Hmotnostní spektrometrie - Mass Spectrometry (MS)

Hmotnostní spektrometrie - Mass Spectrometry (MS) Další pojem: Hmotnostně spektrometrický (selektivní) detektor - Mass spectrometric (selective) detector (MSD) Spektrometrie - metoda založená na interakci hmoty a záření Hmotnostní spektrometrie - metoda založená na tvorbě iontů a následné interakci iontů a elektrických/magnetických polí Jan Poustka - ISM 2007 VŠCHT PRAHA

Princip MS a výstup měření 1. Tvorba iontů (ionizace) 2. Filtrace iontů (hmotnostní analýza) 3. Měření četnosti iontů v závislosti na hodnotě m / z m - relativní molekulová hmotnost vzniklého iontu z - počet nábojů vzniklého iontu (1, 2, 3, 4, 5, 6...) 4. Hmotnostní spektrum * osa x přísluší hodnotě m / z * osa y přísluší četnosti iontů (intenzitě signálu)

Formát hmotnostního spektra Grafický (profilové X čárové) Tabulkový m / z Intenzita Relativní intenzita (%) 57 560 3,72 58 800 5,31 59 550 3,65 125 2532 16,81 126 2935 19,48 127 2580 17,13 128 2100 13,94 134 5785 38,40 135 15065 100,00 136 6256 41,53 137 10258 68,09 138 4618 30,65

Aplikace hmotnostní spektrometrie Identifikace sloučenin Sumární vzorec téměř absolutně při dostatečně vysokém rozlišení Identifikace struktury v závislosti na typu ionizace (možnost fragmentace) Identifikace porovnáním spekter - identifikace sloučeniny na základě tvorby a poměru četností iontů o určitých hodnotách m/z (knihovny) Kvantifikace sloučenin Univerzální - citlivost se liší podle schopnosti sloučenin poskytovat za daných podmínek ionty

Historický vývoj MS - souhrn 100 let od katodové trubice k modernímu spektrometru 2000 GC-MS *1956 LC-MS(ESI) *1984 TOF-MS 1900 1899-1920 *1946 Vývoj záznamu spekter

Vznik a typy iontů * vznikají různými mechanismy - typ mechanismu zásadně ovlivňuje výsledné spektrum * z hlediska polarity vznikají ionty nabité kladně nebo záporně (vždy jeden typ) - rozlišujeme POZITIVNÍ a NEGATIVNÍ ionizaci * z hlediska velikosti a původní struktury vznikají ionty: a) molekulové: [M] + nebo [M] - b) pseudomolekulové a aduktové: [M+H] +, [M-H] -, [M+CH 4 ] + ap. c) fragmentové: např. [M-CH 3 ] +

Ionizace v plynné fázi (a) (za sníženého tlaku) Elektronová ionizace (Electron Ionization - EI) * ztráta elektronu po nárazu elektronů (Electron Impact) nebo jinak po uvolnění valenčního elektronu - vznikají ionty: M + e (70eV) M +. + 2e * standardní EI spektra (knihovna) - ionizační energie 70 ev (1 ev = 96,487 kj/mol = 23,06 kcal/mol) * "tvrdá" ionizace a) spektrum bohaté na fragmentové ionty b) molekulové ionty v některých případech nejsou stabilní (chybí ve spektru) * lze využít pro určení sumárního vzorce, strukturní analýzu a kvantifikaci * aplikace: velmi rozšířená (standardní) v GC-MS, sonda, moving belt, particle beam

Ionizace v plynné fázi (a) (za sníženého tlaku)

Ionizace v plynné fázi (b) (za sníženého tlaku) Ionizace polem (Field Ionization - FI) * ztráta elektronu po průchodu vysokonapěťovým elektrickým polem ( 5 kv) - vznikají ionty * měkká" ionizace ve spektru se vyskytují molekulové a sekundárně vzniklé aduktové ionty ([M+Na] + apod.) * lze využít pro určení sumárního vzorce, kvantifikaci * aplikace: GC-MS, sonda

Ionizace v plynné a kapalné fázi (za sníženého nebo atmosférického tlaku) Chemická ionizace (chemical ionization - CI) * adukce reagenčního činidla nebo záchyt nízkoenergetického neboli termo-elektronu - vznikají (PCI) nebo (NCI) ionty * různé podmínky ionizace neexistují standardní spektra (omezená dostupnost knihoven) * měkká" ionizace spektrum často obsahuje pouze nejstabilnější ionty (zpravidla molekulové), fragmentové ionty většinou chybí - můžeme je získat úpravou podmínek (fragmentace ve zdroji - většinou ztrácíme molekulové ionty) * lze využít pro určení sumárního vzorce, kvantifikaci * aplikace: GC-MS, LC-MS (APCI), sonda, moving belt, particle beam

Ionizace v kapalné a pevné fázi (a) (za sníženého tlaku) Ionizace urychlenými ionty nebo atomy a) fast ion bombardment FIB, používá se např. Cs + b) fast atom bombardment FAB, používá se např. Xe, Ar * ionizace vhodná pro výšemolekulární sloučeniny * lze využít pro určení sumárního vzorce, kvantifikaci * aplikace: sonda, continuous flow (CF FAB), moving belt, LC-MS

Ionizace v kapalné a pevné fázi (a) (za sníženého tlaku)

Ionizace v kapalné a pevné fázi (a) (za sníženého tlaku)

Ionizace v kapalné a pevné fázi (b) (za sníženého tlaku) Desorpční ionizace a) chemická (DCI): Pt drát smočený vzorkem - prudký ohřev b) plazmatická ( 252 Cf PD): kalifornium se rozpadá na radioaktivní izotopy vznik aduktů c) laserem (LDI): pulsní vypařování laserovými paprsky d) laserem za přítomnosti matrice (MALDI): jako LDI, ale s matricí e) polem (FD): ionizace přímo z emitoru (viz ionizace polem - FI) * lze využít pro strukturní analýzu * aplikace: sonda

Ionizace v kapalné a pevné fázi (b) (za sníženého tlaku)

Ionizace v kapalné fázi (a) (za sníženého tlaku) Termosprej (thermospray - TSP) * ionizace prudkým vypařením za zvýšené teploty ( 300 C) za současného zmlžování do vakuovaného prostoru * měkká ionizace spektrum obsahuje většinou molekulové nebo pseudomolekulové ionty * lze využít pouze pro určení sumárního vzorce * aplikace: LC-MS (první interface podobný API)

Ionizace v kapalné fázi (a) (za sníženého tlaku) [M+H] + [M+NH 4 ] + [M-H] - (ne [M + zh] z + ) 1 - výstup z HPLC 2 - vyhřívaná kapilára 3 - vyhřívaný blok iontového zdroje 4 - výbojová elektroda (nebo zdroj urychlených e - ) 5 - odpuzovací elektroda 6 - vakuové pumpy 7 - hmotnostní analyzátor t 150 300 C průtok m. f. < 1 ml/min tlak v iontovém zdroji vyšší než např. u EI X není atmosférický jako u APCI nebo ESI

Ionizace v kapalné fázi (a) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) Elektrosprej (electrospray - ESP, electrospray ionization - ESI) * ionizace vysokým napětím ( 5 kv) za současného zmlžování * měkká ionizace spektrum obsahuje většinou molekulové nebo pseudomolekulové ionty mohou vznikat vícenásobně nabité ionty * lze využít pouze pro určení sumárního vzorce, kvantifikaci * aplikace: LC-MS

Ionizace v kapalné fázi (a) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API)

Ionizace v kapalné fázi (a) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) Schéma vzniku iontů

Ionizace v kapalné fázi (a) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) ESI [M+H] + [M+NH 4 ] + [M-H] - [M ± zh] z ± t N2 50 400 C (přídatné) Napětí: 2-8 kv Průtok m. f. 0,001-1 ml/min Ionizace za atmosférického tlaku Těkavé přísady: octan amonný, mravenčí k. Netěkavé přísady: fosfátové pufry

Ionizace v kapalné fázi (a) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) Varianty elektrospreje Ionspray (ISP) - pneumatická podpora zmlžování Ultraspray (USP) - ultrazvuková podpora zmlžování Turbospray (TBSP) - tepelná podpora zmlžování

Ionizace v kapalné fázi (b) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) Chemická ionizace za atmosférického tlaku - (APCI) * ionizace kombinací vypařování za vysoké teploty ( 400 C) a elektrického výboje ( 5 kv) za současného zmlžování * měkká ionizace spektrum obsahuje většinou molekulové nebo pseudomolekulové ionty * lze využít pouze pro určení sumárního vzorce, kvantifikaci * aplikace: LC-MS

Ionizace v kapalné fázi (c) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) APCI [M+H] + [M+NH 4 ] + [M-H] - ([M ± zh] z ± ) t 200 650 C Napětí (výboj. el.): 2-8 kv Průtok m. f. 0,2-2 ml/min Ionizace za atmosférického tlaku Těkavé přísady: octan amonný, mravenčí k. Netěkavé přísady: fosfátové pufry

Ionizace v kapalné fázi (c) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) Fotoionizace za atmosférického tlaku - (APPI) * ionizace kombinací vypařování za vysoké teploty ( 400 C) a UV záření ( 5 kv) za současného zmlžování * měkká ionizace spektrum obsahuje většinou molekulové nebo pseudomolekulové ionty * lze využít pouze pro určení sumárního vzorce, kvantifikaci * aplikace: LC-MS

Ionizace v kapalné fázi (c) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) APPI [M+H] + [M+NH 4 ] + [M-H] - ([M ± zh] z ± ) t 200 650 C UV záření 10 ev průtok m. f. 0,2-2 ml/min Ionizace za atmosférického tlaku Dopant: toluen, benzen (citlivost )

Ionizace v kapalné fázi (d) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) DESI Desopční ESI X DART Direct Analysis in Real Time

Ionizace v kapalné fázi (d) (za atmosférického tlaku: atmospheric pressure ionization - API) DESI Desopční ESI X DART Direct Analysis in Real Time

Techniky spreje (1) Vliv techniky spreje: depozice matrice vzorku kontaminace zdroje analyty citlivost, stabilita - opakovatelnost

Techniky spreje (2) Schéma Z-spreje s umístěním vzorkovacích kón

Molekulová hmotnost Použitelnost ionizačních technik 100 000 Elektrosprej 10 000 APPI APCI Termosprej 1 000 GC/MS (EI/CI/FI) Particle Beam FAB Nepolární Polarita analytu Polární