PŘÍLOHA 5
Subletální účinky sinic na ptáky studie s modelovým organismem křepelkou japonskou Hana Paskerová 1, Klára Hilscherová 1, Veronika Pašková 1, Jiří Pikula 2 1 Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, RECETOX Research Centre for Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Kamenice 3, 625 00 Brno, Česká Republika; ssedmikraska@email.cz 2 Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, Palackého 1/3, 612 42 Brno, Úvod a cíle práce Sinice neboli cyanobakterie jsou kosmopolitně rozšířené organismy všeobecně známé díky své schopnosti vytvářet tzv. vodní květ. Ten je důsledkem jevu zvaného eutrofizace neboli obohacování vod o živiny, který způsobuje masivní růst sinic a řas. Vodní květ je celosvětovým problémem pro svou schopnost znesnadňovat využití vodních nádrží. Mimo to má také schopnost negativně ovlivňovat ostatní vodní organismy a celý ekosystém narušením kyslíkového režimu nádrže, tvorbou bariéry pro sluneční záření, ovlivněním druhové skladby organismů v nádrži a produkcí sinicových toxinů neboli cyanotoxinů. Ty jsou známy svými hepatotoxickými, neurotoxickými a iritujícími účinky na ostatní organismy. Negativní vlivy sinic a jejich toxinů byly pozorovány v mnoha studiích s vodními organismy. Z vodních obratlovců to byly především ryby a modeloví savci, ojediněle modeloví ptáci. Tyto studie ukázaly, že sinice a jejich toxiny mají prokazatelně schopnost negativně ovlivňovat vodní obratlovce a po dlouhodobém působení vyvolávají změny biochemických, hematologických, fyziologických a morfologických parametrů [1-5]. Studie, jejíž součástí je i má práce, se zaměřuje na negativní vliv sinic na vodní ptáky. Masivní rozvoj sinic je totiž často spojován s jejich hromadnými úhyny. Ty byly zaznamenány u nádrží s rozvinutým vodním květem v nejrůznějších částech světa, jako např. u plameňáků (Phoenicopterus minor) v Keni a Tanzánii, kachen (Anas poecilorhyncha) v Japonsku či dalších ptáků v Belgii, Dánsku nebo Kanadě [6-9]. Experimentálních studií, jež by se zabývaly negativním vlivem sinic na vodní ptáky není příliš mnoho. Patří k nim např. studie s izolovanými kuřecími enterocyty, které byly vystaveny toxinům sinic a u nichž byly zaznamenány deformace a nekrózy buněk [10]. Dále pak studie s modelovými ptáky křepelkou japonskou (Coturnix japonica), u kterých bylo po
intraperitoneální expozici cyanotoxiny zaznamenáno zvětšení sleziny [11]. Další studie s křepelkou již sledovala subletální změny po dlouhodobější expozici biomasou sinic a to v pitné vodě. Byly zde zaznamenány změny biochemických, hematologických a histologických parametrů [5]. Experiment, jehož součástí je má práce, navazuje na tuto studii s křepelkou japonskou. Kromě dlouhodobého působení sinic se však zaměřuje také na současný vliv jiných stresorů prostředí. Neboť v přirozeném ekosystému na organismy nikdy nepůsobí pouze jeden stresor, ale vždy více faktorů, jež se mohou vzájemně ovlivňovat a přispívat tak k vyšší toxicitě. Proto tento typ studie lépe modeluje situaci v přírodním prostředí. Tato část studie se konkrétně zabývá hodnocením ovlivnění biochemických parametrů oxidativního stresu. Oxidativním stresem jsou nazývány škodlivé účinky tzv. ROS (reaktivních kyslíkových radikálů), jež jsou redukčními produkty molekulárního kyslíku a jejichž škodlivé účinky spočívají ve schopnosti reagovat s důležitými makromolekulami buňky, což může vést k dalším negativním efektům na organismus. ROS vznikají v buňkách přirozeně a jejich množství je regulováno antioxidačním systémem, jehož součástí jsou antioxidační enzymy - superoxid dismutáza (SOD), kataláza (CAT), glutathion peroxidáza (GPx) a glutathion reduktáza (GR) a neenzymatické látky, mezi něž patří glutathion (GSH) [12]. Oxidativní stres se v tkáních organismu projeví nárůstem aktivit těchto antioxidačních enzymů a hladin látek neenzymatické ochrany, neboť nastává ve chvíli, kdy prooxidativní síla převáží antioxidativní ochranu. V předchozích studiích bylo zjištěno, že sinice mají prokazatelně schopnost způsobovat oxidativní stres u organismů, jež jim byly vystaveny. Cílem této studie je tedy zjistit, zda sinice v koexpozici s jinými stresory prostředí mají schopnost po dlouhodobé expozici negativně ovlivňovat vodní ptáky. A to konkrétně na úrovni subletálních biochemických změn v organismu. Materiál a metody Studie negativního působení sinic na vodní ptáky byla provedena s křepelkou japonskou (Coturnix japonica Temminck & Schlegel, 1849), která sice není vodní pták, je to však ptačí modelový organismus, pro něhož existují standardizované testy. Křepelky byly testovány v chronickém 30denním OECD testu toxicity ve spolupráci RECETOX s Veterinární a farmaceutickou univerzitou Brno. Jako modely stresorů prostředí byla použita biomasa sinic, olověné broky a vakcína AVIPEST. Biomasa sinic obsahovala cyanotoxiny (microcystiny) a byla podávaná v pitné
vodě. Olovo bylo podáno ve formě 6 broků orálně na počátku testu. Olověné broky byly použity z důvodu jejich častého požití vodními ptáky v oblastech s rozšířeným lovem. Vakcína AVIPEST proti pseudomoru drůbeže osahující Paramyxovirus pseudopestis avium byla podána na počátku expozice a měla simulovat napadení ptáků patogenními mikroorganismy. Stresory byly kombinovány do jednotlivých variant expozic (viz.tabulka 1) s 5 jedinci křepelek ve skupině. Tab.1: Označení a charakteristika jednotlivých variant. Označení Expozice Dávkování K Kontrola Kontrolní voda 10 ml vody/den E4 Sinicová biomasa 10 ml biomasy/den Pb Olovo 6 olověných broků na začátku expozice + 10 ml vody/den Vakcína Vakcína Vakcína + 10 ml vody/den E4 + Pb Sinicová biomasa + olovo 6 olověných broků na začátku expozice + 10 ml biomasy/den E4 + vakcína Sinicová biomasa + Vakcína vakcína E4 + Pb + vakcína Sinicová biomasa + olovo + vakcína + 10 ml biomasy/den 6 olověných broků na začátku expozice + vakcína + 10 ml biomasy/den Negativní vliv jednotlivých stresorů byl hodnocen z hlediska vlivu na biochemické parametry. Jednalo se o parametry oxidativního stresu, a to konkrétně o hladinu redukovaného glutathionu GSH, enzymatickou aktivitu glutathion-s-transferázy GST, glutathion peroxidázy GPx, glutathion reduktázy GR a lipidní peroxidaci LPO. Biochemické parametry oxidativního stresu byly sledovány v jaterní a srdeční tkáni metodami založenými na biochemických reakcích příslušné látky či enzymu stanovovaných spektrofotometricky. Data z experimentu byla zpracována pomocí programu Statistica 8. Výsledky jednotlivých skupin byly porovnávány analýzou rozptylu jednoduchého třídění (ANOVA) a post-hoc analýzou LSD testem. Homogenita rozptylů byla hodnocena pomocí Levenova testu. V případě nehomogeních rozptylů byl použit neparametrický Kruskall-Wallisuv test a test mnohonásobného porovnávání skupin. Statisticky významné rozdíly (na hladině významnosti 0,05) mezi jednotlivými skupinami jsou v následujících grafech označeny hvězdičkami.
Výsledky Enzymatická i neenzymatická část antioxidačního systému testovaných křepelek byla expozicí danými stresory ovlivněna a to především po spolupůsobení více faktorů najednou. Hladina glutathionu (GSH) se významně zvýšila v jaterní tkáni po koexpozici biomasy sinic s olovem či vakcínou a to i přestože po působení samotných stresorů nebyl efekt zaznamenán. V srdeční tkáni došlo k nárůstu hladin také po podání olova či působení samotnou biomasou sinic (viz. Obr. 1). 40 35 30 Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy 40 35 30 GSH nmol/mg protein 25 20 15 GSH nmol/mg proteinu 25 20 15 10 10 5 5 Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy 0 K Pb E4 Pb+VAK E4+Pb K+VAK E4+VAK E4+Pb+VAK 0 K Pb E4 Pb+VAK E4+Pb K+VAK E4+VAK E4+Pb+VAK Obr.1: Grafy hladin redukovaného glutathionu v játrech a srdci ( - označuje významný rozdíl oproti kontrole, zkratky popisků viz Tab.1) U antioxidačních enzymů byly zaznamenány především nárůsty aktivit. V jaterní tkáni byl zaznamenán nárůst aktivity glutathion-s-transferázy a glutathion peroxidázy oproti kontrolní skupině po expozici sinicovou biomasou v kombinaci s vakcínou a olovem. V srdeční tkáni byly zaznamenány nárůsty aktivit glutathion-s-transferázy, glutathion reduktázy a glutathion peroxidázy a to po působení více stresorů najednou. Aktivita GST zde signifikantně stoupla u vakcinovaných křepelek vystavených koexpozicím olova a biomasy sinic. Zvýšení aktivity GPx vyvolalo olovo a sinicová biomasa v koexpozicích a také samotná vakcinace křepelek. Na glutathion reduktázu pak měla vliv samotná biomasa sinic i její koexpozice.
Mimo antioxidačního systému byl pozorován také jeden z důsledků oxidativního stresu lipidní peroxidace (LPO). Její nárůst byl zaznamenán především v játrech ptáků jimž byla podávána biomasa sinic v kombinaci s dalšími stresory. V srdci byl pak zaznamenán menší nárůst LPO a to u koexpozic sinicové biomasy a u olova s vakcínou oproti vlivu samotné biomasy sinic. Diskuze Výsledky stanovení potvrdily předpoklady o výraznějším vlivu koexpozic více stresorů na stanovované parametry a byly v souladu se závěry dřívějších studií vlivu sinic na vodní živočichy. Změny biochemických parametrů po expozici sinicemi či jejich toxiny byly sledovány ve studiích s vodními obratlovci a také ve studii s křepelkou japonskou, na níž tento experiment navazoval. Nárůst hladiny glutathionu byl stejně jako v současné studii zaznamenán v experimentech s rybami [1,2] a modelovými ptáky a savci [4,5]. Také zvýšení aktivity antioxidačních enzymů bylo zaznamenáno v předchozích studiích a to konkrétmě u ryb [2,3,13] a jater a srdce křepelky japonské vystavené sinicové biomase v pitné vodě [5]. Významný nárůst lipidní peroxidace byl pozorován ve studiích s rybami [1,3] či opět v předchozím experimentu s křepelkou japonskou a ve studiích s modelovými savci [4,5]. Závěr Z naměřených výsledků lze vyvodit schopnost biomasy sinic negativně ovlivňovat vodní ptáky na úrovni subletálních změn biochemických parametrů. A to především po koexpozici sinic s jinými stresory prostředí, jako je působení olova či patogenních mikroorganismů. Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala Projektu rektora Masarykovy univerzity a projektu MSM No.6215712402 realizovanému na Veterinární a farmaceutické univerzitě Brno, jež mi umožnily práci uskutečnit. Seznam použité literatury [1] Bláha L., Kopp R., Šimková K. et al.: Acta Veterinaria Brno, 73, 2004, s. 477 [2] Adamovský P., Kopp R., Hilscherová K. et al.: Conference on Plant Uptake of Organic Pollutants, 2005, s. 2687
[3] Li L., Xie P., Chen J.: Toxicon, 49, 2007, p. 1042 [4] Gehringer M. M., Shephard E. G., Downing T. G. et al.: Int. J. Biochem. Cell Biol., 36, 2004, p. 931 [5] Paskova V., Adamovsky O., Pikula J. et al.: Sci. Total Environ., 398, 2008, p. 34 [6] Onodera H., Oshima Y., Henriksen P. et al.: Toxicon, 35, 1997, p. 1645 [7] Wirsing B., Hoffmann L., Heinze R. et al.: Syst. Appl. Microbiol., 21, 1998, p. 23 [8] Matsunaga H., Harada K. I., Senma M. et al.: Nat.Toxins, 7, 1999, p. 81 [9] Park H., Namikoshi M., Brittain S. M. et al.: Toxicon, 39, 2001, p. 855 [10] Falconer I. R., Dornbusch M., Moran G. et al.: Toxicon, 30, 1992, p. 790 [11] Takahashi S., Kaya K.: Nat.Toxins, 1(5), 1993, p. 283 [12] Prieto A. I., Jos A., Pichardo S. et al.: Aquatic Toxicology, 77, 2006, p. 314 [13] Qiu T., Xie P., Ke Z. X. et al.: Toxicon, 50, 2007, p. 365