Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti 8. Detekce a identifikace aktivních složek a pomocných látek infračervená spektrometrie Vadym Prokopec Vadym.Prokopec@vscht.cz
8. Detekce a identifikace aktivních složek a pomocných látek infračervená spektrometrie 9. Detekce a identifikace aktivních složek a pomocných látek Ramanova spektrometrie 10.Spektrální metody pro identifikaci a kvantifikaci NIR spektrometrie 11.Metody molekulové spektrometrie pro kvantitativní analýzu léčiv 12.NMR spektrometrie při analýze roztoků 13.Kvantitativní NMR spektrometrie 14.Hmotnostní spektrometrie pro identifikaci farmaceutických látek
Infračervená spektrometrie Podstata vibrační spektroskopie vibrační (vibračně-rotační) stavy - počty vibračních stavů - počet vibračních modů (stupňů volnosti) 3N-6 (3N-5 - lineární molekuly), N - počet atomů - pro každý stupeň volnosti - vibrační frekvence - potenciálová křivka - sada stavů (hladin)
Pohyb v prostoru volné částice translační pohyb 1 atom 3 stupně volnosti 2 atomy 2 x 3 stupně volnosti N atomů N x 3 stupně volnosti
Pohyb v prostoru vzájemně vázané částice 2 atomy spojené vazbou - LINEÁRNÍ MOLEKULA 2 x 3 stupně volnosti ~ 6 JEN 3 translace těžiště 2 stupně volnosti - rotace molekuly 1 stupeň volnosti vibrace periodický pohyb 3 atomy spojené vazbami - LOMENÁ MOLEKULA 3 x 3 stupně volnosti ~ 9 JEN 3 translace těžiště 3 stupně volnosti - rotace molekuly 3 stupeň volnosti vibrace
Pohyb v prostoru vázané částice N atomů spojených vazbou - LINEÁRNÍ MOLEKULA N x 3 stupně volnosti ~ 3 N JEN 3 translace těžiště 2 stupně volnosti - rotace molekuly 3 N - 5 stupňů volnosti - vibrace N atomů spojených vazbou - LOMENÁ MOLEKULA N x 3 stupně volnosti ~ 3 N JEN 3 translace těžiště 3 stupně volnosti - rotace molekuly 3 N - 6 stupňů volnosti - vibrace
Typy vibrací Pohyby atomů v molekule při vibraci Valenční (stretching) změna délky vazby» symetrická» antisymetrická
Typy vibrací Pohyby atomů v molekule při vibraci Deformační (bending) změna vazebných nebo torsních úhlů nůžková kývavá, kyvadlová kroutivá kolébavá vějířová scissoring, rocking, wagging, twisting
Elektromagnetické spektrum x-rays Visible near-ir microwave ultraviolet mid -IR far-ir radio waves 9 7 5 3 1-1 -3-5 10 10 10 10 10 10 10 10 Vlnočet, cm -1 nuclear electronic vibrational rotational transitions -5-3 -1 1 3 5 7 9 10 10 10 10 10 10 10 10 Vlnová délka v mikronech
Infračervená spektrometrie Podstata vibrační spektroskopie VIBRAČNÍ FREKVENCE - model harmonického oscilátoru - hmotnost atomů - síla vazby - vliv typu pohybu v rámci dané skupiny atomů - potenciální energie - vibrační frekvence v klasickém přiblížení
Infračervená spektrometrie Podstata infračervené absorpce jednofotonový přechod mezi dvěma stacionárními vibračními (vibračně-rotačními) stavy molekuly, jejichž energie jsou E 1 a E 2, vyvolaný interakcí s fotonem dopadajícího záření o frekvenci n abs = E 2 - E 1 / h hn abs = E 2 - E 1 hn vib = E 2 - E 1 pro fundamentální přechody
Infračervená spektrometrie Podstata infračervené absorpce přechody mezi vibračními (vibračně-rotačními) stavy - typy možných přechodů při absorpci IČ záření - v rámci jednoho vibračního modu - fundamentální (změna kvantového čísla o jednotku) - vyšší harmonické - svrchní tóny - zahrnuto více vibračních modů - kombinační
Vibrační energetické hladiny
Infračervená spektrometrie Oscilující dipólový moment pohyb molekuly spojený se změnou elektrického dipolového momentu vede k absorpci (nebo k emisi) záření p p p q 0 p - aktuální dipólový moment p 0 - dipólový moment v rovnovážné poloze q - normální souřadnice vibračního módu 0 q
Infračervená spektrometrie Základní výběrové pravidlo infračervené absorpce p q 0 INTENZITA PÁSŮ ÚMĚRNÁ kvadrátu ZMĚNY DIPOLOVÉHO MOMENTU BĚHEM VIBRAČNÍHO POHYBU
Infračervená spektrometrie p q 0 NEABSORBUJÍ IČ záření O 2, N 2, H 2, O 3 prášková síra křemík uhlík - grafit, diamanty N N látka, která neabsorbuje IČ záření, ho může reflektovat, může ho též rozptylovat
Infračervená spektrometrie p 0 SILNĚ ABSORBUJÍ IČ záření q Cl H HCl, H 2 O, CO 2, SO 2, N x O y skleníkové plyny alkoholy, karbonylové a karboxylové sloučeniny nitroderiváty, sulfo-deriváty halogenderiváty anorganické soli a komplexní sloučeniny
Infračervená spektrometrie ANALYZOVANÉ TYPY MATERIÁLŮ - plyny - analýza složení zemního plynu - monitoring vzdušných polutantů - kapaliny, roztoky - analýza olejů - analýza odpadních vod - analýza mléka - práškové vzorky - analýza léčiv, drog, trhavin - analýza rud, hnojiv - fázové rozhraní - povrchová analýza
Infračervená spektrometrie - instrumentace
FT-IR Spectrometr základní schéma Pevné zrcadlo Pohyblivé zrcadlo Dělič paprsku x 0 -x IR zdroj záření He-Ne laser Laserová dioda Vzorek Detektor
Infračervená spektrometrie - instrumentace ČÁSTI FTIR SPEKTROMETRU ZDROJ ZÁŘENÍ MIR, FIR - keramická tyčinka žhavená na teplotu 1000-1200 C - SiC, Globar FIR - rtuťová výbojka NIR - žárovka - wolframová, wolfram-halogenová DĚLIČ PAPRSKŮ MIR - Ge povlak na KBr, ZnSe, CsI NIR - Si povlak na CaF 2, či křemeni FIR - kovová síťka, PET-Mylar
Infračervená spektrometrie - instrumentace ČÁSTI FTIR SPEKTROMETRU DETEKTOR ZÁŘENÍ MIR - DTGS (deuteriumtriglycin sulfát) - MCT (mercury-cadmium-telurid) NIR - PbSe, PbS, InSb, Ge, MCT FIR - DTGS, GaAs-Zn DALŠÍ PRVKY NaCl, KBr, ZnSe, CaF 2, CsI, křemík, diamant
Michelsonův Interferometr, 1 Interferometr Fixované zrcadlo (F) Pohyblivé zrcadlo (P) Dělič paprsku (D) DP = DF NULOVÝ DRÁHOVÝ ROZDÍL x 0 -x Fázový rozdíl = 0 Detektor Konstruktivní interference vln maximum signálu na detektoru
Michelsonův Interferometr, 2 Interferometr Fixované zrcadlo (F) Dělič paprsku (D) DF = DP - 1/8 l Pohyblivé zrcadlo (P) x 0 -x Fázový rozdíl = 1/4 l Detektor Destruktivní interference vln pokles signálu na detektoru
Michelsonův Interferometr, 3 Interferometr Fixované zrcadlo (F) Dělič paprsku (D) DF = DP - 1/4 l Pohyblivé zrcadlo (P) x 0 -x Fázový rozdíl = 1/2 l Detektor Úplná destruktivní interference vln nulový signálu na detektoru
Napětí Signal Detektoru, 1 závislost napětí na dráhovém rozdílu pohybu zrcadel l Dráhový rozdíl
2 waves: Rychlá Fourierova transformace (FFT) V o l t s 3 2 1 0-1 -2 výpočet frekvencí z interferogramu FFT E m i s s i v i t y 400 300 200 100 300 250 200 150 Data Points 100 50 0 0 5000 4000 3000 2000 Wavenumbers 1000 0 3601 waves: V o l t s 4 3 2 1 0-1 -2 FFT E m i s s i v i t y 40 35 30 25 20 15 10-3 5000 4000 3000 Data Points 2000 1000 0 5 4000 3500 3000 2500 2000 Wavenumbers 1500 1000 500
1700 1800 1900 2100 2200 2300-3 -2-1 0 1 2 3 4 Data Points Volts 1700 1800 1900 2100 2200 2300-3 -2-1 0 1 2 3 4 Data Points Volts Transmisní spectrum 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 5 10 15 20 25 30 35 40 Wavenumbers Emissivity 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 5 10 15 20 25 30 35 40 Wavenumbers Emissivity pozadí: FFT vzorek: FFT 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 20 30 40 50 60 70 80 90 Wavenumbers Transmittance poměr
Transmisní spektra pevných vzorků příprava KBr tablet směs vzorku a KBr (1:100) měření tablet v transmisním módu
FT-IR reflexní techniky Infračervený paprsek se odráží od fázového rozhraní úplným vnitřním odrazem Vzorek musí být v optickém kontaktu s krystalem Snímaná informace z povrchové vrstvy vzorku Pevné látky prášková forma, případně naředěná IČ transparentní matricí - (KBr) Informace z objemu vzorku Reflektující vzorek či spíš tenká vrstva na zrcadlovém podkladu Informace z tenké (povrchové) vrstvy
Infračervená spektrometrie - Reflexní techniky ATR
Infračervená spektrometrie - Reflexní techniky ATR - attenuated total reflection - zeslabený úplný (vnitřní) odraz
Infračervená spektrometrie - Faktory, které ovlivňují ATR spektrální analýzu POUZE ODRAZ - NIKOLI LOM! Vlnová délka infračerveného záření Index lomu IRE a vzorku Hloubka průniku Efektivní délka dráhy Úhel dopadu Účinnost kontaktu se vzorkem Materiál IRE (ATR krystalu)
Infračervená spektrometrie - Vlnová délka infračerveného záření Hloubka proniknutí infračerveného záření je závislá na vlnové délce tohoto záření. S rostoucí vlnovou délkou infračerveného záření roste hloubka proniknutí, tj. proniknutí klesá s rostoucím vlnočtem. Oproti transmisním spektrům jsou zvýrazněny intenzity pásů v oblasti nízkých vlnočtů vůči pásům při vyšších vlnočtech.
Infračervená spektrometrie - Index lomu IRE a vzorku HLOUBKA PRŮNIKU Hloubka proniknutí - dp vzdálenost od fázového rozhraní mezi krystalem a vzorkem k vrstvě ve vzorku, kde je intenzita evanescentní vlny zeslabena až na 1/e (přibližně 37%) z její původní hodnoty. l dp = 2 n 1 sin 2 - n 2 21
Zeslabený totální odraz (ATR) - materiály
Infračervená spektrometrie ATR - instrumentace
Attenuated Total Reflection (ATR) ATR Spectra of Rubber Diamond vs Germanium IRE Refractive indexes: Ge=4 Diamond=2.4
Spekulární vs. Difuzní Reflexe
Specular vs Diffuse Reflection
Spekulární reflexe Refractive index Absorbance index K. Yamamoto and H. Ishida, Vibrational Spectrosc., 8, 1 (1994)
Spekulární reflexe Experimentální uspořádání
Difuzní reflexe Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy (DRIFTs) Spectra of powders and rough surfaces can be recorded by illuminating these surfaces and collecting sufficient scattered radiation with ellipsoids or paraboloids. - fast measurement of powdered samples - low repeatability of spectral data - complicated physical description of the effect shape of particles, compactness of samples refractive index of particles reflectivity and absorption characteristics of particles
Diffuse Reflection Mechanisms generating infrared spectrum of a powder
Difuzní reflexe DRIFTs Sample Preparation - powder simply placed into the sample cup and analyzed (no sample preparation) - if the sample is too absorbent, it must be diluted in a nonabsorbent matrix (KBr, KCl, ) - no pellet pressing required - particle size smaller than 10 mm (i.e. not exceeding the wavelength of the incident radiation) preferred - or paper disc coated on a surface by SiC as an abrasive material grinding of sample - ideal for pharmaceutical and forensic applications
DRIFTs Spectra y axe units Difuzní reflexe From the theoretical standpoint, there is no linear relation between band intensity and concentration (as valid in transmission), and quantitative analyses by the DRIFTS method are therefore rather complicated. - expressed in linear Kubelka-Munk units (roughly correspond to absorbance in transmission KBr pellet technique)
Infračervená spektrometrie - Reflexní techniky DRIFT - rychlé měření práškových vzorků - nízká opakovatelnost dat - složitý fyzikální popis jevu tvar částic, zhutnění vzorku index lomu částic reflektivita a absorpční vlastnosti částic
Využití IR spektroskopie ve farmacii FTIR mapování povrchu tablet identifikace distribuce účinné látky Paracetamol v mikrokrystalické celulóze hm. Obsah 10%, 50% a 90% Experimentální parametry: diamantový ATR krystal, rozměr obrázku - ca. 520x715 mm 2, 32 scanů, rozlišení 4 cm -1 A - 10%, B - 50%, C - 90%
Využití IR spektroskopie ve farmacii FTIR mapování rozpouštěcí studie Nikotinamid v PEG hm. obsah 10%, 20%, 30% a 50% Experimentální parametry: průtočná cela s ZnSe ATR krystalem, rozměr obrázku - 3.8 mm x 5.3 mm, 32 scanů, rozlišení 4 cm -1
Využití IR spektroskopie ve farmacii FTIR mapování biologické vzorky, mozkový nádor Komplexní charakter spektrálních dat tisíce odlišných molekul koncentrace se mění v čase - překryv IR pásů různých látek komplikuje interpretaci dat Mapování oblasti nádoru - chemické mapování sacharidů velmi podobné výsledky pro glukosu 1033 cm -1 (Glc), mannosu 1064 cm -1 (Man), a fructosu 1059 cm -1 (Fru) obtížná identifikace nutnost použití statistických metod
Využití IR spektroskopie ve farmacii FTIR mapování sférické kapsle
Využití IR spektroskopie ve farmacii FTIR mapování farmaceutická identifikace steroidních mastí distribuce aktivních a neaktivních složek API - Alclometasone dipropionate (spektrum a) Pomocné látky parafíny, vosky, estery mastných kyselin (spektra b-i)