Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 a 1305/2009 Úpravy a aktualizace: Pavla Chalupová ÚMFGZ MZLU v Brně 1
Lokalizace jaderné DNA 2
http://www.paternityexperts.com/basicgenetics.html
DNA deoxyribonukleová kyselina komplementární antiparalelní 5 3 a 3 5 nese genetickou informaci uložena převážně v chromozomech tvořena dusíkatými bázemi: A adenin,t - tymin,c cytosin,g guanin pořadí 3 bází kóduje aminokyselinu v polypeptidovém řetězci http://cs.wikipedia.org/wiki/soubor:adn_animation.gif 4
Chromozomy v jádře buňky viditelné při dělení buňky uvnitř stočená DNA http://www.tiricosuave.com/images/chromosome.jpg 5
mtdna 16 20 kb 37 genů rrna trna geny CO (c-oxidáza) ND1 ND6 (NADHdehydrogenáza) geny pro ATPázy aj. 6
??? z čeho izolujeme z krve z mléka z chlupu cena rutina 7
Metody pro izolaci nukleových kyselin Metody využívající rozdílné rozpustnosti fenolová extrakce a etanolová nebo izopropanolová precipitace (srážení) obecně rozšířené, široké aplikace vhodné pro vysokomolekulární genomové NK Centrifugace v hustotním gradientu izopyknické centrifugace v gradientu CsCl vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech Metody adsorpční DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malých fragmentů DNA 8
Fenol-chloroformová extrakce fenol extrakce NK, denaturace proteinů do organické fáze chloroform zlepšuje účinnost fenolové deproteinizace; organické rozpouštědlo nemísí se s vodným roztokem buněčného lyzátu; dvě fáze horní vodní, dolní organická) Postup: lyzace vzorku ve směsi guanidinu thiokyanátu a fenolu přidání chloroformu centrifugace rozdělení do fází precipitace izopropanolem peleta odmytí solí etanolem komerční roztoky:trizol, TRIReagent, RNAzol, RNABlue 9
Horní vodní fáze RNA Střední fáze prstenec DNA a proteinů Spodní organická fáze DNA a proteiny
Centrifugace 11
Adsorpční metody rychlá metoda vysoký výtěžek (malé fragmenty) vysoká čistota Oxid křemičitý (kolonky) guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid jodid sodný Síla vazby závisí na chaotropní soli typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) iontové síle ph roztoku Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H2O 12
Mechanismus interakce DNA s kolonkou 13
Princip kolonové izolace lýze buněk vysrážení DNA etanolem a navázání na křemíkovou membránu kolony promývání navázané DNA eluce uvolnění promyté DNA z kolony do zkumavky 15
Stabilizace a uložení NK DNA dny při 4 C týdny měsíce při -20 C roky při -70 C vzorky krve určené k izolaci DNA (RNA) odebrat do chelatačních roztoků (EDTA kyselina etylendiaminotetraoctová) skladovat obvykle 1-5 dní při 4-8 C (DNA) dlouhodobě lze odběry skladovat při -20 C vzorky určené k izolaci RNA zpracovat optimálně do 4 hodin 16
Stanovení koncentrace a kvality NK
Spektrofotometrické nejzákladnější a nejméně informativní nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm stupeň čistoty NK se stanovuje z poměru abs. 260/280 nm 18
Real-time PCR PCR amplifikace v reálném čase se zvyšujícím se množstvím amplifikovaného produktu narůstá signál porovnáváno se standardem detekujeme množství NK v původním vzorku 19
Elektroforéza separace NK dle mobility v agarózových nebo polyakrylamidových gelech působením stejnosměrného elektrického pole DNA (- náboj) migruje k anodě (+ náboj) 20
Agarózová elektroforéza horizontální povaření agarózy v pufru (0,5 6%), obarvení EtBr (např.) ztuhnutí gel nanesení vzorků do jamek elektroforéza 21
http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/lecture2/amg1.12.gif
Nanášení vzorků http://biotrek.rdrake.org/img/gallery/33electrophoresis1_training.jpg 23
Vizualizace např. fluorescenčně po ozáření UV světlem (312 nm) Ethidium bromid GoldStar Sybr Green http://www.biologyreference.com/images/biol_02_img0140.jpg 24
NanoDrop analýza 0,5 2 µl vzorku http://www.nanodrop.com/howitworks.aspx 25
NanoDrop analýza DNA, RNA i proteinů velmi rychlá metoda stanovení koncentrace, čistoty, 26
NanoDrop vzorek je napipetován na konec optického kabelu (přijímající vlákno) pomocí druhého optického kabelu (zdrojové vlákno) se pak vytvoří kontakt se vzorkem měření při vzálenosti 1 mm a 0,2 mm zdrojem světla je pulsní xenonová lampa je analyzováno světlo procházející vzorkem, CCD detektor http://www.nanodrop.com/library/nd-1000-v3.7-users-manual-8.5x11.pdf 27
28
29
Izolační automaty -Automatizace 30
Renčín Děkuji Vám za pozornost