KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

Transkript

1 KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

2 Northern bloty Genové čipy pracné a zdlouhavé nákladné Semikvantitativní RT-PCR nepřesné qpcr vysoké dynamické rozpětí metodiky real-time PCR Vysokoučinné sekvenování transkriptomu

3 problém: precizní kvantifikace mrna spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné řešení: stanovení koncentrace RNA pomocí fluorescenčního barviva RIBOgreen x citlivější, nereaguje s nukleotidy a krátkými fragmenty. Pracnější elektroforetické stanovení (Agilent bioanalyzer čipy) nebo relativní stanovení pomocí qpcr

4 control expt NORTHERN BLOT cílový gen GOI referenční gen aktin, GAPDHetc korigovaný nárůst exprese = 10/2 = 5

5 PCR: Co to je? Polymerase Chain Reaction: znamená amplifikace (mnohonásobná replikace) relativně krátkých úseků specifické DNA Základní nástroj molekulární biologie se vzrůstájícím významem i v dalších oborech (botanika, kriminalistika) The idea Ghobind Khorana 1971 Kary Mullis 1983 Nobelova cena 1993 poprvé provedená mnohonásobná in vitro replikace ve zkumavce

6 Thermus aquaticus Pyrococcus furiosus Taq Pfu

7

8 aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese mrna nebo mikrorna mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami

9 princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání

10 chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot

11 chemismus 2) hybridizační sondy (TAQman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5-3 exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6-Carboxyrhodamine ) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer Försterův rezonanční přenos energie - mechanismus nezářivého přenosu energie mezi dvěma molekulami prostřednictvím dipól-dipólové interakce

12 srovnání TaqMan SybrGreen specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max.4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace cena vysoká nízká

13 kontaminace největší problém PCR aerosol, pipety, staré amplikony částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA štěpí ss a dsdna s inkorporovaným deoxyuracilem (dutp) termolabilní, 0% aktivita nad 55 C nereaguje s templátem (dttp) dutp v qpcr mixu místo dttp pracuje během nastavení PCR reakce

14 chyby v pipetování templát (cdna) premix (primery, proba, polymerasa, dntp, pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX (Karboxy-X-Rhodamin) fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI pracujeme s premixy 1) pufr, Mg 2+,dNTP, ROX, SybrGreen, TaqPol, primery 2) vzorek (cdna, genomická DNA)

15 CYCLE NUMBER AMOUNT OF DNA , , , , , , , , , , ,048, ,097, ,194, ,388, ,777, ,554, ,108, ,217, ,435, ,870, ,073,741, ,400,000, ,500,000, ,550,000, ,580,000,000 AMOUNT OF DNA AMOUN T OF D NA lineární vynesení PCR CYCLE NUMBER logaritmické vynesení PCR CYCLE NUMBER

16 lineární ~20 do ~1500

17 C T hodnoty threshold treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky C T počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)

18 před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku threshold templát: 10x ředění buď přímo cdna, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme C T koncentrace templátu

19 PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY směrnice: ideální -3,32 = 100% efektivita reakce %EFF kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu R 2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0,995) Eff=10 (-1/slope) 1

20 CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY , ,048 1, ,096 2,213 1, ,192 4,205 2, ,384 7,990 3,748 1, ,768 15,181 6,747 2, ,536 28,844 12,144 4, ,072 54,804 21,859 8, , ,127 39,346 14, , ,842 70,824 23, ,048, , ,482 40, ,097, , ,468 69, ,194,304 1,356, , , ,388,608 2,578, , , ,777,216 4,898,763 1,338, , ,554,432 9,307,650 2,408, , ,108,864 17,684,534 4,335, , ,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667, ,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835, ,870, ,298,220 25,287,311 4,819, ,073,741, ,466,618 45,517,160 8,193,466 AMOUNT OF DNA %EFF 100% = 2.00x 90% = 1.90x 80% = 1.80x 70% = 1.70x 10,000,000,000 1,000,000, ,000,000 10,000,000 1,000, ,000 10,000 1, % EFF 90% EFF 80% EFF 70% EFF PCR CYCLE NUMBER relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% 3%

21 tolerance efektivity

22 Chemismus SybrGreen Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání teplota

23 REFERENČNÍ GEN musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích nejčastěji provozní geny (house-keeping) aktin, GAPDH, cyklofilin, 18S RNA, EF1

24 TaqMan Human Endogenous Control Plate C T

25 C T = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvojnásobné změně ve výchozí koncentraci cdna 18S ribosomální RNA přepisována jinou RNA polymerasou než mrna byly popsány výkyvy mezi množstvím rrna a mrna nelze použít pokud se vychází z mrna

26 vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (mrna) přepis do cdna navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení standardních křivek pro oba geny a stanovení efektivity GAPDH GOI GAPDH GOI GAPDH GOI

27 vyhodnocení kalibrátor sample A kalibrátor sample B sample A sample B GAPDH GOI

28 1 vyhodnocení změny exprese pro sample 1 metoda delta delta cé té 1. určíme C T pro všechny křivky 2. určíme C T GOI - C T GAPDH pro kalibrátor C T kalibrátor 3. určíme C T GOI - C T GAPDH pro sample 1 C T sample 1 4. C T sample 1 - C T kalibrátor C T výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2 - CT

29 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek

30 3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích

31 příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do cdna a provedeno qpcr s primery a probou na gen pkg2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg2 po umlčení? pkg2 Eff 86% cdna kalibrator C T 22,48 cdna silencing C T 22,3 GAPDH Eff 77% cdna kalibrator C T 20,05 cdna silencing C T 16, CT pkg2 cdna kalibrator cdna silencing 1,1x10 4 kopií 1,23x10 4 kopií 2 (5,33-2,43) (1+0,86) 0,18 /(1+0,77) 3,08 cdna kalibrator cdna silencing GAPDH 0,134 0,192 0,194 Gen snížil expresi 7,5x 5,2x 5,2x 1,55x10 4 kopií 8,92x10 4 kopií

32 navrhování primerů velikost amplikonu bp délka primerů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50-70%, GC-clamps on the 5 end žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)

33

34 navrhování proby délka proby bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm C o 10 C vyšší než Tm primerů GC obsah 50-70% žádné G na 5 konci zháší fluorescenci FAM barvy

35 navrhování primerů a proby

36 kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon

37 MGB PROBY minor groove binding stabilizuje vazbu proby na ssdna výrazně zvyšuje Tm můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm

38

39 MGB PROBY využití pro alelické diskriminace

40 kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 3X 6X

41 kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3x sample extrakce RNA přepis do cdna qpcr 18X

42 instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900HT Real Time PCR System StepONE Real Time PCR System

43 halogenová lampa emisní filtry zesilovač ccd kamera excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku

44 instrumentace

45

46 HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) detekce SNP bez specifických sond díky kvalitní instrumentaci Corbett ( 0.02 C) a nové generaci interkalačních barviv (LC Green Plus)

47 pro amplikony do 200bp HRM ANALÝZA

48 ddpcr droplet digital PCR

49 ddpcr droplet digital PCR PCR reakce je rozdělená do olejových kapiček, v každé je žádná až několik molekul templátu Po proběhnutí PCR, kapičky jsou analyzovány na průtokovém cytometru a je detekován signál PCR pozitivní/pcr negativní kapičky Absolutní kvantifikace určení koncentrace templátu ve výchozím vzorku bez nutnosti přípravy kalibrační křivky (c) = -ln (1 - p) koncentrace = c/v c počet kopií na kapičku p frakce pozitivních kapiček V objem kapičky Stanovení CNV (copy number variance) v kolika kopiích je daný gen ve vzorku, proti referenci (rozlišení homozygot/heterozygot) Stanovení mutací či SNP dvě různě značené próby (FAM a VIC)

50 Detekce mutace a stanovení její penetrace ve vzorku pomocí ddpcr citlivost až 0.1% mutované formy z celkového množství izolované DNA (např. několik nádorových buněk ve zdravé tkáni)