Ing. Lubomír Věchet, CSc. Metodika poznání braničnatky pšeničné (Mycosphaerella graminicola) a hodnocení symptomů. METODIKA PRO ÚTVARY STÁTNÍ SPRÁVY Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
Metodika vznikla za finanční podpory Mze ČR a je výstupem projektu č. 0002700603. Oponenti: Ing. Markytánová, Odbor rostlinných komodit, Ministerstvo zemědělství. Metodika je určena pro orgány státní správy, poradenské privátní firmy a Ovocnářskou unii Čech a Moravy. Metodika byla schválena odborem výzkumu MZe, odd. NAZV pod č.j. 696/2008-17220. Ministerstvo doporučuje tuto metodiku pro využití orgány státní správy. O uplatnění metodiky byla 27.11.2007 uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Metodika je poskytována bezplatně. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-32-4
Obsah Cíl 1 Úvod 1 Příznaky, metody detekce, škodlivost choroby 1-5 Hodnocení choroby a ochranná opatření 5-6 Proměnlivost populace patogena. 6 Reprodukce patogena 6-7 Proces infekce 7-8 Rezistence pšenice k Mycosphaerella graminicola 8 Obranné mechanizmy pšenice 9 Metodika je prvotní originál Testy rezistence odrůd (listové segmenty) k braničnatce pšeničné
Cílem metodiky je seznámit uživatele (pracovníci Státní rostlinolékařské správy, zemědělská praxe) s narůstající závažností braničnatky pšeničné, škodlivosti, charakterizovat příznaky ochoření, metody detekce, sjednotit hodnocení choroby, proměnlivosti populace patogena, informovat o procesu infekce, vývoji a reprodukci patogena, poukázat na rezistenci k chorobě a na obranné mechanizmy pšenice. Úvod Listové skvrnitosti na obilninách jsou způsobeny třemi původci chorob. Braničnatka pšeničná, asexuální stádium - Septoria tritici Roberge in Desmaz, sexuální stádium Mycosphaerella graminicola Fuckel) J.Schrőt. in Cohn způsobuje chorobu pouze na listech. Braničnatka plevová, asexuální stádium - Septoria (syn. Stagonospora) nodorum (Berk.) E. Castell. & E.G způsobuje chorobu listů a pluch v klase. Helmitospiriová skvrnitost způsobená Pyrenophora tritici-repetis (asexuální stádium Drechslera tritici-repentis) napadá listy a klasy. Symptomy choroby způsobené Septoria tritici a Septoria nodorum jsou si velmi podobné. Braničnatka pšeničná je jednou z nejvážnějších chorob pšenice na světě a to zvláště v posledních patnácti až dvaceti pěti letech. Její původce M. graminicolla způsobuje vážnou chorobou ve všech oblastech pěstování pšenice, zejména v místech s relativně vysokými srážkami a středními teplotami. Způsobuje závažné ztráty na výnosu. Choroba končí v časném stárnutí tkáně listů a tudíž v redukci fotosyntetické aktivity. Uvádí se, že M. graminicola způsobuje ztráty u Evropských pěstitelů pšenice cca. 0,4 miliard Euro. Bylo naznačeno, že k tomu přispívá zvýšená náchylnost pěstovaných odrůd. Příznaky, metody detekce, škodlivost choroby Infekční proces M. graminicola a S nodorum je podobný, ale u braničnatky pšeničné je známé pronikání do mezibuněčného prostoru listu pouze průduchem. Symptomy braničnatky pšeničné obvykle začínají zprvu jako nepravidelné obdélníkové chlorotické skvrny a obvykle se objevují od pěti do šesti dnů po penetraci. Příznaky ochoření se projevují na podzim, kdy se na listech vytvářejí oválné, ve středu světlejší skvrny, které se vyvíjejí do nepravidelných nekrotických lézí. Skvrny často splývají, listy žloutnou a odumírají. Na spodnějších listech se prvně objevují žluté skvrny. Barva skvrn se postupně mění do červenohnědé nebo šedohnědé. Později se skvrny vyvíjejí i ve vyšších listových patrech. Rozsah skvrn se pohybuje až do délky 15mm a šířky 5mm. Skvrny často splývají, listy žloutnou a odumírají. Ve skvrnách se hustě tvoří, po relativně dlouhé latentní periodě po více než tří týdnů, tmavohnědé a ž černé pyknidy (lahvicovitý ponořený útvar plodnička obsahující konidie pyknospory). Ty jsou zapuštěny v epidermální a mezofylové tkáni po obou stranách listu s otvorem na vrcholu. Existuje značná variabilita v symptomech choroby. Na listech můžeme spatřit jednotlivé skvrny, které jsou nakupeny těsně vedle sebe a je mnohdy obtížné je rozlišit (Obr. 4). Velikost je od drobných až po velké skvrny. Tvar skvrn může být značně protáhlý, úzký, až poměrně široký a krátký. V nich se hustě tvoří tmavohnědé až černé pyknidy, po relativně dlouhé latentní periodě více než tří týdnů. Symptomy braničnatky plevové jsou často skvrny čočkovitého tvaru se žluto-zeleným okrajem obklopujícím nekrotickou plochu. Později se na listech vytvářejí tmavě hnědé fleky nebo skvrny, někdy se žlutým lemem. Tyto malé, nepravidelné skvrny se zvětšují do oválných, světle hnědých skvrn s tmavě hnědými středy. Po objevení klasu se příznaky choroby objevují během dvou až tří týdnů. Na klasech pšenice jsou patrné skvrny buď jako našedlé nebo nahnědlé skvrny obvykle v horní třetině plev. Jak se skvrny zvětšují, stávají 1
tmavě hnědými a středy skvrny přecházejí do našedle bílé barvy. Uvnitř skvrny se tvoří maličké hnědé pyknidy. Ty jsou však obtížně viditelné bez pomoci kapesní lupy. U helmitosporiové skvrnitosti jsou prvními příznaky malé, oválné až kosočtverečné skvrny. Postupně se léze prohlubují a rozvíjí se světlehnědá barva s chlorotickým okrajem a s tmavě hnědým středem. V pozdějším stádiu jde o nepravidelně ohraničené zhnědnutí se žlutým okolím a tmavohnědým centrem infekce. Na mladých rostlinách chlorózy splývají. Tento patogen může infikovat také zrna pšenice, která jsou pak červeně zabarvená. Původce produkuje hostitelsky specifické toxiny. Izoláty byly klasifikovány do 11 ras na základě schopnosti indukovat světlehnědé nekrózy nebo rozsáhlé chlorózy na řadě diferenciačních odrůd. Skvrny obou braničnatek, pšeničné a plevové, se mohou vyskytovat na tom samém listu, léze se mohou překrývat, což dělá diagnózu obtížnou. Obě braničnatky jsou však odlišné v požadavcích na teplotu. Septoria tritici je nejvíce agresivní během 15-20 C, zatímco Septoria nodorum je nejvíce agresivní během 20-27 C. Projev symptomů kolísá s izolátem a testovanou linií. V poslední době se ukazuje, že interakce linie pšenice s izolátem STB musí být proto identifikovány statisticky, spíše než fenotypem interakce hostitel-parazit. Patologické testy se provádějí na oddělených listových segmentech podle metody Arriano et al.. Tato metoda je používána také na našem pracovišti. Výskyt braničnatky pšeničné je ovlivněn podmínkami počasí. Někdy, jako koncem března roku 2005, může dojít k časnému silnému napadení chorobou (Obr. 5). K detekci M. graminicola je také možné použít molekulární diagnostické metody PCR (polymerázová řetězová reakce) nebo reverzní transkripci (RT)-PCR. Choroba končí v časném stárnutí tkáně listů a tudíž v redukci fotosyntetické aktivity. Obr. 1. Pyknospory M. graminicola, odrůda Hereward. Obr. 2. Crirhy, nitkovitého tvaru, tvořené na pyknidách M. graminicola, odrůda Galaxie. 2
2a. Cirrhy kapkovitého tvaru, tvořené na pyknidách M. graminicola, odrůda Oasis. Obr. 3. Horní obrázek představuje pyknidy M. graminicola vytvořené na zelené části listu odrůdy Rheia. Spodní obrázek ukazuje pyknidy v nekrotických skvrnách i mimo skvrn na zelené části listu odrůdy Lívia. 3
Obr. 4. Různé tvary skvrn braničnatky pšeničné. 4
0br. 5. Odrůda Meritto napadená braničnatkou pšeničnou brzy na jaře (foceno 30.3.2005). Hodnocení choroby a ochranná opatření Hladiny této choroby jsou často plynulé, pohybující se od úplné imunity, se žádnými pyknidami, k úplné náchylnosti se stoprocentním pokrytím listové plochy pyknidy. Závažnost choroby se hodnotí vizuálně, jako procento listové plochy pokryté skvrnami, nesoucí pyknidy, minimálně v jednom nebo až třech časových intervalech na prvním 5
(praporcovém) nebo druhém listu shora. Tato metoda poskytuje nejvíce přesné a odpovídající výsledky. Podle je lépe, když vizuální odhad provádějí dva odhadci, aby se snížilo riziko subjektivní chyby. K posouzení rezistence nebo náchylnosti odrůd, ale i intenzity výskytu, je možné použít rozčlenění závažnosti napadení na rezistentní je 0-20% nekrotických skvrn, středně rezistentní 21 40% a náchylnou je > 49% nekrotických skvrn. Použití fungicidů ke kontrole braničnatky pšeničné je drahé a není zcela spolehlivé. Nedávno bylo hlášeno, že se izoláty M. graminicola staly obecně rezistentní ke strobulinovým (Qo inhibitor, QoI) fungicidům v Evropě a to je všeobecným neúspěchem QoI fungicidů ke kontrole této choroby. Při časném objevení choroby na jaře je třeba provést první ochranný zásah již na počátku sloupkovaní. Nelze příliš očekávat, že použité a doporučené fungicidní přípravky zničí již vytvořenou infekci na listech napadených již na podzim. Tyto přípravky (většinou triazoly a strobuliny) mají v období maximálního růstu rostlin účinnost pouze 3 4 týdny. Je proto třeba počítat s druhým ošetřením, v době objevení praporcového listu. Při volbě termínu ošetření je třeba zachytit počátek dalšího šíření choroby v porostu, v závislosti na srážkách a ovlhčení povrchu listu. Hledají se také další prostředky (například ABC transportéry proteinů) k posílení fungicidu cyproconazole. Proměnlivost populace patogena Sexuální stádium má hlavní vliv na genetickou strukturu populací M. graminicola, které jsou charakterizováni vysokými hladinami genové a genotypové diverzity. Genotypy M. graminicola mají odlišné morfologické charakteristiky, hlavně tvar, velikost, barvu stélky a spor. Albínové typy typy izolátů a izoláty podobné kvasnicím byly nejméně virulentní i na rezistentních a náchylných odrůdách. Morfologickou a barevnou variabilitu izolátů M. graminicola jsme zjistili také na našem území. Ukázky široké proměnlivosti izolátů z různých odrůd pšenice a z oblastí Prahy, Plzně a Ústí n. Orlicí zobrazené v kruhové tvaru jsou umístěny na webové stránce: http://www.vurv.cz/index.php?key=section&id=316. Uvádí se, že při určení agresivity izolátů S. tritici by velikost skvrn na pšenici měla mít přímé účinky na závažnost choroby. Klusterová analýza rozsahu procenta pyknid na prvních listech seskupila izoláty do šesti virulentních skupin a odrůdy do pěti rezistentních skupin. Podobná analýza na nekrózy seskupila izoláty do osmi skupin virulence a odrůdy do šesti skupin rezistence. Mezi izoláty M. graminicola byla demonstrována lokální specifická adaptace. To naznačuje, že izoláty byly více virulentní k odrůdám pšenice, kterým byly předtím vystaveny. Nedávné studie přinesly důkaz rozdílných interakcí odrůda izoláty. Uvádí se, že byly nalezeny silné, specifické interakce mezi odrůdami pšenice a izoláty patogena na semenáčích i na dospělých rostlinách. Byla zjištěna redukce v rozsahu pyknid na odrůdě Seri82 po inokulaci dvěma izoláty S. tritici, virulentním a avirulentním. Dochází k výraznému potlačení pokryvnosti skvrn pyknidami, když byly semenáče pšenice inokulovány směsí složenou z virulentních a avirulentních izolátů S. tritici. Srovnání s izoláty M. graminicola z jiných regionů ukazuje také značnou geografickou diferenciaci pro patogenitu, pravděpodobně způsobenou selekčním tlakem různých hostitelů. Populace M. graminicola má různé hladiny genetické variability, jak bylo ukázáno pomocí molekulárních markérů. Vysoká frekvence sexuální reprodukce v populacích M. graminicola by mohla končit v rychlé ztrátě efektivnosti rezistence u nově rezistentních odrůd, kvůli rekombinaci genů pro virulenci a agresivitu v populaci patogena. Reprodukce patogena Sexuální stádium braničnatky pšeničné Mycosphaerella graminicola je charakteristické vznikem askokarpů (plodnice vřeckatých hub uzavírající vřecka), ve kterých se tvoří askospory. Ty mají dvě buňky a jsou nerovnoměrné ve velikosti. Askospory (tvoří se ve vřecku askus) nejsou pouze primárním zdrojem inokula, které spouští epidemii, ale mají 6
hlavní vliv na genetickou strukturu populací M. graminicola, která je charakterizována vysokými hladinami genové a genotypové diverzity. Poměr reprodukce sexuální k asexuální u M. graminicola je pravděpodobně silně podmíněn hustotou infekce. Asexuální stádium patogena tvoří štíhlé, prodloužené pyknospory uzavřené uvnitř pyknidy. Pyknidy jsou zapuštěny v epidermální a mezofylové tkáni na obou stranách listu s otvorem na vrcholu. Pyknospory M. graminicola mohou být prezentovány ve dvou formách uvnitř pyknidy: makropyknospory (35-98 x 1-3 μm) se 3-5 septy nebo mikropyknospory (8-10,5 x 0,8-1 μm) bez sept. Obě sporové formy jsou schopny infikovat pšenici. Morfologický vzhled asexuálních pyknid a sexuálních askospor je zcela podobný. To může vést k nesprávnému závěru, že pyknospory jsou jediným zdrojem primární infekce. Pyknospory jsou uvolněny z pyknid, když byl list 30 min. nebo déle ovlhčen. Jsou tvořeny v hustých, často lepkavých lícních formách obsahující vysokou koncentraci zabezpečujících cukrů a proteinů. Toto zabezpečující médium nebo ronící kapka pyknospor zůstává životné během období suchého počasí. Prosakující (ronící) kapka nebo cirrhus, obsahující pyknospory se šíří skrz pór na vrcholu pyknidy následované dostatečnou vlhkostí listu. Cirrhus je tedy gel složený z proteinových a sacharidových složek. Prvotní úloha cirrhu je ochrana pyknospor od vysušení a ochrana před předčasným klíčením. Proces infekce Za optimálních podmínek, příznivé teploty a vysoké relativní vlhkosti, se změna v životním stylu houby vyskytne přibližně za 10 dnů po inokulaci. Dojde ke zhroucení mezofylu, které končí v chlorózách a nekrózách listu hostitele. Rychlost kolapsu mezofylu a skutečnost, že buňky jsou postiženy bez přítomnosti mycelia, dává tušit, že v interakci M. graminicola a pšenice jsou zahrnuty toxické rozpustné sloučeniny. Obojí, sexuální ascospory a aseksuální pyknospory po přistání na listu hostitele a za podmínek vysoké vlhkosti klíčí klíčkem a hyfa se táhne po listu. Při infekci houba proniká list pasivně skrz průduch listu. Jakmile je houba uvnitř listu, kolonizuje mezofylovou tkáň v přísně intercelulárním způsobu, ale netvoří žádné stravovací struktury, tak jako jsou haustoria. U náchylných odrůd je tvořeno vysoké množství biomasy hyf houby, zatímco u rezistentních odrůd se zdá být vývoj houby omezen. V současné době je relativně dobře pochopena neobvyklá biologie infekce a kolonizace M. graminicola. Během počáteční fáze kolonizace mycelium patogena roste a větví se uvnitř stomatálních dutin a v mezibuněčných prostorách mezi mezofylovými buňkami. V této latentní periodě nejsou hostitelské buňky poškozeny a nejsou patrné žádné viditelné symptomy, navzdory hromadění významného množství biomasy houby uvnitř listu. Z důvodů, které ještě nejsou plně jasné, se toto neagresivní spojení nakonec nenávratně rozpadne a patogen nastupuje více virulentní, nekrotrofní fází. Toto období cyklu, které probíhá ve stejnou dobu s objevením pyknid uvnitř substomatálních prostor a proto se objevují v řadách paralelně vaskulárních žil listu. To vede k vývoji charakteristických symptomů skvrny pro tuto chorobu. Během období vysoké vlhkosti jsou z pyknid uvolněny vyzrálé pyknospory v extralelulárním lůžku matrix, cirrhus (úponka), (Obr. 2) na vrcholu se stomatálním otvorem. Po případném zaschnutí se část prosakující kapky může vrátit do pyknidy nebo zůstat na vrcholu póru pro další zvýšenou vlhkost. K vývoji symptomů skvrny charakteristických pro tuto chorobu, objevením pyknid, dojde v období cyklu přechodu z biotrofní do nekrotrofní fáze. Někdy je možné vidět tvorbu pyknid před vznikem charakteristické nekrotické skvrny (Obr. 3). Pletivo listu v této oblasti je ještě zelené nebo na přechodu od zelené po hnědou. Pyknidy produkují asexuální pyknospory. Po delším období 5-12 týdnů se objevují pseudothecia se sexuálními askosporami. Pyknospory jsou rozptylovány na krátké vzdálenosti dešťovými stříkanci, zatímco askospory jsou rozptylovány větrem na dlouhé vzdálenosti. U 7
pšenice jsou primární infekce na podzim pravděpodobně iniciovány askosporami, které se vyskytují přes sezónu pěstování plodin. Během tohoto období pyknospory přispívají více k vývoji choroby, především díky kratšímu období od infekce ke sporulaci, ve srovnání s askosporami. Informace obdržené ze studia plodiny naznačují, že pseudothecia se vyvinou na odumřelé tkáni listu uvnitř hranice staré skvrny. Interval mezi tvorbou pyknidy a pozorováním pseudothecia může kolísat od 62 do 95 dnů, v závislosti na klimatických podmínkách. Avšak za vhodných podmínek v Holandsku bylo hlášeno, že M. graminicola je schopna dokončit sexuální cyklus během 35 dnů. Bylo zjištěno, že v té samotné skvrně se může vyskytnout několik genotypů patogena, což vede uvnitř hostitele ke konkurenci a selekci pro vyšší virulenci patogena. Rezistence pšenice k Mycosphaerella graminicola Rezistentní odrůdy poskytují efektivní a ekonomický způsob kontroly choroby, ale až donedávna bylo málo známo o genetice rezistence k braničnatce pšeničné a šlechtitelé spoléhali na neznámé geny rezistence. Rezistence k M. graminicola je obtížný rys, který je vysoce závislý na podmínkách prostředí. Kromě dlouhé latentní periody, je vývoj odrůd rezistentních k M. graminicola komplikován vlivy prostředí na projevy symptomu a kolísáním mezi hodnotiteli v použití bodovacích systémů. V současné době je známo osm major genů rezistence. Bylo zjištěno, že odrůdy a linie NSL9257, CWW93/58, Batis, Verna, Reaper, Estica a Ordeal měly vysokou hladinu polní rezistence k septoriové skvrnitosti. Mnoho starších odrůd je středně rezistentní k M. graminicola a některé novější odrůdy jsou náchylné. Existují také příklady rezistentních odrůd, které se staly náchylnými k místní populaci M. graminicola po několika letech pěstování. Pšenice je náchylná k braničnatce pšeničné v kterémkoliv stádiu vývoje hostitelské rostliny. To znamená od stádia semenáčů až po dospělé rostliny. Jedna z prvních odrůd identifikovaná jako zdroj rezistence k této chorobě byla odrůda Kavkaz-K4500 L.6.A.4 (KK). Tato odrůda byla použita ve šlechtitelských programech CIMMYT v letech 1970. Je však zajímavé, že KK je náchylná k většině populace M. graminicola v Anglii. Přes to je ale v jinýc oblastech rezistentní v polních podmínkách a je velmi náchylná k virulentním izolátům M. graminicola v semenáčových testech. V této studii bylo ukázáno, že rezistence KK k těmto izolátům je kontrolována kombinací genů zahrnujících geny na chromozómu 4A, jeden z nich může být Stb7 a jiný je pojmenován Stb12 a třetí gen pojmenován Stb10 na chromozómu 1D. Bylo také zjištěno, že britská odrůda Flame nese gen rezistence Stb6 Rezistence Stb6 je vyjádřena ve stádiu semenáčů a v dospělost, ale není známo, jestli je tato rezistence také efektivní v případě pro ostatní izolátově-specifické rezistence. Specifická rezistence asi není trvalá, protože podmnožina populace patogena se může k tomuto typu rezistence adaptovat. Uvádí se, že náchylnost rostliny k braničnatce pšeničné se zvyšovala se stářím rostliny. Má se také za to, že proteolytická aktivita extracelulárního prostoru listu se může podílet na obraně rostlin pšenice protim. graminicola. Jeho regulace může být specifickou obrannou součástí každé odrůdy. Například švýcarská odrůda Arina ukázala rezistenci pouze k izolátům, které jsou avirulentní k Stb6. Uvádí se, že odrůda Gene, když byla zpočátku uvolněna pro komerční produkci, byla vysoce rezistentní v roce 1992, třebaže v posledních letech byly pozorovány zvýšené hladiny septoriové skvrnitosti. Patologické testy se provádějí na oddělených listových segmentech podle metody Arriano et al. (2001). Tato metoda je používána také na našem pracovišti. 8
Obranné mechanizmy pšenice V pokusech s proteolytickou aktivitou extracelulárního prostoru listů pšenice bylo zjištěno, že se tato může účastnit v obraně pšenice proti M. graminicola. Pšenice reaguje mnohem rychleji, než se předtím věřilo, k signálům tvořených M. graminicola. V rezistentních liniích byla přímo regulována lipoxygenáza pšenice v časových bodech, které se shodovaly s vrcholem indukce PR (k patogenezi vztažených) genů. Tyto časné reakce začínají dříve, než penetrace hostitele a zdá se, že určují výsledek interakce hostitel-patogen. K identifikaci genů hostitele zahrnutých v rezistentní reakci, bylo použito vyjádření profilů pšenice linie Tadinia (mající gen rezistence Stb4) a náchylné linie Yecora Rojo, neinokulovaných nebo inokulovaných M. graminicola, které byly srovnány s rozdílným projevem reakcí polymerázového řetězce (DD-PCR). Mezi odlišně vyjádřenými geny byla izomeráza protein disulfidu, která je dobře známá jako molekulární průvodce a komponent drah signální transdukce v systémech živočichů, ale nebyla předtím zapletena v obranných reakcích rostliny. Výsledky naznačují, že proteolytická aktivita listového extracelulárního prostoru se může účastnit v obraně pšenice proti této chorobě. Izoláty M. graminicola produkují také řadu enzymů, které narušují buněčnou stěnu. Tento výzkum byl podporován výzkumným záměrem MZE č. 0002700602. 9