Hmotnostní spektrometrie (1)

1 % Hmotnostní spektrometrie (1) 12_Chudoba_HCVDGrigsby_1ACC 12 (.677) 28 29 27 32 57 71 43 55 69 97 83 85 41 81 95 111 67 99 113 125 54 67 79 93 127 15 137 153155 165 183 197 211 225 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 Josef Chudoba BSAH Hmotnostní spektrometrie Hmotnostní spektrum základní pojmy, molekulová hmotnost, izotopy prvků Rozlišovací schopnost spektrometru způsoby měření spekter Ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii Typy hmotnostních spektrometrů Historie hmotnostní spektrometrie Součásti hmotnostního spektrometru iontový zdroj separátor iontů vakuový systém způsob dávkování vzorku

Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry MS) Analytická technika pro analýzu organických sloučenin Kvalitativní analýza identifikace sloučenin (především nízkomolekulární sloučeniny), pomoc při odvození resp. potvrzení struktury molekuly (výšemolekulární sloučeniny) Kvantitativní analýza sledování obsahu vybraných analytů v různých matricích Ale i sledování obsahu kovů (ICP MS) Speciální aplikace pak např. ISTPE RATI MS Podstatou MS je detekce nabitých částic (iontů), které vznikají z molekul vzorku při INIZACI jedná se o destruktivní metodu vzorek je při analýze znehodnocen VZRKY JAKÉH SKUPENSTVÍ A S JAK VELKU MLEKULU LZE PMCÍ MS ANALYZVAT V hmotnostní spektrometrii se používají různé ionizační techniky, ale v praxi lze ionty vytvořit i z vysokovroucích, vysokomolekulárních sloučenin d vodíku (1 Da) po proteiny s molekulovou hmotností v řádech 1 Da, záleží na ionizační technice a hmotnostním spektrometru C LZE RZLUŠTIT Z HMTNSTNÍH SPEKTRA 1) Hmotnost iontu (popř. molekulovou hmotnost sloučeniny) 2) Přítomnost prvků, které mají výrazné zastoupení izotopů (např. Cl, Br) 3) Při pokročilé fragmentaci molekuly informace o struktuře sloučeniny 4) Je-li hmotnost molekulového resp. pseudomolekulového iontu měřena s dostatečnou přesností tak i možné elementární složení sloučeniny

Hmotnostní spektrum Intenzita 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Cu (.1); Is (1.,1.) C37H68N13 1 [ M + H ] + 734.4691 Molekulový resp. pseudomolekulový ion Magnet EI+ 6.35e12 Izotopické příspěvky % 735.4691 731 732 733 734 735 736 737 738 739 736.4769 mass m/z sa x: m/z hmotnost iontu dělena jeho nábojem sa y: intenzita (četnost) fragmentů, které detekuje detektor je vždy normalizována na nejvyšší změřenou intezitu ve spektru nejvyšší pík má výšku 1 % Hmotnostní spektrum Režim záznamu dat centrovaný (centroid) především u GC/MS instrumentace - intenzity m/z iontů tvar čáry kontinuální (continous) u LC/MS instrumentace intenzity m/z iontů tvar chromatografického píku 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Cu (.1); Is (1.,1.) C37H68N13 1 [ M + H ] + 734.4691 H 3 C H 3 C H H 3 C H CH 3 H H 3 C CH 3 H N CH 3 Magnet EI+ 6.35e12 CH 3 CH 3 CH 3 % 735.4691 H 3 C CH 3 CH 3 Erythromycin 736.4769 H 7_Blazek_P5_1 (15.245) Is (1.,1.) C37H68N13 1 734.4691 Magnet EI+ 6.35e12 % 735.4725 736.4753 737.478 731 732 733 734 735 736 737 738 739 mass

MLEKULVÁ HMTNST atomů Molekolová hmotnost - jednotka dalton (Da) 1 Da = 1 a.m.u. (atomic mass unit) = hmotnost 1/12 izotopu 12 C 1 Da = 1,66 338 782 x 1-27 kg Molekulová hmotnost hmotnost molekuly /prvků/ (jednotka a.m.u.) Molární hmotnost hmotnost 1 molu molekul (jednotka g/mol) číselně molární hmotnost a molekulová hmotnost shodné monoisotopická - počítána z hmotností izotopů prvků průměrná - zohledňuje hmotnosti všech izotopů prvků (uvedená v periodické tabulce) nominální zaokrouhlená (celočíselná) monoisotopická hmotnost MLEKULVÁ HMTNST atomů Výpočet průměrné (relativní) hmotnosti atomu prvku (M r ) M r = Σ (A i * M i ) / Σ A i M i monoisotopická hmotnost izotopu A i intenzita (zastoupení) izotopu Příklad chlor: - 35 Cl Mi = 34,96885 a.m.u. Ai = 1 % 37 Cl Mi = 36,9659 a.m.u Ai = 31,96 % Mr = (1 * 34,96885 + 31,96 * 36,9659) / 131,96 = 35,4525

MLEKULVÁ HMTNST bromobenzene Br V MS spektrech vždy MNISTPICKÁ hmotnost ve spektru jsou všechny izotopy 1 77 Nominal Mass = 156 Da Monoisotopic Mass = 155.957455 Da Average Mass = 157.79 Da Molecular Formula = C 6 H 5 Br benzene 5 51 12 27 38 6 14 113 128 143 1 3 5 7 9 11 13 15 17 (mainlib) Benzene, bromo- Br 156 1 78 Nominal Mass = 78 Da Monoisotopic Mass = 78.4695 Da Average Mass = 78.1118 Da Molecular Formula = C 6 H 6 5 51 39 15 26 63 74 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (mainlib) Benzene Informace z MS spektra zastoupení izotopů prvků Relativní zastoupení izotopů prvků v přírodě Prvek Izotop % rel. Izotop % rel. Izotop % rel. Uhlík 12 C 1 13 C 1,11 Vodík 1 H 1 2 H,16 Dusík 14 N 1 15 N,38 Kyslík 16 1 17,4 18,2 Síra 32 S 1 33 S,78 34 S 4,4 Křemík 28 Si 1 29 Si 5,8 3 Si 3,35 Chlor 35 Cl 1 37 Cl 32,5 Brom 79 Br 1 81 Br 98, A+2 prvky A+1 prvky A prvky F, I, P, Na H(vzhledem k nízké intenzitě A+1)

1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (12.55) Is (1.,1.) Cl2 7 1 5.74e12 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Is (1.,1.) Br2 16 1 5.e12 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Is (1.,1.) Br 78.9183 1 5.7e12 8.9163 Br 2 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Is (1.,1.) Cl 34.9689 1 7.58e12 % Cl 2 72 % 158 162 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Is (1.,1.) Br3 239 1 241 3.8e12 74 66 68 7 72 74 76 78 8 mass % mass 15 16 17 Br 3 % 1 ul, split 1:2 7_Blazek_P5_1 (5.12) Is (1.,1.) Cl3 15 1 4.35e12 17 % 36.9659 237 243 Cl 3 Br mass 7 75 8 85 9 I (m/z 79) : I (m/z 81) cca 1:1 23 235 24 245 25 mass Cl mass 25 3 35 4 45 I (m/z 35) : I (m/z 37) cca 3:1 % 19 111 mass 1 11 12 1 5 25 32 38 51 43 56 61 74 84 97 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 (mainlib) Benzene, chloro- 1 5 51 77 12 27 38 6 14 113 128 143 1 3 5 7 9 11 13 15 17 (mainlib) Benzene, bromo- Br 77 Cl 112 156 m/z 77 45,3 % m/z 112 1 % m/z 113 6,9 % m/z 114 32,9 % m/z 77 1 % m/z 156 61,8 % m/z 157 4,1 % m/z 158 59,8 % 1 5 51 77 I 27 37 6 127 152 176 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 (mainlib) Benzene, iodo- 24 m/z 77 1 % m/z 24 74,5 % m/z 25 4,4 %

Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině (Cn) 1 5 A:m/z 78 1 % A+1:m/z 79 6,5 % 78 Cn = ( I ( A+ 1) I ( A) /1,1) *1 51 39 15 26 49 63 74 4 53 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (mainlib) Benzene 1 5 A:m/z 154 1 % A+1:m/z 155 12,9 % 154 76 51 63 39 27 89 12 115 128 139 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 (mainlib) Biphenyl Nutné doplňující informace k hmotnostnímu spektru 1) Jaká ionizační technika byla při měření použita tvrdé ionizační techniky vlivem přebytku dodané energie se vzniklý molekulový ion dále štěpí měkké ionizační techniky malá nebo skoro žádná fragmentace 2) S jakým rozlišením bylo spektrum měřeno hmotnost s přesností celého čísla (jednotkové rozlišení) v praxi nejvíce rozšířené u GC/MS přístrojů hmota s přesností na desetinná místa 3) Jaký experiment (MS vs MS/MS typ fragmentace v MS) 4) Použitá instrumentace a podmínky měření

Rozlišovací schopnost spektrometru (R) jak se rozdělí ionty s blízkou hmotností R = m/ m m m/z iontu, m... rozdíl m/z dvojice sledovaných iontů Různé definice rozlišení: valley definice vycházející s překryvu píků FWHM (Full Width at Half Maximum) definice vycházející ze šířky píku Převzato z materiálu Thermo Fischer Scientific VYSKÉ rozlišení (HIGH RESLUTIN) Jsou-li MS spektra měřena s vysokým rozlišením je možné rozdělit sloučeniny se stejnou nominální, ale odlišnou monoisotopickou hmotou [ M + H ] +

Je naměřená hmotnost iontu (m/z) správná? Před měřením se provádí kalibrace hmotnostní stupnice pomocí kalibračních standardů chyba naměřené m/z a skutečné m/z závisí na rozlišovací schopnosti resp. typu spektrometru a kvalitě kalibrace Chyba při měření hmoty ( m acc ) m acc = m MEASURED - m TRUE m acc (ppm) = 1 6 x m acc / m TRUE Kalibrace externí nebo interní - přidavek referenční (lockovací) látky přímo při měření vzorku Hmotnostní spektrum sloučeniny je vždy závislé na použité INIZAČNÍ TECHNICE INIZACE tvrdá (vysoká energie stačí na vytvoření iontu z neutrální molekuly a na další štěpení vzniklých iontů) Elektronová ionizace (Electron Impact) s energií elektronů 7 ev / EI + 7 ev / - rutinně používaná při GC-MS analýzách, proměřeny statisíce látek databáze spekter (NIST, WILLEY) V praxi pouze kladný mód (tvorba kladně nabitých iontů) INIZACE měkká (dodaná energie stačí většinou pouze na vytvoření iontu z neutrální molekuly) Příklad: ionizační techniky rutinně používané při LC-MS analýzách Elektrosprejová ionazace / ESI /. chemická ionizace za atmosferického tlaku / APCI / - kladný i záporný mód (tvorba kladně resp. záporně nabitých iontů) MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) pro vysokomolekulární sloučeniny

Vliv použité ionizační techniky na MS spektrum GC/MS analýza efedrinu Molekulový ion v hmotnostním spektru Rozpoznání molekulového iontu v MS spektru není vždy jednoduché EI+ 7 ev u některých látek chybí (vysoký stupeň fragmentace) nebo je jeho intenzita velmi nízká (možnost záměny s ionty pozadí MS spektra) ESI tvorba vícenásobně nabitých iontů, tvorba aduktů iontů s Na, K, tvorba dimerů APCI možné štěpení (vlivem vyšší teploty ve zdroji) Existují však pravidla a postupy, které určení molekulového iontu usnadní EI+ 7 ev: Počet kruhů a dvojných vazeb (RINGS + Double Bonds R+DB); zakázané ztráty iontů, pořadí eluce látek na GC koloně (obvykle vyšší molekulová hmotnost vyšší bod varu delší retenční čas) ESI: Známé adukty, výpočet molekulové hmotnosti ze série vícenásobně nabitých iontů

Dusíkové pravidlo Dusík m= 14 Da, třívazný prvek žádný nebo sudý počet atomů dusíku v molekule -> molekulová hmotnost látky je SUDÉ číslo lichý počet atomů dusíku v molekule -> molekulová hmotnost látky je LICHÉ číslo EI+7 ev: nebo sudý počet N: m/z molekulového iontu sudé číslo m/z fragmentů liché číslo lichý počet N: m/z molekulového iontu liché číslo m/z fragmentů sudé číslo ESI+: nebo sudý počet N: lichý počet N: ESI-: nebo sudý počet N: lichý počet N: m/z [M+H] + iontu liché číslo m/z [M+H]+ iontu sudé číslo m/z [M-H] - iontu liché číslo m/z [M-H]- iontu sudé číslo Počet kruhů a dvojných vazeb Rings + Double Bonds (R + DB) Vyjadřuje stupeň nenasycenosti molekuly R+DB = C ½ H + ½ N +1 C = počet čtyřvazných atomů C, Si H = počet jednovazných atomů - H, Cl, Br, F (halogeny) N = trojvazných atomů N, P, As Počet dvouvazných se neuvažuje (dvouvazebná S, ), ale třeba DMS síra je čtyřvazná Příklad: fenol C 6 H 5 H R+DB = 6 1/2*6+1/2*+1 = 4 1 kruh Aromáty : R+DB = minimálně 4 3 dvojné vazby

Využití R+DB a dusíkového pravidla EI+ 7 ev: Celočíselná hodnota R+DB ion s lichým počtem elektronů může být molekulový ion Neceločíselná hodnota R+DB ion se sudým počtem elektronů nemůže být molekulový ion Využití při strukturní analýze Elementární analýza z High Res MS spektra Vždy nutné předpokládat jaké prvky a kolik kterého maximum org. látky C, H, N,, popř. S, přítomnost halogenů lze zjistit z izotopického zastoupení, hrubý odhad max. počtu uhlíků (Cn) Cn (max) = Mw/14 (přesněji z izotop. zastoupení) ELEMENTÁRNÍ ANALÝZA Z HMTNSTNÍH SPEKTRA H 3 C H H 3 C H H 3 C CH 3 CH 3 H 3 C CH 3 H CH 3 H N CH 3 H CH 3 CH 3 Přesnost měření hmoty: High-RES MS spektrometry 1 3 ppm H 3 C Erythromycin C37 H 67 N 13 CH 3 Mw monoiso = 734,4691 Da Příklad vstupní parametry: C max = 52, H max = 16, N max = 15, max = 15 Výsledek: navržené kombinace C x H y (N z, z,s z ) Přesnost měření - chyba hmoty (ppm) 1 38 výsledků 5 17 výsledků 2 9 výsledků 1 4 výsledky Aplikace chemických pravidel (max. počet kruhů a dvoj.vazeb, dusíkové pravidlo, izotopické zastoupení prvků) snižuje počet nalezených kombinací!! řešeno softwarově

Jakou ionizační techniku vybrat pro jaké sloučeniny? GC/MS Elektronová ionizace (EI+ 7 ev) - v praxi hmotnost do cca 1 Da, nutná teplotní stálost sloučeniny, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua, není vyrazně omezena přítomností nějakých funkčních skupin ale např. problematické skupiny NH2-C- (teplotně labilní) Chemická ionizace (CI) - v praxi hmotnost do cca 1 Da, nutná teplotní stálost, ionizace probíhá po zplynění (zahřátí látky) z plynného stavu za vakua s přídavkem ionizačního plynu (methan, isobutan) většinou pouze na vybrané typy sloučenin LC/MS Elektrosprejová ionizace (ESI) pro teplotně nestálé i vysokomolekulární sloučeniny, ionizace probíhá z roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), sloučeniny musí ale vykazovat určitou polaritu (např. mají kyslík nebo dusík v molekule), vhodný pro iontové sloučeniny Atmosferická chemická ionizace (APCI) - pro teplotně stabilnější látky než ESI ionizace probíhá z plynné fáze po odpaření roztoku sloučeniny a rozpouštědla (mobilní fáze), elektrickým výbojem dochází k tvorbě iontů MATRIX ASSISTED LASER DESRPTIN (MALDI) ionizace vzorku v přítomnosti pevné matrice vzorku laserem vhodné pro vysokomolekulární, teplotně nestálé sloučeniny i nepolární (polymery, proteiny) Existuje celá řada dalších ionizačních technik cílem je vždy vytvořit nabitou částici, která je následně analyzována. Jak velké molekuly lze analyzovat Zdroj: Agilent Technologies

Jak velké molekuly lze analyzovat GC/MS LC/MS Kvadrupol (Q) Iontová past (IT) GC/MS LC/MS TF (Time of Flight) LC/MS RBITRAP GC/MS Magnetický sektor V praxi většinou jednotkové rozlišení, maximální m/z cca 1 2, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter) Měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~ 4), maximální m/z až 5 kda, velmi vysoká frekvence sběru dat (spekter) měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~1), maximální m/z ~4 kda, pomalejší frekvence sběru dat (spekter) měří i s vysokým rozlišení (Rmax ~4), maximální m/z ~2, pomalejší frekvence sběru dat (spekter), Přístroje hybridní umožňují provedení tzv. MS/MS měření (více iontových separátorů) GC/MS LC/MS Tripple Quad (QQQ) Trojitý quadrupol LC/MS Q-TF Quadrupol Time f Flight LC/MS Ion Trap RBITRAP iontová past - rbitrap nebo IT-TF Jak velké molekuly lze analyzovat? MALDI až 1 kda ESI až 1-1 kda (vícenásobně nabité ionty) APCI až 1-2 kda EI+ 7 ev / CI až 1-2 kda

Historie hmotnostní spektrometrie První pokusy s výboji v plynech 1897 J.J.Thomson Cathode Rays Philosophical Magazine, 1897, 44:293 1919 - Aston F.W. The Mass-Spectra of Chemical Elements Phil. Mag., 1919, XXXVIII(), p.77 hmotnostní spektra izotopů prvků Ionizační techniky a přístroje 1922 elektronová ionizace - Smyth na základě pokusů Dempstera 1934 - první magnetický sektorový hmotnostní spektrometr s dvojitou fokusaci J. Mattauch, R. Herzog Über einen neuen Massenspektrographen Zeitschrift fur Physik, 1934, 89(), p.786 1943 první inzerce na komerční hmotnostní spektrometr The Mass Spectrometer: A new electronic method for fast, accurate gas analysis - Westinghouse Electric International Company, 1943 Historie hmotnostní spektrometrie 1946 objev TF analyzátoru Stephens W. Pulsed Mass Spectrometer with Time Dispersion Bull. Am. Phys. Soc., 1946, 21(2), p.22 1953 - objev kvadrupolu a iontová pasti Paul W., Steinwedel H. Ein neues Massenspektrometer ohne Magnetfeld Z. Naturforschg., 1953, 8a(), p.448 1956 spojení plynové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (GC/MS) - Golhke R.S., McLafferty F., Wiley B., Harrington D. First demonstration of GC/MS Bendix Corporation, 1956 1966 chemická ionizace Munson M.S.B., Field F.H. Chemical Ionization Mass Spectrometry I. General introduction J. Am. Chem. Soc., 1966, 88(12), p.2621-263 1968 - první počátky elektrosprejové ionizace (ESI) Dole M., Mack L.L., Hines R.L., Mobley R.C., Ferguson L.D., Alice M.B. Molecular beams of macroions,journal of Chemical Physics, 1968, 49(5), p.224

Historie hmotnostní spektrometrie 1975 atmosferická chemická ionizace (APCI) Carroll D.I., Dzidic I., Stillwell R.N., Haegele K.D., Horning E.C. Atmospheric Pressure Ionization Mass Spectrometry: Corona Discharge Ion Source for Use in Liquid Chromatograph - Mass Spectrometer - Computer Analytical System Analytical Chemistry, 1975, 47(14), p.2369 1978 trojitý kvadrupol Yost R.A. and Enke C.G. Selected Ion Fragmentation with a Tandem Quadrupole Mass Spectrometer Journal of the American Chemical Society, 1978, 1(7), p.2274 1985 počátky MALDI ionizace Tanaka K., Ido Y., Akita S., Yoshida Y., Yoshida T. Detection of High Mass Molecules by Laser Desorption Time-f- Flight Mass Spectrometry Proceedings of the Second Japan-China Joint Symposium on Mass Spectrometry, 1987, (), p.185 Historie hmotnostní spektrometrie 1989 - rozvoj elektrosprejové ionizace (ESI) Fenn J.B., Mann M., Meng C.K., Wong S.F., Whitehouse C.M. Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules Science, 1989, 246(4926), p.64 2 RBITRAP Makarov A. Electrostatic Axially Harmonic rbital Trapping: A High- Performance Technique of Mass Analysis Analytical Chemistry, 2, 72(6), p.1156 25 DART ionizace Cody R.B., Laramee J.A., Durst H.D. Versatile New Ion Source for the Analysis of Materials in pen Air under Ambient Conditions Anal. Chem., 25, 77(8), p.2297 Zdroj: http://masspec.scripps.edu/mshistory/mshistory.php

Nobelova cena a hmotnostní spektrometrie Joseph John Thomson 196 Nobel Prize for Physics "in recognition of the great merits of his theoretical and experimental investigations on the conduction of electricity by gases" Francis William Aston 1922 Nobel Prize for Chemistry "for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the whole-number rule" Wolfgang Paul 1989 Nobel Prize for Physics "for the development of the ion trap technique" John Bennet Fenn 22 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (ESI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules" Koichi Tanaka 22 Nobel Prize for Chemistry "for the development of soft desorption ionisation methods (MALDI) for mass spectrometric analyses of biological macromolecules Schéma hmotnostního spektrometru Inlet Plynový chromatograf Kapalinový chromatgraf Direct Insertion (Infussion) Probe MALDI destička Iontový zdroj Ionizační techniky: EI+, CI, APCI, ESI, MALDI Analyzátor Iontový separátor Detektor vakuum

Režimy snímání dat: MS experiment Intenzita m/z čas SIM (SIR) TIC Full SCAN (Total Ion Current TIC) cyklicky se snímá celé MS spektrum požadovaného rozsahu m/z Rekonstruovaný chromatogram (RIC) z TICu se vybere požadovaný ion a vykreslí se chromatografický záznam Selected Ion Monitoring (SIM) cyklicky se snímají jen vybrané ionty citlivější než TIC režim např. u kvadrupolu detegované absolutní množství analytu činí: TIC řádově ng (1 9 g) SIM řádově pg (1 12 g) až fg (1-15 g) Režimy snímání dat: MS/MS experimenty Pouze hybridní MS spektrometry a tripple Quad Detektor Iontový zdroj Kolizní cela Product Ion Scan: Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC detekce Instrumentace: Tripple Quad, Q-ToF (MS 2 ); Ion Trap (až MS 1 ) s vyšším MS n klesá citlivost! Precursor Ion Scan: Q1:TIC (m/z 1 m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Instrumentace: nelze na Ion Trap Constant Neutral Loss Scan: Q1:TIC (m/z 1 m/z 2 ) Q2: fragmentace iontu Q3: TIC ((m/z 1 - N) (m/z 2 - N)) detekce; N rozdíl hmotností iontů hmotnost odpadající neutrální částice z iontu Instrumentace: nelze na Q-ToF a Ion Trap Selective Reacrion Monitoring (SRM): Q1: izolace iontu (SIM) Q2: fragmentace iontu Q3: SIM detekce Fragmentace probíhá srážkou iontů s molekulami kolizního plynu (Argon)

Které vlastnosti MS spektrometru jsou v praxi důležité Cena, provozní náklady, účel využití!!! Napojení na separační techniku: GC/MS X LC/MS Technické parametry: Single (jeden iont. separátor) x hybridní (více separátorů) Rozsah scanování m/z (nejnižší a nejvyšší m/z) Rychlost scanování (počet scanů/s) Citlivost, dynamický rozsah (pro kvantitativní analýzu) Rozlišovací schopnost (vysokorozlišující X jednotkové rozlišení) Kompatibilita s ionizačními technikami (dostupné iontové zdroje) Vakuum (je-li třeba vyšší stupeň vakua vyšší cena) Požadavky na instalaci: Chlazení pump vakuového systému (vodní nebo vzdušné) Velikost systému - přenosné x stolní (BENCH-TP) x velké (hmotnost > 5 kg) Plyny např. LC-MS průtok N 2 až 5 l/min nutný generátor N 2 nebo zdroj kapalného N 2 MS - iontový zdroj a ionizační technika Electron Impact (EI + 7 ev) elektronová ionizace nejpoužívanější u GC/MS, nejvíce prozkoumaná ionizační technika U většiny látek se hodnota energie pro tvorbu molekulového iontu pohybuje okolo 1 ev 7 ev přebytek energie dostatečný pro tvorbu molekulového iontu a také pro tvorbu fragmentů z molekulového iontu Dnes jsou k dispozici obsáhlé databáze (knihovny) spekter EI+ dnes běžně ve spojení s GC Látka je ionizována proudem elektronů ve vakuu z plynné fáze Ionizace probíhá ve vakuu Schéma EI+ ionizačního zdroje

MS - iontový zdroj a ionizační technika ESI (Electrospray) V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde v elektrickém poli k tvorbě spreje. V kapičkách kapaliny dojde k povrchové lokalizaci náboje a následné tvorbě iontu. Při této ionizaci vznikají často i vícenásobně nabité ionty a adukty např. (M+Na) + - ionizace probíhá za atmosferického tlaku MS - iontový zdroj a ionizační technika APCI (Chemická ionizace za atmosferického tlaku) V proudu dusíku za zvýšené teploty dojde k tvorbě spreje a vypařování látky i mobilní fáze. Na jehlu je vloženo vysoké napětí, výbojem vzniká plazma a v ní ionty H 3 + a H radikály. Ionty předají náboj analytu.

MS - iontový zdroj a ionizační technika Zdroj pro APCI a ESI je prakticky konstrukčně shodný, liší se v přítomnosti jehly pro koronový výboj (APCI). Existují i kombinované zdroje ESI/APCI. U sprayových ionozací vždy záleží na povaze analytu nutno zvolit pozitivní nebo negativní mód APCI první komerční využití 1986 oproti ESI lze použít vyšší průtok mobilní fáze, vyšší teplota, vyšší stupeň fragmentace ESI první komerční využití 1988 22 Nobelova cena za chemii: John Bennett Fenn Kompatibilní pouze s LC s reverzním uspořádáním fází (polární mobilní fáze), tvorba vícenásobně nabitých iontů, ionizace z roztoku, lze analyzovat i soli MS - iontový zdroj a ionizační technika MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption) Roztok vzorku je smíchán s roztokem matrice (nízkomolekulární UV absorbující látka) na spotovací destičce. Ta je vložena do zdroje, kde dochází k tvorbě pevné směsi matrice a vzorku. Účinkem energie dodané laserovým pulzem dochází k ionizaci aduktu matrice-vzorek a následně odtržení matrice. Ionty analytu jsou měřeny obvykle TF analyzátorem. Příklad matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina, laser 337 nm. Vzorek µm roztok, matrice 1 mm roztok Tvorba obvykle jednonásobně nabitých iontů (M+H) +, (M+K) +, (M+Na) + Spotovací destička

Zdroj:Agilent Technologies Zdroj:Agilent Technologies

MS - separátory iontů lineární kvadrupol konstrukčně se jedná o 4 kovové tyče hyperbolického nebo kruhového průřezu, které jsou připojeny ke zdrojům DC a AC napětí. Ionty, které vlétnou do prostoru mezi tyčemi, se dostanou do střídavého elektrického pole a začnou oscilovat. Při vhodném poměru DC a AC složky napětí a dané hodnotě těchto napětí projdou kvadrupolem pouze ionty o určitém poměru m/z. Zařízení se chová jako filtr nastavený na určitou hodnotu m/z. Změnou vkládaných napětí je možné nechat projít filtrem postupně ionty v celém rozsahu hodnot m/z MS - separátory iontů Iontová past (ion trap) účinkem elektrického pole jsou ionty uzavřeny v ohraničeném prostoru. Iontová past se skládá ze vstupní a z výstupní elektrody kruhového průřezu a z prstencové středové elektrody. Krajní elektrody jsou uzemněny, na středovou elektrodu je vkládáno vysokofrekvenční napětí s proměnnou amplitudou. Ionty jsou nuceny pohybovat se uvnitř iontové pasti po uzavřených kruhových drahách s rostoucí amplitudou napětí se ionty s rostoucím m/z dostávají na nestabilní trajektorie a opouštějí prostor iontové pasti směrem do detektoru

MS - separátory iontů Průletový analyzátor (time of flight TF) je tvořen prázdnou trubicí. K časovému rozdělení iontů podle m/z dochází na základě jejich odlišné doby letu z iontového zdroje do detektoru. Nutná konstatantní stabilní teplota - st Hmotnější ionty se pohybují nižší rychlostí než ionty lehčí a dorazí do detektoru později. Dosažené rozlišení závisí na délce dráhy, kterou ionty v průletovém analyzátoru urazí. MS - separátory iontů Magnetický - sektorový hmotnostní analyzátor umožňuje prostorové rozdělení svazku iontů podle hodnoty m/z, konstrukčně se jedná o elektromagnet, mezi jehož pólovými nástavci prochází fokusovaný paprsek iontů z elektrického pole B r B. r m/ z = 2. V 2 V ionty o rozdílném poměru m/z opisují dráhy o různých poloměrech dochází k prostorové disperzi iontů podle jejich hmotnosti

RBITRAP MS - separátory iontů Svazek iontů je v C-trapu zbržděn kolizí s molekulami dusíku, stlačen a vystřelen do rbitrapu. Na jeho centrální elektrodě se postupně zvyšuje napětí a ionty se začínají spirálově pohybovat generují proudový signál, který je pomocí Fourierovy tranformace převeden na MS spektrum ctapole sa z elektroda ω ~ z konst. m/ z MS - detektor iontů detektor zařízení, které detekuje ionty separované hmotnostním separátorem Elektronový násobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony a ty dále lavinovým jevem, v tzv. channeltronu tvaru rohu, emitují další elektrony. Měří se vzniklý proud. Elektronásobič je citlivý na přetížení. Fotonásobič konverzní dynóda umožňuje konvertovat ionty na sekundární elektrony. Tyto elektrony při interakci s fosforem emitují fotony. Fotonový signál je zesílen ve fotonásobiči. Fotonásobič je zataven ve skle a je tak velmi rezistentní vůči poškození.

MS - vakuum EI+ 7 ev, CI, MALDI vakuum i ve zdroji spektrometru, všechny spektrometry vakuum v analyzátoru: aby byla zachována dlouhá dráha letu nabitých částic (mohly být detekovány) Spektrometry mají vždy dvoustupňový systém vakua 1. Stupeň vakua rotační olejové vývěvy vakuum cca 1-2 mbar slouží pro provoz pump 2. stupně vakua MS - vakuum 2. Stupeň vakua cca 1-5 až 1-8 mbar (1 mbar = cca 1 Pa) turbomolekulární pumpa difuzní olejová pumpa

MS - způsob vnosu vzorku EI+ 7 ev: GC/MS kapilární GC kolona (split, splitless, PTV inlet) evakuvatelný reservoar se septem kapilárou napojený do iontového zdroje sonda přímého vstupu (Direct insertion Probe - DIP) vzorek je v mikrovialce v držáku vyhřívané sondy zaveden přímo do iontového zdroje přes vacuum lock ESI, APCI: LC/MS mobilní fáze je pumpou čerpána přes LC kolonu a (popř. přes celu UV detektoru) kapilárou do zdroje (v případě potřeby se průtok před vstupem do MS splituje) Direct Infusion (DI) - přímý nástřik robotickou stříkačkou (mechanický posuv pístu) kapilárou do zdroje Flow Injection Analysis (FIA) nástřik přes vebtil do proudu mobilní fáze čerpané pumpou LC chromatografu kapilárou do zdroje Hmotnostní spektrometr Přenosný GC-MS HAPSITE (firma Inficon, Inc. U.S.A) Nasazení v Afganistánu (britské jednotky)

Hmotnostní spektrometr Sektorový hmotnostní spektrometr Hmotnostní spektrometr Kvadrupolový hmotnostní spektrometr s GC chromatografem

Hmotnostní spektrometr IT-RBITRAP hybridní MS spektrometr