Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ Ivo Frébort 5. Metody molekulární biologie II
DNA footprinting hledání interakcí DNA s proteiny
Polymerázová řetězová reakce (Polymerase chain reaction PCR) Malé množství DNA slouží jako templát pro DNA polymerasu DNA polymerasa z termofilního organismu (Thermus aquaticus Taq polymerasa) Komplementární primery, ve 1000 násobném přebytku Opakovaný teplotní cyklus termocykler 95 o C denaturace: ssdna 55-65 o C navázání primerů (hybridizace) 72 o C polymerace Cyklus opakujeme 20-40 x, zmnožení cílového úseku DNA
Amplifikace DNA pomocí PCR
Použití PCR při klonování
Nadexprese proteinů
Afinitní značení proteinů
Značení proteinů v živých organismech pomocí GFP GFP z medůzy Aqueoria victoria Trichomy Arabidopsis obsahující talin-gfp
Cílená mutageneze
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham mutace místně cílená (site-directed mutagenesis) gen, či sekvenci kterou budeme chtít mutovat, je třeba naklonovat do vhodného vektoru navržení dvou komplementárních primerů, v místě kde chceme mutovat, nesoucí tuto mutaci Stratagene M G A L L W L původní sekvence 5 ATG GGA GCT CTA TTA ACC TTA 3 forward primer 3 TAC CCT CGA GAT AAT TCG AAT 5 reverse primer 5 ATG GGA GCT CTA TTA AGC TTA 3 M G A L L S L PCR s těmito primery na templátový plasmid a s Pfu polymerasou vytváří se nové cirkulární DNA nesoucí mutaci, jsou k sobě komplementární a drží u sebe, mají přerušení v místě konce primerů (tzv. nick) ošetření restrikční endonukleasou DpnI (štěpí pouze methylovanou DNA, templátový plasmid) transformace do bakterie a namnožení mutovaného plasmidu Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Studium protein-protein interakcí yeast two-hybrid screen
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham YEAST TWO HYBRID SYSTÉM PRO STUDIUM PROTEIN-PROTEIN INTERAKCÍ význam pro studium regulačních a signálních drah konstitutivní promotor naklonovaná cdna knihovna z libovolného euk.organismu kvasinkový chromozom Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Inkorporace genů do genomu pomocí homologní rekombinace Příprava stabilní linie mutatního organismu
Transformace rostlin pomocí Agrobacterium tumefaciens
Příprava transgenních rostlin
Regenerace transgenních rostlin z kalusové kultury
Transgenní rostliny se změněným fenotypem
Transgenní zvířata Geny mohou být vloženy do zvířat transfekcí Metody transfekce - Lipofekce - Transfekce pomocí retroviru - Mikroinjekce - Embryonální kmenové buňky Všechny metody mají nízkou účinnost, max. 5% Geny jsou vloženy náhodně, exprese variabilní Nutná selekce
Lipofekce
Transfekce pomocí retroviru
Mikroinjekce
Transfekce pomocí embryonálních kmenových buněk
Chlupatá myš geneticky upravené zvíře Defektní gen kódující fibroblast growth factor, negativní regulátor tvorby srsti
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Nové metody sekvenování genomu (High-throughput genome sequencing) Whole Genome Sequencing (WGS, FGS) komparativní sekvenování člověk 3 mld. bp de novo sekvenování - do 50 mil. bp mikrobiální genomy Amplicone Sequencing detekce mutací (SNP) Transcriptome Sequencing mrna/cdna, exprese genů Metagenomics studium genomů v komplexním vzorku Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Full Genome Sequencing Race 2006 - Archon X Prize for Genomics - 10 mil. USD pro toho, kdo postaví přístroj, který bude schopen sekvenovat 100 lidských genomů za 10 dní s přesností 1/100 tis., pokrytím 98% a náklady do 10 tis. USD/genom Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Intelligent Bio-Systems, Genome Corp., ION Torrent Systems, Helicos Biosciences, IBM 454 Life Sciences 50 tis. USD Knome - 39.5 tis. USD Illumina 19.5 tis. USD Pacific Biosciences, Complete Genomics 5 tis. USD?? Metodiky Sequencing by synthesis Nanopore technology DNA Transistor Fluorophore technology Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Pyrosekvenování 454 Life Sciences https://www.roche-applied-science.com Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Princip pyrosekvenování 1. DNA polymerasa po přidání datp, dctp, dgtp nebo dttp inkorporuje pouze komplementární nukleotid, uvolní se PPi. 2. ATP sulfurylasa s adenosin 5 -phosphosulfátem převede PPi na ATP. 3. Luciferasa s ATP - přeměna luciferinu na oxyluciferin a světelné kvantum. 4. Apyrasa degraduje nevyužité dntps a ATP. Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham Solexa (Illumina) princip http://www.illumina.com/ Sekvenování pomocí značeného reversibilního terminátoru 1. Inkorporace jednoho 3 -fluorescenčně značeného nukleotidu 2. Detekce značení 3. Chemická hydrolýza/odstranění značení/terminátoru Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company
Biochemistry 2/e - Garrett & Grisham SMRT Technology (ZMW - zero-mode waveguide) www.pacificbiosciences.com -1 molekula DNA polymerasy imobilizovaná v ZMW - 5 -značené nukleotidy (na fosfátu), každý specifickým fluoroforem - laserem ozářené dno ZMW excitace fluorescence poblíž polymerasy - reakce polymerasy - 10 ms fluorescence daného nukleotidu - difuse nukleotidů 1000x rychlejší, krátké signály/šum Copyright 1999 by Harcourt Brace & Company