nebo podtypů v každé reakci. Tepelně stabilní DNA polymeráza se používá jak pro reverzní transkripci, tak pro PCR amplifikaci. Činidla Master Mix obsahují místo deoxythymidin trifosfátu (dttp) deoxyuridin trifosfát (dutp), který je zabudováván do nově syntetizované DNA (amplikonu). 7-9 Jakékoli kontaminující amplikony z předcházejících cyklů PCR jsou jako PCR templáty inaktivovány enzymem AmpErase přítomným v činidlech Master Mix ještě před prvním denaturačním krokem PCR. AmpErase katalyzuje odštěpení uracilu z DNA, ale nevykazuje žádnou aktivitu vůči RNA nebo přírodní DNA, která neobsahuje uracil. Amplikony vytvořené během následujících cyklů PCR nejsou inaktivovány, protože enzym AmpErase je při anelačních a denatruačních teplotách PCR inaktivní. Každá z oligonukleotidových sond v Master Mixech cobas HCV GT je označena nefluorescenčním tlumicím barvivem a fluorescenčním oznamovacím barvivem. Když jsou sondy intaktní, fluorescence oznamovacích barviv je potlačena tlumicím barvivem. Během PCR amplifikace sondy hybridizují se svými cílovými sekvencemi mezi vazebnými místy primerů a DNA polymeráza primery prodlužuje. Nukleázová aktivita DNA polymerázy ve směru 5' 3' štěpí hybridizované sondy, čímž dojde k separaci oznamovacího a tlumicího barviva a vzniku fluorescenčního signálu. Každý cyklus PCR vytváří větší množství rozštěpených sond a kumulativní signál oznamovacího barviva se zvyšuje. Detekce a rozlišení produktů PCR je dosaženo automatickým měřením fluorescence uvolněných oznamovacích barviv v každém cyklu PCR analyzátorem cobas z 480. Doc. Rev. 1.0 5

Materiály a činidla Činidla Veškerá neotevřená činidla a kontroly budou uchovávány podle doporučení v tabulce Uchovávání činidel a manipulace s nimi. Souprava Součásti a složky činidel Množství v soupravě Bezpečnostní symboly a varování a MMX R1 N/A (Činidlo Master Mix 1 pro systém cobas ) Octan hořečnatý, hydroxid draselný, < 0,1% azid sodný 10 x 1,75 ml HCV GT MMX R2A (Činidlo Master Mix 2A pro test cobas HCV GT) N/A Tricinový pufr, octan draselný, 18% dimethylsulfoxid, glycerol, < 0,1% Tween 20, EDTA, < 0,12% datp, dctp, dgtp, dutp, < 0,01% HCV primery, < 0,01% fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy, < 0,01% oligonukleotidový aptamer, < 0,01% polyadenylová kyselina, < 0,01% Z05D DNA polymeráza (mikrobiální), < 0,01% enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální), < 0,1% azid sodný 10 x 0,5 ml HCV GT MMX R2B N/A (Činidlo Master Mix 2B cobas HCV GT) cobas HCV GT 120 testů (P/N: 06984274190) Tricinový pufr, octan draselný, 18% dimethylsulfoxid, glycerol, < 0,1% Tween 20, EDTA, < 0,12% datp, dctp, dgtp, dutp, < 0,01% HCV primery, < 0,01% fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy, < 0,01% oligonukleotidový aptamer, < 0,01% polyadenylová kyselina, < 0,1% Z05D DNA polymeráza (mikrobiální), < 0,1% enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální), < 0,1% azid sodný 10 x 0,5 ml HCV GT MMX R2C (Činidlo Master Mix 2C cobas HCV GT) N/A Tricinový pufr, octan draselný, 18% dimethylsulfoxid, glycerol, < 0,1% Tween 20, EDTA, < 0,12% datp, dctp, dgtp, dutp, < 0,01% HCV primery, < 0,01% fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy, < 0,01% oligonukleotidový aptamer, < 0,01% polyadenylová kyselina, < 0,1% Z05D DNA polymeráza (mikrobiální), < 0,1% enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální), < 0,1% azid sodný 10 x 0,5 ml Doc. Rev. 1.0 6

Souprava Součásti a složky činidel Množství v soupravě Bezpečnostní symboly a varování a cobas HCV GT Control Kit (Kontrolní souprava pro test cobas HCV GT) 10 souprav (P/N: 06984339190) HCV GT (+)C (Pozitivní kontrola cobas HCV GT) < 0,001% syntetická (armored) HCV RNA enkapsulovaná v obalovém proteinu bakteriofágu MS2, normální lidská plazma, nereaktivní podle licenčních testů na protilátky proti HIV-1/2, protilátky proti HCV, HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami. 0,1% konzervantu ProClin 300 ( ) C (Negativní kontrola cobas ) Normální lidská plazma, nereaktivní podle licenčních testů na protilátky proti HIV-1/2, protilátky proti HCV, HBsAg; HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami. < 0,1% konzervantu ProClin 300 10 x 0,75 ml 10 x 0,75 ml Varování H317 Může vyvolat alergickou kožní reakci. P261 Zamezte vdechování prachu/dýmu/ plynu/mlhy/par/aerosolů. P272 Kontaminovaný pracovní oděv neodnášejte z pracoviště. P280 Používejte ochranné rukavice. P333 + P313 Při podráždění kůže nebo vyrážce: Vyhledejte lékařskou pomoc/ ošetření. P362 + P364 Kontaminovaný oděv svlékněte a před opětovným použitím vyperte. P501 Odstraňte obsah/obal předáním zařízení schválenému pro likvidaci odpadů. cobas 4800 System Sample Preparation Kit 2 (Souprava 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800) 240 testů (P/N: 06979513190) MGP 2 (MGP činidlo 2 pro systém cobas 4800) Magnetické skleněné částice, Tris pufr, 0,1% methyl-4-hydroxybenzoát, <0,1% azid sodný EB 2 (Eluční pufr 2 pro systém cobas 4800) 10 x 8 ml 10 x 17 ml N/A Tris pufr, 0,2% methyl-4-hydroxybenzoát MGP 2 N/A cobas 4800 System Sample Preparation Kit 2 (Souprava 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800) (MGP činidlo 2 pro systém cobas 4800) Magnetické skleněné částice, Tris pufr, 0,1% methyl-4-hydroxybenzoát, <0,1% azid sodný 10 x 16 ml 960 testů (P/N: 06979521190) EB 2 (Eluční pufr 2 pro systém cobas 4800) 10 x 17 ml Tris pufr, 0,2% methyl-4-hydroxybenzoát cobas 4800 System Wash Buffer Kit (Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800) 240 testů (P/N: 05235863190) WB Dihydrát citrátu sodného, 0,05% N-methylizothiazolon HCl 10 x 55 ml N/A cobas 4800 System Wash Buffer Kit (Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800) 960 testů (P/N: 05235871190) WB Dihydrát citrátu sodného, 0,05% N- methylizothiazolon HCl 10 x 200 ml N/A Doc. Rev. 1.0 7

Souprava Součásti a složky činidel Množství v soupravě Bezpečnostní symboly a varování a cobas 4800 System Lysis Kit 2 (Lytická souprava 2 pro systém cobas 4800) 240 testů (P/N: 06979530190) P 2 (Proteáza 2 pro systém cobas 4800) Tris pufr, <0,05% EDTA, chlorid vápenatý, octan vápenatý, 8% (w/v) proteináza LYS 2 (Lytický pufr 2 pro systém cobas 4800) 42,56% (w/w) guanidinthiokyanát, 5% (w/v) polydokanol, 2% (w/v) dithiothreitol, dihydrát citrátu sodného 10 x 1,0 ml 10 x 27 ml Nebezpečí H302+H332 Zdraví škodlivý při požití. H315 Dráždí kůži. H318 Způsobuje vážné poškození očí. H334 Při vdechování může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dýchací potíže. H412 Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. EUH032 Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. P261 Zamezte vdechování prachu/dýmu/ plynu/mlhy/par/aerosolů. P280 Používejte ochranné rukavice/ ochranné brýle/obličejový štít. P284 Používejte vybavení pro ochranu dýchacích cest. P305 + P351 + P338 + P310 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P342 + P311 Při dýchacích potížích: Volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P362 + P364 Kontaminovaný oděv svlékněte a před opětovným použitím vyperte. Doc. Rev. 1.0 8

Souprava Součásti a složky činidel Množství v soupravě Bezpečnostní symboly a varování a cobas 4800 System Lysis Kit 2 (Lytická souprava 2 pro systém cobas 4800) 960 testů (P/N: 06979548190) P 2 (Proteáza 2 pro systém cobas 4800) Tris pufr, <0,05% EDTA, chlorid vápenatý, octan vápenatý, 8% (w/v) proteináza LYS 2 (Lytický pufr 2 pro systém cobas 4800) 42,56% (w/w) guanidinthiokyanát, 5% (w/v) polydokanol, 2% (w/v) dithiothreitol, dihydrát citrátu sodného a Bezpečnostní označení produktů vychází primárně z pokynů GHS EU. 10 x 1,0 ml 10 x 84 ml Nebezpečí H302+H332 Zdraví škodlivý při požití. H315 Dráždí kůži. H318 Způsobuje vážné poškození očí. H334 Při vdechování může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dýchací potíže. H412 Škodlivý pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. EUH032 Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. P261 Zamezte vdechování prachu/dýmu/ plynu/mlhy/par/aerosolů. P280 Používejte ochranné rukavice/ ochranné brýle/obličejový štít. P284 Používejte vybavení pro ochranu dýchacích cest. P305 + P351 + P338 + P310 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Okamžitě volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P342 + P311 Při dýchacích potížích: Volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO nebo lékaře. P362 + P364 Kontaminovaný oděv svlékněte a před opětovným použitím vyperte. Doc. Rev. 1.0 9

Požadavky na uchovávání činidel a manipulaci s nimi Činidlo Teplota uchovávání Doba uchovávání cobas HCV GT 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti Kontrolní souprava pro test cobas HCV GT 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti Souprava 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti Souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800 15-25 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti Lytická souprava 2 pro systém cobas 4800 2-8 C Stabilní do uvedeného data použitelnosti Činidla nezmrazujte. Další potřebný materiál Materiál Extrakční destička (s hlubokými jamkami) 2,0 ml pro systém cobas 4800 06884008001 Mikrotitrační destička AD 0,3 ml pro systém cobas 4800 05232724001 Aplikátor zalepovací fólie 04900383001 Špičky CORE, 1000 µl, stojan s 96 ks 04639642001 Zásobník na činidla 200 ml 05232759001 Zásobník na činidla 50 ml 05232732001 Nosič s 24 pozicemi 04639502001 Nosič s 32 pozicemi 04639529001 Pytel na pevný odpad Plastová skluzavka na odpad Hamilton STAR 04639669001 Rukavice na jedno použití bez pudru Vortex mixer (pro jednu zkumavku) Centrifuga s kyvnou nádobou rotoru s min. otáčkami 1500 P/N 05530873001 (malý) nebo 04691989001 (velký) Jakékoliv rukavice na jedno použití bez pudru. Jakýkoliv vířivý mixér. Jakákoliv vhodná centrifuga. Více informací ohledně samostatně prodávaných materiálů získáte u svého místního zástupce společnosti Roche. Doc. Rev. 1.0 10

Potřebné vybavení a software, které není součástí dodávky Potřebné vybavení a software, které není součástí dodávky Systém cobas 4800 Přístroj cobas x 480 Analyzátor cobas z 480 Řídicí jednotka Aplikační software cobas 4800 (základní) verze 2.1.0 nebo vyšší Systém cobas 4800 cobas HCV GT AP verze 1.0.0 nebo vyšší Dodatečné informace o typech primárních a sekundárních vzorkových zkumavek vhodných pro přístroje najdete v provozní příručce systému cobas 4800 verze softwaru 2.1 nebo vyšší pro test cobas HCV GT pro použití se systémem cobas 4800 (dále uváděna jako provozní příručka systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT). Pozn.: Kontaktujte místního zástupce společnosti Roche ohledně podrobných seznamů pro objednávky stojanů na vzorky, stojanů pro špičky se sraženinou a stojany, které se vejdou do přístrojů. Bezpečnostní opatření a požadavky na manipulaci Varování a bezpečnostní opatření Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké analytické citlivosti testu je třeba dbát opatrnosti, aby mezi činidly, vzorky a amplifikačními směsmi nedošlo ke kontaminaci. Pouze pro účely diagnostiky in vitro. Test cobas HCV GT není určen k plošnému screeningovému vyšetřování krve či krevních derivátů na přítomnost HCV, ani jako diagnostický test k potvrzení infekce virem HCV. Se všemi vzorky pacientů je nutno zacházet, jako by byly infekční, za použití správných laboratorních postupů, tak jak jsou popsány v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories a v dokumentu CLSI číslo M29-A4. 10,11 Tento postup smí provádět pouze personál zkušený v zacházení s infekčními vzorky a systémy cobas HCV GT a cobas 4800. Veškeré materiály pocházející z lidských zdrojů by měly být považovány za potenciálně infekční a musí se s nimi zacházet dle všeobecných bezpečnostních opatření. Kontrolní souprava pro test cobas HCV GT obsahuje plazmu z lidské krve. Zdrojový materiál byl analyzován pomocí licenčních serologických testů a byl shledán nereaktivním vůči protilátce proti HCV, protilátce proti HIV-1/2, protilátce proti HBsAg a protilátce proti HBc. Testování metodami PCR neprokázala žádné detekovatelné nukleové kyseliny HIV-1 RNA, HIV-2 RNA, HCV RNA, a HBV DNA. Nicméně žádná známá testovací metoda nepředstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nepřenesou nějaká infekční agens. Zamezte expozici MGP vůči zdrojům magnetického pole. Nezmrazujte plnou krev ani žádné vzorky v primárních zkumavkách. Pro zajištění optimální účinnosti testu používejte pouze spotřební materiál, který je součástí dodávky, nebo specifikovaný požadovaný materiál. Bezpečnostní listy (SDS) zašle na vyžádání Váš místní zástupce společnosti Roche. Doc. Rev. 1.0 11

Pečlivě dodržujte uvedené postupy a předpisy, aby se zajistilo správné provedení testů. Jakákoliv odchylka od postupů a předpisů může negativně ovlivnit optimální účinnost testu. Pokud nebude během manipulace a zpracování vzorků patřičně kontrolována kontaminace přenosem, mohou vzniknout falešně pozitivní výsledky. Další varování, upozornění a postupy pro snížení rizika kontaminace přístroje cobas x 480 nebo analyzátoru cobas z 480 najdete v provozní příručce systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. Pokud máte podezření na kontaminaci, proveďte čištění a údržbu podle popisu v provozní příručce systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. Pozn.: Konkrétní pokyny viz Odběr, přeprava a uchovávání vzorků. Správná laboratorní praxe Nepipetujte ústy. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Po manipulaci se vzorky a činidly soupravy si důkladně umyjte ruce, jakož i po svléknutí rukavic. Při práci s jakýmikoliv činidly používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochranné brýle. Dbejte na to, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opatření zanedbána, může dojít k popáleninám. Pokud dojde k rozlití, zřeďte je před vytřením dosucha vodou. Všechny pracovní plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným 0,5% roztokem chlornanu sodného v destilované nebo deionizované vodě (zředěný bělicí prostředek pro domácnosti 1:10). Dále povrch otřete 70% etanolem. Manipulace s činidly Aby nedošlo u vzorků nebo kontrol ke kontaminaci přenosem, zacházejte se všemi činidly, kontrolami a vzorky podle zásad správné laboratorní praxe. Před použitím vizuálně zkontrolujte každou láhev a lahvičku s činidly, zda nejeví žádné známky netěsnosti. Pokud známky netěsnosti vykazuje, nepoužívejte tento materiál k testování. Lytický pufr 2 pro systém cobas 4800 obsahuje potenciálně nebezpečnou látku guanidinthiokyanát. Vyhněte se kontaktu činidel s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud dojde ke kontaktu, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody, jinak může dojít k popáleninám. Test cobas HCV GT a souprava 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 obsahují azid sodný jako konzervační látku. Vyhněte se kontaktu činidel s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud dojde ke kontaktu, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody, jinak může dojít k popáleninám. Pokud se činidlo rozlije, zřeďte ho před vytřením dosucha vodou. Lytický pufr 2 pro systém cobas 4800, jenž obsahuje guanidinthiokyanát, se nesmí dostat do styku s roztokem chlornanu sodného (bělicím prostředkem). Tato směs vytváří vysoce toxický plyn. Kontaminace Je nutné nosit rukavice. Aby nedošlo ke kontaminaci, musí se rukavice vyměňovat mezi manipulací se vzorky a manipulací s činidly testu cobas HCV GT. Zabraňte kontaminaci rukavic při manipulaci se vzorky a kontrolami. Při práci se vzorky a soupravami činidel používejte laboratorní rukavice, laboratorní pláště a ochranné brýle. Zamezte mikrobiální a ribonukleázové kontaminaci činidel. Pokud se během zacházení se vzorkem nezabrání kontaminaci vzorků, mohou být získány falešně pozitivní výsledky. Doc. Rev. 1.0 12

Integrita Nepoužívejte soupravy po uplynutí data použitelnosti. Činidla nemíchejte. Položky k jednorázovému použití nepoužívejte po uplynutí doby použitelnosti. Všechny položky k jednorázovému použití použijte jen jednou. Pufr znovu nepoužívejte. Veškeré vybavení je nutné řádně udržovat podle pokynů výrobce. Likvidace Test cobas HCV GT a souprava 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 obsahují azid sodný (viz Varování a bezpečnostní opatření ). Ten může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a vytvářet vysoce explozivní kovové azidy. Při likvidaci roztoků obsahujících azid sodný do laboratorního umyvadla propláchněte odtok velkým množstvím studené vody, abyste tak zabránili vytváření azidů. Nespotřebovaná činidla a odpad likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy. Pozn.: Likvidace kapalného odpadu viz příslušná příručka systému cobas 4800. Rozlití a čištění Lytický pufr 2 pro systém cobas 4800 obsahuje guanidinthiokyanát. Pokud se kapalina obsahující guanidinthiokyanát rozlije, postižené místo vyčistěte vodou s vhodným laboratorním detergentem. Jestliže rozlitá kapalina obsahuje potenciálně infekční látky, vyčistěte místo NEJPRVE vodou s vhodným laboratorním detergentem a potom 0,5% chlornanem sodným. Pokud dojde k rozlití kapaliny na přístroj cobas 4800, řiďte se při čištění pokyny v příslušné příručce systému cobas 4800. K čištění přístroje cobas x 480 nebo analyzátoru cobas z 480 nepoužívejte roztok chlornanu sodného (bělidlo). Vyčistěte přístroj cobas x 480 nebo analyzátor cobas z 480 podle pokynů v příslušné příručce systému cobas 4800. Odběr, přeprava a uchovávání vzorků Pozn.: Se všemi vzorky je třeba zacházet jako s infekčními. Všechny vzorky uchovávejte při stanovených teplotách. Zvýšené teploty ovlivňují stabilitu vzorků. Pokud používáte vzorky zmrazené v sekundárních zkumavkách, ponechte je při pokojové teplotě (15 30 C) do úplného roztátí a pak odstředěním shromážděte veškerý objem na dně zkumavky. Odběr vzorků Krev se odebírá do zkumavek SST (sérové separační zkumavky), do zkumavek pro přípravu plazmy BD Vacutainer PPT pro molekulární diagnostické testovací metody nebo do sterilních zkumavek za použití EDTA jako antikoagulantu. Pozn.: Uživatel musí dodržovat pokyny výrobce zkumavky pro přípravu séra/plazmy. Doc. Rev. 1.0 13

Přeprava, uchovávání a stabilita vzorků Krev odebranou do zkumavek SST (sérové separační zkumavky), do zkumavek pro přípravu plazmy BD Vacutainer PPT pro molekulární diagnostické testovací metody nebo do sterilních zkumavek za použití EDTA jako antikoagulantu lze uchovávat nebo přepravovat po dobu do 24 hodin při 2 C až 25 C před přípravou plazmy/séra a následným testováním. Vzorky plazmy/séra lze uchovávat v sekundárních zkumavkách po dobu do 24 hodin při teplotě 2 C až 25 C, do 72 hodin při 2 C až 8 C nebo do 6 týdnů při -18 C. Separované vzorky plazmy/séra v sekundárních zkumavkách jsou stabilní až do tří cyklů zmrazení a rozmrazení, pokud jsou uchovávány zmrazené při teplotě -18 C. Pokud mají být vzorky přepravovány, musí být zabaleny a označeny dle platných státních anebo mezinárodních předpisů o přepravě vzorků a etiologických agens. Návod k použití Spuštění testu Obrázek 1: Pracovní postup testu cobas HCV GT 1 Spusťte systém. 2 Proveďte údržbu přístroje. 3 Vyjměte vzorky a činidla z místa uchovávání. 4 Spusťte cyklus. 5 Zaveďte vzorky 6 S LIS: potvrďte objednávku. Bez LIS: vytvořte objednávku. 7 Zaveďte spotřební materiál (destičku s hlubokými jamkami, mikrotitrační destičku, stojany na špičky). 8 Zaveďte činidla 9 Spusťte cyklus přípravy vzorku 10 Vyjměte a zalepte mikrotitrační destičku 11 Zaveďte mikrotitrační destičku do analyzátoru 12 Vyjměte vzorky, použitá činidla a destičku s hlubokými jamkami. 13 Zkontrolujte výsledky 14 S LIS: odešlete výsledky do LIS 15 Vyprázdněte analyzátor Pozn.: Viz provozní příručka systému cobas 4800 pro cobas HCV GT, kde najdete podrobné postupy. Doc. Rev. 1.0 14

Velikost cyklu Generická činidla pro přípravu vzorků (souprava 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800, lytická souprava 2 pro systém cobas 4800 a souprava promývacího pufru pro systém cobas 4800) jsou k dispozici v soupravách dvou velikostí; každá obsahuje množství činidel dostatečné pro 10 cyklů po 24 nebo 96 vzorcích, které zahrnují kontroly a vzorky pro všechny potřebné testy. Souprava testu cobas HCV GT se dodává v jedné velikosti, která stačí na testování 120 (10 12) vzorků včetně kontrol. Kontrolní souprava testu cobas HCV GT se dodává v jedné velikosti s 10 sadami obsahujícími negativní a pozitivní kontrolu a je vhodná pro všechny konfigurace cyklu. Pro každou dávku testu HCV GT musí být použita jedna pozitivní a jedna negativní kontrola. Pro jeden cyklus testu cobas HCV GT je povolen maximální počet 30 vzorků a 2 kontroly. Postup testu je podrobně popsán v provozní příručce systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. Obrázek 1 uvádí souhrn postupu. Pozn.: Za účelem optimálního využití činidel lze generická činidla pro přípravu vzorků použít pro cyklus obsahující celkem 1-22 vzorků (velikost testovací soupravy 10 24) nebo celkem 1-30 vzorků (velikost testovací soupravy 10 96). Různé velikosti soupravy promývacího pufru pro systém cobas 4800, soupravy 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800 a lytické soupravy 2 pro systém cobas 4800 nelze kombinovat. Pokud je například na začátku cyklu nasnímána láhev s promývacím pufrem pro 96 testů, musí být použita také činidla z dalších dvou souprav o velikosti pro 96 testů. Pracovní postup Test cobas HCV GT se provádí s použitím úplného pracovního postupu v softwaru cobas 4800. Skládá se z přípravy vzorku na přístroji cobas x 480 a poté následuje amplifikace a detekce na analyzátoru cobas z 480. Cyklus může sloužit pouze pro test HCV GT nebo pro kombinované dávky s testy, které sdílejí stejný automatický proces extrakce a PCR profil amplifikace a detekce. Při kroku výběru testu software zobrazí testy kompatibilní pro zpracování při kombinací dávek spolu s testem cobas HCV GT. Podrobné informace viz provozní příručka systému cobas 4800. 1. Zapněte systém a proveďte jeho údržbu podle pokynů v příručce systému cobas 4800 pro cobas HCV v části Provádění údržby. 2. Nachystejte si všechna činidla a potřebný spotřební materiál. Všechna činidla kromě HCV GT MMX R2A, HCV GT MMX R2B, HCV GT MMX R2C a MMX R1 musí mít před nadávkováním do přístroje cobas x 480 okolní teplotu laboratoře. Činidla HCV MMX R2A, HCV GT MMX R2B, HCV GT MMX R2C a MMX R1 je možné vzít přímo z místa uchovávání o teplotě 2 8 C, protože se vytemperují na okolní teplotu laboratoře v přístroji cobas x 480 předtím, než budou použity v procesu. Pozn.: Veškerá činidla a zásobníky na činidla jsou označená čárovým kódem a jsou určena pro jedno použití. Software systému cobas 4800 sleduje použití činidel a zásobníků na činidla a vyřazuje již dříve použitá činidla nebo zásobníky na činidla. 3. Spusťte nový cyklus a definujte objednávku pro cyklus. Existují tři způsoby, jak vytvářet objednávku: Pomocí editoru vzorků před vložením stojanu na vzorky do přístroje cobas x 480 (tlačítko Editor se nachází na pravé straně hlavní nabídky). Objednávky je možné v případě potřeby uložit, upravit a znovu nahrát. Pomocí softwarového průvodce pro nový cyklus vložením vzorků do přístroje cobas x 480, jakmile je k tomu uživatel vyzván. Čárové kódy budou automaticky nasnímány a musí být definovány požadované výsledky pro každý vzorek. Pomocí systému LIS vašeho zdravotnického zařízení. Další podrobné informace viz provozní příručka systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. Při výběru požadovaných výsledků zatrhněte HCV GT. Doc. Rev. 1.0 15

4. Zaveďte vzorky a definujte/zvolte objednávku nebo použijte LIS dle potřeby. Minimální objem vzorku závisí na typu a velikosti zkumavky. Další podrobné informace viz provozní příručka systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. 5. Při vkládání spotřebního materiálu postupujte podle softwarového průvodce. Nedoplňujte jednotlivé špičky do částečně použitého stojanu na špičky, ani je nevytahujte, protože software sleduje počet zbývajících špiček. Pokud zde není dostatek špiček pro uskutečnění cyklu, software vydá varování pro uživatele. 6. Vložte činidla pro přípravu vzorků do zásobníků na činidla označených čárovým kódem. Zásobníky na činidla jsou k dispozici ve dvou velikostech: 200 ml a 50 ml. Při výběru správné velikosti zásobníku na činidla postupujte podle softwarového průvodce. Čárové kódy zásobníků na činidla musí směřovat na pravou stranu nosiče. Pro činidla pro přípravu vzorků použijte metodu naskenovat-naskenovat-nalítumístit : Naskenujte čárový kód lahvičky s činidlem. Naskenujte čárový kód zásobníku na činidla. Nalijte činidlo do zásobníku na činidla. Vložte naplněný zásobník na činidla na určenou pozici do nosiče činidel. Pozn.: Systém cobas 4800 je vybaven vnitřními hodinami, které monitorují čas, po který jsou činidla umístěná v přístroji. Jakmile jsou LYS 2 nebo WB naskenovány, zbývá 1 hodina na nadávkování vzorků a kliknutí na tlačítko Start. Na záložce Workplace se zobrazí ubíhající čas. Jestliže vyprší čas, po který mohou být činidla umístěná v přístroji, systém nedovolí spuštění cyklu. Pozn.: Aby přenos MGP proběhl správně, bezprostředně před dávkováním do zásobníku na činidla lahvičku s MGP protřepejte na třepačce nebo s ní silně zatřepejte. 7. Vložte lahvičky s amplifikačními/detekčními činidly (HCV GT MMX R2A, HCV GT MMX R2B, HCV GT MMX R2C a MMX R1) a lahvičky s kontrolami [HCV GT(+)C, a ( )C] přímo do nosiče činidel. Aby se zabránilo kontaminaci, musí si obsluha po manipulaci s pozitivními kontrolami vyměnit rukavice. 8. Po úspěšném cyklu přípravy vzorků budou k dispozici tlačítka Sample Preparation results a Unload. Pokud si přejete, zkontrolujte výsledky stisknutím tlačítka Sample Preparation results a pak vyjměte nosiče destiček stisknutím tlačítka Unload. Tlačítkem Unload můžete též vyjmout nosiče destiček bez prohlížení výsledků. Viz provozní příručka systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. 9. Postupujte podle pokynů v příslušné provozní příručce systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT a zalepte mikrotitrační destičku, přeneste destičku do analyzátoru cobas z 480 a spusťte cyklus amplifikace a detekce. Pozn.: Systém cobas 4800 má vnitřní hodiny, které monitorují čas po přidání připravených vzorků do aktivní směsi Master Mix. Amplifikaci a detekci je nutné spustit co nejdříve, ale ne později než 40 minut po dokončení cyklu přístroje cobas x 480. Na záložce Workplace se zobrazí ubíhající čas. Jestliže vyprší čas, systém přeruší cyklus. 10. Po dokončení cyklu amplifikace a detekce vyjměte mikrotitrační destičku z analyzátoru cobas z 480. 11. Chcete-li prohlédnout a přijmout výsledky, řiďte se pokyny v provozní příručce systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. Doc. Rev. 1.0 16

Výsledky Systém cobas 4800 u vzorků automaticky zjistí genotyp HCV a subtypy 1a a 1b. Kontrola kvality a platnost výsledků S každou dávkou je zpracována jedna negativní ( ) C a jedna pozitivní kontrola HCV GT(+). Zkontrolujte platnost dávky v softwaru cobas 4800 anebo v příslušné zprávě. Software cobas 4800 označuje neplatnost výsledků automaticky na základě selhání negativních a pozitivních kontrol. Kontrolní značky Tabulka 1: Kontrolní značky u negativních a pozitivních kontrol Negativní kontrola Identifikace značky Výsledek Interpretace ( ) C R21 Invalid Negativní kontrola je neplatná. Pozitivní kontrola Identifikace značky Výsledek Interpretace HCV GT (+)C R20 Invalid Pozitivní kontrola je neplatná. Pokud je dávka neplatná, opakujte testování celé dávky včetně vzorků a kontrol. Vyhodnocení výsledků Pozn.: Veškerou validaci testů a cyklů provádí software cobas 4800. Pozn.: Platná dávka může zahrnovat jak platné tak i neplatné výsledky vzorků. Interpretace výsledků vzorků platné dávky viz Tabulka 2. Tabulka 2: Výsledky a jejich interpretace Invalid cobas HCV GT Indeterminate Výsledkový protokol a interpretace Jedna, dvě nebo všechny tři reakce jsou neplatné. Celková kontrola HCV není detekována v jedné, dvou nebo všech třech reakcích. Celková kontrola HCV je detekována ve všech třech reakcích, ale nebyl identifikován žádný genotyp ani podtyp. 1; 1a; 1b; 2; 3; 4; 5 nebo 6 Identifikované genotypy jsou uvedeny v alfanumerickém pořadí rozdělené středníky. Doc. Rev. 1.0 17

Procedurální omezení 1. Test cobas HCV GT byl vyhodnocen pouze pro použití v kombinaci s kontrolní soupravou pro test cobas HCV GT, soupravou 2 pro přípravu vzorků pro systém cobas 4800, lytickou soupravou 2 pro systém cobas 4800 a soupravou promývacího pufru pro systém cobas 4800. 2. K získání spolehlivých výsledků je třeba dodržovat příslušné postupy odběru, transportu, uchovávání a zpracování vzorků. Řiďte se postupy v tomto návodu k použití (také je označován jako příbalová informace) a příslušné příručce systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. 3. Tento test je validován pouze pro vyšetřování EDTA plazmy a séra. Testování jiných typů vzorků může vést k nepřesným výsledkům. 4. Identifikace genotypů HCV závisí na přítomnosti virových částic ve vzorku, na což mají vliv metody odběru vzorku, faktory pacienta (tj. věk, příznaky) anebo stádium infekce. 5. I když se vyskytují vzácně, mutace ve vazebných místech primerů a sond testu cobas HCV GT mohou ovlivnit vázání primerů anebo sond, a tak vést k selhání identifikace genotypu vzorku. 6. Přidání enzymu AmpErase k činidlu cobas HCV GT Master Mix umožňuje selektivní amplifikaci cílové nukleové kyseliny. Aby se však předešlo kontaminaci činidel a amplifikačních směsí, je třeba uplatňovat zásady správné laboratorní praxe a důsledně dodržovat postupy uvedené v tomto návodu k použití. 7. Tento produkt smí používat pouze personál vyškolený v technikách PCR a v používání systému cobas 4800. 8. Pouze přístroj cobas x 480 a analyzátor cobas z 480 byl validován pro použití s tímto produktem. S tímto produktem se nesmí používat žádný jiný přístroj na přípravu vzorků nebo jiný systém PCR. 9. Vzhledem k rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před přechodem od jedné technologie k druhé provedli ve své laboratoři studie pro stanovení rozdílů mezi těmito technologiemi. Uživatelé by měli dodržovat své vlastní zásady/postupy. 10. Křížová kontaminace může způsobit falešně pozitivní výsledky. V neklinické studii byla zjištěna míra křížové kontaminace mezi vzorky v testu cobas HCV GT o hodnotě 0,0 %. Křížová kontaminace mezi cykly nebyla pozorována. 11. Test cobas HCV GT není určen k plošnému screeningovému vyšetřování krve či krevních derivátů na přítomnost HCV, ani jako diagnostický test k potvrzení infekce virem HCV. 12. Identifikace genotypu 6 testem cobas HCV GT je omezena na podtypy 6a a 6b. Doc. Rev. 1.0 18

Hodnocení neklinických funkčních parametrů Klíčové funkční charakteristiky Přesnost Přesnost testu cobas HCV GT byla vyhodnocena testováním 379 HCV pozitivních vzorků a srovnáním výsledků s genotypy určenými sekvenováním nukleové kyseliny (Tabulka 3). Studie byla provedena se dvěma dávkami testu cobas HCV GT. Výsledky zjištění genotypu testem cobas HCV GT a sekvenováním nukleové kyseliny souhlasily u 352 ze 353 vzorků s výslednou celkovou genotypovou přesností 99,7 %. Přesnost testu cobas HCV GT pro identifikaci podtypů 1a a 1b genotypu 1 byla vyhodnocena na 99 vzorcích genotypu 1a a 50 vzorcích genotypu 1b (Tabulka 4). Celková přesnost pro identifikaci podtypů byla 100 % (148/148). Tabulka 3: Přesnost pro genotypy 1 až 6 Genotyp Výsledky Výsledky testu HCV určený se cobas HCV GT Procento správně 95% CI d sekvenováním Počet testů a smíšenými genotypy Výsledky Indeterminate b Výsledky Included c souhlasící se sekvenováním identifikovaných (přesnost) DM HM 1 e 151 0 2 149 149 100 (149/149) 97,6 100 a b c d e f g h 2 65 3 0 62 62 100 (62/62) 94,2 100 3 f 60 1 12 47 46 97,9 (46/47) 88,7 100 4 g 57 2 0 55 55 100 (55/55) 93,5 100 5 27 0 3 24 24 100 (24/24) 85,8 100 6 h 19 0 3 16 16 100 (16/16) 79,4 100 Souhrnně 379 6 20 353 352 99,7 (352/353) 98,4 100 Zahrnuje všechny vzorky s platnými výsledky testu cobas HCV GT. Test cobas HCV GT nahlásí výsledek Indeterminate, když je detekován HCV, ale není identifikován genotyp. Počet testů (Výsledky se smíšenými genotypy + výsledky Indeterminate ). 95% dvoustranný interval spolehlivosti. Zahrnuje 99 vzorků genotypu 1a, 50 vzorků genotypu 1b a 2 vzorky genotypu 1 určené sekvenováním nukleových kyselin. Jeden vzorek genotypu 3 měl v testu cobas HCV GT výsledek genotyp 1a. Zahrnuje 43 vzorků genotypu 4a, 9 vzorků genotypu 4 jiného podtypu než je a a 5 vzorků genotypu 4 neidentifikovaného podtypu. Zahrnuje 18 vzorků genotypu 6a a jeden vzorek genotypu 6b. Doc. Rev. 1.0 19

Tabulka 4: Přesnost pro podtypy 1a a 1b genotypu 1 Genotyp Výsledky Výsledky testu HCV určený se Výsledek genotyp cobas HCV GT Procento správně 95% CI d sekvenováním Počet testů a smíšenými podtypy 1 a výsledky Indeterminate b Výsledky Included c souhlasící se sekvenováním identifikovaných (přesnost) DM HM 1a 99 0 0 99 99 100 (99/99) 96,3 100 a b c d e 1b e 50 0 1 49 49 100 (49/49) 92,8 100 Souhrnně 149 0 1 148 148 100 (148/148) 97,5 100 Zahrnuje všechny vzorky genotypu 1a a 1b s platnými výsledky testu cobas HCV GT. Test cobas HCV GT nahlásí výsledek Indeterminate, když je detekován HCV, ale není identifikován genotyp. Pro výpočet přesnosti určování podtypů byly výsledky gt 1 bez identifikace genotypu 1a nebo genotypu 1b pokládány za Indeterminate. Počet testů (Výsledky se smíšenými genotypy + výsledky Indeterminate ). 95% dvoustranný interval spolehlivosti. U jednoho vzorku genotypu 1b byl výsledek testu cobas HCV GT gt 1 bez identifikace genotypu 1a nebo 1b. Mez detekce (Limit of Detection, LoD) Mez detekce testu cobas HCV GT byla zjištěna testováním HCV pozitivních vzorků zředěných HCVnegativním sérem nebo EDTA plazmou (Tabulka 5). Pro každý genotyp byl zředěn jeden vzorek HCV HCV-negativní EDTA plazmou nebo sérem na koncentrace 1000, 500, 250, 125, 50 a 25 IU/ml (pro genotyp 5 byly koncentrace 1000, 750, 500, 250, 125 a 50 IU/ml). Panely šesti hladin koncentrace plus negativní vzorek byly testovány při větším počtu cyklů v různých dnech s různou obsluhou a přístroji s použitím tří dávek testu cobas HCV GT, se 20 až 24 měřeními na dávku činidla a celkovým počtem 60 až 72 měření na vzorek. Nejnižší koncentrace, u kterých vyšel správný výsledek genotypu ve 95 % testů uvádí Tabulka 5. Doc. Rev. 1.0 20

Tabulka 5: Mez detekce* (IU/ml) testu cobas HCV GT Typ vzorku HCV genotyp 1a 1b 2 3 4 5 6 Plazma 125 250 125 125 125 1000 125 Sérum 125 125 50 125 125 500 125 * Nejnižší testované koncentrace se správnými výsledky genotypů v nejméně 95 % testů. Opakovatelnost Opakovatelnost testu cobas HCV GT byla zjištěna testováním zaslepeného randomizovaného panelu o 15 položkách se 2 replikáty na cyklus, 2 cykly denně, 5 dní pro každou dávku činidel s použitím 3 dávek činidel, jednoho přístroje a jednoho člena obsluhy, s celkovým počtem 60 testů na vzorek (Tabulka 6). Panel sestával ze dvou ředění jednoho klinického vzorku každého genotypu HCV-negativním lidským sérem nebo EDTA plazmou a ze vzorku HCV-negativního lidského séra nebo plazmy. Každý vzorek byl v panelu přítomen ve dvou koncentracích: Nízká (500 1000 IU/ml) a buď střední (10 000 20 000 IU/ml) nebo vysoká ( 100 000 IU/ml). Celková četnost správných výsledků testu cobas HCV GT byla 99,8 % (890/892). Tabulka 6: Opakovatelnost testu cobas HCV GT Genotyp Koncentrace (IU/ml) Typ vzorku Celkový počet výsledků a Počet správných výsledků Procento správných výsledků b 1a 910 Sérum 60 60 c 100 (60/60) 1a 330000 Plazma 60 60 100 (60/60) 1b 970 Sérum 58 58 100 (58/58) 1b 350000 Plazma 59 59 100 (59/59) 2 780 Sérum 59 59 100 (59/59) 2 13000 Plazma 60 60 100 (60/60) 3 570 Plazma 60 60 100 (60/60) 3 96000 Sérum 60 60 100 (60/60) 4 940 Sérum 59 59 100 (59/59) 4 180000 Plazma 59 59 100 (59/59) 5 1000 Sérum 59 57 d 96,6 (57/59) 5 16000 Plazma 60 60 100 (60/60) 6 800 Plazma 60 60 100 (60/60) 6 17000 Sérum 59 59 100 (59/59) HCV-negativní 0 Plazma 30 30 100 (30/30) HCV-negativní 0 Sérum 30 30 100 (30/30) Souhrnně 892 890 99,8 (890/892) a Osm z celkem 900 testů nevedlo k žádnému výsledku kvůli chybám způsobeným srážením. b Procento správných výsledků = Počet správných výsledků / Celkový počet výsledků. c 58 z 60 mělo výsledek 1; 1a, zatímco 2 testy měly výsledek 1a d Jeden test měl výsledek Indeterminate a jeden test měl výsledek 1; 5. Doc. Rev. 1.0 21

Infekce se smíšenými genotypy cobas HCV GT Identifikace infekcí se smíšenými genotypy byla vyhodnocena testováním všech možných kombinací dvou genotypů 1a, 1b, a 2 až 6 při třech různých poměrech koncentrací: 1:1 (1000:1000 IU/ml), 1:1 (1E+06:1E+06 IU/ml), 10:1 (1E+04:1E+03 IU/ml) a 100:1 (1E+05:1E+03 IU/ml). Každý vzorek byl testován trojnásobně. Test cobas HCV GT identifikoval oba genotypy ve 100 % (63/63) testů směsí 1:1 o koncentraci 1E+06 IU/ml a v 95,2 % (60/63) testů směsí 1:1 o koncentraci 1000 IU/ml (Tabulka 7). Test cobas HCV GT identifikoval menšinový genotyp v 85,7 % (108/126) testů směsí 10:1 a v 63,5 % (80/126) testů směsí 100:1. Test cobas HCV GT identifikoval většinový genotyp ve 100 % testů (252/252) směsí 10:1 a 100:1. Tabulka 7: Identifikace infekcí se smíšenými genotypy a b c d e Koncentrace a (IU/ml) Poměr koncentrací Počet testovaných kombinací Celkový počet testů Identifikace obou genotypů b 1 x 10 6 : 1 x 10 6 1:1 21 63 100 % (63/63) 1 x 10 3 : 1 x 10 3 1:1 21 63 95,2 % (60/63) c 1 x 10 4 : 1 x 10 3 10:1 42 126 85,7 % (108/126) d 1 x 10 5 : 1 x 10 3 100:1 42 126 63,5 % (80/126) e Směsi obsahující genotyp 5 v poměru 1:1 byly testovány při koncentraci 1 x 10 5 IU/ml. Ve směsích nestejných koncentrací (10:1 a100:1) byl většinový genotyp identifikován ve100 % (252/252) testů. Ve směsích 1:1 při koncentraci 1 x 10 3 IU/ml byl genotyp 3 identifikován v 83 % (15/18) testů. Všechny ostatní genotypy byly identifikovány ve 100 % testů. Ve směsích 10:1 byl genotyp 3 identifikován v 0/18 testů, když byl menšinovým genotypem. Všechny ostatní genotypy byly identifikovány ve 100 % testů, když byly menšinovými genotypy. Ve směsích 100:1 byly genotypy 1b, 2, 3 a 6 identifikovány v 83 % (15/18), 44 % (8/18), 0 % (0/18) a 17 % (3/18) testů v daném pořadí, když byly menšinovými genotypy. Genotypy 1a, 4 a 5 byly identifikovány ve 100 % testů, když byly menšinovými genotypy. Specificita Specificita testu cobas HCV GT byla zjištěna testováním 52 vzorků EDTA plazmy a 52 vzorků séra od 104 individuálních, normálních, HCV-negativních dárců s použitím dvou dávek testu cobas HCV GT. Test cobas HCV GT je určen k použití u osob s chronickou infekcí HCV. Test detekuje HCV bez ohledu na genotyp jako vnitřní kontrolu. Pokud není HCV detekován, test cobas HCV GT oznámí výsledek Invalid. Všechny 104 testy ve studii specificity měly výsledky Invalid, jak se u HCV-negativních vzorků očekávalo. Analytická specificita Analytická specificita testu cobas HCV GT byla vyhodnocena zředěním 27 patogenů (Tabulka 8) HCVnegativní EDTA plazmou a testováním vzorků s přídavkem HCV genotypu 1a do koncentrace přibližně 1500 IU/ml i bez přídavku. HCV genotyp 1a byl identifikován ve všech vzorcích s HCV a patogeny, což znamená, že patogeny nepůsobily interferenci. Výsledky Invalid (očekávaný výsledek u HCV-negativních vzorků) byly u testu cobas HCV GT obdrženy pro všechny vzorky patogenů bez HCV, což znamená, že nedochází ke zkřížené reakci patogenů s testem cobas HCV GT. Test cobas HCV GT detekuje HCV bez ohledu na genotyp jako vnitřní kontrolu. Pokud není HCV detekován, test cobas HCV GT oznámí výsledek Invalid. Doc. Rev. 1.0 22

Tabulka 8: Patogeny testované pro zkříženou reaktivitu Viry Baktérie Kvasinky Adenovirus typ 5 Herpesvirus simplex 1 a 2 Propionibacterium acnes Candida albicans Cytomegalovirus Lidský papillomavirus Staphylococcus aureus Virus Dengue typ 1, 2, 3 a 4 Virus chřipky A Virus Epstein-Barrové Virus klíšťové meningoencefalitidy (kmen HYPR) Virus encefalitidy Murray Valley Virus St. Louiské encefalitidy Virus hepatitidy A Virus Varicella zoster Virus hepatitidy B Virus Západního Nilu Virus lidského imunodeficitu-1 Virus žluté zimnice Lidský T-buněčný lymfotropní virus typ 1 a 2 Zika virus Lidský herpes virus typ 6 Analytická specificita interferenční látky Vzorky plazmy obsahující zvýšené hladiny triglyceridů (27,9-30,0 g/l), konjugovaný bilirubin (0,18-0,22 g/l), nekonjugovaný bilirubin (0,19-0,2 g/l), albumin (57,8-60,6 g/l), hemoglobin (1,8-2,3 g/l) a lidskou DNA (2 mg/l) byly podrobeny testu cobas HCV GT v přítomnosti i nepřítomnosti HCV genotypu 1a, přidaného do koncentrace přibližně 1500 IU/ml. HCV genotypu 1a byl identifikován ve všech vzorcích s HCV a výsledky Invalid (očekávaný výsledek pro HCV-negativní vzorky) byl obdrženy u všech vzorků bez HCV, což dokazuje, že tyto látky nezpůsobují interferenci s testem cobas HCV GT. Vzorky plazmy od HCV-negativních dárců s markery pro autoimunní choroby systémový lupus erythematodes (SLE), revmatoidní artritida (RA) a antinukleární protilátky (ANA) byly podrobeny testu cobas HCV GT v přítomnosti i nepřítomnosti genotypu HCV 1a přidaného do přibližné koncentrace 1500 IU/ml a neměly na fungování testu cobas HCV GT žádný vliv. Vzorky plazmy obsahující léčiva, které uvádí Tabulka 9, a to v koncentracích trojnásobně překračujících Cmax, byly podrobeny testu cobas HCV GT v přítomnosti i nepřítomnosti genotypu HCV 1a přidaného do přibližné koncentrace 1500 IU/ml. HCV genotypu 1a byl detekován ve všech vzorcích s HCV a výsledky Invalid (očekávaný výsledek pro HCV-negativní vzorky) byl obdrženy u všech vzorků bez HCV, což dokazuje, že tyto látky nezpůsobují interferenci s testem cobas HCV GT. Doc. Rev. 1.0 23

Tabulka 9: Látky léčiv testované na interferenci s identifikací genotypu pomocí testu cobas HCV GT Třída léčiva Generický název léčiva Imunomodulátory Peginterferon a-2a Ribavirin Inhibitory vstupu HIV Peginterferon a-2b Maraviroc Inhibitory HIV integrázy Elvitegravir/Cobicistat Raltegravir Nenukleozidové inhibitory HIV reverzní transkriptázy Efavirenz Etravirin Nevirapin Rilpivirin Inhibitory HIV proteázy Atazanavir Nelfinavir Darunavir Fosamprenavir Lopinavir Ritonavir Saquinavir Tipranavir HCV proteáza Boceprevir Telaprevir Inhibitory reverzní transkriptázy nebo DNA polymerázy Simeprevir Abacavir Acyklovir Adefovir dipivoxil Gancyklovir Lamivudin Sofosbuvir Látky pro léčbu oportunních infekcí Cidofovir Emtricitabin Entekavir Foscarnet Azitromycin Klaritromycin Ethambutol Fluconazole Isoniazid Telbivudin Tenofovir Valgancyklovir Zidovudin Pyrazinamid Rifabutin Rifampicin Sulfamethoxazol Trimethoprim Korelace metody Vyhodnocení funkce testu cobas HCV GT ve srovnání s diagnostickým produktem in vitro označeným značkou CE Fungování testu cobas HCV GT a produktu pro diagnostickou genotypizaci HCV in vitro označeného značkou CE byly srovnány z hlediska identifikace HCV genotypů 1 až 6 testováním 379 HCV-pozitivních vzorků oběma metodami (Tabulka 10). Platné výsledky s jedním genotypem byly obdrženy oběma metodami u 334 ze 379 vzorků ve studii. U dvou vzorků nebyly obdrženy výsledky kvůli systémovým chybám a 43 vzorky měly neurčité výsledky nebo smíšené genotypy zaznamenané jednou nebo oběma metodami. Mezi testem cobas HCV GT a srovnávacím produktem bylo při identifikaci HCV genotypů 1 až 6 procentní shoda 99,7 % (333/334). Shoda mezi srovnávacím produktem a testem cobas HCV GT při identifikaci podtypů 1a a 1b genotypu 1 byla zjištěna z výsledků sekvenování nukleových kyselin 99 vzorků genotypu 1a a 50 vzorků genotypu 1b. Platné výsledky identifikující podtyp byly obdrženy oběma metodami u 143 ze 149 vzorků. Jeden vzorek genotypu 1a a 4 vzorky genotypu 1b (určené sekvenováním nukleových kyselin) vedly u srovnávacího produktu k výsledku genotyp 1, aniž by byl identifikován podtyp 1a nebo 1b. Jeden vzorek genotypu 1b (určený sekvenováním nukleových kyselin) měl u srovnávacího produktu neurčitý výsledek a jeden vzorek genotypu 1b měl u testu cobas HCV GT výsledek genotyp 1. Mezi testem cobas HCV GT a srovnávacím produktem byla při identifikaci HCV podtypů 1a a 1b procentní shoda 100,0 % (142/142). Doc. Rev. 1.0 24

Tabulka 10: Srovnání metody testu cobas HCV GT s diagnostickým prostředkem in vitro označeným značkou CE při identifikaci HCV genotypů 1 až 6 Výsledný genotyp zjištěný srovnávacím produktem a b c Počet výsledků a Výsledky testu cobas HCV GT v souladu se srovnávacím produktem Procentní shoda DM 95% CI b 1 150 c 149 c 99,3 (149/150) 96,3 100 2 52 52 100,0 (52/52) 93,2 100 3 44 44 100,0 (44/44) 92,0 100 4 50 50 100,0 (50/50) 92,9 100 5 24 24 100,0 (24/24) 85,8 100 6 14 14 100,0 (14/14) 76,8 100 Souhrnně 334 333 99,7 (333/334) 98,3 100 Zahrnuje všechny vzorky, které měly platné výsledky jednoho genotypu jak u srovnávacího produktu, tak u testu cobas HCV GT. Vzorky, jejichž výsledky u jedné nebo obou metod byly selhání, Indeterminate nebo smíšený genotyp, byly vyloučeny. 95% dvoustranný interval spolehlivosti. Jeden vzorek, který měl u srovnávacího produktu výsledek genotyp 1, měl podle testu cobas HCV GT a sekvenování nukleových kyselin genotyp 6. Jeden vzorek, který měl u srovnávacího produktu i testu cobas HCV GT výsledek genotyp 1, měl podle sekvenování nukleových kyselin genotyp 3. HM Tabulka 11: Srovnání metody testu cobas HCV GT s diagnostickým prostředkem in vitro označeným značkou CE při identifikaci podtypů 1a a 1b genotypu 1 Výsledný genotyp zjištěný srovnávacím produktem a b Počet výsledků a Výsledky testu cobas HCV GT v souladu se srovnávacím produktem Procentní shoda 95% CI b 1a 98 98 100,0 (98/98) 96,3 100 1b 44 44 100,0 (44/44) 92,0 100 Souhrnně 142 142 100,0 (142/142) 97,5 100 Zahrnuje všechny vzorky genotypů 1a a 1b určených sekvenováním nukleových kyselin, které měly platné výsledky jak u srovnávacího produktu, tak u testu cobas HCV GT. Vzorky, jejichž výsledky u jedné nebo obou metod byly selhání, Indeterminate nebo smíšený genotyp, byly vyloučeny. 95% dvoustranný interval spolehlivosti. Selhání celého systému Míra selhání celého systému, vedoucí k falešně negativním výsledkům testu cobas HCV GT, byla zjištěna testováním celkem 200 replikátů EDTA plazmy a séra s genotypem HCV 1a přidaným do koncentrace 375 IU/ml, což je přibližně 3násobek meze detekce genotypu 1a. Test cobas HCV GT správně identifikoval genotyp 1a ve všech 200 vzorcích, což znamená míru selhání celého systému 0,0 % (horní mez 1stranného 95% intervalu spolehlivosti 1,49 %). Zkřížená kontaminace Míra zkřížené kontaminace u testu cobas HCV GT byla zjištěna provedením osmi dávek testu cobas HCV GT, přičemž každá z nich obsahovala 15 replikátů EDTA plazmy s kontrolní HCV-pozitivní armored RNA v koncentraci odpovídající 1,0E+08 IU/ml, a 15 replikátů HCV-negativní EDTA plazmy. Vzorky byly nadávkovány do stojanů na vzorky v polohách, které vytvořily na extrakční destičce přístroje cobas x 480 šachovnicový vzor. Všech 120 replikátů HCV-negativní EDTA plazmy mělo výsledky Invalid, očekávané u HCV-negativních vzorků, a tedy míru zkřížené kontaminace 0,0 % (horní mez 1stranného 95% intervalu spolehlivosti 2,47 %). Doc. Rev. 1.0 25 DM HM

Doplňující informace Hlavní parametry testu Typ vzorku Požadované minimální množství vzorku Objem pro zpracování vzorku 400 µl EDTA plazma, sérum Viz provozní příručka systému cobas 4800 pro test cobas HCV GT. Identifikované genotypy a podtypy HCV genotypy 1 6 a podtypy a a b genotypu 1. Přesnost Pro identifikaci HCV genotypů 1 až 6: 99,7 % Pro identifikaci podtypů 1a a 1b HCV genotypu 1: 100 % Analytická citlivost Sérum: 50 až125 IU/ml (genotypy 1a, 1b, 2, 3, 4 a 6), 500 IU/ml (genotyp 5) Plazma: 125 až 250 IU/ml (genotypy 1a, 1b, 2, 3, 4 a 6), 1000 IU/ml (genotyp 5) Doc. Rev. 1.0 26

Symboly V označování diagnostických produktů společnosti Roche PCR se používají následující symboly. Tabulka 12: Symboly použité při označování diagnostických produktů PCR společnosti Roche Pomocný software Diagnostický zdravotnický prostředek in vitro Zplnomocněný zástupce pro evropské společenství Dolní mez přiřazeného rozmezí Datový list s čárovými kódy Výrobce Číslo šarže Uchovávejte v temnu Biologická rizika Obsah vystačí pro <n> testů Katalogové číslo Omezení teploty Čtěte návod k použití Definiční soubor testu Obsah soupravy Horní mez přiřazeného rozmezí Distribuce Použitelné do Pouze pro vyhodnocení účinnosti IVD Globální číslo obchodní položky Tento výrobek odpovídá požadavkům Evropské směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro. Technická podpora pro zákazníky v USA 1-800-526-1247 Doc. Rev. 1.0 27

Výrobce a distributoři Tabulka 13: Výrobce a distributoři Vyrobeno ve Spojených státech Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Strasse 116 appeler le: 1-877-273-3433) 68305 Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, 171-173 38240 Meylan, France E-08174 Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, 1729 20052 Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building 10 05321-010 São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, 249-1 2720-413 Amadora, Portugal Obchodní značky a patenty Viz http://www.roche-diagnostics.us/patents Autorská práva (Copyright) 2015 Roche Molecular Systems, Inc. Doc. Rev. 1.0 28