Téma J05: Stanovení citlivosti bakterií na antimikrobiální látky, průkaz faktorů rezistence K nastudování: z učebnic a internetu: hesla například Difusní diskový test ; E-test ; diluční mikrometoda ; minimální inhibiční koncentrace Citlivost bakterií vůči antimikrobiálním látkám se stanovuje kvalitativně (difusní diskový test) nebo kvantitativně (stanovení minimální inhibiční nebo minimální baktericidní koncentrace). Významný je průkaz případné rezistence vyšetřovaného kmene. Úkol č. 1 Příprava difusního diskového testu Dvě kolonie Escherichia coli z Endovy půdy odeberte kličkou a suspendujte ve fyziologickém roztoku s glukosou. Vatovým tampónem na špejli naočkujte suspenzi hustými rovnoběžnými tahy na Muellerův- Hintonové agar. Misku pak otočte o 90 o a očkujte znovu. Po zaschnutí naklaďte jehlou alespoň 15 mm od okraje ve směru chodu hodinových ručiček následující sestavu disků a zapište si, co jste nakladli Název atb Název atb 1. 4. 2. 5. 3. 6. Prohlédněte si také dispensor, který slouží k rychlému kladení sestav disků, které se často používají Miska se inkubuje přes noc při 37 C. Antibiotika difundují do okolí disků. Je-li bakterie citlivá, vznikne kolem disku zóna inhibice růstu větší než stanovená referenční zóna. Úkol č. 2 Kvalitativní test citlivosti na antibiotika (difusní diskový test) a srovnání citlivosti grampozitivních a gramnegativních bakterií U difusních diskových testů porovnáváme nalezené zóny citlivosti s referenčními zónami, které nám poskytuje výrobce a které jsou vesměs stanoveny v souladu s doporučeními organizací, jako je evropská EUCAST či americká CLSI. Když je zóna větší nebo stejná jako referenční mez, říkáme, že kmen je na dané antibiotikum citlivý. Někdy jsou zóny tak velké, že ani není možné je změřit. Samozřejmě i v takových případech hodnotíme výsledek jako citlivý. Když je zóna menší než referenční mez, nebo pokud vůbec žádnou zónu nenalézáme (bakterie rostou až těsně k disku), popisujeme takový výsledek jako rezistentní. V některých případech jsou stanoveny dvě meze, přičemž leží-li změřená velikost zóny mezi nimi, považuje se kmen za intermediárně citlivý. Tato možnost interpretace existuje jen pro některá antibiotika a mikroby Zóna je větší než referenční mez. Takový výsledek lze vyhodnotit jako C (kmen je na dané antibiotikum citlivý) Zóna citlivosti je přítomna, avšak je menší než hraniční. V takovém případě se výsledek hodnotí jako R (kmen je rezistentní na dané antibiotikum) Zóna je tak velká, že ji ani nelze změřit, což ale nevadí, je evidentní, že kmen je citlivý ( C ) Zde není žádná viditelná zóna, proto kmen je rezistentní, R Používáme různé sestavy podle toho, jaké bakterie testujeme. Sestavy pro gramnegativní bakterie obsahují především antibiotika účinná proti gramnegativním bakteriím (a širokospektrá antibiotika), sestavy pro stafylokoky či streptokoky zase zahrnují antibiotika používaná proti těmto bakteriálním rodům (a opět také antibiotika se širším spektrem). Jméno Směr zubní Datum. 3. 2015 Str. 1/5
Odečtěte, na která antibiotika uvedených sestav jsou dva předložené kmeny bakterií citlivé. Podle tabulky určete, zda je kmen citlivý (C), intermediární (I) nebo rezistentní (R). Povšimněte si rozdílu mezi vhodnou sestavou (G+ sestava u G+ koka, G sestava u G tyčinky) a nevhodnou sestavou (G+ sestava u G tyčinky, G sestava u G+ koka). Název antibiotika Zkratka Změřená zóna Interpretace Změřená zóna Interpretace sada pro grampozitivní bakterie (mm) Staphylococcus aureus (grampozitivní kok) (C / I / R) (mm) (C / I / R) Escherichia coli (gramnegativní tyčinka) sada pro gramnegativní bakterie Staphylococcus aureus (grampozitivní kok) Escherichia coli (gramnegativní tyčinka) Úkol č. 3 Stanovení citlivosti původců močových infekcí Pro infekce močových cest (IMC) používáme specifická antibiotika, která se koncentrují v močovém měchýři. Některá z nich se koncentrují pouze v močovém měchýři; taková pak lze použít k léčbě cystitid, avšak nikoli již pyelonefritid, kde musí být dosaženo dostatečné koncentrace i ve tkáních. V praxi používáme sestavu pro enterobakterie z moče, sestavu pro stafylokoky z moče apod., avšak máme i univerzální močový test, který používáme např. u izolátů z dětské polikliniky. S pomocí prezentace a učitele napište názvy alespoň pěti antibiotik vhodných k léčbě infekcí močových cest. Z časových důvodů úkol neprovádějí studenti zubního lékařství. Úkol č. 4 Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) diluční mikrometodou Diluční mikrometodou (mikrodilučním testem) stanovujeme MIC v destičkách, jejichž důlky obsahují stoupající koncentrace antimikrobiálních látek. Destička se naočkuje suspenzí testovaného kmene bakterie a kultivuje se přes noc při 37 C. Růst bakterie se projeví zákalem v důlcích destičky nebo tečkou ze sedimentovaných bakterií. První jamka, v níž došlo k inhibici růstu a která je tudíž bez zákalu, udává MIC daného antibiotika. Zakroužkujte všechny čisté důlky (tj. bez zákalu a bez tečky) Dvojitým kroužkem označte nejspodnější z důlků bez zákalu (minimální inhibiční koncentrace) Pro každé antibiotikum porovnejte hodnotu MIC s breakpointem (označeno >X<) a rozhodněte, zda je daný kmen na dané antibiotikum citlivý (C) nebo rezistentní (R). Pokud jsou u určitého antibiotika všechny důlky zakalené, nekroužkujte nic a napište R. MIC je v tomto případě vyšší než nejvyšší hodnota zapsaná v tabulce. Pokud není u určitého antibiotika zakalený žádný důlek, zakroužkujte všechna čísla a dvakrát zakroužkujte nejspodnější, přestože skutečná hodnota MIC může být ještě nižší. Kmen je v takovém případě samozřejmě C. Jméno Směr zubní Datum. 3. 2015 Str. 2/5
Koncentrace ZLLM0421c Lékařská orální mikrobiologie I, praktická cvičení. Protokol k tématu J05 Napište plná jména antibiotik, zapište, do které skupiny patří a jaké jsou vedlejší účinky při léčbě těmito preparáty (dle listů, které máte na stole) Atb AMP AMS CZL CRX CXT GEN COT COL OXO OFL TET AZT C/R? 32 64 64 64 64 16 32 32 32 32 64 >8< >16< 16 16 16 32 4 8 >8< >8< >8< Z časových důvodů >16< studenti zubního lékařství 2 4 4 4 4 tuto část destičky nevyhodnocují 8 1 2 2 2 2 4 0.5 1 1 1 1 2 0.25 0.5 0.5 0.5 0.5 1 KR = kontrola růstu (má být vždy zakalená, není tam žádné antibiotikum) Vysvětlení zkratek antibiotik Zkr. Celý název preparátu Skupina Nežádoucí vedlejší účinky (jsou-li) AMP AMS CZL CRX CXT GEN COT COL OXO OFL TET AZT KR Jméno Směr zubní Datum. 3. 2015 Str. 3/5
Úkol č. 5: Stanovení MIC pomocí E-testu: Ačkoli je v principu podobný difusnímu diskovému testu, je E-test kvantitativní. Koncentrace jsou napsány přímo na proužku. Hodnota MIC se odečítá v místě, kde okraj zóny kříží proužek. Odečtěte E-test u daného kmene. Výsledek zakreslete a zapište. Testovaný kmen Testované antibiotikum nebo antimykotikum: Hodnota MIC: Breakpoint: Závěr (kmen je na použitou látku citlivý / resistentní) Úkol č. 6: Test na produkci běžné betalaktamázy nitrocefinovým proužkem Zakreslete vzhled pozitivního a negativního výsledku betalaktamázového testu dle prezentace. Positivní betalaktamáza Negativní betalaktamáza Úkol č. 7 Detekce širokospektrých beta-laktamáz (ESBL) pomocí testu CLSI Velmi důležitým problémem dnešní medicíny jsou takzvaní producenti ESBL (ESBL = širokospektrá betalaktamáza). Test je založen na sledování rozdílu účinku samotného antibiotika (CTX = cefotaxim nebo CAZ = ceftazidim) a antibiotika s inhibitorem betalaktamázy (CCTX či CTX CLA a CCAZ či CAZ CLA). Producent ESBL je prokázán tak, že antibiotikum s inhibitorem má zónu alespoň o pět milimetrů větší než je zóna antibiotika bez inhibitoru. Abychom zabránili chybám, provádíme test dvakrát s různými antibiotika (CTX = cefotaxim a CAZ = ceftazidim). Zakreslete a zhodnoťte výsledky testů prokazujících tvorbu širokospektrých beta-laktamáz (ESBL, extendedspectrum beta lactamases) u dvou předložených bakteriálních kmenů dle pokynů učitele a prezentace. V případě negativity začerněte horní a dolní raménko znaménka +, čímž ho přetvoříte v. Jméno Směr zubní Datum. 3. 2015 Str. 4/5
Úkol 8: Detekce širokospektrých betalaktamáz (ESBL) a ampc betalaktamáz pomocí ABCD testu V dnešní době nejsou klasické betalaktamázy ESBL jedinými důležitými betalaktamázami. Celosvětový problém je spojen s takzvanými metalobetalaktamázami a karbapenemázami, které jsou rezistentní k ještě většímu počtu betalaktamových antibiotik. Významným problémem jsou i takzvené ampc betalactamázy. Jsou podobné betalaktamázám ESBL, ale bývají produkovány jinými kmeny enterobakterií. Více a více laboratoří se snaží současně detekovat jak klasické ESBL, tak i batalaktamázy typu ampc, například pomocí testu ABCD.. Pomocí obrázku se pokuste určit, zda je váš kmen producentem ESBL, producentem ampc, není producentem žádné z obou betalaktamáz nebo je naopak producentem obou. Pozor: Váš test je origiál z vyšetřovací laboratoře a váš výsledek se tudíž může lišit od výsledku vašeho souseda! A = CPD (cefpodoxim), B = CPD + ESBL inhibitor, C = CPD + ampc inhibitor, D = CPD + oba inhibitory ESBL pozitivní: B a D jsou větší než A a C (rozdíl 5 mm a více) ampc pozitivní: C a D jsou větší než A a B (rozdíl 5 mm a více) ESBL a ampc pozitivní: D je větší než ostatní, ostaní se vzájemně neliší Závěr: Můj kmen je ESBL pozitivní negativní a ampc pozitivní negativní (nehodící se škrtněte) Jméno Směr zubní Datum. 3. 2015 Str. 5/5