Univerzita Karlova v Praze. Farmaceutická fakulta v Hradci Králové

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v radci Králové VYUŽITÍ NMR SPEKTRSKPIE PŘI STRUKTURNÍ ANALÝZE SEKUNDÁRNÍC METABLITŮ IZLVANÝC Z BERBERIS VULGARIS L. (diplomová práce) radec Králové, 2014 Anežka ordějčuková

Prohlášení Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu. V radci Králové dne 13. 5. 2014

Poděkování Za všestrannou a obětavou pomoc, cenné rady a připomínky při vypracovávání diplomové práce děkuji doc. PharmDr. Jiřímu Kunešovi, CSc. a Mgr. Zdeňku Novákovi. Za poskytnuté vzorky a materiály k izolaci děkuji Ing. Lucii Cahlíkové, PhD. a Mgr. Anně ošťálkové.

Abstrakt Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v radci Králové Katedra anorganické a organické chemie Kandidát: Školitel: Název diplomové práce: Anežka ordějčuková doc. PharmDr. Jiří Kuneš, CSc. Využití NMR spektroskopie při strukturní analýze sekundárních metabolitů izolovaných z Berberis vulgaris L. Diplomová práce je věnována určení struktury neznámých látek. Na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v radci Králové byla z rostliny Berberis vulgaris z čeledi Berberidaceae izolována celá řada alkaloidů. Některé z nich byly předány do NMR laboratoře s žádostí o určení jejich struktury. Cílem diplomové práce byla indentifikace tří neznámých vzorků izolovaných z rostliny Berberis vulgaris pomocí NMR analýzy. U neznámých sloučenin byla na základě provedených NMR experimentů ( 1 NMR, 13 C NMR, gsqc, gmbc, gcsy, NESY ) určena jejich struktura.

Abstract Charles Univeversity in Prague Faculty of Pharmacy in radec Králové Department of Inorganic and rganic Chenistry Candidate: Supervisor: Title of Thesis: Anežka ordějčuková doc. PharmDr. Jiří Kuneš, CSc. The use of NMR spectroscopy for structural analysis of secondary metabolites isolated from Berberis vulgaris L. This diploma thesis deals with determination of unknown substances structure. A great many alkaloids from the plant Berberis vulgaris from the Berberidaceae family has been isolated in the Department of Pharmaceutical Botany and Ecology at the Faculty of Pharmacy in radec Králové. Some of them were passed to the NMR laboratory, requestig a structure determination. The aim of this thesis was to identify three unknown chemical formulas isolated from the plant Berberis vulgaris with the help of NMR analysis. The unknown compounds were determined on the basis of NMR experiments ( 1 NMR, 13 C NMR, gsqc, gmbc, gcsy, NESY).

bsah: 1. Úvod a cíl... 2 2. Teoretická část... 3 2.1 Berberis vulgaris... 3 2.2 Využití Berberis vulgaris... 4 2.3 bsahové látky Berberis vulgaris... 4 3. Experimentální část... 7 3.1 Rostlinný materiál a postup izolace... 7 3.2 NMR experimenty... 8 3.3 Přístrojové vybavení... 10 4. Výsledky s komentářem... 11 4.1 Ckr... 11 4.2 E 42... 20 4.3 E 51... 32 5. Závěr... 42 6. Seznam literatury... 43 7. Seznam příloh... 45

1. Úvod a cíl Nukleární magnetická rezonance je v současné době nezbytnou součástí moderní chemie při analýze organických sloučenin. Je využívána k důkazům látek připravených chemickou cestou i k odhalování obsahových látek rostlin. NMR spektroskopie se začala rozvíjet někdy během druhé světové války. Tehdy se k měřením využíval fyzikální přístroj, který měřil gyromagnetickou konstantu. Později byla vytvořena klasická NMR spektra, která jsou vlastně vyobrazením chemické struktury zkoumané látky. V roce 1991 získal za tento posun v oblasti NMR Nobelovu cenu R. R. Ernst. Je tedy zřejmé, že NMR spektroskopie pošla bouřlivým vývojem, který se samozřejmě nezastavil a pokračuje neustále dál - vyvíjí se nové, pokročilé NMR techniky. Důkazem toho je i další Nobelova cena na poli nukleární magnetické rezonance, kterou v roce 2002 získal švýcarský chemik a biofyzik Kurt Wüthrich, který rozšířil NMR analýzu o možnosti studia biologických makromolekul. Celkem bylo v oblasti NMR uděleno šest Nobelových cen, poslední v roce 2003. Na Farmaceutické fakultě v radci Králové je NMR laboratoř využívána hlavně k analýze látek syntetizovaných na Katedře anorganické a organické chemie a Katedře farmaceutické chemie, dále k analýze přírodních látek, které jsou izolovány na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie. Práce v laboratoři nukleární magnetické rezonance zahrnuje obsluhu spektrometru a především pak analýzu naměřených spekter. Výsledkem této práce je potvrzování předpokládaných struktur, vytváření struktur neznámých látek, sledování čistoty vzorku, atd. Cílem této diplomové práce je určit strukturu tří neznámých látek za pomoci NMR spektroskopie. Jedná se o látky izolované z rostliny Berberis vulgaris na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie. V této práci jsou jednotlivé látky popisovány pod kódovými označeními Crk, E 42 a E 51. 2

2. Teoretická část 2.1 Berberis vulgaris Berberis vulgaris dřišťál obecný je rostlinou z čeledi Berberidaceae a rodu Berberis, v němž rozeznáváme kolem 500 druhů 1. Roste na hlinitých, jílovitých a slínových půdách především ve střední a jižní Evropě, v České republice roste roztroušeně na slunných stráních a světlých hájích od nížin do podhorského pásma 2, 3. Jedná se o stálezelený, opadavý, trnitý keř s hladkou bělavě zelenavou kůrou, dorůstající až 3 m výšky. Je typický tvrdým žlutým dřevem, které svou barevnost získalo přítomností berberinových alkaloidů a dříve se používalo v řezbářství, k barvení kůže a vlny 5. Listy jsou podlouhlé, vejčité, světle zelené, jemně pilovité 4, nahloučené ve svazečcích na krátkých brachyblastech 6. Jeho květy jsou žluté a uspořádané v hroznovitých převislých květenstvích. Kvete v dubnu až červnu 3, 4. Plody jsou červené bobule, které dozrávají v říjnu a na keřích zůstávají až dlouho do zimy 1, obsahují 1 až 3 semena 2. Bobule jsou kyselé, obsahují vitamin C a organické kyseliny. Dříve se používaly do kompotů a dalších zavařenin (marmelád, džemů) 5, 7. 3

2.2 Využití Berberis vulgaris Dřišťál obecný je v lidové medicíně pro své účinky používán jako léčivá rostlina. Téměř všechny jeho části, kromě mladých výhonků a zralých plodů, obsahují alkaloidy (např. berberin, berbamin, berberubin, jatrorrhizin, palmatin a kolumbamin) 1. Kůra kořenů je farmaceutickou surovinou právě díky obsahu isochinolinových alkaloidů, především pak berberinu 6, který je využívám pro své silné antifglogistické účinky (testovány byly ethanolické, glycerolické extrakty i jejich mix; nejvýraznější aktivitu prokázaly extrakty ethanolické) 8, působí na celou řadu mikrobů streptokoky, stafylokoky, salmonely, Escherichii coli (jako častého původce močových infekcí) i na kvasinku Candida albisans, která je zodpovědná za četné vaginální mykózy 1. V lidovém léčitelství byl Berberis vulgaris používán k léčbě močových kamenů i jiných onemocnění močového traktu. V homeopatickém systému léčby je nejčastěji používanou rostlinou při bolesti ledvin a pro odstranění ledvinových kamenů, proto byl vodno metanolový extrakt kůry kořene rostliny Berberis vulgaris testován na zvířecím modelu. Výsledkem této studie je prokázání jeho antiurolithického potenciálu 9. Předávkování se projevuje ochrnutím dýchacího a vazomotorického centra, omámením, zvracením a průjmem 4. 2.3 bsahové látky Berberis vulgaris Berberin je rostlinný isochinolinový alkaloid, který patří do protoberberinové řady. Ačkoliv nemusí v rostlině být vždy zastoupen v největším množství z isochinolinových alkaloidů, je nejvíce spojován s farmakologickým efektem. Kromě Berberis vulgaris je přítomný v i v mnoha dalších rostlinách např. ydastis canadensis, Coptis chinensis, Arcangelisia flava a dalších. Jak ukazují studie, k dalším významným obsahovým látkám patří také berbamin a palmatin, které stejně jako berberin obsahují isochinolinové jádro 10. 4

berberin: R 1 + R 2 = C 2, R 3 = C 3 jatrorrhizin: R 1 =, R 2 = C 3, R 3 = C 3 kolumbamin: R 1 = C 3, R 2 =, R 3 = C 3 palmatin: R 1 = R 2 = C 3, R 3 = C 3 berberubin: R 1 + R 2 = C 2, R 3 = C 3 3 C 3 C N C 3 N C3 berbamin Mezi nově objevené obsahové látky patří berbanin. Tento alkaloid je druhým izolovaným isochinolin-isochinolonovým dimerem po berbidinu, který byl izolován z druhu Berberis brandisian 11. Berbanin byl izolován a popsán na Farmaceutické fakultě v radci Králové a odpovídá jedné z řešených molekul (v práci pod kódovým označením E51). C 3 N C 3 N C3 C 3 berbanin 5

Byly studovány také antioxidační účinky lihových extraktů kořenů, větviček a listů dvou druhů Berberis B. vulgaris L. a B. croatica orvat. Antioxidační aktivita byla prokázána nejvíce v extraktech z listů. Bylo dokázáno, že za antioxidační aktivitou stojí především přírodní antioxidanty fenolického typu fenoly a flavonoly. Antioxidační aktivita se projevuje nejen antiflogistickým, antibakteriálním a antimykotickým působením, kdy brání oxidaci nezbytné pro mnoho mikroorganismů, ale také by se mohla projevit při patologických stavech, které jsou oxidačním působením vyvolávány a podporovány, jako je např. diabetes mellitus, nádorová onemocnění či kardiovaskulární onemocnění 12. Dřišťál obsahuje také další látky, mezi nimi např. třísloviny, škrob, sacharidy, flavonové sloučeniny a v plodech již zmiňované organické kyseliny (nejvíce kyselinu jablečnou, citronovou a vinnou) a významné množství vitamínů C a K 1. 6

3. Experimentální část 3.1 Rostlinný materiál a postup izolace Neznámé látky, jejichž struktura je v této práci určována, byly izolovány na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie pracovní skupinou pod vedením Ing. Lucie Cahlíkové, PhD. Sumární alkaloidní extrakt byl připraven ze suché kůry kořenů Berberis vulgaris (10 kg), která byla rozemleta a extrahována. Spojené extrakty byly odpařením rozpouštědla zahuštěny do viskózního hnědého sirupu (2 kg). Při krátkém zahřátí byl po částech přidán roztok 2% Cl, suspenze byla promíchána a zfiltrována přes křemelinu (Celite 535), která byla promyta destilovanou vodou (1 l). Následně byl filtrát zředěn dalším množstvím vody (5 l) a třikrát vytřepán diethyletherem. Vodná fáze s obsahem solí alkaloidů byla alkalizována 10% Na 2 C 3 na p ~ 9,5 a po částech vytřepávána chloroformem. Po vysušení pomocí bezvodého Na 2 S 4 a odpaření nepolární fáze byl získán odparek 128 g (výtřepek A). Pro přečištění alkaloidního extraktu byl výtřepek A rozpuštěn v chloroformu (2,5 l), rozdělen na dvě poloviny a přečištěn přes neutrální Al 2 3. Po zasáknutí vzorku, promýváním cloroformem a následně ethanolem, byly frakce jímány po 500 ml a monitorovány pomocí TLC. Byly získány 3 souhrnné frakce (A1-A3). Frakce A1 (59,5 g) byla dále separována pomocí sloupcové chromatografie stupňovitou elucí řadou směsí rozpouštědel benzín lékařský:chloroform (85:15, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 20:80) a dále směsí chloroform:ethanol (99:1 a 80:20). Jednotlivé frakce byly jímány po 500 ml a monitorovány pomocí TLC a MS (ESI). Kvalitativně stejné frakce byly spojovány a takto bylo získáno jedenáct souhrnných frakcí (A-J) z původních 204 najímaných frakcí. Z frakce C (1,591 g) byly opakovanými krystalizacemi získány žluté krystaly látky označené Ckr (415 mg). Frakce E (208 mg) byla postoupena preparativní TLC (soustava - toluen:et 2 N, 9:1, 2x). Z dvou hlavních zón (Rf 0,62 a 0,34), které byly seškrábány a z adsorbentu vymyty, byla z první zóny opakovanou preparativní TLC na analytických deskách získána látka označená E 42 (4 mg) a z druhé zóny rovněž pomocí preparativní TLC na analytických deskách látka s označením E 51 (12 mg). Látky s označeními Ckr, E 42 a E51 byly předány na identifikaci do laboratoře NMR. 7

3.2 NMR experimenty Jednorozměrné 1 NMR spektrum je základním experimentem, který poskytuje prvotní informace o struktuře zkoumané organické látky. V případě jednoduchých sloučenin může být dostačující pro ověření struktury zkoumané molekuly. K základním charakteristikám 1 NMR spektra patří počet signálů, chemický posun, štěpení signálů a intenzita signálů. Počet signálů odpovídá počtu neekvivalentních jader atomů vodíku měřeného vzorku. Chemický posun popisuje polohu signálu ve spektru a je závislý na chemickém okolí konkrétního atomu. Právě podle svého okolí je signál stíněn či odstíněn. V případě odstínění dochází k posunu signálu k vyšším hodnotám ppm, v případě stínění je tomu naopak. Pro vyjádření chemického posunu byla zavedena δ-stupnice s bezrozměrnými jednotkami ppm (pars per milion). Třetí charakteristikou 1 NMR spektra je štěpení signálů, k němuž dochází na základě spinspinových interakcí jaderných spinů přes kovalentní vazby. Velikost interakcí lze změřit a popisuje ji veličina zvaná interakční konstanta J (jednotkou je z). J odpovídá vzdálenosti mezi dvěma rameny multipletu. Jednotlivé signály nedekaplovaného spektra mají tedy různou multiplicitu, která je výsledkem působení sousedních atomů. Neštěpný signál je označován jako singlet (s), signály s dvěma ekvivalentními liniemi jako dublet (d), signály s třemi ekvidistantními liniemi jako triplet (t), signály s čtyřmi ekvidistantními liniemi jako kvartet (q), více štěpené signály se popisují většinou jako multiplet (m). Poslední charakteristikou je intenzita signálů, kterou udává plocha píku a kterou lze stanovit integrací. Slouží také ke kvantitativní analýze poměrově vyjadřuje počet jader daného signálu 13, 14. Počet signálů v 13 C NMR spektru odpovídá počtu neekvivalentních jader (stejně jako tomu je v 1 NMR spektru). Chemický posun je analogicky vyjádřením chemického okolí, které na daný atom uhlíku působí. Multiplicita, která definuje štěpení signálu vlivem spinspinových interakcí, je ve spektrech 13 C NMR nežádoucí, neboť komplikuje spektra především v oblastech většího počtu signálů s minimálními rozdíly chemických posunů. Používá se proto techniky tzv. širokopásmového heteronukleárního decouplingu - za optimálních podmínek tak získáme spektrum, v němž každému atomu uhlíku odpovídá jeden neštěpený signál. Na rozdíl od 1 NMR spektra mají všechny signály přibližně stejnou intenzitu. Tato intenzita je však zkreslená (vlivem širokopásmového decouplingu vodíků) a poměry intenzit signálů tedy nejsou kvantitativní 13, 14. Mezi složitější experimenty sloužící k strukturální NMR analýze patří homonukleární i heteronukleární 2D spektra. V případě homonukleárních experimentů se v obou dimenzích 8

zobrazují spektra téhož atomu, v heteronukleárních experimentech každá dimenze zobrazuje spektra jiného atomu a umožňuje tak sledovat korelace mezi různými jádry. omonukleárním 2D experimentem je gcsy. Toto spektrum v obou dimenzích zobrazuje chemické posuny vodíků: diagonální píky odpovídají původnímu 1D 1 NMR spektru a mimodiagonální píky popisují interakce mezi jádry. Interakce jsou zpravidla přes tři vazby tedy vzájemné interakce atomů vodíků na sousedních atomech uhlíku 13, 14. K řešení složitých chemických struktur jsou nezbytné také heterokorelované 2D NMR experimenty, mezi něž patří experiment gsqc, který umožňuje pomocí specifického nastavení pulzních sekvencí získat spektrum propojující vodíkové a uhlíkové 1D spektrum a popisující vazby vodík uhlík. Jedná se o korelace přes jednu kovalentní vazbu díky nastavené interakční konstantě. Ta v tomto případě odpovídá přibližně 145 z. Pomocí toho experimentu lze tedy určit, které atomy vodíku náleží příslušným atomům uhlíku 14. V určování složitých struktur je klíčovým NMR experimentem gmbc. Jedná se opět o heteronukleární 2D experiment a popisuje korelace vodík uhlík. Na rozdíl od spektra gsqc se však jedná o vzdálenější korelace zpravidla přes tři vazby. Intenzita signálů v gmbc spektrech je závislá na zvolené interakční konstantě. Běžně dosahují interakce uhlík - vodík přes jednu vazbu interakčních konstant 120 320 z, přičemž velikost konstanty je ovlivněna hybridizací, počtem a charakterem substituentů. Interakce přes dvě kovalentní vazby jsou většinou malé (1 6 z), někdy i záporné (např. -3.4 z), a opět závisí na hybridizaci, substituentech a také na vazebném úhlu mezi vodíkem a uhlíkem. Kromě těchto faktorů je velikost interakcí přes tři vazby ovlivněna také případnou přítomností heteroatomu mezi sledovanými atomy vodíku a uhlíku (např. v přítomnosti dusíku s volným elektronovým párem dochází k výraznému zvýšení interakční konstanty - téměř na dvojnásobnou hodnotu). Aromatické korelace přes tři vazby a v nepřítomnosti heteroatomu mají interakční konstantu většinou kolem 8 z. Z toho faktu se vychází při nastavování interakční konstanty pro měření spekter přírodních látek, kdy očekáváme množství aromatických kruhů ve zkoumané molekule. Je ale zřejmé, že pro korelace na rozhraní aromatické a alifatické části je intenzita korelací zkreslena (pro tyto oblasti jsou vhodnější jiné velikosti interakční konstanty např. pro alifatickou část jsou vhodné interakční konstanty kolem hodnot 4 6 z). 9

3.3 Přístrojové vybavení motnostní spektra vzorků Ckr a E 42 byla naměřena na přístroji ESI-MS Thermo Finnigan LCQDuo (GenTech Scientific, Inc., New York, USA). K molekule E 51 byla hmotnostní spektra neměřena na přístroji EI-RMS Waters GCT Premier, with an orthogonal acceleration time-of-flight (A-TF), connected to an Agilent 7890A GC Systém a na přístroji EI-MS Agilent 7890A GC 5975 inert MSD operating in EI mode at 70 ev (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). NMR spektra (zahrnující 1D experimenty 1, 13 C i 2D experimenty gmbc, gsqc, gcsy, gnesy) všech zkoumaných látek byla měřena v roztocích CDCl 3 při laboratorní teplotě na přístroji VNMR S500. Chemické posuny byly změřeny jako hodnoty δ v pars per milion (ppm) a byly nepřímo vztaženy k tetramethylsilanu (TMS) jako standardu pomocí zbytkového signálu rozpouštědla. odnoty chemického posunu pro CDCl 3 jsou u atomů 1 δ = 7.26 ppm a u atomů 13 C δ = 77.0 ppm. Měřeními získaná data jsou prezentována v následujícím pořadí: chemický posun (δ), integrovaná intenzita 1 NMR spekter, multiplicita (s: singlet, d: dublet, t: triplet, q: kvartet, dd: dublet dubletů, m: multiplet, bs: široký singlet) a interakční konstanta (z). 10

4. Výsledky s komentářem 4.1 Ckr Neznámá sloučenina s kódovým označením Ckr byla získána izolací z rostliny Berberis vulgaris z čeledi Berberidaceae. V klasickém 1 NMR spektru se nacházejí signály jak aromatických, tak i alifatických atomů vodíku. V alifatické části spektra se nacházejí čtyři signály. Vodíky s chemickým posunem δ = 4.29 ppm (dd) a δ = 2.89 ppm (dd) spolu dle štěpení (interakční konstanty: J = 7.0 z a J = 5.5 z) sousedí, což potvrzuje i experiment gcsy. Dalšími signály vodíkového spektra jsou singlety s chemickými posuny δ = 3.94 ppm a δ = 4.01 ppm, u nichž chemický posun i integrál nasvědčují tomu, že se jedná o methoxyskupiny. Singlet s chemickým posunem δ = 6.00 ppm náleží (dle integrálu) methylenové skupině, která by podle posunu mohla náležet aromatické oblasti nebo bude silně odstíněna nejpravděpodobněji dvěma atomy kyslíku. Vzhledem k tomu, že integrálem odpovídá dvěma atomům vodíku, lze předpokládat, že se bude jednat spíše o výrazně odstíněnou methylenovou skupinu. Správnost či nesprávnost úvahy však potvrdí až 2D experimenty. Aromatická část dále obsahuje pět signálů s chemickým posunem δ = 6.70 ppm (s), δ = 6.71 ppm (s), δ = 7.21 ppm (s), δ = 7.27 ppm (d, J = 8.8 z), δ = 7.31 ppm (d, J = 8.8 z), které odpovídají pěti aromatickým vodíkům, z nichž dva (δ = 7.27 ppm a δ = 7.31 ppm) spolu podle interakční konstanty evidentně sousedí. Dále v aromatické části zbývají tři singlety. Celkem neznámá sloučenina podle 1 NMR spektra obsahuje sedmnáct vodíků, dále je možné, že molekula obsahuje i nějaké atomy vodíku vázané na heteroatomech, které v spektru, díky chemické výměně za deuterium, nemusí být vidět. Z klasického 13 C NMR spektra je patrné, že neznámá sloučenina obsahuje 20 atomů uhlíku. V aromatické části se nachází 16 signálů. Jeden z nich (δ = 101.4 ppm) bude s největší pravděpodobností signálem methylenové skupiny odstíněné dvěma atomy kyslíku. Aromatické atomy uhlíku pravděpodobně tvoří základ tří aromatických kruhů. Signál s chemickým posunem δ = 160.1 ppm odpovídá výrazně odstíněnému aromatickému uhlíku - dle posunu by mohlo jít o derivát karboxylové kyseliny tj. esterový či amidový uhlík. Zbylé čtyři signály v uhlíkovém spektru pak náleží alifatickým atomům uhlíku. 11

Pomocí hmotností spektrometrie byla zjištěna molekulová hmotnost, jejíž velikost je 373. Neznámá látka obsahuje: 17 atomů vodíku, 20 atomů uhlíku, minimálně 5 atomů kyslíku (dle chemických posunů ve spektrech se pravděpodobně bude jednat o dvě methoxyskupiny, výrazně z obou stran kyslíkem odstíněnou methylenovou skupinu a karbonylový kyslík). Jmenované atomy představují hmotnost 337, která se od molekulové hmotnosti liší o 36. V molekule by se mohl nacházet atom dusíku. Stále ale zbývá od naměřené molekulové hmotnosti 22, což odpovídá atomu sodíku. Experiment gsqc umožnil přiřadit přítomné atomy vodíku odpovídajícím atomům uhlíku, na něž jsou vázány. C (28.7) (2.89) C (39.3) (4.29) C (56.9) (3.94) C (61.6) (4.01) C (101.3) (6.71) C (101.4) (6.00) C (104.7) (7.21) C (107.9) (6.70) C(119.0) (7.31) C (122.3) (7.27) Deset atomů uhlíku nese minimálně jeden atom vodíku (některé uhlíky nesou dva či tři atomy vodíku). Druhou polovinu tvoří kvarterní atomy uhlíků s následujícími chemickými posuny: δ = 119.4 ppm, δ = 123.7 ppm, δ = 130.0 ppm, δ = 132.3 ppm, δ = 135.6 ppm, δ = 147.3 ppm, δ = 148.4 ppm, δ = 149.5 ppm, δ = 151.4 ppm, δ = 160.1 ppm. Již několikrát zmiňovaný atom uhlíku s posunem δ = 101.4 ppm, jemuž odpovídá singlet s posunem δ = 6.00 ppm a integrálem odpovídajícím dvěma vodíkům, bude výrazně odstíněn dvěma atomy kyslíku a bude tvořit dioxolanový kruh viz obr. 1. Toto uspořádání potvrzuje přítomnost pouhých dvou korelací v gmbc (na uhlíky δ = 147.3 ppm a δ =148.4) a absence korelací v gcsy. 12

6.00 101.4 148.4 147.3 obr. 1 První benzenové jádro má s dioxolanovým kruhem dva společné uhlíky (δ = 148.4 ppm a δ = 147.3 ppm), na které mají korelace vodíky δ = 6.70 ppm a δ = 7.21 ppm. Atom vodíku δ = 6.70 ppm vykazuje korelaci přes tři vazby na atomy uhlíku δ = 147.3 ppm a 123.7 ppm a ještě jednu slabou korelaci na uhlík 148.4 ppm, zatímco atom vodíku s chemickým posunem δ = 7.21 ppm má korelaci na atomy uhlíku δ = 148.4 ppm i 147.3 ppm, dále na uhlík δ = 130.0 ppm (obr. 2). 6.70 148.4 130.0 147.3 7.21 123.7 obr. 2 Další významné korelace zmíněných aromatických vodíků jsou na atomy uhlíku δ = 135.6 ppm (aromatický) a 28.7 ppm (alifatický). Tyto skupiny musí být vázané po řadě na atomy uhlíku δ = 130.0 ppm a 123.7 ppm. Uhlík δ = 28.7 ppm nese vodíky δ = 2.89 ppm, které mají korelaci na aromatický uhlík 107.9 ppm. Tyto vodíky mají také korelaci na aromatické uhlíky δ = 130.0 ppm a 123.7 ppm (obr. 3). 13

6.70 2.89 107.9 130.0 28.7 7.21 123.7 135.6 obr. 3 Uhlík δ = 28.7 ppm sousedí s uhlíkem δ = 39.3 ppm. Vodíky těchto dvou atomů uhlíku jsou štěpeny stejnými interakčními konstantami (viz výše) a zároveň je jejich sousedství potvrzeno i experimentem gcsy (obr. 4). cosy 2.89 28.7 4.29 39.3 obr. 4 Další korelace přes tři vazby vodíků s chemickým posunem δ = 4.29 ppm jsou na uhlíky δ = 135.6 ppm a δ = 130.0 ppm (obr. 5), čímž je dokázáno uzavření kruhu. Stále ale není jasné, přes jaký atom je toto spojení uskutečněno, neboť na něj nejsou žádné korelace. S ohledem na chemický posun vodíků δ = 4.29 ppm i uhlíku δ = 39.3 ppm se nejpravděpodobněji jedná o atom dusíku, což odpovídá i molekulové hmotnosti. 130.0 135.6 N 4.29 39.3 obr. 5 14

Vodíky s posunem δ = 4.29 ppm mají také korelaci na uhlík δ = 160.1 ppm, čímž se potvrzuje počáteční domněnka o amidové části molekuly (obr. 6). 39.3 N 160.1 obr. 6 Doposud nezmiňovaný aromatický vodík δ = 6.71 ppm, náležící uhlíku s chemickým posunem δ = 101.3 ppm, má korelaci přes tři vazby na kvarterní uhlík δ = 123.7 ppm (obr. 7), a tím poukazuje na napojení protonovaného aromatického uhlíku s posunem δ = 101.3 ppm na uhlík δ = 135.6 ppm. 6.71 123.7 N 135.6 101.3 obr. 7 Další korelace tohoto vodíku jsou na kvarterní aromatický uhlík s chemickým posunem δ = 119.4 ppm a na protonovaný aromatický uhlík s posunem δ = 122.3 ppm, jemuž náleží vodík s chemickým posunem δ = 7.27 ppm. Tento vodík má pak korelaci přes tři vazby na uhlík δ = 101.3 ppm i na uhlík δ = 119.4 ppm (obr. 8). N 6.71 7.27 101.3 119.4 122.3 obr. 8 15

Poslední korelaci v gmbc má vodík δ = 7.27 ppm na odstíněný uhlík s posunem δ = 151.4 ppm. Vodík δ = 7.31 ppm je sousedním k vodíku δ = 7.27 ppm, jak o tom vypovídá korelace ve spektru gcsy i shodné štěpení signálu vodíkového spektra (interakční konstanta J = 8.8 z). Vodík δ = 7.31 ppm má pak v gmbc korelaci na odstíněný uhlík δ = 149.5 ppm. Uhlíky δ = 151.4 ppm a δ =149.5 ppm jsou odstíněné methoxyskupinami a ze spektra NESY je zřejmé, že jsou tyto methoxyskupiny vázány na sousední aromatické uhlíky (obr. 9). 7.27 cosy 7.31 151.4 149.5 C 3 C 3 noesy obr. 9 Vodík δ = 7.31 ppm má také korelaci přes tři vazby na kvarterní aromatický uhlík s chemickým posunem δ = 132.3 ppm, sousední vodík má pak korelaci na aromatický kvarterní uhlík o chemickém posunu δ = 119.4 ppm (obr. 10), čímž je dokázána přítomnost aromatického kruhu. 7.27 132.3 119.4 7.31 C3 C 3 obr. 10 Je samozřejmé, že přítomnost metoxyskupin není uvažována pouze na základě chemického posunu aromatických uhlíků, ale jejich přítomnost potvrzují korelace ve spektru gmbc, v němž vidíme korelaci vodíku δ = 4.01 ppm na uhlík δ = 149.5 ppm a korelaci vodíku δ = 3.94 ppm na uhlík 151.4 ppm (obr. 11). 16

149.5 C 3 4.01 151.4 C 3 3.94 obr. 11 Napojení tohoto kruhu je již nastíněn na obr. 8, kde je vidět korelace vodíku δ = 6.71 ppm na uhlíky δ = 119.4 ppm a δ = 122.3 ppm, které jsou součástí právě dokázaného aromatického jádra. N 6.71 119.4 C 3 122.3 C 3 obr. 12 Jelikož jsou právě vyčerpány všechny atomy vodíku i uhlíku ve spektrech se objevující, a molekulové hmotnosti odpovídající, je zřejmé, že uhlíky δ = 160.1 ppm a δ = 119.4 ppm budou spojené chemickou vazbou (obr. 13). N C 3 C 3 obr. 13 17

Tím je dokončeno určení struktury neznámé molekuly. Sloučenina má sumární vzorec C 20 17 N 5. Jedná se o 8 oxoberberin 15. 1 NMR (500 z, CDCl 3 ): δ 7.31 (1, d, J = 8.8 z); 7.27 (1, d, J = 8.8 z); 7.21 (1, s); 6.71 (1, s); 6.70 (1, s); 6.0 (2, s, -C 2 -); 4.29 (2, dd; J = 7.0 z, 5.5 z); 4.01 (3, s, C 3 -- ); 3.94 (3, s, C 3 -- ); 2.89 (2, dd; J = 7.0 z, 5.5 z) 13 C NMR (125 Mz, CDCl 3 ): δ 160.1, 151.4, 149.5, 148.4, 147.3, 135.6, 132.3, 130.0, 122.3, 119.4, 119.0, 107.9, 104.7, 101.4, 101.3, 61.6, 56.9, 39.3, 28.7 18

Ckr 6.00 101.4 148.4 147.3 6.70 107.9 104.7 7.21 130.0 123.7 2.89 28.7 135.6 6.71 101.3 7.27 122.3 132.3 N 4.29 39.3 160.1 119.4 119.0 7.31 151.4 149.5 3 C 3.94 56.9 3 C 4.01 61.6 19

4.2 E 42 Kódové označení E42 náleží neznámé molekule, jež byla izolována z rostliny Berberis vulgaris z čeledi Berberidaceae. V 1 NMR spektru se nachází mnoho signálů v alifatické oblasti, méně pak v oblasti aromatické. V alifatické části nelze přehlédnout tři výrazné signály, které integrálem i posunem (δ = 3.67 ppm, δ = 3.85 ppm, δ = 3.96 ppm) odpovídají methoxyskupinám. Další dva výrazné signály (δ = 2.83 ppm, δ = 3.06 ppm), z nichž každý dle hodnoty integrálu náleží opět třem vodíkům, však podle chemického posunu neodpovídají methoxyskupinám, ale pravděpodobně se bude jednat o methylové skupiny odstíněné atomem dusíku. Dále jsou zde patrné multiplety (δ = 3.60-3.46 ppm, δ = 3.05-2.86 ppm a δ = 3.28 3.20 ppm), z nichž první dva integrálem odpovídají třem atomům vodíku a poslední multiplet odpovídá jednomu vodíku. Najdeme zde také dva dublety dubletů - každý náleží jednomu atomu vodíku s chemickými posuny δ = 4.41 ppm, δ = 3.82 ppm a s podobnými hodnotami interakčních konstant jednotlivých vodíků (J = 15.9 z a J = 4.6 z, J = 15.8 z a J = 5.0 z). Dle 1 NMR spektra by molekula mohla obsahovat 27 atomů vodíku, vodíkové spektrum ale obsahuje ještě mnoho dalších signálů a je zjevné, že některé signály nepatří neznámé molekule přírodní látky, nýbrž měřený vzorek obsahuje rovněž nečistoty. Se stejným problémem se lze setkat i u 13 C NMR spektra, kde je patrných 34 signálů. Z těchto 34 signálů je 18 v alifatické oblasti a 16 v oblasti aromatické. Vzhledem k molekulové hmotnosti zkoumané látky, která je 412, by látka mohla obsahovat sudý počet dusíků. Jisté je, že všechny uhlíkové atomy nebudou součástí molekuly. Určit uhlíky, které neznámé látce náleží, pomohou další experimenty. Zatím lze uvažovat, že uhlík s posunem δ = 164.2 ppm bude nejpravděpodobněji odpovídat uhlíku amidové či esterové skupiny, což vyplývá z jeho chemického posunu. Poměrně značně odstíněné jsou i signály δ = 154.0 ppm, δ = 151.7 ppm, δ = 145.8 ppm, δ = 145.4 ppm a δ = 141.2 ppm, zde lze očekávat odstínění atomem kyslíku. V alifatické části pak patrné odstíněné atomy uhlíku, které by měly odpovídat třem methoxyskupinám a dvěma metylovým skupinám, které jsou odstíněné dusíkem. Této úvaze odpovídají i posuny a integrály příslušných vodíků v 1 NMR spektru. Z 1D experimentů vyplývá, že molekula obsahuje minimálně 27 atomů vodíku a minimálně 11 atomů uhlíku. Lze však s určitostí konstatovat, že další atomy uhlíku odhalí 20

2D experimenty. Molekula bude pravděpodobně obsahovat pět až šest atomů kyslíku a dva atomy dusíku. Molekulová hmotnost sloučeniny E42 je 412. Pomocí experimentu gsqc byly nejprve přiřazeny jednotlivé atomy vodíků k příslušným atomům uhlíku. C (23.7) 2 (3.05 2.86 a 3.41) C (27.6) 2 (3.05 2.86) C (35.0) 3 (3.06) C (40.9) 3 (2.83) C (48.2) 2 (3.60 3.46) C (49.4) 2 (3.82 a 4.41) C (50.0) 2 (3.28 3.20 a 3.60 3.46) C (56.1) 3 (3.85) C (56.2) 3 (3.96) C (61.0) 3 (3.67) C (108.9) (6.59) C (110.5) (6.72) C (113.6) (7.19) Protonované aromatické uhlíky jsou v molekule tři, mezi alifatickými uhlíky najdeme pět atomů uhlíku, které nesou tři atomy vodíku a pět atomů uhlíku nesoucích dva atomy vodíku. Experiment dokázal 13 protonovaných uhlíků. Zbývá tedy 21 kvarterních uhlíků, přičemž je jasné, že některé z nich do molekuly E 42 nepatří. Tyto uhlíky mají následující posuny: δ = 27.7 ppm, δ = 29.7 ppm, δ = 30.0 ppm, δ = 30.1 ppm, δ = 30.3 ppm, δ = 35.0 ppm, δ = 61.1 ppm, δ = 61.2 ppm, δ = 110.6 ppm, 113.0 ppm, δ = 113.4 ppm, δ = 122.0 ppm, δ = 125.6 ppm, δ = 133.8 ppm, δ = 141.2 ppm, δ = 145.4 ppm, δ = 145.8 ppm, δ = 151.7 ppm, δ = 154.0 ppm, δ = 164.2 ppm a δ = 207.2 ppm. Nejvíce informací o neznámé látce obsahoval experiment gmbc, v určitých případech byly k důkazu řešené struktury využity i experimenty gcsy a NESY, pokud obsahovaly potřebné korelace. Aromatickým uhlík s chemickým posunem δ = 108.9 ppm nese jeden vodík s posunem δ = 6.59 ppm. Tento atom vodíku má v gmbc spektru tři silné korelace, které budou přes tři 21

vazby (viz obr. 14). Tyto korelace jsou na aromatické uhlíky s posuny δ = 141.2 ppm, δ = 113.0 ppm a na alifatický uhlík s posunem δ = 23.7 ppm. 6.59 108.9 23.7 141.2 113.0 obr. 14 Další tři korelace toho vodíku jsou slabší a budou tedy pravděpodobně přes dvě nebo čtyři vazby a přednostně budou tyto korelace na jednom aromatickém jádře, jak naznačuje obr. 15. Všechny tyto korelace jsou na aromatické kvarterní uhlíky s chemickými posuny δ = 154.0 ppm, δ = 145.4 ppm a 125.6 ppm. 6.59 108.9 154.0 125.6 145.4 obr. 15 Uhlíky s posuny δ = 154.0 ppm a δ = 141.2 ppm jsou odstíněny atomy kyslíku, které zároveň odstiňují i methylové skupiny. Důkazem toho uskupení jsou korelace methylových vodíků s posuny δ = 3.85 ppm a 3.67 ppm na kvarterní uhlíky jádra s posuny δ = 154.0 ppm a δ = 141.2 ppm (obr. 16). Spektrum NESY navíc dokazuje slabou korelací sousedství těchto methoxyskupin a dále zde najdeme korelaci vodíků δ = 3.85 ppm s aromatickým vodíkem (δ = 6.59 ppm) viz obr. 17. 22

3.85 3.67 6.59 56.1 108.9 3 C 154.0 3 C 141.2 61.0 noesy 3.85 3.67 noesy 6.59 56.1 108.9 3 C 154.0 3 C 141.2 61.0 obr. 16 obr. 17 Uhlík s chemickým posunem δ = 23.7 ppm nese dva atomy vodíku (s posuny: δ = 3.41 ppm a δ = 3.05 2.86 ppm). Každý z těchto atomů vodíků vykazuje v 1 spektru jiný signál. Signál vodíku, jehož chemický posun je δ = 3.05 2.86 ppm, je součástí multipletu, který svým integrálem odpovídá 3 atomům vodíku. Podle spektra gsqc náleží dvěma uhlíkům. Jedním z nich je již zmiňovaný uhlík s posunem δ = 23.7 ppm. Atomy vodíku s posuny δ = 3.41 ppm a δ = 3.05 2.86 ppm pak mají ve spektru NESY korelaci na aromatický vodík δ = 6.59 ppm (obr. 18). ba tyto vodíky náležící uhlíku δ = 23.7 ppm mají i odpovídající korelace v gmbc spektru. Jsou to slabé korelace na uhlíky δ = 113.0 ppm a 125.6 ppm a 108.9 ppm, jak ukazuje obr. 19. 3 C 3 C 6.59 noesy 3.05-2.86 3.41 108.9 125.6 113.0 23.7 3 C 3 C 6.59 3.05-2.86 3.41 108.9 125.6 113.0 23.7 obr. 18 obr. 19 Kromě korelací v NESY a gmbc spektrech má vodík s chemickým posunem δ = 3.41 ppm i korelaci ve spektru gcsy. Konkrétně jde o korelaci na atom vodíku s posunem δ = 3.60 3.46 ppm, který má v gcsy spektru korelaci i s atomem vodíku o posunu δ = 3.05 2.86 ppm (obr. 20). Zmíněný atom vodíku (δ = 3.60 3.46 ppm) náleží atomu uhlíku s chemickým posunem δ = 50.0 ppm, což dokazuje, že atomy uhlíků o posunech δ = 23.7 ppm a δ = 50.0 ppm spolu sousedí. Atom uhlíku δ = 50.0 ppm navíc nese dva atomy vodíku, z nichž každý ve spektru vykazuje svůj signál, a ve spektru gcsy spolu vzájemně korelují, jak ukazuje obr. 20, kde je zobrazena také gmbc korelace vodíků δ = 3.28 3.20 23

ppm a δ = 3.60 3.46 ppm (náležících uhlíku δ = 50.0 ppm) na aromatický uhlík δ = 125.6 ppm. 3 C 3 C 3.41 3.05-2.86 cosy 3.28-3.20 23.7 3.60-3.46 125.6 50.0 cosy obr. 20 Atom uhlíku s chemickým posunem δ = 50.0 ppm bude odstíněný heteroatomem - nejpravděpodobněji atomem dusíku, jak napovídá jeho chemický posun. Za další důkaz přítomnosti heteroatomu považuji skutečnost, že atomy vodíku náležící uhlíku (δ = 23.7 ppm) nemají žádnou korelaci na atom uhlíku, který by se v těchto místech mohl vyskytovat. Atom vodíku δ = 3.60 3.46 ppm má pouze slabou korelaci na atom uhlíku δ = 23.7 ppm a především pak korelaci přes tři vazby na atom uhlíku o chemickém posunu δ = 40.9 ppm, který opět dosvědčuje přítomnost heteroatomu - ta se projevila vyššími hodnotami chemického posunu (obr. 21). Tento atom uhlíku navíc náleží jedné z odstíněných methylových skupin (δ = 2.83 ppm) jak bylo uvedeno na začátku. 3 C 3 C 23.7 N 3.60-3.46 50.0 40.9 C 3 2.83 obr. 21 Vodíky methylové skupiny pak mají korelace na atom uhlíku δ = 50.0 ppm a novou korelaci na atom uhlíku s posunem δ = 49.4 ppm, který velikostí svého chemického posunu opět naznačuje sousedství s dusíkem. Tomuto atomu uhlíku (δ = 49.4 ppm) náleží dva atomy vodíku, z nichž každý má svůj chemický posun, jeden δ = 4.41 ppm a druhý δ = 3.82 ppm, 24

který má korelace na aromatické kvarterní atomy uhlíku s posuny δ = 125.6 ppm a δ = 113.0 ppm, čímž je dokázáno uzavření kruhu napojením na aromatické jádro, jak ukazuje obr. 22. 3 C 3 C 125.6 113.0 49.4 3.82 N 50.0 4.41 40.9 2.83 C 3 obr. 22 Tímto je dořešena první část molekuly, a jelikož spektra neposkytují žádné další korelace, je zřejmé, že odstíněný atom uhlíku (δ = 145.4 ppm) bude nejpravděpodobněji spojen s další částí molekuly přes heteroatom (obr. 23). Podle velikosti chemického posunu tohoto atomu uhlíku lze očekávat, že spojovacím heteroatomem bude kyslík. Molekulová hmotnost této první části byla 206. Z výše uvedeného lze předpokládat, že se molekula neznámé sloučeniny bude skládat ze dvou substrukturálních fragmentů vzájemně spojených přes atom kyslíku. V další fázi bylo tedy třeba určit strukturu druhé části molkuly a dokázat její napojení na první fragment. 3 C 3 C 145.4 N C 3 X obr. 23 Aromatická část druhého fragmentu je opět bohatá na korelace především v gmbc spektru. Atom uhlíku s posunem δ = 113.6 ppm nese vodík (δ = 7.19 ppm), který má hned pět korelací tři výraznější a dvě méně výrazné. Lze tedy předpokládat, že podle nastavených parametrů budou silnější korelace odpovídat vzdálenosti přes tři vazby, slabší korelace pak budou přes dvě či čtyři vazby. Výrazné korelace tohoto vodíku jsou na atomy uhlíků: δ = 151.7 ppm (dle velikosti posunu předpokládám odstínění methoxyskupinou), δ = 133.8 ppm a δ = 164.2 ppm (nejspíše součástí amidové skupiny), jak ukazuje obr. 24. 25

7.19 113.6 164.2 151.7 133.8 obr. 24 Slabé korelace jsou na atom uhlíku δ = 145.8 ppm, jehož chemický posun poukazuje na odstínění nejpravděpodobněji methoxyskupinou, a δ = 122.0 ppm, na který jsou korelace z alifatické části molekuly (viz dále obr. 28), a tím je dokázáno právě toto uspořádání. Na atomy uhlíků δ = 145.8 ppm a δ = 122.0 ppm má korelace přes tři vazby atom vodíku s chemickým posunem δ = 6.72 ppm (obr. 25), který náleží aromatickému atomu uhlíku δ = 110.5 ppm. 7.19 145.8 122.0 6.72 110.5 obr. 25 Atom vodíku (δ = 6.72 ppm) má pak ještě slabou korelaci na uhlík s posunem δ = 151.7 ppm a velmi slabou korelaci (přes čtyři vazby) na atom uhlíku δ = 164.2 ppm viz obr. 26. V sousedství uhlíku s chemickým posunem δ = 164.2 ppm lze očekávat přítomnost heteroatomu, s největší pravděpodobností se bude jednat o atom dusíku a výsledkem bude amidová skupina, kterou potvrzuje i velikost chemického posunu uhlíku δ = 164.2 ppm. 26

164.2 151.7 6.72 110.5 obr. 26 Poslední korelace vodíku δ = 6.72 ppm je výrazná a směřuje do alifatické části molekuly - na atom uhlíku s chemickým posunem δ = 27.6 ppm (obr. 27), jemuž náleží dva vodíky s posunem δ = 3.05 2.86 ppm. Stejný chemický posun vykazuje i atom vodíku náležící uhlíku δ = 23.7 ppm (v již vyřešené části molekuly), integrál tohoto signálu totiž odpovídá třem atomům vodíku. 110.5 27.6 6.72 3.05-2.86 obr. 27 Atomy vodíku s chemickým posunem δ = 3.05 2.86 ppm pak mají korelace na uhlíky: δ = 110.5 ppm, δ = 133.8 ppm a δ = 122.0 ppm (obr. 28). 122.0 133.8 110.5 27.6 3.05-2.86 obr. 28 27

V sousedství uhlíku δ = 27.6 ppm se bude nacházet uhlík nesoucí atomy vodíku s chemickým posunem δ = 3.60 3.46 ppm, jedná se tedy o uhlík s posunem δ = 48.2 ppm, který svým posunem jasně naznačuje, že tento je odstíněn atomem dusíku (viz dále obr. 30). Úvaha o sousedství zmíněných uhlíků je založená na korelaci vodíků δ = 3.05 2.86 ppm a δ = 3.60 3.46 ppm ve spektru gcsy, dále pak na korelaci atomů vodíku o chemickém posunu δ = 3.05 2.86 ppm na uhlík δ = 48.2 ppm - zde se jedná o slabou korelaci přes dvě vazby (obr. 29). 27.6 48.2 3.05-2.86 3.60-3.46 cosy obr. 29 Dle odstíněného uhlíku δ = 48.2 ppm i nepřítomnosti další korelace atomů vodíku s chemickým posunem δ = 3.05 2.86 ppm v gmbc spektru se bude v sousedství uhlíku s chemickým posunem δ = 48.2 ppm nacházet atom dusíku. Toto uspořádání dokazuje i odstínění uhlíku (δ = 35.0 ppm), který náleží methylové skupině, a jehož atomy vodíku s chemickým posunem δ = 3.06 ppm mají korelaci na uhlík s posunem δ = 48.2 ppm, jak ukazuje obr. 30. V sousedství dusíku se nachází odstíněný atom uhlíku s posunem δ = 164.2 ppm. Na tento atom mají korelace vodíky s chemickými posuny δ = 3.06 ppm a δ = 3.60 3.46 ppm, čímž je dokázáno uzavření kruhu. ybridizace nejvíce odstíněného uhlíku je sp 2 a je tedy zřejmé, že bude spojen dvojnou vazbou s kyslíkem. Tím je potvrzena prvotní domněnka o amidové skupině. 164.2 N 35.0 3.06 C 3 48.2 3.60-3.46 obr. 30 28

Důkaz přítomnosti methoxyskupiny, která by měla odstiňovat aromatické atomy uhlíku s chemickými posuny δ = 145.8 ppm nebo δ = 151.7 ppm, se nachází v gmbc spektru. Na atom uhlíku s chemickým posunem δ = 151.7 ppm mají korelaci vodíky s chemickým posunem δ = 3.96 ppm náležící uhlíku s posunem δ = 56.2 ppm, přičemž je to jejich jediná korelace a z hodnoty integrálu je jasné, že se jedná o tři atomy vodíku. Tím je dokázána přítomnost jedné methoxyskupiny (obr. 31). 56.2 3.96 3 C 151.7 N C 3 obr. 31 Zbývá navázání na odstíněném uhlíku s chemickým posunem δ = 145.8 ppm. Na tento uhlík mají však korelace pouze vodíky s posuny δ = 7.19 ppm a δ = 6.72 ppm (viz obr. 25). A vzhledem k tomu, že spektra opět nenabízejí žádné další korelace, je třeba vrátit se k prvnímu substrukturálnímu fragmentu (obr. 23). Na první pohled se nabízí spojení obou částí přes atom kyslíku, čemuž odpovídá i odstínění obou atomů uhlíku v jeho sousedství a nepřítomnost korelací (v gmbc spektru) mezi těmito dvěma částmi molekuly. Na oprávněnost této myšlenky poukazuje také NESY korelace mezi atomy vodíku s chemickými posuny δ = 7.19 ppm a δ = 3.82 ppm. Správnost této úvahy o propojení obou částí potvrzuje i fakt, že sečteme-li molekulovou hmotnost první části s molekulovou hmotností části druhé (obr. 31), získáme hodnotu 396, které se od celkové molekulové hmotnosti liší o 16, což odpovídá atomové hmotnosti kyslíku. Výsledný sumární vzorec molekuly tedy bude: C 23 28 N 2 5. Podobu celkové molekuly pak vyobrazuje obr. 32. Jedná se o berbidin 16, 17. 29

3 C 3 C N C 3 3 C N C 3 obr. 32 1 NMR (500 z, CDCl 3 ): δ 7.19 (1, s), 6.72 (1, s), 6.59 (1, s), 4.41 (1, dd, J = 15.9 z, 4.6 z), 3.96 (3, s), 3.85 (3, s), 3.82 (1, dd, J = 15.8 z, 5.0 z), 3.67 (3, s), 3.60 3.46 (3, m), 3.41 (1, dt, J = 17.3 z, 6.7 z), 3.28 3.20 (1, m), 3.06 (3, s), 3.05 2.86 (3, m), 2.83 (3, s) 13 C NMR (125 Mz, CDCl 3 ): δ 164.2, 154.0, 151.7, 145.8, 145.4, 141.2, 133.8, 125.6, 122.0, 113.6, 113.0, 110.5, 108.9, 61.0, 56.2, 56.1, 50.0, 49.4, 48.2, 40.9, 35.0, 27.6, 23.7 30

E 42 3 C 3.85 56.1 154.0 6.59 108.9 125.6 3.05-2.86 3.41 23.7 3.60-3.46 50.0 3.28-3.20 3.67 3 C 61.0 141.2 145.4 113.0 49.4 4.41 3.82 N 40.9 2.83 C 3 3.96 56.2 3 C 151.7 145.8 7.19 113.6 110.5 6.72 122.0 133.8 164.2 27.6 3.05-2.86 48.2 3.60-3.46 N 3.06 C 3 35.0 31

4.3 E 51 Neznámá sloučenina s kódovým označením E 51 byla získána izolací z rostliny Berberis vulgaris z čeledi Berberidaceae. Z 1 NMR spektra lze odečíst počet atomů vodíků obsažených ve studované molekule. Chemický posun v kontextu s integrálem poskytuje prvotní informace o těchto atomech. Neznámá molekula obsahuje pravděpodobně 22 atomů vodíku, z nichž 16 je alifatických a 6 aromatických. Jednoznačně lze identifikovat tři methoxyskupiny (chemické posuny δ = 3.93, δ = 4.01 a δ = 4.14 ppm). Vodík s chemickým posunem δ = 3.04 ppm náleží methylenové skupině odstíněné pravděpodobně dusíkem. V alifatické části se též vykytují signály svědčící o přítomnosti nečistot. V 13 C NMR spektrum necházíme 26 signálů, ne všechny však náleží neznámé sloučenině, neboť stejně jako v 1 MNR spektru i zde nacházíme stopy nečistot. Z těchto 26 signálů odpovídá 10 signálů alifatické části molekuly a 16 signálů je v oblasti aromatické. Signály s nejvyššími chemickými posunemy poukazují na přítomnost kyslíkových atomů. Molekulový pík v MS spektru má hodnotu 395, což odpovídá skutečné hmotě 394, z čehož můžeme usuzovat na sudý počet dusíků v neznámé molekule. Pomocí gsqc experimentu byly přiřazeny jednotlivé atomy vodíků k příslušným atomům uhlíku. C (27.6) 2 (2.99) C (35.0) 3 (3.04) C (48.1) 2 (3.54) C (56.4) 3 (4.01) C (57.1) 3 (4.14) C (61.4) 3 (3.93) C (102.9) (7.20) C (110.7) (6.81) C (114.8) (7.19) C (122.5) (7.96) C (130.8) (8.35 8.31) C (139.1) (9.23) 32

Z experimentu gsqc tedy vyplývá, že molekula obsahuje 12 protonovaných uhlíků. V alifatické části nacházíme dva atomy uhlíku, z nichž každý nese dva atomy vodíku dle štěpení spolu budou tyto uhlíky sousedit. Dále jsou zde obsaženy čtyři atomy uhlíku, z nichž každému odpovídají tři atomy vodíku. Podle odstínění a tedy podle chemického posunu je zřejmé, že jedna tato methylová skupina bude ostíněna dusíkem a zbylé tři budou odstíněny atomy kyslíku. V aromatické části je šest protonovaných atomů uhlíku, z nichž každý nese právě jeden atom vodíku. Zbylé atomy uhlíků jsou kvarterní - ve spektru se jedná o signály s následujícími chemickými posuny: δ = 119.3 ppm, δ = 122.1 ppm, δ = 135.0 ppm, δ = 137.0 ppm, δ = 143.5 ppm, δ = 144.8 ppm, δ = 146.2 ppm, δ = 151.6 ppm, δ = 162.0 ppm, δ = 163.9 ppm. Nejvíce informací o neznámé sloučenině lze nalézt v experimentu gmbc. Významné korelace zde poskytuje atom vodíku s chemickým posunem δ = 6.81 ppm (dle gsqc spektra náleží atomu uhlíku s posunem δ = 110.7 ppm). Tento vodík má ve spektru pět korelací na aromatické uhlíky, které budou nejpravděpodobněji tvořit jedno benzenové jádro, a šestou korelaci na aromatický uhlík, který už bude patřit další části molekuly. Korelace v části aromatické na první pohled neozřejmují jednoznačné umístění atomů uhlíku na jádře. Poslední - sedmá korelace tohoto atomu vodíku (δ = 6.81 ppm) je na alifatický atom uhlíku s chemickým posunem δ = 27.6 ppm (obr. 33). Dalším vodíkem, který je součástí stejného benzenového jádra, je atom s posunem δ = 7.19 ppm, který náleží uhlíku s posunem δ = 114.8 ppm. I tento atom vodíku má četné korelace v aromatické části, nicméně korelace do alifatické oblasti u něho chybí. ba signály zmíněných aromatických vodíků mají v 1 spektru tvar singletu a je tedy zřejmé, že atomy uhlíků, které se nacházejí v sousedství, budou kvarterní. 33

6.81 110.7 27.6 114.8 7.19 obr. 33 Na atom uhlíku s chemickým posunem δ = 27.6 ppm dle gsqc spektra jsou vázány dva atomy vodíku, které mají chemický posun δ = 2.99 ppm a ve spektru gmbc mají korelace přes tři vazby na uhlíky s posuny δ = 110.7 ppm, δ = 122.1 ppm a přes dvě vazby na uhlík s posunem δ = 135.0 ppm a na alifatický atom uhlíku s posunem δ = 48.1 ppm. Ten nese rovněž dva atomy vodíku s chemickým posunem δ = 3.54 ppm. V 1 spektru jsou signály vodíků s posuny δ = 2.99 ppm i δ = 3.54 ppm rozštěpeny na triplety, uhlíky s posuny δ = 27.6 ppm a δ = 48.1 ppm se tedy budou nacházet v sousedství. Tento fakt potvrzuje i spektrum gcsy, viz obr. 34. Vodík s chemickým posunem δ = 3.54 ppm má korelaci přes tři vazby na atom uhlíku s chemickým posunem δ = 135.0 ppm a je tedy zřejmé, že umístění atomů uhlíku s posuny δ = 135.0 ppm a δ = 122.1 ppm bude takové, jak naznačuje obr. 34. 110.7 2.99 27.6 135.0 122.1 48.1 3.54 obr. 34 Korelaci na atomy uhlíku s chemickým posunem δ = 122.1 ppm a 135.0 ppm mají i aromatické atomy vodíku s chemickými posuny δ = 6.81 ppm a δ = 7.19 ppm. Dále má vodík s chemickým posunem δ = 7.19 ppm korelaci přes tři vazby na výrazně odstíněný 34

kvarterní uhlík o chemickém posunu δ = 163.9 ppm, viz obr. 35. Jelikož se jedná o výrazně odstíněný kvarterní uhlík, lze předpokládat, že bude součástí karbonylové skupiny. 6.81 135.0 122.1 7.19 163.9 obr. 35 Z chemického posunu uhlíku δ = 48.1 ppm je na první pohled patrné, že bude odstíněný a dle velikosti odstínění nejpravděpodobněji atomem dusíku. Korelaci na tento uhlík mají vodíky methylové skupiny s chemickým posunem δ = 3.04 ppm. Tato skupina náleží odstíněnému atomu uhlíku δ = 35.0 ppm. Druhá korelace methylové skupiny s posunem δ = 3.04 ppm je na uhlík s vysokým chemickým posunem δ = 163.9 ppm a je tedy jasné, že dojde k uzavření kruhu přes amidové uskupení, jak znázorňuje obr. 36. 122.1 135.0 163.9 48.1 N 35.0 C3 3.04 obr. 36 Zbývající atomy uhlíku na aromatickém jádře mají chemické posuny δ = 146.2 ppm a δ = 151.6 ppm a je tedy zřejmé, že budou odstíněny. Na oba tyto uhlíky mají korelace vodíky s posuny δ = 6.81 ppm a δ = 7.20 ppm. Na uhlík s posunem δ = 151.6 ppm mají korelaci atomy vodíku s chemickým posunem δ = 4.01 ppm (dle velikosti integrálu z 1 spektra je zřejmé, že se jedná o tři atomy). Tyto vodíky náleží atomu uhlíku s chemickým posunem δ = 56.4 ppm a společně tvoří methoxyskupinu (obr. 37). Jejich umístění na kruhu dokazuje NESY korelace s atomem vodíku o chemickém posunu δ = 6.81 ppm. Druhý atom uhlíku s posunem δ = 146.2 ppm další korelace v gmbc spektru nemá. 35

noesy 6.81 4.01 56.4 3 C 151.6 146.2 N C 3 obr. 37 Z dosavadních informací, která spektra poskytují, je tedy zřejmé, že se molekula bude skládat z dvou substrukturálních fragmentů vzájemně propojených přes heteroatom. Právě díky přítomnosti heteroatomu nenacházíme žádnou korelaci mezi jednotlivými částmi ve spektru gmbc. Bylo tedy třeba samostatně vyřešit strukturu druhého fragmentu a dokázat propojení obou částí. Atom vodíku s chemickým posunem δ = 7.20 ppm, který dle spektra gsqc náleží uhlíku s posunem δ = 102.9 ppm. Korelace přes tři vazby má tento vodík na aromatické kvarterní uhlíky s chemickými posuny δ = 144.8 ppm a δ = 119.3 ppm. Třetí korelaci přes tři vazby má vodík s posunem δ = 7.20 ppm na protonovaný aromatický uhlík s posunem δ = 122.5 ppm. Ten nese atom vodíku s chemickým posunem δ = 7.96 ppm a na atom vodíku (δ = 7.20 ppm) má korelaci ve spektru NESY, viz obr. 38. Již z těchto prvních korelací se nabízí myšlenka, že tento fragment zkoumané molekuly bude obsahovat dvě aromatická jádra. 144.8 119.3 102.9 122.5 7.20 7.96 noesy obr. 38 Velikost chemického posunu uhlíku δ = 144.8 ppm naznačuje odstínění a ve spektru gmbc na něho mají korelaci přes tři vazby vodíky methylové skupiny s posunem δ = 3.93 36

ppm, které náleží uhlíku s posunem δ = 61.4 ppm. Je tedy zřejmé, že na atom uhlíku s posunem δ = 144.8 ppm bude navázána methoxyskupina. Správnost umístění atomu uhlíku o chemickém posunu δ = 119.3 ppm (na spoji dvou aromatických kruhů) dokazuje korelace vodíku s posunem δ = 7.96 ppm na tento zmiňovaný uhlík. Další korelace vodíku s chemickým posunem δ = 7.96 ppm směřuje k uhlíku s posunem δ = 102.9 ppm, jak znázorňuje obr. 39. 61.4 3.93 C 3 144.8 119.3 102.9 122.5 7.96 obr. 39 Vodík s chemickým posunem δ =7.96 ppm má korelaci ve spektru gcsy a poukazuje na přítomnost vodíku s chemickým posunem δ = 8.35 8.31ppm, které náleží atomu uhlíku s chemickým posunem δ = 130.8 ppm. Tento uhlík tedy sousedí s uhlíkem o chemickém posunu δ = 122.5 ppm, jak popisuje obr. 40. C 3 122.5 7.96 130.8 8.35-8.31 cosy obr. 40 Atom vodíku s posunem δ = 8.35 8.31 ppm má také korelace v gmbc spektru. Mezi ně patří korelace na aromatické uhlíky s posuny δ = 139.1 ppm a 137.0 ppm. Slabou korelaci má pak přes dvě vazby na atom uhlíku s posunem δ = 122.5 ppm (obr. 41). Atom uhlíku s vysokým chemickým posunem δ = 139.1 ppm je protonovaný a nese vodík s chemickým posunem δ = 9.23 ppm. 37

C 3 9.23 139.1 137.0 130.8 122.5 8.35-8.31 obr. 41 Zmíněný aromatický vodík s chemickým posunem δ = 9.23 ppm má cenné korelace v gmbc spektru. Mezi ně patří korelace na atom uhlíku s posunem δ = 137.0 ppm, která potvrzuje správnost umístění tohoto kvarterního uhlíku. Další korelace je na uhlík s chemickým posunem δ = 143.5 ppm, který bude podle velikosti chemického posunu odstíněný kyslíkem a bude se nacházet na sousedním benzenovém jádře. Další korelace atomu vodíku s posunem δ = 9.23 ppm směřuje k uhlíku s posunem δ = 130.8 ppm, viz obr. 42. A poslední méně výrazná korelace bude přes dvě vazby na atom uhlíku s chemickým posunem δ = 119.3 ppm, který se nachází na spoji aromatických jader a už byl zmiňován v obr. 38. C 3 143.5 9.23 119.3 137.0 139.3 130.8 obr. 42 Posledním aromatickým atomem uhlíku, který lze ve spektru nalézt je odstíněný uhlík s posunem δ = 162.0 ppm. V gmbc spektru na něho mají korelaci přes tři vazby vodíky s posunem δ = 4.14 ppm, které jsou navázány na uhlík s chemickým posunem δ = 57.1 ppm a podle velikosti všech posunů je zřejmé, že se bude jednat o methylovou skupinu navázanou na aromatický systém, jak naznačuje obr. 43. Slabou korelaci (přes dvě vazby) na uhlík s posunem δ = 162.0 ppm má i atom vodíku s chemickým posunem δ = 7.20 ppm. V NESY spektru je patrná vzájemná korelace vodíků, které mají chemické posuny δ = 7.20 ppm a δ = 4.14 ppm (obr. 43). 38