1. SPEKTROFOTOMETRIE Analytické metody Vladimíra Kvasnicová 2. CHROMATOGRAFIE 3. POTENCIOMETRIE 4. VOLUMETRIE Spektrofotometrie Materiál používaný pro analýzu: ROZTOK spektrofotometr
PRINCIP interakce mezi stanovovaným analytem a monochromatickým zářením část záření je absorbována stanovovanou látkou, zbývající záření je detekováno detektorem množství absorbovaného záření je přímo úměrné množství analyzované látky Spektrofotometrie je kvantitativní metoda: stanovujeme KONCENTRACI koncentrace tmavší roztok absorpce Důležité termíny vzorek = analyzovaný roztok neznámý vzorek = vzorek o neznámé koncentraci standard = vzorek o známé koncentraci blank = roztok neobsahující analyzovanou látku chromofor = část struktury chemické látky, která je schopna absorbovat záření určité vlnové délky fialová modrá zelená žlutá oranžová červená 380 450 nm 450 495 nm 495 570 nm 570 590 nm 590 620 nm 620 750 nm viz. http://en.wikipedia.org/wiki/electromagnetic_spectrum
Používané elektromagnetické záření barevné vzorky: bezbarvé vzorky: viditelné (VIS) UV záření Obrázek převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/electromagnetic_spectrum (2006) Komplementární barvy A / λ absorpční spektrum
SCHÉMA spektrofotometru Které veličiny jsou měřeny? TRANSMITANCE = poměr intenzity záření vystupujícího z kyvety (I) k intenzitě záření do kyvety vstupující (I o ) (tj. záření dopadající na detektor / původní záření) T = I / I o T = 0 1 nebo v procentech % (0 100 %) Jak se vyjadřuje množství pohlceného záření? T 1 prošlo (%) 100 pohlceno (%) 0 A 0 veličina odvozená od transmitance: A = - log 10 T ABSORBANCE = - log 10 (I/I 0 ) = log 10 (I 0 /I) = log 10 (1/T) 0.99 0.90 0.50 0.10 99 90 50 10 1 10 50 90 0.004 0.05 0.3 1.0 A = 0 1.0 (1.5 nebo více) horní limit závisí na citlivosti detektoru 0.01 0.001 1 0.1 99 99.9 2.0 3.0 0.0001 0.01 99.99 4.0
T 1 prošlo (%) 100 pohlceno (%) 0 A 0 Zjištění koncentrace: 0.99 99 1 0.004 0.90 90 10 0.05 1. Lambert-Beerův zákon 0.50 0.10 50 10 50 90 0.3 1.0 2. Kalibrační křivka 3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků 0.01 1 99 2.0 0.001 0.1 99.9 3.0 0.0001 0.01 99.99 4.0 citlivosti detektoru Zjištění koncentrace: Lambert-Beerův zákon A = ε x l x c nebo T = 10 - (ε x l x c) A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10 -A ) ε = molární absorpční ( extinkční ) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace 3 a více standardů zpracovaných stejnou metodou lineární kalibrační křivka A = ε x l x c y = kx + q Kalibrační křivka
Výpočet pomocí standardů A st = c st x l x ε A vz = c vz x l x ε A st / c st = l x ε A vz / c vz = l x ε l x ε = l x ε A st / c st = A vz / c vz c vz = A vz x (c st / A st ) c vz = A vz x f f = průměr všech (c st / A st ) použitých při experimentu Cvičení 1) A vz = 0,25 C vz =? A st = 0,40 C st = 4mg / L [2,5mg/L] 2) standard glukózy: Cs = 1000mg/L, T = 0,49. neznámý vzorek: T = 0,55, C vz =? (v mg/l i mmol/l) MW = 180g [839mg/L = 4,7mM ] 3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44 Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se standardem. [4/3] Přesnost stanovení Spektrofotometrie v praktickém cvičení absorpce ostatními látkami přítomnými ve vzorku musí být eliminována: Stanovení koncentrace kreatininu v moči analyzovaný vzorek: vlastní moč BLANK (slepý pokus) jeho absorbance se odečte od absorbance vzorku výsledná absorbance odpovídá pouze koncentraci analyzované látky 1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí 2. koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky
Chromatografie chromatograf Obrázek převzat z http://www.fredmiranda.com/hosting-data/500/43850455-end-of-the-rainbow.jpg (říjen 2007) PRINCIP Všechny chromatografické techniky nejsou instrumentální... Separace směsi různých látek je založena na rozdílné distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: stacionární fáze (pevná nebo kapalná) mobilní fáze (kapalná nebo plynná) TLC chromatografie = úkol v praktiku Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.
pokud je afinita látky k mobilní fázi vysoká, látka putuje systémem rychleji než látka s nižší afinitou pokud je afinita látky ke stacionární fázi vysoká, látka je ve stacionární fázi déle zadržována a pohybuje se sytémem pomaleji než látka mající nižší afinitu Obrázek převzat z http://www.chemistry.vt.edu/chem-ed/sep/lc/lc.html (listopad 2006) Co je cílem analýzy? 1. rozdělit (separovat) od sebe jednotlivé látky 2. identifikovat látky (= kvalitativní analýza) 3. stanovit koncentraci přítomných látek (= kvantitativní analýza)
Klasifikace chromatografických technik 1) podle mobilní fáze kapalinová chromatografie (LC) plynová chromatografie (GC) 2) podle uspořádání planární (rovinná) chromatografie chromatografie v koloně 3) podle fyzikálněchemických interakcí adsorpční chromatografie rozdělovací chromatografie gelová permeační chromatografie (GPC) chromatografie na iontoměničních (IONEX) afinitní chromatografie Fyzikálně-chemické mechanismy separace adsorpce rozpouštění sítový efekt gelová chromatografie kapalinová v koloně manuální chromatografie iontová výměna Snímek převzat z prezentace analyticke_metody / Petr Tůma specifická interakceafinitní chromatografie
příklad: kapalinová v koloně instrumentální chromatografie kapalinová planární chromatografie Plynová chromatografie (GC) http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-6.html Obrázek převzat z http://www.cofc.edu/~kinard/221lchem/ (listopad 2006) Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006)
Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006) Obrázek převzat z http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/255/255tech/255techniques.htm (listopad 2006) Vyhodnocení chromatogramu 2) chromatografie v koloně (HPLC, GC) 1) planární chromatografie (př. TLC) Porovnání píků se Porovnání skvrn se standardy: standardy: R f = a /b b a t R = retenčníčas identifikace látek R f = retardační faktor ( rate of flow ) a = vzdálenost start-střed skvrny b = vzdálenost start-čelo mobilní f. Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006) h = výška píku koncentrace látek píky
Chromatografie v praktickém cvičení TLC lipofilních barviv Demonstrace HPLC a GC HPLC = High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) = adsorpční planární kapalinová chromatografie mobilní fáze: toluen (nepolární) stacionární fáze: destička se silikagelem (polární) stadardy barviv porovnání R f neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva normální nebo reverzní fáze princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.) GC = Gas Chromatography (plynová chromatografie) Obrázek převzat z http://images.epilogue.net/users/lorangel/the_alchemist.jpg (říjen 2007)
Potenciometrie PRINCIP Potenciometrie je elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu. potenciometr dvě elektrody: indikační (měřící) elektroda referentní (srovnávací) elektroda Schéma: Elektrody indikační elektroda její potenciál závisí na složení roztoku referentní elektroda její potenciál je stabilní (konstantní, známý) Měřit přímo potenciál jako takový nelze měříme rozdíl potenciálů (=napětí)
Nernstova rovnice E = E 0 + (RT/nF) ln a M indikační elektrody Obrázek převzat z http://food.oregonstate.edu/images/ph/beck8.jpg (2006) E = elektrodový potenciál E 0 = standardní elektrodový potenciál R = molární plynová konstanta (8.314 J K -1 mol -1 ) F = Faradayova konstanta (96 458 C mol -1 ) T = absolutní teplota (25 0 C = 298 K) n = náboj stanovovaného iontu (M) a = aktivita stanovovaného iontu E = E 0 + (RT/nF) ln a M ln a = 2.303 log a; dosazeno za R, T a F E = E 0 + (0.059/n) log a M! DŮLEŽITÉ! elektrodový potenciál závisí na teplotě roztoku, aktivitě ( koncentraci ) a náboji stanovovaného iontu elektrodový potenciál nepotřebujeme počítat: ke kalibraci potenciometru používáme standardy Obecná klasifikace elektrod 1) elektrody I. druhu (kovové nebo plynové) 2) elektrody II. druhu (kov + jeho nerozpustná sůl) REFERENTNÍ ELEKTRODY 3) redoxní elektrody (Pt, Au) 4) membránové elektrody ISE = iontově selektivní elektr. (stanovení iontů v medicíně: H +, Na +, K +, Cl -,...)
Standardní vodíková elektroda (SHE) plynová elektroda její potenciál byl definován: E SHE = 0 za všech podmínek kalomelová Referentní elektrody argent-chloridová REFERENTNÍ ELEKTRODA, ale v praxi se běžně nepoužívá SHE Skleněná elektroda Membránové elektrody na stanovení plynů = ISE (H + ) membránová electroda stanovení ph
tělo sensoru vnitřní elektrolyt skleněná elektroda permeabilní membrána ph-metr analyzované prostředí referentní elektroda skleněná elektroda CO 2+H 2O HCO - 3+H+ film elytu permeabilní membrána CO 2 (g) analyzované prostředí elektroda používaná na stanovení CO 2 v krvi Potenciometrie v praktickém cvičení Měření ph fosfátového pufru roztoky fosfátového pufru o různém složení stanovení ph pomocí ph-metru (= upravený potenciometr) kalibrace přístroje pomocí standardů skleněná kombinovaná elektroda ( dvojče ) Skleněná kombinovaná elektroda Skleněná kombinovaná elektroda v praktiku plnicí otvor vnější refeferentní elektroda stínění přívod k vnější ref.elektrodě vnitřní vodič přívod k vnitřní ref.elektrodě solný můstek (keramická frita) skleněná membrána vnitřní referentní elektroda
Volumetrie (= titrace, odměrná analýza) A večer nabereme vzoreček krve... Obrázek převzat z http://xnet.kp.org/permanentejournal/fall02/images/draccartoon.jpg (říjen 2007) Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem titrace = zjištění přesné koncentrace vzorku byreta s odměrným roztokem titrační baňka s naředěným analyzovaným vzorkem PRINCIP K analyzované látce se pomocí byrety postupně přidává roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického poměru reagujících látek (= bod ekvivalence) bod ekvivalence = reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisující probíhající reakci
Odměrný roztok (OR) známé, přesně definované složení jeho koncentraci lze přesně stanovit pomocí stadardu o známé a neměnné koncentraci reaguje se stanovovanou látkou rychle, bez vedlejších reakcí reakci lze popsat chemickou rovnicí v bodě ekvivalence dochází skokem k fyzikálně-chemické změně, kterou je možno snadno indikovat Zjištění přesné koncentrace OR titrací standardu o přesně známé koncentraci porovnání teoretické (předpokládané, vypočítané) spotřeby se skutečnou (aktuální, titrací zjištěnou): V t / V a = f f = faktor odměrného roztoku (0,900 1,100) aktuální konc. OR (= titr): c a = f x c t faktorem při výpočtu koncentrace vzorku násobíme teoretickou hodnotu koncentrace OR Výpočet koncentrace vzorku založen na znalosti stechiometrie chemické reakce a A + b B c C + d D a, b, c, d = stechiometrické koeficienty = látkové množství (n) A = odměrný roztok, B = analyzovaná látka a / b = n(a) / n(b) a / b = n(a) / n(b) c = n / V n = c x V c = molární koncentrace (mol/l) n = látkové množství (mol) V = objem roztoku a, b = stechiometrické koeficienty a x n(b) = b x n(a) a x c B x V B = b x c A x V A
a x c B x V B = b x c A x V A známe stechiometrii chemické reakce známe koncentraci odměrného roztoku a jeho objem spotřebovaný při dosažení bodu ekvivalence známe objem vzorku použitého pro analýzu Cvičení 1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH, (f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H 2 SO 4 ; C =? [0,12M] 2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO 4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO 4 ; C =? (mol/ L, % ), MW = 152g [0,25M = 3,8% ] jediná neznámá je koncentrace vzorku c B 3) H 3 PO 4 Na 2 HPO 4 vzorek: 20ml H 3 PO 4 (C = 0,3M ), odměrný roztok: 0,2M NaOH V =? [60ml] Titraci provádí jedna osoba: po kapkách přidává OR z byrety za stálého promíchávání obsahu titrační baňky Indikace bodu ekvivalence 1) pomocí indikátoru jednoduché, ale subjektivní hodnocení bod ekvivalence objemu OR po jehož přidání změní titrovaný roztok trvale své zbarvení indikuje první nadbytečnou kapku přidaného OR ve skutečnosti je při změně zbarvení roztok přetitrován 2) pomocí přístroje (např. potenciometru) objektivní vyhodnocuje se TITRAČNÍ KŘIVKA
Titrační křivka titrace kyseliny hydroxidem titrace hydroxidu kyselinou měřená veličina indikátory odměrný roztok odměrný roztok Klasifikace titrací Titrační křivky a pk http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz 02/2-15.html http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz 02/2-16.html 1) neutralizační (acidobazické) kyselina /báze H + + OH - H 2 O 2) oxidačně-redukční (redox) ox./red. činidlo oxidace: red ox + e - redukce: ox red + e - 3) srážecí př. AgNO 3 vznik nerozpustné sraženiny 4) komplexometrické př. EDTA vznik koordinačně-kovalentní sloučeniny
Titrace v praktickém cvičení Stanovení acidity žaludeční šťávy reaguje HCl ze žaludeční šťávy odměrný roztok: NaOH neutralizační titrace (= alkalimetrie) indikátor: fenolftalein (bezbarvý fialový) z konc. HCl se vypočítá ph žaludeční šťávy zjišťuje se ph před a po stimulaci (= na lačno a po jídle ) Obrázek převzat z http://success.shoreline.edu/mlt/debhitachi9172.jpg (říjen 2007) Návody na praktika + teorie metod a zkušební otázky: http://vyuka.lf3.cuni.cz (Buněčné základy medicíny, č. 112) Cvičení 1. 0,3 osmol/l MgCl 2 =... mol/l 2. c(st) = 15,0 mm A(St) = 0,600 c(vz) =... mm A(vz) = 0,200 3. c 1 = 0,10 mm / 10 x naředěno c 2 =... mm 4. 0,2 mol/l Na 2 HPO 4 =... osmol/l 5. T(St) = 0,25 T(vz) = 0,25 / porovnejte koncentrace 6. c 1 = 0,2 mm / c 2 = 0,002 mm? x naředěno 7. 0,1 mol/l NaCl =... osmol/l 8. T(St) = 0,30 T(vz) = 0,60 / porovnejte koncentrace 9. c 1 = 0,1 mm / c 2 = 0,01 mm? x naředěno 10. 0,1 mol/l NaH 2 PO 4 =... osmol/l
Cvičení 11. T(St) = 0,50 T(vz) = 0,30 / porovnejte koncentrace 12. c 1 = 0,2 mm / c 2 = 0,1 mm? x naředěno 13. 0,24 osmol/l KCl =... mol/l 14. c(st) = 10,0 mm A(St) = 0,400 c(vz) =... mm A(vz) = 0,200 15. c 1 = 0,2 mm / 10 x naředěno c 2 =... mm 16. 0,24 osmol/l NaH 2 PO 4 =... mol/l 17. c(st) = 5,0 mm A(St) = 0,300 c(vz) =... mm A(vz) = 0,600 18. c 1 = 0,2 mm / 100 x naředěno c 2 =... mm 19. 0,2 mol/l MgCl 2 =... osmol/l Cvičení 20. T(St) = 10% T(vz) = 40% / porovnejte koncentrace 21. c 1 = 0,25 mm / c 2 = 0,05 mm? x naředěno 22. 0,24 osmol/l glukóza =... mol/l 23. c(st) = 10,0 mm A(St) = 0,400 c(vz) =... mm A(vz) = 0,800 24. c 1 = 0,20 mm / 5 x naředěno c 2 =... mm 25. 0,3 osmol/l NaHCO 3 =... mol/l 26. c(st) = 20,0 mm A(St) = 0,800 c(vz) =... mm A(vz) = 0,200 27. c 1 = 0,10 mm / c 2 = 0,05 mm? x naředěno 28. 0,2 mol/l CaCl 2 =... osmol/l