VIROVÉ CHOROBY VČELY MEDONOSNÉ (APIS MELLIFERA)

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE VIROVÉ CHOROBY VČELY MEDONOSNÉ (APIS MELLIFERA) Bakalářská práce Andrea Foralová Vedoucí práce: RNDr. Jana Prodělalová Ph.D. Brno 2014

Bibliografický záznam Autor: Andrea Foralová Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Název práce: Virové choroby včely medonosné (Apis mellifera) Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Experimentální biologie Speciální biologie, zaměření Mikrobiologie a molekulární biotechnologie RNDr. Jana Prodělalová Ph.D. Akademický rok: 2013/2014 Počet stran: 56 Klíčová slova: virus; infekce; včela medonosná; paralýza; deformace; kleštík včelí; hmyzomorka včelí

Bibliographic Entry Author Andrea Foralová Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology Title of Thesis: Virus infections in honey bees (Apis mellifera) Degree programme: Field of Study: Supervisor: Experimental Biology Special Biology, specialization Microbiology and molecular biotechnology RNDr. Jana Prodělalová Ph.D. Academic Year: 2013/2014 Number of Pages: 56 Keywords: virus; infection; Apis mellifera; paralysis; deformation; Varroa destructor; Nosema apis

Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala vedoucí mé bakalářské práce RNDr. Janě Prodělalové Ph.D. za její ochotu, připomínky a čas, který mi při zpracování bakalářské práce věnovala. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s použitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. V Brně 15.5.2014. Andrea Foralová

Abstrakt Se včelou medonosnou (Apis mellifera) je spojeno přes 20 druhů převážně +ssrna virů. Virové infekce včely medonosné probíhají většinou skrytě na úrovni jednotlivců i včelstev, kdy nedochází k žádným větším škodám. Replikace viru však může být při dlouhodobých stresových situacích aktivována, což vede k rozvoji onemocnění. Největším problémem v posledních 30 letech je zejména společný výskyt virů a parazitů kleštíka včelího (Varroa destructor) a hmyzomorky včelí (Nosema apis), který může ve včelstvech způsobit značné škody a v extrémních případech i jejich úhyn. V práci jsou shrnuty dosavadní poznatky o taxonomii, historii, způsobech přenosu, klinických příznacích, geografické distribuci a diagnostických metodách využívaných k detekci virových onemocnění včel. Abstract There are more than 20, mostly +ssrna species of viruses which are associated with the honey bee (Apis mellifera). Virus infections are usually present in individuals and colonies as a covert infection and do not cause any serious damage. However, virus replication can be activated in long-term stress situations, resulting in emergence of disease. The major problem of the last 30 years is the coincidence of viruses and parasites Varroa destructor and Nosema apis that can cause a serious harm to colonies, in extreme cases even their death. This thesis summarize the current information about taxonomy, history, modes of transmission, clinical symptoms, geographical distribution and diagnostic methods used for detection of virus diseases in honey bees.

Obsah 1 ÚVOD... 12 2 CÍL PRÁCE... 13 3 TAXONOMIE... 14 3.1 Čeleď Dicistroviridae... 14 3.2 Čeleď Iflaviridae... 15 3.3 Nezařazené viry... 16 4 ZPŮSOBY PŘENOSU VIRŮ... 17 4.1 Horizontální přenos virů... 17 4.1.1 Přímý horizontální přenos... 17 4.1.2 Nepřímý horizontální přenos... 19 4.2 Vertikální přenos virů... 22 5 PRŮBĚH VIROVÉ INFEKCE... 23 5.1 Otevřená infekce... 23 5.2 Skrytá infekce... 24 6 VIROVÉ CHOROBY VČEL... 25 6.1 Čeleď Dicistroviridae... 25 6.1.1 Acute bee paralysis virus... 25 6.1.2 Kashmir bee virus... 25 6.1.3 Israeli acute paralysis virus... 26 6.1.4 Black queen cell virus... 26 6.1.5 Big Sioux River virus... 27 6.1.6 Aphid lethal paralysis virus strain Brookings... 27 6.1.7 Cloudy wing virus... 27 6.2 Čeleď Iflaviridae... 28 6.2.1 Deformed wing virus... 28 6.2.2 Sacbrood virus... 30 6.2.3 Slow bee paralysis virus... 31 6.2.4 Varroa destructor virus 1... 32 6.2.5 Kakugo virus... 32 6.3 DNA viry... 32 6.3.1 Apis iridescent virus... 32

6.3.2 Filamentous virus... 33 6.4 Ostatní nezařazené viry... 33 6.4.1 Chronic bee paralysis virus... 33 6.4.2 Chronic bee paralysis virus associate... 36 6.4.3 Bee virus X... 36 6.4.4 Bee virus Y... 37 6.4.5 Egypt bee virus... 37 6.4.6 Arkansas bee virus a Berkeley bee picornavirus... 37 6.4.7 Lake Sinai virus 1 a Lake Sinai virus 2... 38 7 GEOGRAFICKÁ DISTRIBUCE VČELÍCH VIRŮ... 39 8 DIAGNOSTIKA VIROVÝCH ONEMOCNĚNÍ... 45 9 ZÁVĚR... 47

Seznam použitých zkratek ABPV ABV AIV ALPV BBPV BSRV BQCV BVX BVY CBPV CBPVA CCD cdna CrPV CWV DNA dsdna DWV EBV ELISA FV IAPV IFV IGR KBV Acute bee paralysis virus Arkansas bee virus Apis iridescent virus Aphid lethal paralysis virus Berkeley bee picornavirus Big Sioux River virus Black queen cell virus Bee virus X Bee virus Y Chronic bee paralysis virus Chronic bee paralysis virus associate Syndrom kolapsu kolonií (colony collapse disorder) Komplementární deoxyribonukleová kyselina Cricket paralysis virus Cloudy wing virus Deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid) Dvouřetězcová deoxyribonukleová kyselina (double-stranded deoxyribonucleic acid) Deformed wing virus Egypt bee virus Imunoenzymatický test (enzyme-linked immunosorbent assay) Filamentous virus Israeli acute paralysis virus Infectious flacherie virus Mezigenový nepřekládaný úsek (intergenic untranslated region) Kashmir bee virus

kda KV Kilodalton Kakugo virus LSV 1 Lake Sinai virus 1 LSV 2 Lake Sinai virus 2 NASBA nt ORF PCR RhPV RNA RT RT-LAMP RT-PCR ssdna SBV SBPV +ssrna UTR Amplifikace sekvencí nukleových kyselin (nucleic acids sequence based amplification) Nukleotid Otevřený čtecí rámec (open reading frame) Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction) Rhopalosiphum padi virus Ribonukleová kyselina (ribonucleic acid) Reverzní transkriptáza (reverse trancriptase) Reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification Polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí (reverse transcription polymerase chain reaction) Jednořetězcová deoxyribonukleová kyselina (single-stranded deoxyribonucleic acid) Sacbrood virus Slow bee paralysis virus Pozitivní jednořetězcová RNA (+ single-stranded ribonucleic acid) Nepřekládáný úsek (untranslated region) VDV 1 Varroa destructor virus 1 VP VPg Virový protein (virus protein) Virový protein vázaný na genom (genome-linked virus protein)

1 ÚVOD Včela medonosná (Apis mellifera) je hostitelem přibližně 20 popsaných druhů virů. Tyto viry postihují všechna vývojová stadia a kasty včel a mohou u nich způsobovat morfologické, fyziologické a etologické změny. Pokud tyto změny postihnou větší část včelstva, může to mít za následek jeho oslabení nebo i úhyn. Většinou však viry ve včelách přetrvávají skrytě v nízkých koncentracích, kdy replikace viru neprobíhá vůbec, nebo pouze omezeně. V tomto případě včela nevykazuje žádné příznaky onemocnění a jeví se tedy jako zcela zdravá. Za určitých okolností, jako je např. stres, nedostatek potravy, dlouhodobě špatné klimatické podmínky nebo napadení jiným patogenem, parazitem nebo škůdcem, však může dojít k aktivaci replikace a tedy i k rozvoji klinického onemocnění (Allen a Ball 1996). První záznamy o výskytu onemocnění včel, jejichž možným původcem byly viry, pochází z počátku 20. století (White 1917), intenzivní výzkum včelích virů však začal probíhat až o několik desetiletí později (Bailey et al. 1963). Ačkoli od té doby došlo k výraznému pokroku v diagnostických metodách a výzkum se tak značně usnadnil, nejsou doposud získané informace o včelích virech kompletní. Zejména co se týká mechanismu přenosu virů, jejich vzájemné interakce, geografické distribuce a faktorů spouštějících virovou infekci, zůstává i nadále řada otázek nezodpovězených, a jejich objasnění je teprve otázkou budoucnosti. 12

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je vypracovat literární přehled, který se bude zabývat taxonomií, historií, původem, rozšířením, patologií, způsoby přenosu a diagnostikou nejvýznamnějších virů včely medonosné. 13

3 TAXONOMIE Většina doposud popsaných včelích virů je řazena do čeledí Dicistroviridae a Iflaviridae řádu Picornavirales. Do tohoto řádu patří celkem pět čeledí vedle již zmíněných dvou to jsou Picornaviridae, Marnaviridae a Secoviridae, a 2 nezařazené rody Bacillarnavirus a Labyrnavirus [URL1]. 3.1 Čeleď Dicistroviridae Do této čeledi řadíme celkem dva rody virů. Prvním z nich je rod Cripavirus, do kterého je řazen Black queen cell virus (BQCV) (King et al. 2012) a Aphid lethal paralysis virus strain Brookings (ALPV-Brookings). U ALPV-Brookings však zatím není jasné, zda se jedná o nový druh, nebo pouze nový subtyp viru ALPV, který je patogenní pro mšice (Runckel et al. 2011). Typovým druhem rodu Cripavirus je Cricket paralysis virus (CrPV). Druhým rodem spadající do čeledi Dicistroviridae je rod Aparavirus zahrnující tři vzájemně příbuzné včelí viry Acute bee paralysis virus (ABPV), Israeli acute paralysis virus (IAPV) a Kashmir bee virus (KBV). ABPV je současně typovým druhem tohoto rodu (King et al. 2012). Do čeledi je předběžně zařazen také Cloudy wing virus (CWV) [URL1] a nově objevený Big Sioux River virus (BSRV) (Runckel et al. 2011). Jedná se o malé neobalené viry s lineární jednořetězcovou pozitivní RNA (+ssrna). Průměrná velikost částic je přibližně 30 nm a velikost genomu činí 8500-10000 nt (King et al. 2012). Struktura genomu virů čeledi Dicistroviridae je uvedena na Obr. 1. Obr. 1: Struktura genomu virů čeledi Disictroviridae. Řetězec obsahuje dva otevřené čtecí rámce, ORF1 o délce 530 nt kódující nestrukturní proteiny a ORF2 o délce 2500 nt kódující strukturní (kapsidové) proteiny VP1, VP2, VP3 a u některých druhů také VP4. Velikost VP1, VP2 a VP3 činí 24 40 kda, nejmenší VP4 je velký 4,5 9 kda. ORF1 a ORF2 jsou od sebe odděleny mezigenovým nepřekládaným úsekem (IGR) o délce 170 530 nt a z obou stran jsou ohraničeny nepřekládanými oblastmi (UTR). Na 5 konec řetězce je vázán malý protein VPg a 3 konec je polyadenylován. Upraveno podle Chen et al. (2006b). 14

Viriony jsou ikosahedrálního tvaru s pseudo T=3 symetrií. Schéma stavby virionu je uvedeno na Obr. 2. Obr. 2: Schéma virionu rodu Aparavirus. Virion se skládá ze 60 protomer, složených ze strukturních proteinů VP1, VP2 a VP3. Na vnitřním povrchu částic se u některých druhů nachází také menší VP4 a většinou zde můžeme nalézt také proteinový prekurzor VP0, vázaný na VP3 a VP4. Organizace virionů rodů Aparavirus, Cripavirus a Iflavirus je shodná. Dostupné z [URL2]. 3.2 Čeleď Iflaviridae Čeleď Iflaviridae obsahuje jediný rod, kterým je rod Iflavirus. Do tohoto rodu jsou řazeny Sacbrood virus (SBV), Deformed wing virus (DWV), Varroa destructor virus 1 (VDV-1), Slow bee paralysis virus (SBPV) (King et al. 2012) a nedávno objevený Kakugo virus (KV) (Fuiyuki et al. 2004). Typovým druhem tohoto rodu je Infectious flacherie virus (IFV). Stejně jako v případě virů čeledi Dicistroviridae se jedná o neobalené +ssrna viry s ikosahedrální symetrií, měřící v průměru 26 30 nm. Celková délka jejich genomu činí 8800 10100 nt (King et al. 2012). Organizace genomu je však v případě druhů této čeledi odlišná (Obr. 3). Obr. 3: Struktura genomu virů čeledi Iflaviridae. Řetězec obsahuje jeden otevřený čtecí rámec ORF kódující strukturní proteiny na 5 konci a nestrukturní proteiny na 3 konci. Velikost strukturních proteinů VP1, VP2 a VP3 se pohybuje v rozmezí 28 44 kda. U některých druhů virů se vyskytuje také VP4 o velikosti zhruba 4 12 kda. ORF je z obou stran ohraničen nepřekládanými oblastmi (UTR), jejichž délka je druhově specifická. Na 5 konec řetězce je vázán malý protein VPg a 3 konec je polyadenylován. Upraveno podle Chen et al. (2006b). 15

3.3 Nezařazené viry Řada včelích virů nebyla doposud klasifikována. Jedná se celkem o dva DNA viry Apis iridescent virus (AIV) a Filamentous virus (FV) a několik +ssrna virů, které se v některých ohledech liší od druhů výše zmíněných. Zvláštním případem je Chronic bee paralysis virus (CBPV), který je charakteristický svými oválnými částicemi (Obr. 4) a rozdílnou organizací RNA. Ačkoli má některé shodné znaky s viry čeledí Nodaviridae a Tombusviridae, od všech známých virů se liší. V budoucnosti se tedy může stát typovým druhem pro novou skupinu +ssrna virů (Olivier et al. 2008). Příbuznými viry jsou Lake Sinai virus 1 (LSV 1) a Lake Sinai virus 2 (LSV 2), které jsou viru CBPV podobné a stejně jako on se řadí na pomezí čeledí Nodaviridae a Tombusviridae (Runckel et al. 2011). Obr. 4: Viriony CBPV. Snímek z elektronového mikroskopu. Upraveno podle Bailey (1976). 16

4 ZPŮSOBY PŘENOSU VIRŮ Včely jsou sociálním druhem hmyzu vyznačujícím se vysoce organizovaným kastovním systémem. Včelí společenstvo čítající 20 000 60 000 jedinců žijící v jednom úlu vytváří superorganismus, který funguje jako celek a kde má každý jedinec svoji úlohu. Tento způsob života však predisponuje včely k celé řadě onemocnění. Viry nebyly nikdy považovány za velkou hrozbu pro populaci včel, protože ve včelstvech většinou přetrvávaly, aniž by u včel způsobovaly jakékoli příznaky onemocnění. Za posledních několik desetiletí však došlo k nárůstu případů virových infekcí a s nimi souvisejících úhynů včelstev. Navíc byla zaznamenána řada případů tzv. syndromu kolapsu kolonií (CCD). Dosud není znám původce tohoto jevu, při kterém dochází ke zmizení většiny dělnic ze včelstva, avšak často je spojován právě s napadením některými druhy virů (Oldroyd 2007). Vzhledem ke kastovnímu systému včelstev, rozdělení úkolů a rozsáhlé sociální interakci včel je možné šíření virů jak mezi jedinci v rámci jednoho včelstva, tak i mezi jedinci různých včelstev. Lze rozlišit dva směry šíření infekčních částic, a to horizontální a vertikální (Obr. 7). Převládající směr šíření každého druhu viru souvisí s jeho vlastnostmi patogenitou a virulencí. Patogenitou rozumíme druhově specifickou schopnost vyvolat onemocnění, virulence je schopnost kmene uplatnit svoji patogenitu. Kmeny s nízkou virulencí jsou zničeny imunitním systémem hostitele dříve, než dojde k rozšíření viru, naopak kmeny s příliš vysokou virulencí svého hostitele zahubí a zaniknou spolu s ním. Jelikož cílem každého viru je maximalizace jeho rozšíření, je nejvýhodnější vyrovnaná patogenita, která je výsledkem dlouhodobé adaptace (Lipsitch et al. 1996). 4.1 Horizontální přenos virů K horizontálnímu přenosu virů dochází v rámci jedné generace včel. Může k němu docházet buď přímou, anebo nepřímou cestou. Obecně lze říci, že infekce přenášené horizontálně jsou virulentnější, často doprovázené pozorovatelnými klinickými příznaky (Chen et al. 2006a). 4.1.1 Přímý horizontální přenos Tento způsob přenosu vyžaduje blízký fyzický kontakt s infikovaným jedincem, pozření infikované potravy nebo pobyt v infikovaném prostředí. 17

V rámci jednoho včelstva hraje velkou roli při přenosu virů rozdělení úkolů dělnic na krmičky pečující o včelí plod, strážkyně bránící úl před predátory, stavitelky vytvářející plástve, uklízečky čistící úl a létavky přinášející zásoby vody a potravy. Při každé z těchto činností je včela vystavována možnosti nakažení virem při kontaktu s infikovanými jedinci, zásobami nebo materiálem a zároveň se stává i jeho potencionálním přenašečem (Chen et al. 2006a; Schmid-Hempel 1998). U řady virů je běžný přenos z dospělé včely na larvu prostřednictvím infikované potravy, kterou produkují dělnice svými podhltanovými žlázami. Takto vyprodukovaná potrava může obsahovat velké množství virových částic, jelikož právě podhltanové žlázy jsou často viry silně napadeny. Infikovaná však nemusí být jen larvální potrava či mateří kašička, ale rovněž i další včelí produkty, které přijdou do kontaktu s jejich slinami. Jde tedy také o pyl, med a nektar, jejichž prostřednictvím se viry mohou rovněž šířit (Chen et al. 2006a; Shen et al. 2005a). K přenosu infekčních částic může docházet také fyzickým kontaktem zdravých jedinců s infikovanými. Jak bylo popsáno například u viru SBV, dospělá včelí dělnice se nakazí pozřením malého množství exuviální tekutiny při odstraňování infikovaných larev z úlu (Bailey 1969). Podobným případem je přenos CBPV, kdy zdravé včely napadají infikované jedince, a při těchto útocích dochází k pozření chloupků z jejich těl. Ty jim následně způsobují v zažívacím traktu drobná poranění, kterými virus snadno pronikne do jejich organismu (Rinderer a Rothenbuhler 1975). Navíc u obnažené kutikuly dochází k snadnějšímu prostupu virových částic a přenos viru je tak možný i prostým fyzickým kontaktem těl při vysoké koncentraci jedinců na určité ploše (Bailey et al. 1983b in Aubert et al. 2008). Další možností přímého horizontálního přenosu viru je prostřednictvím infikovaných včelích výkalů. Některé studie dokazují, že včely napadené CBPV (Ribière et al. 2007), ABPV (Bailey a Gibbs 1964), DWV, BQCV (Chen et al. 2006b) a KBV (Hung 2000) vylučují ve výkalech částice viru, které jsou při pozření schopny infikovat zdravé jedince. Množství takto přenesených virových částic je však na vyvolání otevřené infekce příliš nízké (Ribière et al. 2007). Posledním, zatím neprostudovaným způsobem přímého horizontálního přenosu virů, je přenos pohlavní cestou, ke kterému může docházet při páření. Ačkoli zatím neexistuje studie, která by dokázala tento druh přenosu potvrdit, je zde jistá pravděpodobnost, že k němu opravdu dochází. Svědčí o tom zejména výsledky analýzy spermatu trubců 18

a spermaték včelích matek, ve kterých byly zaznamenány virové částice (Chen et al. 2006b). Obdobné způsoby přenosu existují rovněž mezi včelstvy navzájem. Děje se tak například zalétáváním dělnic do cizích úlů, ať už omylem nebo za účelem loupeže zásob, či zalétáváním trubců. Rovněž je možný přenos při kontaktu s infikovaným materiálem, jakým mohou být například opylované květy. Nemalý podíl na šíření nemocí mají také sami včelaři, kteří spojují slabá včelstva, aby vytvořili včelstvo silnější, nebo vyměňují mezi úly materiál. Těmito zásahy významně zvyšují riziko přenosu infekčních částic (Genersch 2008). 4.1.2 Nepřímý horizontální přenos Nepřímý přenos viru je uskutečňován prostřednictvím přenašeče. Mezi nejvýznamnější přenašeče virů u včel patří paraziti Varroa destructor a Nosema apis. Interakce mezi Varroa destructor a včelími viry Varroa destructor neboli kleštík včelí (Obr. 5) je považován za nejvýznamnějšího parazita včely medonosné, jemuž je přisuzován hlavní podíl na šíření a vyvolávání virových onemocnění včel. Dříve byl tento druh roztoče nesprávně klasifikován jako Varroa jacobsoni, avšak v roce 2000 byl na základě výsledků analýzy mitochondriální DNA od tohoto druhu taxonomicky odlišen (Anderson a Trueman 2000). Obr. 5: Dospělá samička Varroa destructor z ventrální a dorsální strany. Dostupné z [URL3], upraveno. Tento exotický parazit se do Evropy dostal z Asie pravděpodobně na počátku 20. století, odkud se během několika desetiletí rozšířil do celého světa. Jeho původním hostitelem je 19

včela východní (Apis cerana), která má oproti včele medonosné při napadení varroou dvě výhody. První z nich je skutečnost, že se u ní V. destructor rozmnožuje pouze na málo početném trubčím plodu. Druhou výhodou je silný čistící pud, který se u těchto včel vyvinul jako adaptace pod vlivem dlouhodobého soužití s tímto parazitem. Dokáže tak odstraňováním jednotlivých roztočů a jimi napadených larev z úlu udržovat jeho populaci v únosné míře. Včela medonosná však tuto schopnost postrádá a rozmnožování roztoče u ní probíhá nejen na trubčím plodu, ale rovněž na plodu dělničím a matečním. Napadení V. destructor tak může mít pro včelstvo bez zásahu člověka fatální následky (Martin 1995). Vývojový cyklus V. destructor trvá přibližně stejně dlouho jako vývoj včelí larvy. Oplozené samičky roztoče se nechávají zavíčkovat společně s larvou v buňce, kde se na larvu přisají a živí se její hemolymfou. Samička zde následně klade vajíčka. Z vajíček se líhnou larvy z prvního nakladeného vajíčka se líhne sameček, z ostatních se po několika dnech líhnou samičky. Ještě před vykuklením včely se roztoči v buňce spáří, samečci zahynou a samičky se přichytí na kuklu, kde dokončí svůj vývoj. Spolu se včelou pak opouští buňku. I když zatím není znám přesný mechanismus přenosu a aktivace virů varroou, existuje řada důkazů, že mezi těmito parazity a některými druhy virů existuje jistá spojitost. Prvním z nich je fakt, že před rozšířením V. destructor z Asie nebyly zaznamenány případy otevřených virových infekcí včel, ačkoli bylo známo, že se u nich viry běžně v nízkých koncentracích vyskytují. Po rozšíření V. destructor však byl zaznamenán výrazný nárůst případů otevřených virových infekcí, a to pouze u včelstev napadených tímto parazitem (Bailey et al. 1981). Druhým důležitým faktem je, že se virové částice vyskytují ve vyšší koncentraci u jedinců přímo napadených V. destructor než u jedinců nenapadených (Shen et al. 2005b). U těchto jedinců pak vlivem vyšší koncentrace virových částic častěji dochází k rozvoji otevřené infekce. Tato skutečnost vedla k závěru, že sliny V. destructor mají schopnost regulovat expresi genů, které jsou zodpovědné za humorální a buněčnou imunitní reakci včely. Snížená imunita pak dává prostor pro spuštění virové infekce (Yang a Cox-Foster 2005). Přenos virů prostřednictvím V. destructor byl nepřímo potvrzen také analýzou těl roztočů, která prokázala přítomnost virových částic v jejich zažívacím traktu. Jistotu však přinesl laboratorní experiment, při kterém byla samička roztoče ponechána k nasátí na včele infikované ABPV a později přenesena na zdravou včelí larvu. U této larvy byla následně prokázána přítomnost virových částic. Při tomto experimentu bylo rovněž zjištěno, že 20

někteří roztoči jsou schopni virus přenášet i více než 36 hodin po odstranění z infikované včely a nakazit i několik larev po sobě. Z toho plyne domněnka, že přenos se pravděpodobně neděje pouze prostřednictvím ústního ústrojí kontaminovaného hemolymfou infikované včely, ale že se virus pozřený společně s nasátou hemolymfou hromadí v zažívacím traktu V. destructor a k přenosu dochází při vyvržení útrobního obsahu těsně před začátkem sání na hostiteli, stejně jako se tomu děje při přenosu rostlinných virů některými druhy hmyzu (Ball 1985; Wiegers 1986). Interakce mezi Nosema apis a včelími viry Nosema apis neboli hmyzomorka včelí je eukaryotický jednobuněčný organismus z říše hub způsobující onemocnění zažívacího traktu dospělých včel, tzv. nosemózu. Jde o vnitrobuněčného parazita vytvářejícího oválné jednobuněčné spory o velikosti přibližně 4 7 μm (Obr. 6) s typickým dutým tzv. pólovým vláknem, které slouží k vystřelení zárodku spory do cytoplasmy epiteliální buňky v žaludku včely. Obr. 6: Spory Nosema apis. Snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu. Dostupné z [URL4], upraveno. Přítomnost nosemy v trávicím traktu včely způsobuje ztenčení výstelkového epitelu trávicí trubice, a to má za následek nedostatečnou funkci střeva. Nedokonale natrávená potrava se v něm hromadí a způsobuje průjem včel, které kálí v úlu. Trus infikovaných včel obsahuje mnoho nestrávených látek (zejména bílkoviny a glycidy), a to láká ostatní včely k jeho konzumaci. Tím se onemocnění šíří (Veselý et al. 2003). Nemocná včela hyne na sepsi v důsledku přechodu saprofytických bakterií ze střeva do hemolymfy skrz porušenou střevní stěnu (Lucký 1984). 21

N. apis je spojována zejména s virem BQCV, ale možná je i jeho role při infekci viry BVY a FV. Laboratorní experimenty prokázaly, že k syntéze částic BQCV dochází pouze tehdy, jsou-li včelám v potravě obsahující virové částice podávány současně spory tohoto parazita, nebo pokud byly spory v potravě podávány včelám, které již byly nakaženy virem BQCV. Pokud byl virus injekčně nebo v potravě bez přítomnosti spor parazita podáván zdravým včelám, k propuknutí onemocnění nedošlo. Virus se tedy ukázal být na N. apis zcela závislý (Bailey et al. 1983). 4.2 Vertikální přenos virů Jako vertikální je označován přenos viru z rodiče na potomstvo, tedy na další generaci. Dochází k němu z matky prostřednictvím vaječníků nebo z trubce prostřednictvím spermatu. První případ, přenos z matky na potomstvo, můžeme dále rozlišovat podle toho, jestli je virus z vaječníku přenášen na povrch vajíčka nebo do něj. To závisí na fázi vývoje vajíčka, ve které přijde do kontaktu s virovými částicemi (Chen et al. 2006b). Tento způsob přenosu viru byl zaznamenán u BQCV, DWV a SBV (Chen et al. 2006a). Přenos viru z trubce na potomstvo zatím není blíže prozkoumán. O jeho existenci však napovídá nález virionů ABPV a DWV v trubčím spermatu a ve spermatékách včelích matek (Chen et al. 2006b; Yue et al. 2007). Vertikálně přenášené jsou většinou skrytě probíhající infekce s nízkou virulencí, které nejsou doprovázeny žádnými pozorovatelnými klinickými příznaky (Chen et al. 2006a). Obr. 7: Schéma přenosu virů mezi včelami. Plné čáry představují horizontální směr přenosu, přerušované čáry představují vertikální směr přenosu. Upraveno podle Chen et al. (2006b). 22

5 PRŮBĚH VIROVÉ INFEKCE V závislosti na konečném vlivu viru na hostitelskou buňku můžeme rozlišit 4 typy virové infekce: 1. Lytický cyklus viru je charakteristický produkcí velkého množství virových částic uvnitř hostitelské buňky. V konečné fázi hostitelská buňka praskne a uvolní tak viriony do svého okolí. 2. Perzistentní infekce je charakteristická neustálou produkcí malého množství virových částic. Hostitelská buňka přežívá bez poškození, nebo je množství odumřelých buněk tak malé, že je vyvažováno produkcí buněk nových. Při tomto druhu infekce tedy nevzniká žádné poškození organismu. 3. Latentní infekce je charakteristická začleněním genetické informace viru do genetické informace hostitelské buňky, při kterém nedochází k produkci dalších virových částic. Virová genetická informace je však replikována spolu s genetickou informací hostitelské buňky a ve vhodných podmínkách může dojít k jejímu vyčlenění z genomu a spuštění vlastní replikace. 4. Infekce vedoucí k neustálému dělení hostitelské buňky způsobená začleněním genetické informace viru do jejího genomu, typicky u nádorových buněk. Nicméně viry vyskytující se u hmyzu není možné zařadit do žádné z těchto kategorií, a proto jsou u nich užívány více popisné termíny, jako je otevřená a skrytá infekce (Yue et al. 2007). 5.1 Otevřená infekce Jako otevřenou můžeme nazvat infekci, při které je produkováno velké množství virových částic a současně jsou pozorovatelné i klinické příznaky onemocnění. Otevřená infekce končí vždy buď úhynem hostitele, anebo jeho uzdravením, po kterém už k další produkci virových částic nedochází. Tento druh infekce můžeme dále rozdělit do dvou skupin, a sice na akutní a chronickou. Akutní infekce se vyznačují krátkou dobou trvání a vysokou produkcí virových částic doprovázené zřetelnými příznaky onemocnění. Při chronických infekcích je naopak produkce virových částic dlouhodobá, trvající do konce života hostitele, nebo do konce jeho infekčního životního stadia (De Miranda a Genersch 2010). 23

5.2 Skrytá infekce Skrytou infekcí rozumíme takovou infekci, která není doprovázena žádnými viditelnými příznaky, produkce virových částic je omezena nebo zastavena a hostitel při ní dále přežívá (Yue et al. 2007). Dimmock a Primrose (1987) uvádí, že je v literatuře označení skrytá často zaměňováno s označením inaparentní. Inaparentní infekce je však svým průběhem podobná spíše akutní otevřené infekci. Typická je pro ni krátká délka trvání, vysoká produkce virových částic a výhradně horizontální přenos, avšak narozdíl od akutní otevřené infekce není inaparentní infekce doprovázena žádnými klinickými příznaky. 24

6 VIROVÉ CHOROBY VČEL 6.1 Čeleď Dicistroviridae 6.1.1 Acute bee paralysis virus Virus akutní paralýzy včel byl objeven v roce 1963 při práci na identifikaci původce paralýzy včel viru CBPV. Bylo zjištěno, že oba viry po experimentální infekci včelám způsobují během několika dní třes a paralýzu, přičemž u ABPV dochází k nástupu příznaků a úhynu rychleji (5 6 dní) než u CBPV (7 8 dní) (Bailey et al. 1963). Kromě včely medonosné byl ABPV zaznamenán i u pěti druhů čmeláků, avšak včela medonosná je pravděpodobně jeho původním hostitelem (Bailey a Gibbs 1964). Jedinci nakažení virem ABPV v přírodních podmínkách nevykazují žádné příznaky onemocnění (Ribière et al. 2010). Někdy však může tento virus způsobit úhyn jedinců nebo i celých včelstev, zejména při jejich silném napadení V. destructor (Martin 2001). V laboratorních podmínkách však tento virus vykazuje vysokou virulenci a k usmrcení jedince během několika dní stačí pouhých 100 virionů při injekčním podání nebo 10 11 virionů při podání prostřednictvím potravy (Bailey a Gibbs 1964). Právě vysoká virulence může být vysvětlením, proč nejsou ve včelstvech napadených ABPV zaznamenávány včely postižené příznaky paralýzy. K úhynu nakažených včel totiž dochází dříve, než se nahromadí jejich větší počet, který by byl člověkem zaznamenatelný (Bailey et al. 1963; Ribière et al. 2010). Za nejvýznamnějšího přenašeče ABPV je považován právě roztoč V. destructor. Malé množství částic, které není schopno vyvolat u jedince otevřenou infekci, avšak přispívá k šíření viru, je přenášeno také prostřednictvím potravy a včelích výkalů (Bailey a Gibbs 1964). Kromě horizontálního přenosu je zřejmě možný také přenos vertikální, což dokládá nález částic ABPV ve spermatu trubců (Yue et al. 2007). 6.1.2 Kashmir bee virus KBV byl poprvé zaznamenán roku 1974 jakožto kontaminace ve vzorku AIV izolovaného z Apis cerana pocházející ze severní Indie. Následný laboratorní experiment prokázal, že injekční aplikace částic tohoto viru včele medonosné způsobovala úhyn včel během několika dní (Bailey et al. 1976; Bailey a Woods 1977). KBV je považován za nejvirulentnější včelí virus, protože letální dávku při injekčním podání činí pouhých 35 virových částic (Bailey et al. 1979). Virus se v organismu včely 25

rychle množí a už během 24 hodin dosahuje nejvyšší koncentrace. Včela hyne během tří dnů (Dall 1985 in Aubert et al. 2008). Podání velkého množství částic v potravě larvám a mladým včelám má stejný účinek. Ačkoli je tento virus blízce příbuzný viru ABPV, včely v laboratorních ani přirozených podmínkách nevykazují žádné klinické příznaky (Bailey et al. 1979). Stejně jako u ABPV je i u KBV hlavním původcem šíření a aktivace virové infekce V. destructor (Chen et al. 2004a; Shen et al. 2005b). Dalším možným způsobem přenosu je také horizontální přenos prostřednictvím kontaminované potravy a výkalů (Hung 2000). Chen et al. (2006b) rovněž připouští možnost vertikálního přenosu z matky na potomstvo. 6.1.3 Israeli acute paralysis virus IAPV je blízce příbuzným druhem virů ABPV a KBV. K jeho objevení došlo v roce 2002, kdy byl izolován u jedné z mrtvých včel pocházející ze slábnoucího včelstva poblíž města Alon Hagalil v Izraeli. Do současnosti nebyl tento virus zaznamenán u žádného jiného hostitele než u včely medonosné. Onemocnění se zpočátku projevuje ztrátou ochlupení a v důsledku toho zčernáním špičky zadečku, které se během 3 6 dní rozšíří až na hruď včely. Nakažení jedinci jsou značně neklidní, neustále se pohybují v kruhu, téměř nelétají a nepřijímají potravu. Mezi 7. a 10. dnem onemocnění dochází ke zčernání celého zadečku a ztrátě ochlupení na hrudi. Postižené včely se přestávají pohybovat a během několika dní hynou. O způsobu šíření tohoto viru není zatím příliš známo. Při experimentální injekční aplikaci viru uhynuly všechny sledované včely během čtyř dní. O něco pomalejší byl průběh infekce po podání viru v potravě, kdy k úhynu včel došlo během deseti dní (Maori et al. 2007). 6.1.4 Black queen cell virus První záznam o příznacích BQCV pochází z července roku 1975, následovaný dalšími záznamy o podobných příznacích v dubnu a květnu následujícího roku. Vyšetření vzorků pomocí elektronové mikroskopie prokázalo 10 12 virových částic o průměru 30 nm. Jelikož příznaky onemocnění blízce připomínaly SBV, bylo pro ověření diagnózy použito antisérum SBV, které ale nevyvolalo žádnou reakci a prokázalo tak, že se jedná o odlišný druh viru (Bailey a Woods 1977). 26

Příznaky infekce jsou postiženy pouze larvy včelích matek. V raném stadiu infekce má larva světle žlutou barvu a tuhou pokožku, podobně jako je tomu u SBV. Po uhynutí larvy stěny matečníku zčernají (Ball a Bailey 1997). Virus napadá i dospělé jedince, avšak u nich nejsou patrné žádné příznaky onemocnění. K rozvoji onemocnění navíc dochází pouze pokud jsou včely současně napadeny parazitem N. apis (Bailey et al. 1983). K přenosu infekce dochází zejména prostřednictvím potravy, kterou jsou larvy budoucích matek krmeny (Chen et al. 2006a). Vysvětlením, proč k nákaze nedochází také u larev dělnic, je zřejmě fakt, že larvy dělnic jsou krmeny infikovanou mateří kašičkou méně a kratší dobu než larvy matek. Zkonzumované množství virových částic tedy u nich není dostatečné pro rozvoj otevřené virové infekce (Allen a Ball 1996). Chen et al. (2006b) ve své studií připouští také možnost vertikálního přenosu BQCV, jelikož byly sekvence virové RNA zaznamenány u matek a jejich vajíček (100 %), larev (25 %) a dospělých potomků (4 %). 6.1.5 Big Sioux River virus BSRV je nově identifikovaným virem, jenž se nejvíce podobá jinému viru čeledi Dicistrovirade, Rhopalosiphum padi viru (RhPV) napadajícímu mšice. BSRV a RhPV mají identických 78 % aminokyselin v nestrukturních genech a 69 % v genech strukturních. Zatím není jasné, zda je tento virus včelím patogenem, či jestli se do včel dostává pouze náhodně při sběru pylu (Runckel et al. 2011). 6.1.6 Aphid lethal paralysis virus strain Brookings ALPV Brookings je virem vysoce podobným viru ALPV, který však napadá mšice a dosud nebyl u včel zaznamenán. Zatím není patrné, zda se jedná o dva rozdílné, avšak příbuzné druhy, či jestli jde pouze o dva subtypy jednoho viru. O patogenitě tohoto viru není dosud nic známo (Runckel et al. 2011). 6.1.7 Cloudy wing virus Částice CWV byly objeveny v extraktech dospělých včel, které byly používány pro laboratorní experimenty s jinými druhy virů. Tyto včely měly matná, méně průsvitná křídla a docházelo k jejich předčasnému úhynu (Bailey et al. 1980a). Původně byl tento 27

virus spojován s kolapsem kolonií, nicméně laboratorní experimenty, které tuto domněnku měly potvrdit, nebyly úspěšné (Carreck et al. 2010). Tento virus je často spojován s již zmíněnou ztrátou průsvitnosti včelích křídel, avšak diagnostika založená pouze na detekci viditelných příznaků není v tomto případě příliš spolehlivá. Bailey et al. (1980a) uvádí, že příznaky zakalených křídel se nezdají být nezaměnitelně nebo výhradně spojeny s vážnou infekcí CWV. Nepodařilo se prokázat přítomnost virových částic u uhynulých včel, které měly zakalená křídla, a na druhou stranu jsme zaznamenali mnoho virových částic v ostatních včelách, které neprojevovaly žádné příznaky onemocnění. Pro CWV je typický přenos fyzickým kontaktem těl zdravých a infikovaných jedinců zejména při vysoké hustotě těchto jedinců na malé ploše, kdy dochází k přenosu virových částic do malých ranek na povrchu jejich těl (Bailey et al. 1980a). To vysvětluje, proč se virus vyskytuje zejména u včel chovaných v laboratorních podmínkách (Carreck et al. 2010). Množství CWV bylo také zaznamenáno u zavíčkovaného včelího plodu, což naznačuje možnost přenosu viru z dospělých včel na larvy prostřednictvím potravy. To potvrzuje i nález CWV u dospělců Braula coeca. Tyto komenzální bezkřídlé mušky se živí včelími produkty, zejména medem a nektarem, a mohou tak pozřít i produkty slinných žláz včel obsahující virové částice (Carreck et al. 2010). Dalším možným, avšak zatím nepotvrzeným, způsobem přenosu je přenos vzduchem na krátkou vzdálenost (Bailey et al. 1980a). 6.2 Čeleď Iflaviridae 6.2.1 Deformed wing virus Poprvé byl DWV izolován v Japonsku u včelstev napadených V. destructor a následně byl označen za původce ztrát včelstev v mnoha zemích (Ball 1983 in Aubert et al. 2008). Po svém objevení v roce 1982 byl považován za japonskou variantu Egyptského včelího viru, avšak dnes již je jasné, že jde o dva rozdílné druhy (Bailey a Ball 1991 in De Miranda a Genersch 2010). Zatím není známo, zda je Apis mellifera původním hostitelem DWV, či zda je původním hostitelem Apis cerana. Kromě dvou druhů včel byl DWV zaznamenán také u dvou druhů čmeláků Bombus terrestris a Bombus pascorum (Genersch et al. 2005), u trpasličí včely Apis florea (Allen a Ball 1996), 28

brouka Aethina tumida vyskytujícího se ve včelích úlech (Eyer et al. 2009) a v neposlední řadě také u Varroa destructor (Yue a Genersch 2005) a jemu podobnému včelímu ektoparazitovi Tropilaelaps mercedesae (Forsgren et al. 2009). Jak již sám název viru napovídá, mezi typické příznaky otevřené infekce DWV patří deformovaná, špatně vyvinutá křídla u nově vylíhnutých jedinců, dále je to pak menší velikostí těla a jeho bledé zbarvení (Obr. 8). Postižené včely během krátké doby hynou (Martin 2001). Je však třeba zmínit, že k postižení křídel dochází pouze v případě, že k nákaze došlo ještě před vylíhnutím včely. Pokud k přenosu viru dojde až v pozdějším věku, včela žádnými příznaky napadení netrpí (Aubert et al. 2008). Obr. 8: Nově vylíhnutá včela postižená DWV. Dostupné z [URL5], upraveno. Již od počátku objevení deformací křídel u včel je zřejmé, že jejich výskyt úzce souvisí s V. destructor. Původně byl tento parazit považován za výhradního původce tohoto postižení (Akratanakul a Burgett 1975 in Aubert et al. 2008), jelikož se deformované včely vyskytovaly pouze při jeho přítomnosti ve včelstvu. Ačkoli je dnes již jasné, že původcem onemocnění je virus, jeho spojitost s tímto roztočem je více než zřejmá (Ball 1993 in Aubert et al. 2008). Samotné napadení včelstva V. destructor však nemusí vždy nutně znamenat onemocnění DWV, ačkoli je pro propuknutí infekce nezbytné. Klíčovým faktorem je schopnost viru se uvnitř roztočů replikovat. Parazit zde tedy funguje nejen jako mechanický, ale rovněž jako biologický vektor (Mockel et al. 2011). Gisder et al. (2009) uvádí, že k vyvolání infekce DWV je zapotřebí alespoň 10 10 kopií viru v těle parazita. Takto vysoký počet virových částic nemůže být dosažen jinak než právě 29

replikací v jeho organismu. Neméně důležitá je také celková míra napadení včelstva roztočem, jelikož byla zaznamenána pozitivní korelace mezi počtem parazitujících roztočů a množstvím virových částic u jimi napadených včel (Bowen-Walker et al. 1999). Kromě horizontálního přenosu infekce je možný také vertikální přenos, a to jak prostřednictvím infikované matky, tak i prostřednictvím trubce. Yue et al. (2007) tuto domněnku potvrdil svými laboratorními experimenty s DWV pozitivními jedinci a následnou analýzou jejich potomstva pomocí RT-PCR a in situ hybridizace. Chen et al. (2006b) uvádí možnost šíření DWV prostřednictvím výkalů infikovaných jedinců a naznačuje tak i možnou roli orálního přenosu, avšak zatím neexistují data, která by tuto možnost mohla s jistotou potvrdit. 6.2.2 Sacbrood virus Toto onemocnění bylo vůbec prvním onemocněním včel, kterému byl v roce 1917 přisouzen jeho virový původ. Zásluhu na tomto objevu měl američan G. F. White, který prováděl experimentální aplikaci extraktů z larev vykazujících příznaky SBV zdravým larvám a podařilo se mu u nich vyvolat příznaky onemocnění (White 1917). Samotný původce onemocnění, virus SBV, byl popsán až v roce 1964 (Bailey et al. 1964). Pro toto onemocnění je charakteristické postižení vyvíjejícího se plodu. V normálním případě se larva po čtyřech dnech od zavíčkování naposledy svléká a následně kuklí. Larva napadená SBV však svoji poslední larvální pokožku nesvlékne, pouze ji oddělí od těla a poté se pod ní začíná hromadit exuviální tekutina obsahující rozpadající se tukové buňky. Larva pak vypadá jaké váček naplněný tekutinou. Její barva se mění z perleťově bílé na světle žlutou a larva postupně seschne v tmavě hnědý útvar se zvednutou hlavou a zadečkem (Obr. 9) (Bailey 1975 in Grabensteiner et al. 2001). Ačkoliv toto onemocnění postihuje pouze larvální stadium, může virus napadat i dospělé včely, avšak nezpůsobuje u nich žádné klinické příznaky (Bailey 1969). Nejčastěji je tento virus přenášen z larvy na dospělou včelí dělnici nebo z dělnice na larvu. K prvnímu případu přenosu dochází u nejmladších včel, které zastávají funkci čističek úlu (viz 4.1.1). K dalšímu přenosu pak dochází, když včela začne zastávat funkci tzv. krmičky, která krmí larvy výměšky svých podhltanových žláz (Shen et al. 2005a). Larvy jsou nejcitlivější k virové nákaze během prvních 4 8 dní života (Bailey 1969). 30

Pravděpodobně je přenos možný také prostřednictvím V. destructor. Jeho schopnost SBV přenášet byla potvrzena jak experimentálním přenosem viru na včelí larvu (Bailey 1968 in Aubert et al. 2008), tak i detekcí virových částic ve slinách roztoče (Shen et al. 2005b). Doposud však není znám jeho význam při přenosu viru na dospělé jedince v přirozených podmínkách. Většina dostupných záznamů totiž vypovídá pouze o úhynu včelího plodu na SBV (Ball 1999b in Aubert et al. 2008). Další možností přenosu viru je možný rovněž vertikálně z včelí matky na potomstvo. To dokládá analýza přirozeně infikovaných včelích matek, jejich vajíček, larev a dospělých potomků. Bylo zjištěno, že SBV obsahovalo 6 matek z 10 a 100 % jimi nakladených vajíček. Nicméně pouze 25 % larev a 10 % dospělých potomků bylo SBV pozitivní (Chen et al. 2006b). Obr. 9: Larva s typickými příznaky napadení virem SBV. Dostupné z [URL6], upraveno. 6.2.3 Slow bee paralysis virus SBPV byl objeven náhodně v Anglii roku 1974 při výzkumu Bee virus X (Bailey a Woods 1974). Jméno získal tento virus díky pomalejšímu průběhu infekce, než je typické pro ABPV a CBPV (Aubert et al. 2008). Po injekčním podání preparátu obsahujícího částice SBPV zdravým dospělým včelám dochází během 10 12 dní k jejich úhynu, kterému předchází paralýza prvních dvou párů končetin (Bailey a Woods 1974). Nicméně v přírodě tento virus většinou přetrvává jako skrytá infekce a k rozvoji otevřené infekce dochází jen zřídka, zejména při silném napadení včelstva V. destructor (De Miranda et al. 2010b). 31

Hlavním způsobem přenosu virových částic mezi dospělými jedinci navzájem a mezi dospělými jedinci a larvami je orální přenos prostřednictvím infikované potravy. Stejně jako u řady dalších včelích virů je však také možný nepřímý přenos prostřednictvím V. destructor (Bailey a Ball 1991 in De Miranda et al. 2010b). 6.2.4 Varroa destructor virus 1 VDV 1 je geneticky blízce příbuzným druhem viru DWV, se kterým sdílí 84 % identických nukleotidů a 95 % aminokyselin. Oba viry mohou společně v organismu včel i V. destructor koexistovat (Ongus 2004). Mezi těmito viry může navíc docházet k vzájemné rekombinaci. Zioni et al. (2011) uvádí, že k replikaci viru dochází výhradně v hlavě nově vylíhnutých včel s deformovanými křídly a zároveň zde byla zaznamenána i přítomnost DWV-VDV 1 rekombinantů. Nově vzniklé rekombinantní DWV-VDV 1 částice mohou vykazovat vyšší virulenci než samotné DWV a VDV 1, čímž mohou významně přispívat ke vzniku otevřené infekce ve včelstvech napadených V. destructor. Modifikace genetické informace těchto virů může navíc stát za vyšší účinností přenosu viru prostřednictvím V. destructor (Ongus et al. 2006). 6.2.5 Kakugo virus Dalším blízce příbuzným druhem viru DWV je nedávno objevený KV. Tyto viry sdílejí 96 % identických nukleotidů a 98 % identických aminokyselin. KV byl izolován z mozku útočných včelích dělnic strážkyň, které při laboratorním experimentu aktivně napadaly pokusného sršně. Jelikož přítomnost KV nebyla prokázána u jedinců, kteří toto agresivní chování neprojevovali, existuje možná souvislost mezi přítomností KV ve včelím mozku a agresivitou, kterou tito jedinci projevují. Jak je již známo z dřívějších studií, může přítomnost některých patogenů ovlivňovat funkci nervové soustavy a může tak stát za změnami chování postižených jedinců. Přesná povaha souvislosti mezi KV a agresivním chováním včel však zatím není známa stejně jako jeho případné negativní důsledky na zdraví napadeného jedince (Fuiyuki et al. 2004, 2009). 6.3 DNA viry 6.3.1 Apis iridescent virus Tento virus byl poprvé izolován v 70. letech 20. století z Apis cerana pocházejících ze severní části Indie, Kašmíru. Postižené včely vykazovaly známky onemocnění, jejich 32

aktivita byla značně snížená a brzy došlo k jejich úhynu. Včelstva, ze kterých tito jedinci pocházeli, vyhynula během dvou měsíců (Mahindre, osobní komunikace in Bailey et al. 1976). Všechny vzorky postižených včel obsahovaly velké množství virových částic, průměrně 10 10 10 11. Po injekční aplikaci roztoku virových částic dospělým jedincům A. mellifera dochází k tvorbě duhových krystalických agregátů uvnitř cytoplasmy některých tkání, zejména tělní stěny a podhltanových žláz. Barva infikovaných tkání se současně mění na světle modrou. Pokud je navíc virus podáván orálně, dochází ke zmodrání tkání také u střevní stěny a proximálních konců Malphigiových trubic. Pokud jsou virové částice injekčně podány včelím larvám, dochází u nich k mírnému zpomalení vývoje, avšak nakonec se larva vyvine ve zdánlivě zdravého jedince. V přirozených podmínkách nebyl výskyt u A. mellifera zaznamenán (Bailey et al. 1976). 6.3.2 Filamentous virus FV je druhým DNA virem napadajícím včelu medonosnou (Bailey et al. 1981). Příznaky onemocnění jako shlukování nakažených včel na zemi před vstupem do úlu poprvé popsal Wille a považoval je za projev napadení včelí rickettsiózou. Rovněž popsal mléčně zbarvenou hemolymfu včel plnou malých částic, viditelných pouze pod mikroskopem s fázovým kontrastem při zvětšení nejméně 1000 a nazval toto onemocnění Anomálie R. (Wille a Printer 1961 in Aubert et al. 2008). Nicméně pozdější výzkum, který provedl Clark (1978), prokázal, že původcem onemocnění není Rickettsia, ale FV. Experimentální injekční a orální podání částic FV mladým včelám mělo za následek jejich úhyn během pěti dní. Bailey et al. (1983) navíc uvádí, že po injekčním podání částic dospělým včelám u nich sice dochází k replikaci viru, avšak včely zůstávají dále bez jakýchkoli příznaků onemocnění. Toto onemocnění dle něj pravděpodobně souvisí s parazitem Nosema apis. 6.4 Ostatní nezařazené viry 6.4.1 Chronic bee paralysis virus První záznamy o viru chronické paralýzy pochází z doby před více než 2000 lety, kdy Aristoteles popsal černé lysé včely, které nazýval zloději (Bailey et al. 1963). Že jde 33

o onemocnění virového původu zjistil C. E. Burnside v roce 1945 při svém laboratorním experimentu se zdravými včelami, kterým podával extrakty ze včel napadených paralýzou a podařilo se mu u nich vyvolat příznaky onemocnění (Burnside 1945 in Aubert et al. 2008). Trvalo ale dalších 18 let, než byl tento virus poprvé izolován a popsán a stal se tak spolu s ABPV prvním popsaným virem, který napadá včelu medonosnou (Ribière et al. 2010). CBPV je jediným virovým onemocněním dospělých včel, které má pozorovatelné jak morfologické, tak etologické příznaky. Tyto příznaky se v literatuře tradičně dělí do dvou skupin. První skupinu příznaků tvoří roztřesený pohyb křídel a celého těla, doprovázený neschopností létat. Napadené včely lezou po česně úlu, po zemi před úlem nebo vylézají po stéblech trávy k vrcholu. Díky zduřenému mednímu váčku mají zvětšený zadeček a rozložená křídla. Nemocní jedinci hynou během několika dní, vážné případy napadení včelstev mohou skončit až jejich úhynem. Druhou skupinou příznaků je ztráta ochlupení, takže se postižené včely jeví jako černé, lesklé a celkově drobnější, než zdraví jedinci (Obr. 10). Ostatní včely na ně často útočí. Díky černému zbarvení nejsou tito jedinci strážkyněmi u vchodu rozeznáni a vpuštěni do úlu, což je důvodem, proč se velké množství infikovaných včel zdržuje venku před úlem (Berenyi et al. 2006). Během několika dní nastupuje u nemocných jedinců třes, ztrácejí schopnost letu a hynou (Ball and Bailey 1997). Obr. 10: Včela napadená CBPV se ztrátou ochlupení zadečku. Dostupné z [URL7], upraveno. Během výzkumu bylo zjištěno, že ať včely trpí příznaky první nebo druhé skupiny, obsahují vždy srovnatelné množství virových částic, které jsou sérologicky nerozlišitelné (Rinderer a Green 1976). Rozdíl v příznacích je tedy pravděpodobně 34

způsoben sekundárními vlivy (Bailey 1965). V jedné kolonii se mohou vyskytovat včely s příznaky obou skupin (Ball a Bailey 1997). K přenosu CBPV dochází zejména horizontálním směrem, a to jak přenosem prostřednictvím potravy (Bailey 1965), tak i fyzickým kontaktem těl infikovaných a zdravých jedinců (viz 4.1.1) (Bailey et al. 1983). Ribière et al. (2007) navíc zmiňuje i možnost přenosu prostřednictvím výkalů infikovaných jedinců. Laboratorními experimenty bylo dokázáno, že nejúčinnější je injekční podání, při kterém k vyvolání infekce stačí cca 100 částic viru (Bailey et al. 1963; Bailey 1965). Ačkoli tento výsledek napovídá, že při šíření viru může mít velký vliv V. destructor, ve skutečnosti nikdy nebyla zaznamenána souvislost mezi onemocněním CBPV a tímto parazitem (Ball a Allen 1988 in Aubert et al. 2008). Donedávna nebyl tento virus zaznamenán ani u vzorků analyzovaných roztočů (Tentcheva et al. 2004). Nález tohoto viru u V. destructor poprvé dokládá Celle et al. (2008) u vzorku roztočů pocházejících ze včelstva napadeného CBPV. Počet kopií viru v těle roztoče však byl relativně nízký, řádově 10 4 kopií na jedince (pro srovnání: dospělá dělnice s příznaky paralýzy obsahuje cca 1,9 10 13 kopií, dělnice a trubci bez příznaků maximálně 3,4 10 6 kopií viru). Jako méně účinné se ukázalo podání na kutikulu zbavenou chloupků, kdy k vyvolání otevřené infekce bylo potřeba aplikovat minimálně 10 7 částic viru (Ribière et al. 2004 in Aubert et al. 2008). Nejméně účinné bylo podání prostřednictvím potravy (Bailey 1965), jelikož minimální dávka viru dostačující k vyvolání otevřené infekce musela obsahovat alespoň 10 10 částic (Bailey et al. 1983). I když je nepravděpodobné, že by v přirozených podmínkách mohlo dojít k pozření takto vysoké dávky viru, může tento druh šíření významně přispívat k šíření viru mezi jedinci (Bailey 1965). Kromě horizontálního šíření je možné i šíření vertikální, a to z matky na potomstvo. Analýzou pomocí metod molekulární biologie bylo zjištěno, že částice CBPV byly nalezeny jak u matek (67 %), tak u vajíček (50 %), larev (17 %) a dospělých potomků (17 %) pocházejících od těchto matek. Nicméně v případě matek nebyly částice CBPV nalezeny v jejich vaječnících, ale pouze v těle a hemolymfě. Vysvětlením však může být nízká koncentrace virových částic ve vaječnících, kterou nebylo možné zachytit (Chen et al. 2006b). 35