Výzkumný ústav pícninářský, spol. s r.o. Troubsko Zemědělský výzkum, spol. s r.o. Troubsko Odbor rostlinolékařství ČAZV Pícninářská komise ORV ČAZV Agrární komora ČR AKTUÁLNÍ POZNATKY V PĚSTOVÁNÍ, ŠLECHTĚNÍ, OCHRANĚ ROSTLIN A ZPRACOVÁNÍ PRODUKTŮ Úroda 12/2014, vědecká příloha časopisu
Výzkumný ústav pícninářský, spol. s r.o. Troubsko Zemědělský výzkum, spol. s r.o. Troubsko Odbor rostlinolékařství ČAZV Pícninářská komise Odboru rostlinné výroby ČAZV Agrární komora ČR Aktuální poznatky v pěstování, šlechtění, ochraně rostlin a zpracování produktů Úroda 12/2014, vědecká příloha časopisu Editor: Ing. Barbora Badalíková Ing. Jaroslava Bartlová, Ph.D. Organizační výbor: Ing. Barbora Badalíková - předseda Ing. Jaroslava Bartlová, Ph.D. Ing. Pavel Kolařík Ing. Jaroslav Lang Ing. Karel Vejražka, Ph.D Mgr. Tomáš Vymyslický Vědecký výbor: RNDr. Jan Nedělník, Ph.D. - předseda Ing. Barbora Badalíková doc. Ing. Bohumír Cagaš, CSc. Ing. Jaroslav Čepl, CSc. RNDr. Jan Hofbauer, CSc. Ing. Miroslav Hochman Ing. Pavel Kolařík Ing. Slavoj Palík, CSc. Ing. Jan Pelikán, CSc Ing. Karel Vejražka, Ph.D. Mgr. Tomáš Vymyslický Příspěvky byly recenzovány členy vědeckého výboru Doporučná citace příspěvků: Autoři příspěvků: Název příspěvku. Úroda 12, 2014, vědecká příloha, s. od do ISSN 0139-6013
REGENERACE CELISTVÝCH ROSTLIN MÁKU SETÉHO (PAPAVER SOMNIFERUM L.) V IN VITRO KULTURÁCH Plant regeneration in in vitro cultures of opium poppy (Papaver somniferum L.) Klíma M., Hilgert A., Urban M. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i., Praha - Ruzyně Abstrakt Byla stanovena regenerace prýtů a kořenového systému v in vitro kulturách u tří genotypů máku setého na třech typech médií. Efekt genotypu i kultivačního média byl dle analýzy rozptylu významný u obou sledovaných charakteristik, interakce médium genotyp ovšem nikoliv. Nejvyšší průměrné regenerace prýtů, resp. kořenů bylo dosaženo na médiu A1, resp. A2; nejúspěšnějším genotypem byl ozimý mák 24/6, u kterého v nejlepším opakování na médiu A1 bylo dosaženo regenerace alespoň jednoho prýtu u 60 % kalusů. Naopak tvorba prýtů nebyla zaznamenána na médiu C1 u genotypů OPP10 a OPP13. Ačkoliv byla vyhodnocena optimální kombinace médium genotyp, stanovení bylo komplikováno poměrně velkými rozdíly mezi biologickými opakováními, které lze přičíst zejména heterogenitě výchozího biologického materiálu (kalusů). Klíčová slova: mák setý, in vitro regenerace, růstové regulátory Abstract Shoot and root regeneration was evaluated in in vitro cultures of the three genotypes of opium poppy on three types of cultivation media. According to analysis of variance the effects of genotype and culture medium were significant in both mentioned parameters, unlike the medium genotype interactions. The highest average regeneration of shoots and roots was achieved on medium A1, and respectively on A2; winter poppy accession 24/6 was considered as the most successful genotype, in which 60 % of calli regenerated at least one shoot on media A1. In contrast, the formation of shoots was not observed on medium C1 for OPP10 and OPP13 genotypes. Although the optimal medium genotype combination was identified, the determination was complicated by the relatively large differences between biological replications, mainly attributable to heterogeneity of biological material (calli). Key words: opium poppy, in vitro regeneration, growth regulators Úvod Mák setý (Papaver somniferum) je po řepce naší nejdůležitější olejninou. Při tvorbě nových materiálů s požadovanými vlastnostmi se výzkum stejně jako u ostatních významných plodin zaměřuje na zavádění biotechnologických postupů do šlechtění. U máku byly doposud publikovány např. experimenty se somatickou embryogenezí v tkáňových kulturách z buněk kalusů (Nabha et al. 1999), regenerace z izolovaných vajíček (Maheswari 1957) a tvorba dihaploidních regenerantů, získaných z nezralých pylových zrn v prašníkových kulturách (Dieu a Dunwell 1988). Kritickou fází in vitro kultivace u rodu Papaver je regenerace rostlin s dobře vyvinutým kořenovým systémem z nediferencovaných pletiv, vytvořených v rámci výše zmíněných kultur. Za tímto účelem se testují různé typy médií, růstových regulátorů a jejich kombinací. U P. somniferum bylo dle literárních údajů nejlepší regenerace prýtů, resp. kořenů dosaženo na MS médiu s Kinetinem a BAP, resp. MS médiu bez fytohormonů (Dieu a Dunwell 1988), na MS médiu s 2-iP a IAA, resp. ½ MS médiu s IAA (Khanna et al. 2005), u P. orientale na MS médiu s BA a NAA, resp. B5 médiu s Kinetinem a NAA (Zakaria et al. 2011). Cílem práce bylo stanovit regeneraci rostlin máku setého na různých typech kultivačních médií z kalusových pletiv, odvozených v prašníkových kulturách tří vybraných genotypů. 199
Materiál a metody Jako výchozí materiál bylo vybráno neorganizované pletivo (kalus) genotypu máku setého ozimého a dvou genotypů jarního typu (24/6, OPP10 a OPP13, vše liniové šlechtitelské materiály, poskytnuté firmou OSEVA PRO s.r.o.), s vyhovující regenerací v prašníkových kulturách, ověřenou v předchozích experimentech. Na základě literárních údajů pro rod Papaver byly pro testování regenerační schopnosti vybrány tři varianty agarem solidifikovaných médií a růstových regulátorů: A (Dieu a Dunwell 1988): MS médium s 20 g/l sacharózy, 8 g/l agaru, 0,5 mg/l Kinetin a 0,1 mg/l BAP, pro regeneraci prýtů (A1) a MS médium s 10 g/l sacharózy a 10 g/l agaru pro regeneraci kořenového systému (A2); B (Khanna et al. 2005): MS médium s 20 g/l sacharózy, 8 g/l agaru, 0,5 mg/l 2-iP a 0,1 mg/l NAA (B1), resp. MS médium s polovičním množstvím solí, 30 g/l sacharózy, 10 g/l agaru a 1 mg/l IAA (B2); C (Zakaria et al. 2011): MS médium (20 g/l sacharózy, 8 g/l agaru) s 0,5 mg/l Kinetin a 1 mg/l NAA (C1), resp. B5 médium (20 g/l sacharózy, 8 g/l agaru) s 1 mg/l Kinetin a NAA (C2). Rozpadavý kalus výše zmíněných genotypů byl opatrně rozdělen pinzetami na segmenty o průměru 8±2 mm. Kultivace probíhala na médiích A1, B1 a C1 v termostatu ve tmě a 25 C do objevení prvních prýtů, kdy byly kultury přeneseny na světlo do kultivační komory (fotoperioda den/noc 16/8 h, intenzita 200 μmol/m 2 /s, teplota 25 C). Po zezelenání prvních prýtů byla příslušné kultury přeneseny do kultivační komory s kratší délkou dne (9/15 hod.), nižší teplotou a intenzitou osvětlení (18 ±2 C, resp. 120 μmol/m 2 /s), aby byl u listových růžic oddálen nástup prodlužovacího růstu. Ve fázi 3-5 listů byly prýty nebo skupiny prýtů odříznuty ostrým skalpelem od mateřského explantátu a pasážovány na média A2, B2 a C2 a dále kultivovány za stejných podmínek do objevení prvních kořenů. Od každé varianty bylo testováno po 20-ti segmentech kalusů, resp. prýtů ve třech biologických opakováních. Pro každé biologické opakování byla založena nová prašníková kultura. Pro stanovení regenerace kořenů byla na základě výsledků regenerace prýtů vybrána kombinace genotyp médium s nejlepší regenerační schopností a z ní založeny ve třech biologických opakováních prašníkové kultury v rozsahu, zajišťujícím regeneraci alespoň 60-ti prýtů z každého opakování. Repasáže na čerstvá média probíhaly ve 30-ti denních intervalech. Vyhodnocení regenerace prýtů probíhalo 3 měsíce od prvního pasážování segmentů kalusů, regenerace kořenového systému do 5-ti měsíců od prvního pasážování prýtů. Srovnání jednotlivých variant kultivace bylo provedeno analýzou rozptylu v programu Statistica 12.0. Výsledky a diskuse Vliv genotypu i kultivačního média na regeneraci prýtů byl dle analýzy rozptylu významný (P < 0.05), interakce médium genotyp nikoliv. Významný byl i vliv média na regeneraci kořenového systému (P < 0.05). Nejvyšší průměrné regenerace prýtů z kalusů bylo dosaženo na médiu A1 (29 % kalusů regenerovalo alespoň jeden prýt); nejúspěšnějším genotypem byl ozimý mák 24/6, u kterého v nejlepším opakování na médiu A1 regenerovalo 60 % kalusů. U tohoto média byla zároveň charakteristická tvorba vícenásobných prýtů, a to u všech genotypů (průměr 5,2 prýtu/kalus), viz obr. 2A. Obdobných výsledků dosáhli i Dieu a Dunwell (1988) u jiných genotypů. Pouze malé množství kalusů regenerovalo po jednom prýtu (obr. 2B). Na ostatních médiích byla frekvence regenerace vícenásobných prýtů nižší (1,8). Naopak tvorba prýtů nebyla zaznamenána na médiu C1 u genotypů OPP10 a OPP13 (podrobněji viz obr. 1A). Tvorba mnohonásobných prýtů mohla být stimulována vyšší koncentrací a typem použitých cytokininů a/nebo absencí auxinů v médiu. Naopak nižší koncentrace cytokininu a přítomnost auxinu v médiu mohla být příčinou nižší regenerace prýtů a/nebo frekvence mnohonásobných prýtů u ostatních médií. 200
Regenerace kořenového systému genotypu 24/6 byla zjištěna na všech testovaných médiích (obr. 1B). Nejvyšší frekvence tvorby kořenů bylo dosaženo na médiu A2 (82 %), následovaná Obr. 1: Regenerace prýtů z kalusů (A) a kořenového systému (B) u třech, resp. jednoho genotypu máku setého Chybové úsečky = ± standardní chyba (± SE); Homogenní podskupiny dle Tukey HSD testu (α = 0,05). Varianty se stejným společným písmenem se od sebe s 95% pravděpodobností významně neliší. Sloupce a chybové úsečky odpovídají skutečným hodnotám, homogenní podskupiny jsou vypočteny z údajů, upravených angulární transformací, aby bylo dosaženo normálního rozdělení dat. Obr. 2: Regenerace mnohonásobných prýtů z kalusu genotypu 24/6 na médiu A1 (A); Prýt genotypu OPP13 na médiu B1 (B); Repasážované prýty genotypu 24/6 na zakořeňovacím médiu B2 (C); Regenerace kořenového systému genotyp OPP10 na médiu A2 201
médii B2 (62 %) a C2 (5 %). Z výsledků vyplývá, že uspokojivé regenerace kořenů u sledovaného genotypu může být dosaženo i na médiu bez růstových regulátorů (obr. 2D). Dobrých výsledků bylo dosaženo i na médiu B2 s auxinem (IAA, 1 mg/l) a s polovičním množstvím živných solí. Naopak nedostatečná regenerace kořenů byla pozorována na médiu C2, což mohlo být způsobeno přítomností cytokininů v médiu a/nebo odlišným složením základního média (B5), ve srovnání s médii A2 a B2 (MS). Ačkoliv byla z hlediska regenerace prýtů vyhodnocena optimální kombinace médium genotyp, stanovení bylo komplikováno poměrně velkými rozdíly mezi biologickými opakováními, které byly pravděpodobně zapříčiněny heterogenitou výchozího biologického materiálu (kalusů). Závěr Ačkoliv byl pro stanovení vlivu genotypu a média na regeneraci prýtů a kořenů máku setého použit omezený počet variant výchozích materiálů a kultivačních parametrů, lze konstatovat, že jak genotyp, tak složení média měly významný vliv na výše uvedené parametry. Pokud se potvrdí pozitivní vliv médií A1 a A2 na regeneraci i u širšího spektra genotypů, bude možné toto médium zařadit pro rutinní in vitro regeneraci celistvých rostlin máku setého ve šlechtitelských programech. Dedikace Práce vznikla za podpory projektu TAČR TA01010375. Použitá literatura Khanna R., Mathur A.K., Mehrotra N.K. (2005): Selection of 3-fluorotyrosine tolerant callus lines in two cultivars of opium poppy (Papaver somniferum L.) and regeneration of plants through somatic embryogenesis. Current Science 88: 274-280. Zakaria R.A., Hour M.H. Zare N (2011): Callus production & regeneration of the medicinal plant Papaver orientale. Afri J Biotechnol 10: 11152-11156. Nabha S., Lamblin F., Gillet F., Laurain. D, Fliniaux M., David A., Jacquin A. (1999): Polyamine content and somatic embryogenesis in Papaver somniferum cells transformed with sam-1 gene. J Plant Physiol 154: 729-734. Maheshwari N. (1957): In vitro Culture of Excised Ovules of Papaver somniferum. Science 127: 342. Dieu P., Dunwell J.M. (1988): Anther culture with different genotypes of opium poppy (Papaver somniferum L.): Effect of cold treatment. Plant Cell Tissue And Organ Culture 12: 263-272. Kontaktní adresa: Ing. Miroslav Klíma, Ph.D., Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507/73 161 06 Praha 6-Ruzyně e-mail: klima@vurv.cz 202