Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

Transkript

1 Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

2 1) Úvod Proteomické analýzy mohou být naprosto odlišné cíle... Detekce změn v mozkové kůře při Alzheimerově chorobě Identifikace plazmatických markerů karcinomu prsu Co stojí za rezistencí 3 kmenů stejné bakterie Jakým mechanismem působí léčivo na nádorové buňky od plánování proteomické analýzy je nutné myslet na povahu vzorků a jejich zpracování

3 1) Úvod Nejdůležitější faktory ovlivňující zpracování vzorků: Druh biologického materiálu Cíl vlastní analýzy Identifikace, kvantifikace, analýza PTM atd. Plánované proteomické metody Gel-based analýza (metody založené na gelech) Příprava vzorků na separační krok, příprava vzorků na identifikaci Shotgun analýza Příprava na on-line analýzu LC-MS/MS MS profilování,...

4 1) Úvod Zpracování vzorků musí zabezpečit: Proteiny musí být před analýzou řádně rozpuštěny Proteiny by měly být co nejčistější nutné odstranit interferujících příměsí Proteiny by měly zůstat v původním stavu zabezpečení ochrany před nežádoucími modifikacemi Dostatečný výtěžek proteinů Proteiny v buňkách a tělních tekutinách představují majoritní komponentu (mimo vody) snadnější příprava a není je nutné specificky izolovat (oproti izolaci nukleových kyselin)

5 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 1) Homogenizace orgánů, tkání Metody Mechanické homogenizátory Rozetření tkáně v kapalném dusíku Homogenizace třepáním s pevnými kuličkami Enzymatická homogenizace Získáte buňky, shluky buněk

6 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 2) Další dezintegrace buněk, shluků buněk Metody Osmotická lýza Ultrazvuk (20 50 khz) French-press (20,000 30,000 psi nebo MPa) Obrovský tlakový skok Získáte proteiny, komplexy proteinů

7 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 2) Další dezintegrace buněk, shluků buněk Metody Opakované zmrazování/rozmrazování Tvorba krystalů > dezintegrace buněk Rozpuštění v detergentech (viz. dále) Získáte proteiny, komplexy proteinů

8 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 3) Extrakce a solubilizace proteinů a jejich komplexů Činidla používaná pro extrakci a solubilizaci proteinů: Detergenty jak denaturující tak nedenaturující Ionogenní Dodecylsulfát sodný silně denaturující Deoxycholát sodný nedenaturující CHAPS zwitterion, spíše nedenaturující Neionogenní Triton X100 nedenaturující

9 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 3) Extrakce a solubilizace proteinů a jejich komplexů Činidla používaná pro extrakci a solubilizaci proteinů: Chaotropní činidla omezují vodíkové vazby a elektrostatické interakce, jsou denaturující Močovina Guanidin hydrochlorid

10 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 3) Extrakce a solubilizace proteinů a jejich komplexů Činidla používaná pro extrakci a solubilizaci proteinů: Pozor na inkompatibility činidel: Nekompatibilní s SDS elektroforézou Vysoká koncentrace chaotropních činidel Nekompatibilní s izoelektrickou fokusací Ionogenní detergenty, ale ne zwitteriony Nekompatibilní s enzymatickým štěpením Vysoká koncentrace denaturujících činidel Nekompatibilní s HPLC separací Detergenty nejsou obecně kompatibilní se separacemi na reverzních fázích

11 A) Proteiny musí být před analýzou rozpuštěny 3) Extrakce a solubilizace proteinů a jejich komplexů Činidla používaná pro přerušení disulfidických můstků Redukční činidla Dithiothreitol (DTT) Tris(2-karboxyethyl)fosfin hydrochlorid (TCEP) -SH modifikační činidla (zabraňují opětovné tvorbě S-S-) Amid kyseliny 2-jodoctové Lze kombinovat s DTT i TCEP Methylmethanthiosulfonát Nelze kombinovat s DTT O Protein SH + I NH 2 Protein S NH 2 O O Protein SH + S H 3 C S Protein S S CH 3 CH 3 O

12 B) Proteiny by měly v co nejčistějším stavu Odstranění interferujících složek biologického materiálu: Solí, NK, lipidů, artificiálně přidaných látek Metody Dialýza Hnací silou je osmóza, membránou proteiny neprochází Prochází jen nízkomolekulární látky - snaží se naředit v okolním prostředí

13 B) Proteiny by měly v co nejčistějším stavu Odstranění interferujících složek biologického materiálu: Solí, NK, lipidů, artificiálně přidaných látek Metody Gelová chromatografie (filtrace) V porézním gelu malé látky penetrují hlouběji a pobývají v něm delší čas než velké molekuly

14 B) Proteiny by měly v co nejčistějším stavu Odstranění interferujících složek biologického materiálu: Solí, NK, lipidů, artificiálně přidaných látek Metody Ultrafiltrace Především v centrifugačním provedení Membrány o dobře definované porozitě 3 kda, 10 kda, 50 kda, 100 kda atd.

15 B) Proteiny by měly v co nejčistějším stavu Odstranění interferujících složek biologického materiálu: Solí, NK, lipidů, artificiálně přidaných látek Metody Precipitace proteinů Snížení rozpustnost proteinů změnou prostředí Přidání organického rozpouštědla - nejčastěji Změny ph (někdy v kombinaci s přidáním org. rozpouštědla) Změna iontové síly - přidání síranu amonného (výjimečně) Odstředění precipitátu a oddělení supernatantu s nečistotami

16 C) Proteiny by měly zůstat původním stavu Ochrana proti proteolýze Inhibitory proteáz EDTA chelatace iontů nutných pro aktivitu proteáz Fenylmethylsulfonyl flourid ireverzibilní inhibitor proteáz Leupeptin, pepsation, aprotinin, bestain inhibitory proteáz Denaturace Denaturované proteiny ztrácí aktivitu Ochlazení Vždy pracovat na ledě Pozor na inkompatibility činidel: Inhibitory proteáz brání zdárný průběh štěpení proteinů

17 C) Proteiny by měly zůstat původním stavu Zabránit defosforylaci Inhibitory fosfatáz Fluorid sodný, vanadičitan sodný Zabránit vzniku vedlejších reakcí Karbamylace proteinů močovinou za vyšší teploty Pracovat s čerstvými roztoky močoviny Vzorky s močovinou zahřívat max. na 37 C O O Protein NH 2 + H 2 N NH 2 Protein NH 2 Vedlejší reakce amid kyseliny 2-jodoctové s NH 2 skupinami Deaktivovat nezreagovaný amid kyseliny 2-jodoctové pomocí DTT

18 D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Zjištění výtěžnosti přípravy vzorků Krok je nezbytný pro všechny další analýzy Spektrofotometrické metody Stanovení absorbance specifického barevného produktu Spektrofotometrické metody Stanovení přímé absorbance komponent proteinů Fluorimetrické metody Zatím méně rozšířené

19 D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Spektrofotometrické metody Stanovení absorbance specifického barevného produktu Metoda dle Bradforda Barvivo Coomassie briliantová modř G-250 mění v přítomnosti proteinů zabarvení z červeného na modré s novým abospčním maximem při 595 nm

20 D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Spektrofotometrické metody Stanovení absorbance specifického barevného produktu Bicinchoninová metoda (BCA) Alkalická redukce měďnatého iontu peptidovými vazbami proteinů na měďný a následná chelatace kys. bicinchoninovou červené zabarvení

21 D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Spektrofotometrické metody Stanovení přímé absorbance komponent proteinů Měření absorbance při 280 nm Vlnová délka, kde absorbují aromatické aminokyseliny stanovení je citlivé na obsah těchto aminokyselin v proteinu slouží pro přibližné zjištění koncentrace proteinů Metoda není příliš specifická

22 D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku Fluorimetrické metody Zatím nejsou příliš rozšířené Obecně jsou citlivější než ostatní Dva principy: Fluorofor se váže přímo na protein Fluorofor se váže na detergent navázaný na protein

23 D) Stanovení koncentrace proteinů ve vzorku S různými metodami pro stanovení koncentrace interferuje celá řada látek vždy ale záleží na jejich koncentraci: Koncentrace Činidlo kompatibilní s BCA EDTA 10mM Dithiothreitol (DTT) 1mM SDS 5.0% Guanidine HCl 4M Močovina 3M

24 3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách A) Metody založené na gelech Hlavní inkompatibility: SDS elektroforéza Nekompletní redukce -S-S- Vysoké koncentrace solí, močoviny Isoelektrická fokusace: Nerozpuštěné, precipitující proteiny Nabité látky (sole, SDS), NK DIGE značení Všechny látky obsahující primární aminy Štěpení proteinu v gelu Většinou bez problémů, nutné je ale dobře odstranit barvu Analýzy vzniklých peptidů pomocí hmotnostní spektrometrie Sole, detergenty záleží na typu ionizace

25 % Intensity 3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách A) Metody založené na gelech Postup přípravy gelu s proteinem pro identifikaci na MALDI-MS Odbarvovací pufr Ekvilibrační pufr Proteáza Acetonitril Vyříznutí z gelu Odbarvení gelu Voyager Spec #1[BP = , 6104] Vyrovnání ph na optimum pro proteázu Vznik peptidů Extrakce peptidů MALDI-TOF Mass (m/z) Matrice

26 3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách A) Metody založené na gelech Postup přípravy proteinů pro DIGE Pozor na interference s DIGE značením - založeno na reakci s NH 2

27 3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách B) Metody shotgun proteomiky Hlavní inkompatibility: Enzymatické štěpení se provádí v roztoku: Inhibitory proteas Denaturující činidla (detergenty, chaotropní činidla) Činidla měnící ph mimo optimum pro aktivitu proteolytického enzymu Trypsin ph 7-9 Pepsin ph 3-5 Asp-N - ph 4-9 Identifikace pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-MS Přítomnost solí a dalších nečistot ve směsi peptidů LC-ESI-MS Detergenty dobrou volbou jsou odbouratelné detergenty (ph labilní apod.) Přítomnost solí nevadí pokud je použita C18 separace

28 3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách B) Metody shotgun proteomiky Postup přípravy roztoku s proteinem pro shotgun analýzu Štěpící pufr Proteáza LC/MSMS Proteiny Vznik peptidů P 175 MS ' 09-Nov :54:42 Q : TOF MS ES+ BPI e3 0% Time

29 3) Hlavní inkompatibility v proteomických analýzách B) Metody shotgun proteomiky Kvantifikační metody shotgun proteomiky často zahrnují kovalentní značení peptidů značkami nesoucími těžké izotopy Např.: itraq, ICAT, reduktivní dimethylace formaldehydem apod. Tyto metody přinášejí přísnější požadavky na čistotu vzorku Nejsnadnější metoda pro přečištění peptidů C18 nebo SCX Solid Phase Extraction (SPE)

30 Instrumentace pro elektroforézu

31 Softwarové hodnocení 2D gelů analysis-workflow/video-demo/