UNIVERZITA PALACKÉHO Lékařská fakulta Laboratoř molekulární patologie

UNIVERZITA PALACKÉHO Lékařská fakulta Laboratoř molekulární patologie Studium mikrorna u dendritických buněk a T regulačních lymfocytů Disertační práce Olomouc 2013 Mgr. Renata Héžová

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Studium mikrorna u dendritických buněk a T regulačních lymfocytů - vypracovala samostatně pod vedením vedoucího disertační práce a s použitím uvedené literatury. V Olomouci dne 2. 4. 2013 Mgr. Renata Héžová 2

Poděkování: Na tomto místě bych chtěla poděkovat svému školiteli prof. MUDr. Jiřímu Ehrmannovi, PhD zejména za jeho vstřícnost během celého studia. Dále bych chtěla poděkovat doc RNDr. Ondřeji Slabému, PhD za pomoc při zpracování dat a prof. MUDr. Jaroslavu Michálkovi, Phd za spolupráci při vedení projektu. Děkuji také Mgr. Martině Rédové, PhD za jazykovou korekci a všem kolegům z Laboratoře molekulární patologie a Univerzitního centra pro buněčnou imunoterapii za vytvoření dobrého kolektivu, výbornou spolupráci a také za jejich pomoc a odborné rady po celou dobu mého studia. Současně velké poděkování patří mému příteli a rodině za morální podporu a toleranci. 3

OBSAH 1. ÚVOD... 6 2. TEORETICKÁ ČÁST... 7 2.1. T regulační lymfocyty... 7 2.1.1 Objev T regulačních lymfocytů...7 2.1.2. FOXP3 jako hlavní regulátor vývoje a funkce Treg...8 2.1.3. Diferenciace Treg v thymu: role TCR receptorů...9 2.1.4. Molekulární mechanizmy Treg vyvolané suprese... 10 2.1.5. Hlavní typy regulačních buněk... 12 2.1.6. Možnosti využití Treg v terapii... 15 2.2. Dendritické buňky... 16 2.2.1. Typy dendritických buněk... 16 2.2.2. Tolerogenní DC, mechanizmy regulace a použití v klinických hodnoceních... 17 2.2.3. Aktivační DC použití v imunoterapii nádorových onemocnění... 22 2.3. MikroRNA... 23 2.3.1. Biogeneze... 24 2.3.2. Role mirna u vrozené (nespecifické) imunitní odpovědi... 28 2.3.3. Role mirna u získané (adaptivní) imunitní odpovědi... 32 2.3.4. mirna a nové možnosti terapie... 38 2.4. Autoimunitní onemocnění... 38 2.4.1. Genetické faktory ovlivňující vznik autoimunit... 39 2.4.2. Klasifikace autoimunitních onemocnění.... 40 2.4.3. Diabetes mellitus... 40 2.5. Průtoková cytometrie... 45 3. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE... 48 4. METODY... 49 4.1. Studie A:... 49 Stanovit rozdílně exprimované mirna v T regulačních lymfocytech pacientů s autoimunitním onemocněním DM1... 49 4

4.1.1. Soubor pacientů... 49 4.1.2. Separace CD4+, CD25+, CD127- Treg pomocí průtokové cytometrie na přístroji FACS ARIA... 49 4.1.3. Izolace celkové RNA bohaté na frakci krátkých RNA... 51 4.1.4. Technologie mirna qrt-pcr arrays... 52 4.2. Studie B:... 57 Porovnat mirna profil aktivačních versus tolerogenních dendritických buněk zdravých dárců generovaných in vitro... 57 4.2.1. Generování DC in vitro:... 57 4.2.2. Izolace RNA a provedení TLDA array... 59 Izolace RNA a TLDA a array byla provedena dle protokolu viz. kapitola: 4.1.3. a 4.1.4.... 59 5. VÝSLEDKY... 60 5.1. Studie A... 60 5.1.1. Celkové výtěžky a čistota izolované RNA... 60 5.1.2. Zpracování a analýza dat TLDA microrna array... 61 5.1.3. Validace vybraných dat pomocí jednotlivých mirna esejí... 64 5.2. Studie B... 69 5.2.1. Izolace RNA... 69 5.2.2. Zpracování a analýza dat TLDA microrna array... 69 6. DISKUZE... 79 6.1. Studie A... 79 6.2. Studie B... 83 7. SOUHRN... 88 8. SUMMARY... 90 9. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 92 10. PŘEHLED PUBLIKACÍ AUTORA... 94 11. LITERATURA... 94 5

1. ÚVOD Imunitní systém byl vyvinut za účelem obrany proti patogenům a zároveň se schopností minimalizovat imunitní odpověď proti tělu vlastním antigenům, škodlivým zánětlivým procesům vyvolaným komensálními mikroorganismy a chronickým zánětlivým onemocněním. MikroRNA (mirna) jsou významné regulátory genové exprese kontrolující jak fyziologické, tak patologické pochody organismu, mezi které řadíme onkologická onemocnění, virové infekce či autoimunitní onemocnění. Stejně jako všechny buňky v těle, také buňky imunitního systému spoléhají na mirna ve smyslu regulace vývoje, proliferace, migrace a diferenciace. Význam regulace diferenciace a funkce imunokompetentních buněk pomocí mirna je podtrhnut fenotypovými poruchami, ke kterým dochází změněnou expresí mirna. Bereme-li v úvahu nově vznikající roli mirna v modulaci imunitních reakcí, je pravděpodobné, že každá dysregulace exprese mirna může přispívat k patogenezi autoimunitních onemocnění, chronických zánětů a malignit. U některých onemocnění byla v současné době prokázána spojitost s dysregulací mirna a také bylo ukázáno, že mirna mohou mít funkci jak onkogenu, tak nádorového supresoru. Protože mirna hrají zásadní roli ve vývoji a funkci imunomodulačních buněk, rozhodli jsme se stanovit jejich expresní profil v T regulačních lymfocytech pacientů s autoimunitním onemocněním, konkrétně s diabetem mellitu I typu a zdravých dárců, a také u dendritických buněk zdravých dárců, u kterých byly in vitro navozeny jak tolerogenní, tak aktivační vlastnosti. 6

2. TEORETICKÁ ČÁST Teoretická část shrnuje poznatky týkající se Treg a dendritických buněk v regulaci imunitního systému zejména zapojení do jejich regulačních funkcí. Dále se zabývá krátkým přehledem autoimunitních onemocnění se zaměřením na problematiku diabetu mellitu 1. typu. 2.1. T regulační lymfocyty Pro biologické systémy je nezbytná regulace v podobě zpětné vazby, v imunitním systému tuto roli hrají zejména T regulační lymfocyty, které se podílí na udržení lymfocytární homeostázy, navozují toleranci k vlastnímu tělu a kontrolují autoimunitní poruchy 1, 2. Slouží také jako důležitý mechanizmus negativní regulace zánětlivé odpovědi vyvolané komensálními mikroorganismy nebo chronickou infekcí, metabolických zánětlivých onemocnění a alergií 3. Na druhé straně mohou bránit odstranění nádorových buněk a přispívat tak k rozvoji nádorového onemocnění 4. 2.1.1 Objev T regulačních lymfocytů Dříve popisovaný mechanizmus tolerance založený na tzv. 2. signálu požadovaném pro spuštění imunitní reakce se jeví jako nedostatečný bez specializovaného subsetu T lymfocytů, který umí udržet pod kontrolou patologicky probíhající imunitní reakce. První důkazy o existenci tohoto subsetu T lymfocytů generovaných v thymu, které mohou zprostředkovat imunitní toleranci supresí ostatních buněk, vyšly najevo během experimentů na novorozených myší provedených japonskými vědci Nishizuka, Sakaguchi a dalšími 5-8. Neonatální thymektomie u myší provedená mezi 2.-4. dnem života vyústila v zánět tkání zprostředkovaný T lymfocyty. Toto zánětlivé vzplanutí mohlo být potlačeno adoptivním transferem thymocytů nebo splenocytů ze zdravých dospělých myší 5-9. Tyto experimenty potvrdily, že subset T lymfocytů generovaný v myším thymu během prvních 3 dnů života může zabránit autoimunitnímu onemocnění. V další linii experimentů se zabývali studiem chimér (kuře-křepelka), na kterých ukázali, že dárcovský štěp epitelu thymu je zodpovědný za navození tolerance xenograftu 9. Kuřecímu embryu byl transplantován štěp epitelu thymu z křepelčího embrya, a to v době před hematopoetickou kolonizací thymu, což mělo za následek diferenciaci a selekci T lymfocytů příjemce dle antigenní prezentace donorových buněk epitelu thymu. Výsledné T lymfocyty byly imunologicky kompetentní, tj. schopné rejekce štěpu třetí strany, ale zárověň u nich byla 7

navozena tolerance ke štěpu epitelu thymu dárce. Podobný allogenní experiment u myší, kterým byl transplantován epitel thymu dárce, ukázal, že alloreaktivní T lymfocyty byly suprimovány pomocí transplantovaných thymocytů, čímž došlo k navození tolerance na allogenní štěp 10. Tolerance k autoantigenům je tedy výsledek alespoň částečné interakce mezi buňkami autoreaktivními a buňkami, které vykazují silnou kontrolu jejich reaktivity. Regulační T lymfocyty jsou přitom závislé na setkání s endodermálními složkami thymu 11. Vyvrcholení těchto prací týkajících se regulačních T lymfocytů přišlo v roce 1995, kdy byl objeven subset CD4+ T lymfocytů konstantně exprimující vysoké množství alfa řetězce receptoru pro IL-2 (CD25). Tyto buňky, nazvané T regulační lymfocyty (Treg), vykazovaly silnou supresní činnost 12. Treg byly schopny zabránit autoimunitní reakci po přenosu do myší, kterým byl 3. den jejich života odstraněn thymus a v řadě jiných experimentálních modelů autoimunit inhibovaly rejekci transplantátu a oslabovaly nádorovou imunitu 13, 14. 2.1.2. FOXP3 jako hlavní regulátor vývoje a funkce Treg Přestože identifikace CD25 jako markeru Treg umožnila izolaci buněk pro funkční analýzy, toto použití bylo limitováno, protože CD25 je zvýšeně exprimován u všech aktivovaných T lymfocytů. Neschopnost rozlišit mezi tolerogenními a zánět-zprostředkujícími lymfocyty během imunitní odpovědi narušilo pozdější porozumění centrální tolerance, speciálně funkční stránku věci. Studium biologie Treg proto bylo velice usnadněno identifikací a studiem mutací v transkripčním faktoru FOXP3 vázaném na chromozom X, a to u myší a lidí trpících syndromem IPEX (imunitní polyendokrinopatie a enteropatie vázaná na X chromozom) 15-18. U jedinců postižených funkční mutací v genu pro FOXP3 se rozvíjí časné fatální na T buňkách dependentní lymfoproliferativní imunitní onemocnění manifestující se neonatálním diabetem, thyreoitidou, hemolytickou anémií, nadměrnou tvorbou IgE protilátek, exfoliativní dermatitidou, splenomegalií, lymfadenopatií a tzv. cytokinovou bouří 19. Toto onemocnění se vyskytuje pouze u hemizygotních mutací u mužů a nevyskytuje se u heterozygotních mutací FOXP3 genu u žen. Ženy zůstávají zdravé, protože dochází k náhodné inaktivaci X chromozomu, což zajistí, že některé T lymfocyty nesou nemutovanou alelu FOXP3 20. Na základě těchto skutečností vědci ve 3 různých laboratořích zkoumali expresi FOXP3 u myších CD25+CD4+ Treg a odhalili vysokou stabilní expresi FOXP3 u myších Treg a žádnou expresi u CD25-CD4+ T lymfocytů nebo aktivovaných CD4+ T lymfocytů 21-23. T lymfocyty FOXP3 mutantních myší se staly 8

aktivovanými během několika prvních dní života, zatímco počty CD4+CD25+ T lymfocytů byly podstatně sníženy 21, 23. Retrovirální přenos FOXP3 genu do aktivovaných periferních CD25+CD4+ T lymfocytů vyvolal supresní funkce a povrchové fenotypové znaky Treg 21-23. Transgenní exprese FOXP3 navodila supresi aktivovaných myších CD8+ T lymfocytů 23. Pro supresní funkci Treg je rozhodující hladina exprese proteinu FOXP3, neboť experimentální potlačení exprese FOXP3 vyústilo v poškozenou supresní funkci Treg 24. Zachování exprese FOXP3 v maturovaných Treg je nezbytné pro udržení fenotypu Treg a jejich supresních funkcí. Cre- zprostředkovaná ablace podmíněné FOXP3 alely u maturovaných Treg vyústila ve ztrátu supresních funkcí a charakteristických povrchových znaků a došlo k nabytí vlastností efektorových buněk včetně produkce cytokinů produkovaných při imunitní odpovědi jako jsou IL-2, IL-4, IL-17, and IFN-γ 25. Z těchto studií vyplývá, že transkripční faktor FOXP3 je nezbytný pro diferenciaci Treg a jejich supresní funkce a definuje tak Treg buněčnou populaci 3. Tento transkripční faktor je v současné době považován také za hlavní fenotypový marker CD4 + CD25 + Treg, neboť jeho exprese koreluje s regulační aktivitou a počtem Treg 26. FOXP3 interferuje s vazbou mezi AP-1 (aktivační protein 1) a NFAT (nukleární faktor aktivovaných T- lymfocytů) v oblasti IL-2 promotoru, a brání tak transkripci genu pro IL-2. Zároveň se podílí na snížené genové expresi IL-4 a IFN-γ, následkem čehož dochází ke snížené proliferaci T- lymfocytů 26. 2.1.3. Diferenciace Treg v thymu: role TCR receptorů Většina Treg diferencuje během pozitivní selekce CD4+ lymfocytů v thymu za vzniku tzv. přirozených Treg. Hlavními faktory ovlivňujícími osud naivních T-lymfocytů v thymu je avidita TCR signálu k autoantigenům prezentovaným buňkami thymického epitelu, která je v případě Treg střední tj. pod prahem nezbytným pro deleci (viz Obr.1) 3, dále síla kostimulačních signálů poskytovaných APC a složení cytokinového prostředí 27. Treg opouští thymus v celkovém množství odpovídajícím asi 10-15 % všech zralých CD4 + T lymfocytů a putují do periferie, kde se usazují v sekundárních lymfatických orgánech. Existují také tzv. indukované Treg, které vznikají v periferii z konvenčních T lymfocytů působením řady spouštěčů, čímž dochází k indukci FOXP3. Mezi hlavní cytokiny potřebné k indukci FOXP3 v periferii patří TGF-β (transformační růstový faktor-beta) a IL-2 (interleukin-2), jejichž hladiny se zvyšují pod vlivem zánětu 28 9

Obr. 1: Diferenciace Treg v thymu na základě síly TCR signálů. Nezralé CD4+ singl pozitivní (SP) T lymfocyty se setkávají s TCR signály různé intenzity pomocí intekce s antigeny prezentovanými pomocí MHC molekul na antigen prezentujících buňkách. Síla TCR signálu neboli avidita určuje osud CD4+ SP lymfocytů. Při obdržení TCR signálu o vysoké aviditě, většina CD4+ SP lymfocytů podstoupí buněčnou programovanou smrt neboli apoptózu. Část CD4+ SP lymfocytů, které obdrží TCR signál o střední aviditě jsou schopny předejít deleci a diferencovat do Treg. Síla šipek znázorňuje pravděpodobnost indikovaných možností 3. 2.1.4. Molekulární mechanizmy Treg vyvolané suprese V poslední době došlo k velkému nárůstu poznatků týkajících se zapojení Treg v regulaci imunitního systému (IS), přesto porozumění molekulárním mechanizmům suprese je stále limitováno. Díky analýze expresních profilů Treg ve srovnání s naivními či aktivovanými T lymfocyty bylo nalezeno značné množství genů, včetně povrchových markerů a sekretovaných proteinů, které jsou považovány za supresní molekuly zprostředkující regulaci IS 29-31. CD25, podjednotka receptoru pro IL-2 (IL-2R) a původní znak Treg, je zvýšeně exprimován na 10

efektorových T lymfocytech a ve vysokých hladinách konstitutivně exprimován u Treg. Vysoká hladina IL-2R na Treg může připravit efektorové T lymfocyty o IL-2 a inhibovat tak jejich proliferaci 32, 33 34. Další známou povrchovou molekulou Treg je cytotoxický leukocytární antigen 4 (CTLA-4, CD152), který se váže k molekulám B7.1 (CD80) a B7.2 (CD86) exprimovaným na antigen-prezentujících buňkách a ovlivňuje tak průběh buněčného cyklu, cytokinovou produkci a imunitní odpověď T-lymfocytů 35. Funkce CTLA-4 byla studována na myším modelu se selektivně deletovaným CTLA-4 genem u Treg. Selektivní deficit CTLA-4 v Treg vyvolal zvýšenou proliferaci a aktivaci Treg během zánětlivých stavů, ovšem s poškozenou supresní funkcí. 36, 37. Na povrchu Treg jsou exprimovány také imunosupresivní enzymy CD39 a CD73, jež produkují pericelulární adenosin. Imunosuprese je zprostředkována vychytáváním adenosinu A2A receptorem na aktivovaných efektorových T lymfocytech, inhibicí jejich proliferace a zároveň také negativním vlivem adenosinu na funkci dendritických buněk (DC) 38-41. Další povrchovou molekulou Treg je molekula LAG-3, homolog CD4, která vlastní vysokou vazebnou afinitu k MHC II třídy. Spojení MHC II molekul na nezralých DC s LAG-3 vede k inhibici jejich maturace a kostimulační kapacity 42. Teorie regulace IS zprostředkovaná DC byla podpořena objevem povrchového proteinu TIGIG, člena Ig rodiny, který je vysoce exprimován na Treg a aktivovaných T lymfocytech. Při interakci DC a Treg TIGIT indukuje produkci imunosupresivních cytokinů IL-10 a TGFβ dendritickými buňkami 43. Další důležitou molekulou Treg je GITR, člen TNF receptorové rodiny, který hraje důležitou roli v kontrole funkce Treg 29, 44. Zajímavostí je, že deficit molekul GITR nemá za následek zjevnou poruchu imunitní homeostázy či tolerance 45, přesto GITR slouží jako potenciální cílová molekula pro nádorovou imunoterapii 3. Neméně důležitou funkcí Treg je produkce cytokinu TGF-β, který je schopen suprimovat Th1 imunitní odpověď 46. Několik výzkumných skupin zaznamenalo zvýšenou expresi granzymu B v myších Treg. Při aktivaci IS in vitro byly Treg schopny působením granzymu B zabíjet efektorové T lymfocyty či antigen prezentující buňky 47, 48. Tyto studie byly později potrvzeny in vivo, kdy granzym B hrál kritickou roli v udržení dlouhodobé tolerance závislé na Treg vůči transplantovanému kožnímu štěpu 49, 50 11

2.1.5. Hlavní typy regulačních buněk FOXP3+ Treg vznikají dvěma způsoby, většina FOXP3+ Treg vzniká v thymu jako alternativní populace během pozitivní selekce CD4+ konvenčních T lymfocytů 51, 52. FOXP3+ Treg vzniklé v thymu mají charakteristický TCR repertoár, který je odlišuje od konvenčních T lymfocytů. Takto vzniklé Treg opouštějí thymus a usazují se v periferních lymfoidních orgánech, kde tvoří většinu, ne-li veškerou zásobárnu Treg 53-55. Druhý způsob vzniku FOXP3+ Treg je z periferních konvečních CD4+ T lymfocytů, jež mohou být za různých podmínek experimentálně konvertovány in vivo. Mezi testované podmínky patří chronická stimulace peptidovými agonisty 56-58, expozice perorálně podávanými agonisty 59-61, nebo řízená homeostatická expanze lymfocytů při lymfopenii 62-64. Účinnost těchto in vivo konvertovaných Treg byla potvrzena v supresních esejích 55, 60, 63, 64. Kromě toho, naivní CD4+ konvenční T lymfocyty mohou být konvertovány v in vitro podmínkách v přítomnosti IL-2 a TGFβ, které indukují FOXP3 expresi a navozují některé charakteristiky Treg, včetně supresních funkcí 65-67. Na druhou stranu, fenotyp Treg vyvolaný TGFβ je nestabilní 68, tyto buňky nevykazují supresivní funkce ve všech esejích a jejich transkripční profil se jen částečně shoduje s přirozenými Treg 69. Výhoda nestability exprese FOXP3 často pozorovaná u konvertovaných Treg může být v tom, že přechodně vyvolá inhibiční funkci a může tak rychlou cestou "doladit" první kroky lokální imunitní odpovědi. Konverze periferních T lymfocytů na regulační buňky se zdá být velice atraktivním mechanizmem, jelikož dovoluje lymfocytům adaptovat se na imunogenní prostředí a tlumit tak hyperaktivní zánět nebo zkrátit chronickou imunitní odpověď. I když bylo pozorováno, že ke konverzi může docházet během experimentální manipulace, otázkou stále zůstává, jaký je skutečný přínos periferní konverze k celkové zásobě Treg a zdali k tomuto jevu dochází během specifických zánětlivých stavů. V literatuře je tendence interpretovat lokální akumulaci Treg v místě zánětu jako konverzi z konvečních Treg raději než jednoduše migraci, zadržení a proliferaci antigen-specifických přirozených Treg. Potřebné důkazy pro podporu jedné z těchto variant ovšem chybí a tento jev je stále předmětem diskuzí. Otázkou je, zdali jsou Treg buňky samostatnou buněčnou polulací nebo jen jednou z několika stádií, do kterých CD4+T lymfocyty mohou diferencovat, a zda může být tato konverze terapeutickým cílem. U neimunizovaných a non-lymfopenních myší se CDR3 sekvence TCRs receptoru Treg izolovaných z periferních lymfoidních orgánů do značné míry podobají TCR repertoáru Treg izolovaných z thymu, bez známek změn, které by vyplývaly z konverze 53-55, 70. Tato zjištění naznačují, že celkové 12

množství konvertovaných Treg v lymfatických uzlinách a slezině je omezené. Cílenější analýza používající TCR sekvence jako "čárové kódy" za účelem potvrdit lymfocytární konverzi v periferii, a priori více upředňostňované možnosti, nepřinesla požadované důkazy 71. Podobně Treg nacházející se v zánětlivých mozkových lézích u myší s experimentální autoimunní encefalomyelitidou mají původ v thymu a do místa zánětu se dostaly spíše důsledkem migrace než konverzí v místě zánětu 72. Také při infekci dochází častěji k náboru a expanzi antigenspecifických Treg než ke konverzi 73, 74. Studie Dr. Barnese na myších postrádajících gen CARMA1 přinesla částečnou odpověď na tuto otázku 75. U myší s deletovaným genem CARMA1 dochází k velkému deficitu přirozeně se vyskytujících Treg, ale FOXP3+ může být velice efektivně indukováno v maturovaných CD4+ po expozici IL-2 a TGFβ in vitro. Zajímavostí je, že lamina propria CARMA-1 deficientních myší ukazuje značné zastoupení Treg (37 % normální zásoby), což je mnohem více než v lymfatických uzlinách (3-8 %). Přestože možnost lokální expanze malého množství prekurzorů z thymu nemůže být vyloučena, toto rozložení by mohlo být interpretováno jako schopnost periferní konverze v přítomnosti TGFβ privilegovaně častěji v intestinální oblasti, než ve slezině nebo lymfatických uzlinách. Přestože vznik indukovaných T lymfocytů je předmětem diskuze (viz výše), do této doby byly popsány různé typy regulačních buněk. Jejich funkci a původ shrnuje tabulka 1. 13

Typ Původ Funkce Reference Přirozené CD4+ T regulační lymfocyty Vznikají v thymu a šíří se do periferie, představují 10-15 % celkového množství CD4+ lymfocytů Deplece těchto buněk vede k autoimunitním onemocnění, mutace ve FOXP3 genu vede k fatálnímu imunitnímu onemocnění - syndromu IPEX (Imunitní polyendokrinopatie a enteropatie vázaná na X chromosom) 19 CD4+ Tr1 regulační buňky Periferie Jsou indukovány v periferii z naivních T lymfocytů v přítomnosti IL-10. Tyto buňky neexprimují FOXP3, produkují IL-10 a TGFβ 76, 77 CD4+ Th3 buňky Periferie Jsou indukovány v periferii z naivních T lymfocytů v přítomnosti TGFβ. Imunosupresi navozují produkcí TGFβ. Exprimují FOXP3. Hrají roli ve slizniční imunitě - produkce IgA a navození orální tolerance 56, 66 Dvojitě negativní Treg Periferie Představují 1-3 % T lymfocytů u myší a 1 % u člověka. Inhibují aktivaci a proliferaci T lymfocytů antigenněspecifickým způsobem 78 γ/δ T-buňky Infiltrují místo nádorukarcinom prsu Suprimují T lymfocytární imunitní odpověď, inhibují maturaci a funkci DC 79 CD8+ T regulační lymfocyty Většina CD8+ Treg je indukována antigenspecifickým způsobem Existuje několik subsetů CD8 treg: Qa1 specifické CD8 Treg buňky suprimují autoreaktivní T buňky exprimující Qa1 molekuly asociované s vlastními peptidy. CD8+CD28- Treg exprimují FOXP3α a suprimují ostatní buňky na kontaktu závislým mechanizmem. CD8+CD25+ Treg suprimují jak naivní CD4+, tak CD8+ buňky na kontaktuzávislým mechanizmem nebo nezávislým (IL-10) mechanizmem. 80-82 Tab 1: Typy regulačních buněk, původ a funkce 83. 14

2.1.6. Možnosti využití Treg v terapii V posledních 10 letech došlo k podstatnému rozvoji v pochopení biologie Treg lymfocytů a jejich roli v udržení homeostázy imunitního systému ve zdraví i nemoci. V návaznosti na postupujícím výzkumu se zvyšuje zájem o možnost využití Treg lymfocytů v imunoterapii autoimunitních onemocnění a v transplantační medicíně. Imunoterapie pomocí adoptivního přenosu Treg lymfocytů představuje řadu výhod oproti konvenční terapii. Mezi některé z výhod adoptivní imunoterapie řadíme potenciál Treg zprostředkovat antigen specifickou imunosupresi bez utlumení celého imunitního systému, možnost indukce fyziologické a dlouhotrvající regulace in vivo a skutečnost, že léčba pomocí vlastních Treg lymfocytů by mohla být pacientovi ušita přímo na míru, a to pouze s minimálními nežádoucími účinky. Uvedení terapie pomocí Treg do klinické praxe musí předcházet vyřešení několika otázek, jako jsou: určení vhodného subsetu Treg pro adoptivní podání, určení vhodné dávky, výběr nejvhodnějšího metodického postupu pro bezpečnou a účinnou expanzi Treg in vitro, volba onemocnění, které se jeví jako vhodné pro léčbu pomocí Treg, nutnost kombinace léčby s jinými medikamenty. Na některé z těchto otázek nám odpoví vyhodnocení probíhajících klinických studií a širší preklinický výzkum ex vivo. Od roku 2010 probíhá na Kalifornské univerzitě v San Fancisku pod vedením Dr. Bluestone klinické hodnocení fáze I zabývající se imunoterapií pacientů s diabetem mellitu I typu testující adoptivní transfer expandovaných CD4+CD127lo/-CD25+ polyklonálních Treg 84. Tato studie vychází z pre-klinického testování probíhajícího na NOD myších. Pomocí preklinického testování se podařilo prokázat, že adoptivní transfer Treg může zpomalit progresi diabetu 85, 86. Pacienti jsou rozděleni do 4 kohort a každá z nich dostává jednorázovou infuzi Treg různé dávky. Pacienti budou dále monitorováni po dobu 5ti let za účelem vyhodnocení bezpečnosti léčby. Předpokládané ukončení studie je plánováno v roce 2016. 15

2.2. Dendritické buňky Nejenom adaptivní imunitní systém, ale také buňky přirozené imunity hrají důležitou roli v navození imunitní odpovědi či tolerance. Výkonnými buňkami přirozené imunity jsou dendritické buňky (DC), které mají speciální funkci propojovat vrozenou a adaptivní imunitu. DC jsou primárně profesionální buňky prezentující antigen (APC) a zahajující adaptivní imunitní odpověď. Řadí se do buněk hematopoetického systému, vznikají v kostní dřeni z CD34+ kmenových buněk a osidlují prakticky všechny tkáně, kde slouží jako ochrana subjektů před invazí patogenními bakteriemi a udržení imunitního dozoru před transformovanými buňkami. Za účelem ochránit hostitele jsou schopné urychleně vyvolat imunitní odpověď, což zahrnuje aktivaci vrozené imunitní odpovědi, přípravu adaptivní imunitní odpovědi a imunitní paměti. V klinické praxi jsou předmětem zájmu téměř sto let v souvislosti s prevencí život ohrožujících infekčních onemocnění pomocí vakcinace 87-89. 2.2.1. Typy dendritických buněk DC tvoří heterogenní buněčnou populaci, která se navzájem liší rozdílným stádiem maturace a funkcí. Prekurzory DC vznikají v kostní dřeni z myeloidních kmenových buněk, mají schopnost proliferace a usidlují se ve slezině a v lymfatických uzlinách. Hlavní funkce DC je zprostředkování počátečních kroků aktivace imunitního systému vedoucí k ochraně subjektů před invazí patogenními bakteriemi a udržení imunitního dozoru nad transformovanými buňkami. Byly popsány dva základní typy DC, jedním z nich je myeloidní řada DC (mdc) často nazývaných jako konvenční DC vlastnící vysokou kapacitu vystavovat antigeny na svém povrchu a stimulovat tak T lymfocyty. Tyto konvenční antigen prezentující aktivační DC exprimují na svém povrchu ve velké míře MHC molekuly II třídy, integrin CD11c a také další adhezivní molekuly jako jsou LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD50) a ICAM-3 (CD102). U maturovaných DC bývají během imunitní odpovědi ve větší míře exprimovány kostimulační molekuly CD86 a CD80, které jsou považovány za typické znaky maturovaných DC (CD86 bývá exprimován v počátečních stádiích maturace, zatímco CD80 a také CD83 v pozdních fázích maturace). Kožní Langerhansovy buňky jsou jednou z hlavních subpopulací mdc 90. Druhou skupinu DC představují plasmacytoidní DC (pdc), které se nacházejí v periferii a periferních lymfoidních orgánech. Ve srovnání s jinými APC je jejich 16

schopnost prezentovat antigeny na svém povrchu výrazně nižší, jelikož nematurované pdc exprimují pouze nízké hladiny MHC II a dalších kostimulačních molekul. Během aktivace sekretují velké množství IFNα a IFNβ 91, 92. Infekce vyvolané DNA- a RNA-viry spouští imunitní odpověď vyvolanou pdc po rozeznání virového genomu pomocí receptorů rozeznávajících specifické vzory (pattern recognition receptors PRR). Jedná se např. o receptory typu toll-like (TLR) 7 a 9 93-95. Pomocí charakterizace povrchových receptorů bylo zjištěno, že pdc neexprimují běžné markerym DC jako je CD11c, ale narozdíl odm DC exprimují receptor pro IL-3 (CD123) a výhradně lektin typu C BDCA-2 (CD303), který je zapojený v prezentaci antigenů T lymfocytům 96. Předpokládá se, že pdc hrají hlavní roli v antivirové imunitní odpovědi, jelikož při virové infekci produkují velké množství IFNα. Třetí skupinu tvoří folikulární DC (fdc), tyto fdc se nachází v germinálních centrech lymfatických uzlin a prezentují antigeny B lymfocytům za účelem udržení imunitní paměti. fdc, které byly vyizolovány z lidských krčních mandlí, na svém povrchu exprimují receptory CD21, CD23, CD35 a markery buněčného cyklu jako DRC-1, Ki-M4 nebo DR53 97. Je zajímavé, že narozdíl odm DC a pdc fdc exprimují na svém povrchu antigeny (3C8) typické pro fibroblasty 98. 2.2.2. Tolerogenní DC, mechanizmy regulace a použití v klinických hodnoceních V literatuře převládá názor, že imaturované DC jsou tolerogenní a maturované jsou imunogenní, neboli aktivační. 99. Nicméně s vlastnostmi maturovaných DC jako je antigenní prezentace T lymfocytům a in vivo migrace do lymfoidních orgánů se můžeme setkat také u tolerogenních DC (toldc). Proto toldc mohou být tedy buď imaturované, k maturaci rezistentní, případně i aktivované DC 100. Mechanizmus působení toldc je založen na různých mechanizmech. a) DC jsou schopné navodit buď T buněčnou anergii a nebo klonální deleci. T buněčná anergie nastává v případě, kdy DC postrádají expresi kostimulačních molekul pro interakci s T lymfocyty. V přítomnosti antigenu, ale v nepřítomnosti kostimulačních signálů, se T lymfocyty stávají anergickými a ztrácejí svoji schopnost proliferace 101, 102. Na Obr 2C je znázorněna klonální anergie zprostředkovaná aktivací PD-1 na T lymfocytech navázáním ligandů PD-L1 a PD-L2 exprimovaných na DC. Podobně signalizace zprostředkovaná CTLA-4 může indukovat 17

klonální anergii 103-106. Dalším důsledkem recesivní tolerance je klonální delece T lymfocytů zprostředkovaná interakcemi mezi TNF/TNFR2, FasL/Fas nebo indukcí pro-apoptického faktoru Bim 107-110. TolDC mohou také navodit apoptózu T lymfocytů. Jeden z mechanizmů popisující klonální deleci je přestimulování T lymfocytů nazývané AICD (aktivací indukovaná buněčná smrt). K tomuto ději dochází aktivací signální dráhy Fas/Fas ligand 111, anebo produkcí IDO (indolamin 2,3-dioxygenáza) dendritickými buňkami 112. Klonální deleci mohou podstupovat jak naivní, tak přirozené T lymfocyty 113. b) Další z hlavních mechanizmů působení toldc je udržení homeostázy a aktivace, generace a expanze Treg. DC derivované pomocí GM-CSF mají schopnost indukovat expanzi přirozených CD4 + CD25 + FOXP3 + Treg 114, 115, nebo generovat Treg z přirozených CD4 + CD25 - T lymfocytů 116. Aktivace těchto Treg pomocí receptorů MHC II třídy na DC, konkrétně peptidovým komplexem CD80/CD86, je potřebná pro aktivaci imunosupresivních vlastností FOXP3 + Treg a pro indukci jejich expanze. Cytokiny IL-2 a TGF-β produkované dendritickými buňkami jsou nezbytné pro udržení funkčnosti Treg a pro jejich proliferaci 2, 117, 118. TGF-β produkovaný DC se může podílet na konverzi FOXP3 T lymfocytů na FOXP3 + Treg. Tento proces může být zesílen pomocí kyseliny retinové (retinoic acid, RA), která se tvoří v DC z retinaldehydu pomocí enzymu Raldh2 119-121 (viz Obr. 2B). Paralelně Wakkach et al. zaznamenali také generování Tr1 pomocí toldc 122.V generaci či expanzi Treg pomocí DC se předpokládá zapojení molekul exprimovaných toldc jako jsou IDO nebo Galetin-1 123, 124. Generování či expanze Treg pomocí DC je velice důležitý mechanizmus, neboť životnost samotných DC je velice krátká. Dr. Kendal et al. nedávno ukázali, že Treg mohou udržovat toleranci k infekčním agens pomocí de novo generace Treg z naivních CD4+ T lymfocytů 125. Ligandy receptoru pro buněčnou progamovanou smrt PD-1 (PD-L1 a PD-L2) se také podílejí na indukci FOXP3 + Treg 126. c) Jedním z mechanizmů regulace je zapojení DC v negativní selekci autoreaktivních T lymfocytů a tedy v navození centrální tolerance 127-129 (viz Obr. 2A). d) Existují také mechanizmy, které mohou vyústit ve zpětnou inhibici DC (viz Obr. 2D). FOXP3 + Treg se vážou na ko-stimulační molekuly CD80/CD86 na DC pomocí CTLA-4. Tato interakce vede k produkci indolamin-2,3-dioxygenázy (IDO) a supresi maturace DC. IDO vyvolává apoptózu konvenčních T lymfocytů a aktivuje FOXP3 + Tregs. TGF-β produkovaný 18

aktivovanými DC může přímo inhibovat funkce DC 130. Také signalizace pomocí TLR (např. TLR2), DC-SIGN a Wnt/β-catenin dráhy může vyústit v produkci IL-10 dendritickými buňkami 131-133. IL-10 účinně inhibuje maturaci a funkci DC a indukuje produkci IL-10 Treg lymfocyty, čímž vytváří regulační zpětnou vazbu. Obr.2: Mechanizmy tolerance zprostředkované DC 134 e) Přísná rovnováha mezi regulací T buněčné imunity pomocí DC zajišťuje imunitní homeostázu a integritu hostitele. Porušení této rovnováhy by mohlo vysvětlit patologické podmínky poškození vlastní tkáně, chronické infekce či únik imunitnímu dozoru. Role DC v supresi autoimunitních onemocnění je složitá a je stále předmětem výzkumu. Při rovnovážném stavu DC přispívají k negativní selekci autoreaktivních T lymfocytů. Za normálních okolností dochází při negativní selekci T lymfocytů k úniku malého množství autoreaktivních T lymfocytů do periferie, kde jsou regulovány pomocí Treg. Tento proces je závislý na soustavné aktivaci a udržení homeostázy Treg pomocí DC. Rovnováha mezi produkcí 19

myeloidního růstového faktoru FLT3L a jeho spotřebou udržuje konstantní poměr mezi DC a dalšími myeloidními buňkami (viz Obr. 3A) 134. Pro studium deplece DC byl vytvořen experimentální model myší, u nichž byly různým způsobem DC odstraněny (ΔDC-, CB11c:DTA-, FLT3L / ). U těchto myší se vyskytla porucha v negativní selekci, což vedlo ke zvýšenému počtu autoreaktivních klonů T lymfocytů na periferii a vyšším proporcím Th1 a Th17 lymfocytů, hypergamaglobulinemii anebo zvýšené produkci protilátek 135-137. Absence periferních DC vedla k narušení homeostázy, značnému snížení počtu Treg a také narušení jejich funkce. Ačkoli můžeme detekovat znaky autoreaktivity u myší s depletovanými DC, pravděpodobně z důvodu absence DC nedochází k aktivaci auto-reaktivních T lymfocytů a dochází tedy k celkovému potlačení systémové autoimunity (viz Obr. 3B). Při depleci Treg nedochází k narušení negativní selekce v thymu, ale díky narušené negativní regulaci DC a autoreaktivních T lymfocytů dochází k vážným systémovým autoimunitním onemocněním (viz Obr. 3C) 16, 19. 20

Obr.3 Role DC v supresi autoimunitních reakcích 134. f) Pomocí pre-klinického testování toldc na hlodavcích byl zjištěn účinek a bezpečnost podání in vivo. Dnešním cílem je přenos těchto vědomostí k použití toldc u lidí a zajištění léčby pacientů s autiomunitním onemocněním. Ačkoli je technicky možné derivovat DC z lidské kostní dřeně 138, spolehlivým prostředkem pro generování DC u lidí se jeví periferní monocyty. Ovšem rozdílný původ toldc u hlodavců a lidí může limitovat jejich srovnávání, jak bylo zjištěno ve studii provedené na primátech skupinou Cuturi 139, 140. Přestože vakcinační protokol používající imunogenní DC v imunoterapii nádorových onemocnění je testován již více jak 15 let 141, 142, poněkud méně je známo o potenciálním použití toldc v klinické praxi. První studie publikovaná v roce 2001 prokázala proveditelnost a bezpečnost injekčního podání autologních imaturovaných toldc zdravým dobrovolníkům 143. V této studii byly imaturované DC naloženy peptidy a podány subkutánně dvěma 21

dobrovolníkům. Každý z nich obrdžel jedinou injekci o dávce 2 milionů buněk. Injekce DC byly velice dobře snášeny bez známek toxicity a bez známek autoimunitního onemocnění. Podání DC bylo spojeno s antigenně-specifickou inhibicí efektorových T lymfocytů a indukcí antigenně specifických CD8+ Tregs in vivo 143, 144. První klinická studie fáze I používající toldc byla provedena u pacientů s diabetem mellitu I typu 145. 10 pacientů obdrželo 4 intradermální injekce s 10 miliony autologních DC. Tři pacienti obdrželi kontrolní DC generované v přítomnosti GM-CSF a IL-4 a 7 pacientů obdrželo imunosupresivní DC generované v přítomnosti GM-CSF a IL-4 a inhibičních oligonukleotidů ke ko-stimulačním molekulám CD40, CD80, a CD86. Klinickému hodnocení předcházelo použití stejně modifikovaných DC k léčbě diabetických NOD myší, kde byl prokázán preventivní i léčebný účinek 146. V klinickém hodnocení se také podařilo potvrdit bezpečnost, tolerovatelnost a nízkou toxicitu intradermálního podání toldc pacientům s diabetem mellitu I typu. Další klinické studie s použitím toldc u revmatiodní artritidy jsou ve fázi příprav 147. Do této doby není zaznamenána klinická studie používající toldc při transplantacích. Skupina Dr. Cuturi v současné době testuje bezpečnost autologních toldc derivovaných z monocytů u pacientů s transplantací ledviny 140. 2.2.3. Aktivační DC použití v imunoterapii nádorových onemocnění Jedním z podtypům DC jsou aktivační DC generované exvivo a používané zejména v imunoterapii nádorů. Vyznačují se především produkcí IL-12, cytokinu, který je kritický pro vývoj Th1 odpovědi 148.m DC produkují GM-CSF, TGFβ, IL-1β, IL-6, IL-23 a další cytokiny, a mohou vyvolat rozdílnou imunitní odpověď zprostředkovanou T lymfocyty: Th1 odpověď, Th2 odpověď a nebo antigen-specifickou CD8+ T lymfocyty vyvolanou cytotoxickou odpověď 149, 150. Právě DC schopné vyvolat zejména Th1 imunitní odpověď a CD8+ cytotoxickou imunitní odpověď jsou vhodnými kandidáty pro použití v imunoterapii nádorů 151. Aby nedošlo k vytvoření anergie T lymfocytů k nádorovým antigenům, je nutné použít DC schopné produkovat imunostimulační cytokiny a ko-stimulační molekuly současně s prezentací antigenu na svém povrchu 152, 153. Tyto imunostimulační vlastnosti DC jsou indukovány různými signály během maturace DC a liší se v závislosti na použitých maturačních koktejlech 154-157. Kvalita DC je hodnocena na základě maturovaného fenotypu a jejich imunostimulačních vlastností. Pro maturované DC je typická exprese následujících molekul: CD83, CMRF-44, 22

CMRF-56 a DEC-205; ko-stimulačních molekul CD80, CD86 a CD40; adhezivních molekul CD11a, CD11c, ICAM-1 (CD54), ICAM-2 (CD50), ICAM-3 (CD102) a CD58; leukocytárních antigenů CD45RA and CD45RO; a antigen prezentujících molekul MHC I a II třídy 158. Dalším velice významým znakem DC je chemokinový receptor CCR7, který je důležitý pro nasměrování DC do lymfatických uzlin 159. K imunostimulačním vlastnostem řadíme zejména schopnost DC produkovat imunostimulační cytokiny a to: TNF-α, TGF-β, GM-CSF, různé typy interleukinů např. IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23 a další prozánětlivé cytokiny 149, 150, 160. Pro protinádorovou terapii je žádoucí produkce IL-12, který polarizuje imunitní odpověď směrem k Th1 161. V poslední době se výzkum zaměřuje také na roli IL-23 149. IL-12 ve formě IL-12p70 zprostředkovává biologickou aktivaci Th1 buněk. Molekula IL-12p70 je heterodimer tvořený ze dvou podjednotek: IL-12p40 a IL-12p35, kódovaných různými geny 150. IL-12p40 podjednotka také dimerizuje s p19 podjednotkou a tvoří tak IL-23. DC produkující IL-23 indukují proliferaci T lymfocytů a produkci IFN-γ. Narozdíl od IL-12, působí IL-23 také na paměťové buňky a vyvolává Th17 imunitní odpověď 162. znaky aktivační DC tolerogenní DC cytokiny aktivační DC tolerogenní DC CD80 TNFα CD86 IFNg CD40 IL-17 CD83 IL-12p70 MHC II IL-1β TLR II IL-6 PD-L1 IL-23 PD-L2 TGFb CTLA-4 proliferace Tab. 2. Charakterizace tolerogenních a aktivačních DC 163 2.3. MikroRNA MikroRNA (mirna) jsou krátké nekódující jednořetězcové RNA o délce 21-23 nukleotidů, které řadíme do nové třídy regulačních molekul. MiRNA kontrolují expresi cílových transkriptů mrna a řídí tak základní buněčné procesy u rozličných typů organismů. Regulace spočívá ve vazbě mirna většinou na nedokonalé komplementární místo 3 netranslatovaného 23

regionu (UTR), čímž dochází k represi cílových genů na úrovni stability a translace mrna 164. První mirna lin-4 byla objevena týmem Dr. Ambrose v roce 1993 u larev Caenorhabditis elegans. Její hlavní funkcí je kontrola buněčné smrti 165. Jako druhá byla o 7 let později objevena mirna s názvem let-7, která byla současně první lidskou objevenou mirna 166. Let-7 hraje roli v buněčné diferenciaci kmenových buněk a jelikož se vyskytuje na fragilním místě genomu a bývá deletována u některých typů nádorových onemocnění, můžeme ji považovat za nádorový supresor 167. V posledním desetiletí došlo k velkému rozvoji na poli mirna, dle posledního záznamu v internetové databázi mirbase verze 18 ze srpna 2012, je v současné době známo 2042 lidských sekvencí mirna a více jak 21 tisíc sekvencí mirna u 168 různých druhů organismů (www.mirbase.org). Nedochází pouze k objevu nových mirna, ale je intenzivně zkoumána i jejich funkce. Bylo zjištěno, že mirna regulují většinu biologických procesů včetně vývoje, délky přežití, metabolismu a imunitního systému 168. Jsou zahrnuty v procesech jako je buněčný růst, dělení, diferenciace, přežívání, migrace a jiné. Jejich deregulace tak přispívá k rozvoji mnoha onemocnění včetně poruchy imunitního systému či nádorového bujení 169. Podle současných výzkumů tyto krátké molekuly tvoří méně než 2 % lidského genomu a mohou být zodpovědné za regulaci až 60 % lidských genů kódujících proteiny 170, 171. 2.3.1. Biogeneze MiRNA je přepisována spolu s dalšími geny pomocí RNA polymerázy II za vzniku prekurzoru (pri-mirna) o velikosti 100-1000 nukleotidů obsahující polyadenylovaný konec a čepičku (CAP) 172. Charakteristickým rysem každé pri-mirna jsou dvouřetězcové struktury tvaru nedokonalé vlásenky, které se skládají z kmene o délce 33 bp, terminální smyčky a dvou volných jednořetězcových konců 173. Obr. 4: Pri-miRNA 164 24

Tyto struktury jsou v jádře rozeznávány specifickým proteinem DGCR8, označovaným někdy též Pasha 174, jehož funkcí je označit místo následného štěpení. V místě označení se komplex dsrna a proteinu Pasha štěpí enzymatickým komplexem ribonukleázy III, tzv. Drosha, který má schopnost rozeznávat pri-mirna od ostatních vlásenkových struktur se a smyčkou 175. Výsledkem působení mikroprocesorového komplexu (Pasha, Drosha) je zkrácená molekula o délce na 60-70 nt nazývaná pre-mirna 176. Charakteristická vlásenková struktura pre-mirna je následně specificky rozeznávána komplexem Exportin 5/RanGTP a transportována z jádra do cytoplasmy, kde je štěpena ribonukleázou Dicer na přechodný dvouvláknový meziprodukt s proměnlivou délkou 18-25 bp 174. Následně dochází k oddělení obou řetězců, přičemž zpravidla řetězec, jehož 5 konec je méně termostabilní, vstupuje do komplexu RISC (RNA-induced silencing complex) a bývá označován jako vedoucí. Druhý řetězec tzv. passenger, dříve označovaný hvězdičkou, bývá většinou degradován, avšak nové poznatky naznačují, že také passenger může být začleněn do komplexu RISC 177. Klíčovou složkou komplexu RISC je protein TRBP (trans-activator RNA binding protein) a proteiny argonautové rodiny, zejména AGO2. Tento komplex zodpovídá za potlačení genové exprese 178. U živočichů rozeznáváme dvě základní funkce komplexu RISC s mirna. Prvním mechanizmem je degradace cílové mrna, která má úplnou sekvenční homologii s mirna. Výsledkem je fragmentovaná, degradovaná mrna, což má za následek pokles hladiny mrna v buňce 179. Tohoto mechanizmu se rovněž využívá při umělém potlačení genové exprese prostřednictvím uměle vnášených sirna. Zatímco u živočichů dochází ke štěpení cílové mrna na několik delších fragmentů, u rostlin se zcela degraduje. Druhý mechanizmus inhibuje translaci cílové mrna na ribozomech, přičemž hladina mrna v buňce se nemění 180. V průběhu tohoto děje se na polyribozomech vytváří vazba mezi komplexem RISC, který nese mirna, cílovou mrna a proteinem Ago, a dochází tak k pozastavení translace na ribozomech, v důsledku čehož klesá množství proteinu v buňce. Při translační inhibici se předpokládá párování jedné molekuly mirna s cílovou mrna. K vazbě obvykle dochází v 3 netranslatované oblasti (UTR), jejíž délka se pohybuje v rozmezí 100 až 200 nukleotidů 181. Nedávno bylo prokázáno, že molekuly mirna mohou vytvářet vazbu také k 5 UTR konci mrna 182. Translačně umlčená mrna může být degradována exonukleázami, 25

které se nacházejí v cytoplazmě a vytváří tzv. P-tělíska. A však za určitých, především stresových podmínek, může dojít u těchto mrna k obnově translační aktivity 183. Účinnost regulace genové exprese prostřednictvím mirna závisí na míře komplementarity mezi mirna a cílovou mrna. Zatímco pro degradaci mrna je zapotřebí úplné komplementarity obou interagujících molekul, pro potlačení translace jsou nároky na komplementaritu podstatně nižší. Pro potlačení translace postačuje hybridizace mezi druhou a sedmou, resp. devátou bází mirna a mrna 184. Efektorové funkce mirna komplexu RISC závisí také na typu proteinu Ago. Předpokládá se, že Ago2 v živočišných buňkách zodpovídá za nukleázovou aktivitu a tudíž jeho přítomnost vede k degradaci cílové molekuly mrna. Zbývající tři typy Ago proteinů nukleázovou aktivitu nemají a tedy se mohou podílet na inhibici translace 185. Celý proces biogeneze a následné funkce mirna je patrný z obrázku 5. 26

Obr.5: Biogeneze mirna. 27

Transkripcí genu pro mirna pomocí Polymerázy II vzniká pri-mirna. V dalším kroku vstupuje pri-mirna do mikroprocesorového komplexu tvořeného z enzymů Drosha/Pasha a proteinů p68 a p72, kde dochází ke zkrácení molekuly pri-mirna a vzniku pre-mirna. PremiRNA je poté transportována to cytoplazmy pomocí transportního proteinu Exportinu 5. V cytoplazmě je pre-mirna štěpena pomocí Diceru na přechodnou dvoušroubovicovou strukturu, ze které vznikají 2 vlákna, z nichž jedno vchází do RNA umlčujícího komplexu RISC, vzniká aktivní mirna a po připojení na ribozom dochází k umlčení cílové mrna 186. 2.3.2. Role mirna u vrozené (nespecifické) imunitní odpovědi Vrozená imunitní odpověď poskytuje základní obranu proti vnějším patogenům a je zprostředkovaná převážně myeloidní linií buněk jako jsou makrofágy, granulocyty, dendritické buňky (DC) a NK (natural killer) buňky 187-189. Vrozená imunita je fylogeneticky konzervovaný biologický systém, který si mnohobuněčné organismy vyvinuly jako obranu před patogením agens. Rozeznávání cizího od vlastního se děje zejména pomocí receptorů PRRs (pattern recognition receptors), které rozeznávají vysoce konzervované mikrobiální molekuly PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) a spouštějí buněčnou obranou reakci, která vyústí v likvidaci infekčního agens a aktivaci získaného (adaptivního) imunitního systému. V poslední době přibývá prací popisujících roli mirna v regulaci imunitního systému včetně vrozené a získané imunitní odpovědi, vývoji a diferenciaci buněk imunitního systému a prevenci autoimunitních onemocnění 190-194. Jednou z velice významných mirna podílejících se na udržení homeostázy a správném fungování imunitního systému je mir-155 kódovaná genem BIC. Dr. Rodriguez et al. pozorovali imunodeficienci u myší postrádajících BIC/miR-155, neboť mir-155 je zapojená ve vývoji T a B lymfocytů 195. Určitou roli hraje mir-155 také ve vrozené imunitní odpovědi, neboť dochází k indukci exprese této mirna po stimulaci bakteriálními či virovými agens a prozánětlivými cytokiny jako jsou IFNβ a IFN, a to skrze TNFα autokrinní a parakrinní signalizaci 196. Další mirna studovaná v souvislosti s vrozenou imunitní odpovědí je mir-125b. Po ovlivnění makrofágové buněčné linie pomocí LPS dochází k utlumení exprese mir-125b 197. Předpokládaná funkce mir-125b je blokace LPS aktivační dráhy v makrofázích v nepřítomnosti mikrobiální infekce a naopak vyvolání potřebné zánětlivé odpovědi snížením její exprese v odpovědi na expozici LPS 197. Dalším typem vrozené reakce je odpověď na 28

retrovirovou infekci. Tato reakce bývá často nazývána cytokinová bouře a je rozhodující pro další průběh onemocnění při zachování balancované rovnováhy mezi prozánětlivými a protizánětlivými procesy. Prvotní reakce musí být dostatečně prudká, aby mohla zastavit virovou replikaci a zabránit tak šíření infekce. Další fáze reakce je ovšem nutné regulovat zejména z důvodu zabránění poškození vlastní tkáně při chronické aktivaci imunitního systému 196, 198, 199. Witwer 199 et al. jako první objevili regulaci produkce IFNβ v lidských a opičích makrofázích pomocí mir-26a, -34a, -145 a let-7b. Tyto specifické mirna redukovaly proteinovou produkci IFNβ, zatímco inhibitory mirna produkci IFNβ na proteinové úrovni zvyšovaly. Po stimulaci produkce IFNβ opičí makrofágovou linií došlo k navození negativní zpětné vazby zvýšením exprese těchto 3 mirna regulujících hladinu IFNβ. mirna regulující IFNβ tak významně přispívají k regulaci vrozené imunitní odpovědi vyvolané IFNβ v CNS, a to za účelem zabránit potenciálnímu zánětlivému poškození mozku spojenému s dlouhotrvající aktivací této signální dráhy. 199. Dále bylo zjištěno, že mirna hostitele mohou ovlivňovat životní cyklus virů, virový tropismus a patogenezi virových onemocnění 196. Příkladem může být mir-32, která má přímý negativní efekt na replikaci viru PVF-1 (primate foamy virus 1) 196, 200. Na druhou stranu virem kódované mirna formují vzájemné působení mezi virem a hostitelem a také regulují životní cyklus viru 196, 201, 202. Další studie na myších prokázala zvýšenou expresi mirna v plicích po expozici aerosolem LPS. Navýšení exprese mirna (mir-21, -25, -27b, -100, -140, -142-3p, - 181c, -187, -194, -214, -223 a -224) bylo v průměru 4,3 krát vyšší s maximem 33 hodin po expozici. Zvýšení exprese těchto mirna korelovalo se snížením exprese TNFα, keratinocyty produkovaného chemokinu a makrofágového zánětlivého proteinu, z čehož vyplývá role mirna v regulaci produkce prozánětlivých cytokinů 203. Zajímavostí je, že mirna spojené s regulací imunitního systému byly ve vysoké míře nalezeny také v mateřském mléce 204, konkrétně: vysoce exprimovaná mir-155, která je důležitá v regulaci vývoje T a B lymfocytů a vrozené imunitní odpovědi, mir-181a a -181b, které jsou regulátory diferenciace B lymfocytů a selekce CD4+ T lymfocytů, mir-17-92 klastr důležitý pro vývoj T a B lymfocytů a monocytů, mir-125b, která je negativním regulátorem produkce TNFα, mir-146a, která je považována za regulátor vrozené imunitní odpovědi a mir-223 reguláující aktivaci a proliferaci neutrofilů. Překvapivě mir-150, regulátor T a B lymfocytů, v mateřském mléce nalezena nebyla 204. Je tedy zřejmé, že mateřské mléko obsahuje mirna schopné 29

migrovat do imunokompetentních buněk kojence a podpořit tak vývoj jeho imunitního systému, a transfer genetického materiálu jako jsou mirna nastává v tomto případě jinou cestou než sexuální reprodukcí 204, 205. Dalšími mirna přednostně exprimovanými v hematopoetické tkáni jsou mir-223, mir- 181 a mir-142. MiR-181 je přednostně exprimovaná v thymu, v nižší míře potom v kostní dřeni, lymfatických uzlinách, mozku a plicích, mir-223 je téměř výhradně exprimována v kostní dřeni, zatímco mir-142 je exprimována ve všech hematopoetických tkáních. Dr. Fazi et al. popsali regulaci diferenciace granulocytů pomocí mir-223 a dvou transkripčních faktorů: NF-1A (nuclear factor-1a) a C/EBPα (CCAAT enhancer-binding protein), soutěžích o vazebné místo na promotoru mir-223. NF-1A udržuje nízké hladiny mir-223, zatímco jeho nahrazení C/EBPα zvyšuje expresi mir-223 206. Johnnidis et al. také studovali mir-223 u neutrofilů a prokázali, že mir-223 negativně reguluje proliferaci progenitorů a diferenciaci a aktivaci granulocytů. V experimentu na mutantních myších postrádajích funkční alelu pro mir-223 došlo k expanzi granulocytární linie s následkem samovolného nárustu počtu granulocytárních progenitorů 207. Tato výzkumná skupina také prokázala, že transkripční faktor Mef (myeloid ELF-1 like factor) 2c podporující proliferaci myeloidních progenitorů, je negativně regulován pomocí mir-223. Genetická ablace Mef2c potlačila expanzi progenitorů neutrofilů a napravila expandovaný granulocytární fenotyp u mir-223 deletovaných myší. Navíc granulocyty deficientní na mir-223 byly vysoce maturované a přecitlivělé k aktivačním podnětům, což se projevovalo vysokou antimykotickou aktivitou. Jako následek této hyperaktivity se u mir-223 mutantních myší projevil patologický zánět plic a poškození vlastní tkáně po vystavení endotoxinu 207. Zajímavou studii na zdravých dobrovolnících provedl Dr. Radom-Aizik a jeho kolegové na základě hypotézy, že hladina mirna v cirkulujících neutrofilech by mohla být ovlivněna krátkým fyzickým cvičením. Pomocí Agilent Human mirna V2 Microarray se podařilo identifikovat změnu exprese po fyzické zátěži u 38 mirna (z toho 20 mirna se sníženou expresí). Při porovnání změny genové exprese v neutrofilech po vykonání fyzické zátěže v korelaci se změněnými mirna byly identifikovány 3 signální dráhy, a to: ubiquitinem zprostředkovaná proteolýza, Jak-STAT signální dráha a Hedgehog signální dráha, u kterých je pravděpodobné vzájemné působení mezi mirna a genovou expresí. U každé z těchto signálních drah je známo, že hrají klíčovou roli v mechanizmu zánětu 208. 30

Dr. Taganov et al. 200 analyzovali expresi 200 mirna v leukemické buněčné lini THP- 1 (Human acute monocytic leukemia cell line) po expozici LPS a nalezli zvýšenou produkci mir-146a/b, mir-132 a mir-155. Dále prokázali, že TRAF-6 (TNF associated factor 6) a IRAK1 (IL-1 receptor associated kinase) jsou potenciálními cílovými molekulami mir-146 200 (Obr 6). Mir-146a v této signální dráze vytváří zpětnou vazbu a brání tak nadměrné stimulaci IS. Obr. 6: Regulace zánětlivé odpovědi pomocí mir-146, -147 a -155. Intenzivní studium mirna probíhá v současné době u dendritických buněk. DC jsou profesionální antigen prezentující buňky imunitního systému, které mají jedinečnou schopnost vyvolat aktivaci a diferenciaci naivních T lymfocytů a propojit tak vrozenou a získanou imunitu 209, 210 a jsou schopné navodit jak imunogenní, tak tolerogenní odpověď T lymfocytů, což je zásadní krok v regulaci homeostázy imunitního systému. Dr. Ceppi et al. 211 objevili deregulaci 31

mirna u lidských DC derivovaných z monocytů po expozici LPS. Mezi deregulovanými mirna byla také mir-155, která byla vysoce exprimována v závislosti na maturaci DC. Bylo zjištěno, že mir-155 reguluje hladinu velice významné signální molekuly TAB2 211 a stává se tak součástí negativní zpětné vazby, která oslabuje produkci prozánětlivých cytokinů při setkání s mikrobiálními stimuly 211 (viz.obr.6). V týmu Dr. Holmstroma provedli analýzu expresního profilu v maturovaných DC a v nematurovaných DC a našli 12 rozdílně exprimovaných mirna, z čehož 4 (mir-155, -146a, -125a-5p a -29a) potvrdili pomocí qpcr a Northern blotu 212. Stanovením hladin exprese těchto mirna lze určit míru maturace DC. MiRNA regulují kalcium/kalmodulin-dependentní protein kinázu II (CaMKII), což je důležitý regulátor maturace a funkce DC, a modulují tak schopnost DC předkládat antigeny na svém povrchu. Ve studii Liua et al. sledovali, zda jsou mirna schopné regulovat vrozenou imunitní odpověď a schopnost DC prezentovat antigeny na svém povrchu inhibicí CaMKIIα 209. Pomocí programu pro predikci cílových genů regulovaných pomocí mirna a následně funkčních experimentálních analýz prokázali, že 3 mirna (mir-148a, -148b a -152) jsou negativními regulátory vrozené imunitní odpovědi a schopnosti DC prezentovat antigeny na svém povrchu. U maturovaných a aktivovaných DC pomocí agonistů TLR3, TLR4 a TLR9 byla zvýšená exprese těchto 3 mirna a snížená exprese CaMKIIα. Díky této negativní regulaci CaMKIIα došlo k inhibici produkce cytokinů včetně IL-12, IL-6, TNFα, inhibici exprese MHC molekul II třídy zprostředkované pomocí IFNβ a k inhibici antigenně specifické proliferace T lymfocytů iniciované pomocí DC. Tyto mirna tedy vystupují jako velice jemný regulátor vrozené imunitní odpovědi a schopnosti DC prezentovat antigeny na svém povrchu. 2.3.3. Role mirna u získané (adaptivní) imunitní odpovědi MiRNA se uplatňují také ve vývoji adaptivní imunitní odpovědi. Jsou důležité zejména pro izotypové přepnutí, formování germinálních center v B lymfocytech, diferenciaci funkčních linií T lymfocytů a aktivaci antigen prezentujích buněk pomocí pattern recognition pathways 213. MiRNA mají schoponost regulovat přežívání a buněčnou smrt T a B lymfocytů. Kontrola exprese samotných mirna je tedy nezbytná pro zabránění zvýšené proliferace buněk adaptivního imunitního systému. Jelikož některé mirna mají funkci nádorových onkogenů nebo supresorů, jejich deregulace v lymfocytech může navodit vážná maligní onemocnění 213, 214. 32

2.3.3.1.miRNA u B lymfocytů Role mirna ve vývoji B lymfocytů je z velké části neprozkoumaná. Jedna z klíčových rolí mirna v B lymfocytech je umožnit efektivní diferenciaci v kostní dřeni. Dr. Koralov et al. 215 provedli podmíněnou ablaci Diceru v myší linii B lymfocytů, což vyústilo v poruchu diferenciace B buněk z pre-b stadia do pro-b stadia. V týmu Dr. Chena objevili 3 mirna přednostně exprimované v hematoopetické tkáni, které jsou fylogeneticky regulovány během časné fáze hematogeneze a diferenciace buněčných linií. Jednou z nich je mir-181, která je především exprimována v myšších B lymfocytech v kostní dřeni. Ektopická exprese mir-181 v krvetvorných kmenových buňkách vedla ke zvýšení frakce B lymfocytů jak in vitro, tak in vivo 216. Zvýšená exprese mir-155 byla stanovena u několika typů B-buněčných lymfomů včetně difúzního velkobuněčného lymfomu (DLBCL) a Hodgkinova lymfomu oproti normálním cirkulujícím B lymfocytům. 217, 218. U DLBCL s aktivním B buněčným fenotypem byla nalezena významně zvýšená hladina mir-155. Protože tito pacienti mají horší klinickou prognózu, kvantifikace mir-155 by mohla sloužit jako prognostický marker 217. Myši postrádající BIC/miR-155 jsou imunodeficientní a nejsou schopny izotypového přesmyku protilátek po imunizaci na thymu závislými i nezávislými antigeny 219. Další velice významná mirna pro vývoj B lymfocytů je mir-150, která reguluje expresi transkripčního faktoru c-myb, Erk1 a Egr2 (viz Obr. 7) 220. MiR-150 je exprimována především v lymfatických uzlinách a slezině. Její exprese významně narůstá během maturace B i T lymfocytů 221. Za účelem studia role mirna v hematopoéze Zhou a kol. 221 provedli lentivirovou transdukci mir-150 hematopoetických kmenových buněk za účelem ektopické exprese mir-150. Takto pozměněné kmenové buňky transplantovali do letálně ozářené kostní dřeně myší. Nadměrná exprese mir-150 v krevních progenitorech vedla k signifikantně menšímu počtu maturovaných B buněk v periferii a lymfatických uzlinách, zatímco T lymfocyty a myeloidní buňky byly téměř nepoznamenány. Další studie prokázala, že nadměrná exprese mir-150 v krvetvorných progenitorech blokuje lymfopoézu B buněk pomocí inhibice přechodu z pro-b do pre-b stadia 221. 33

Obr. 7: Regulace maturace B lymfocytů pomocí mir-150. 2.3.3.2.miRNA u T lymfocytů Význam mirna u T lymfocytů byl studován pomocí ablace Diceru, enzymu zapojeného do biogeneze mirna, v časném stádiu vývoje T lymfocytů. Dr. Coob et al. prokázali, že ablace Diceru u vyvíjejících se T lymfocytů poškodila přežívání α a β linie T lymfocytů, zatímco počty a nebyly ovlivněny 222. Dr. Mujo et al. provedli ablaci Diceru 1 v T lymfocytech, což mělo za následek poškozený vývoj T lymfocytů, abnormální diferenciaci T CD4+ lymfocytů a atypickou cytokinovou produkci. Přestože ablace Diceru u CD4+ T lymfocytů měla za následek snížení počtu buněk, viabilita buněk poškozena nebyla. Tyto buňky vykazovaly defektní biogenezi mirna, po stimulaci nedostatečně proliferovaly a zvýšeně podstupovaly apoptózu 223. Dr. Thai et al. studovali evolučně konzervovanou mir-155 v regulaci diferenciace pomocných T lymfocytů a schopnosti germinálních center produkovat optimální T dependentní protilátkovou odpověď 224. Dr. Huffaker et al. studovali funkci mir-155 a mir-146 v T lymfocytech a zjistili, že mir-155 nepřímo podporuje produkci IFN T lymfocyty a podporuje tak protinádorovou imunitu, zatímco mir-146 působí opačně. Pomocí mir-155 -/- a mir-146 -/- deficientních myší také zjistili, že fenotyp mir-155 převládá nad fenotypem mir-146. Regulace pomocí mir-155 je nepřímá, dochází k inhibici cílové molekuly Ship1, fosfatázy, která negativně reguluje cytokinovou signalizaci PI3K signální dráhy. V přítomnosti Ship1 dochází k utlumení exprese IFN T lymfocyty (viz Obr. 8) 225. Další mirna hrající roli v imunitním systému je mir-181a, která je specificky zvýšená v CD4+CD8+ (DP) stádiu T lymfocytů a potlačuje expresi Bcl-2, CD69 a TCR receptoru, tj. proteinů, které jsou zahrnuty v koordinaci pozitivní selekce 226. Dr. Li 34

et al. pozorovali zvýšenou expresi mir-181a v maturovaných T lymfocytech, která vyvolala vyšší citlivost k peptidovým antigenům, zatímco inhibice mir-181a exprese v nezralých T lymfocytech snížila senzitivitu a narušila tak jak pozitivní, tak negativní selekci 227. Obr. 8. Znázornění regulace exprese IFN u T lymfocytů. 2.3.3.3.miRNA u T regulačních lymfocytů Za účelem studovat funkci mirna u Treg dvě výzkumné skupiny vyvinuly nezávisle na sobě myší model a provedli depleci Diceru specificky v T regulačních lymfocytech 228, 229 vložením FOXP3Cre alely 228 a nebo FOXP3-GFP-hCre alely 229 do transgeních myší. U obou myších modelů se vyskytl fatální lymfoproliferativní autoimunitní syndrom, a to již ve třetím týdnu života stejný jaký se objevil u mutantních myší postrádajících FOXP3 228-230. Chong et al. provedli deleci enzymu Drosha zapojeného do biogeneze mirna u Treg, což vyvolalo stejný fenotyp, jaký vykazovaly myši postrádající gen pro FOXP3. Byla tak prokázána důležitost mirna v regulaci vývoje Treg v prevenci spontánního zánětlivého onemocnění a autoimunity 231. Liston et al. zjistili, že T regulační lymfocyty postrádající mir-155 vykazovaly narušenou homeostázu a proliferační potenciál, zatímco supresní funkce in vitro i in vivo zůstala zachována 228. Oproti tomu Treg postrádající Dicer, enzym potřebný pro biogenezi mirna, naprosto ztratily supresní funkci v zánětlivých podmínkách. U Treg postrádajících Dicer byla pozorována snížená exprese supresních molekul jako jsou CTLA4, ICOS, IL-10, EBV- 35

indukovaný gen 3, granzym B and CD73, což je v souladu se značným poškozením jejich supresní kapacity. Je zajímavé, že Dicer deficientní Treg vykazovaly stejnou expresní hladinu FOXP3 jak na úrovni mrna, tak na proteinové úrovni ve srovnání s jejich zdravými protějšky, což podporuje teorii, že ztráta supresní funkce není způsobena změnou v expresi FOXP3, ale spíše sníženou expresí výkonných supresních molekul 228. V týmu Dr. Cobba provedli profilování mirna u myších Treg ve srovnání s mirna konvenčních T lymfocytů. Pomocí SAM analýzy objevili 68 mirna rozdílně exprimovaných mezi T regulačními lymfocyty (CD4+, CD25+, GITR+) a konvenčními T lymfocyty (CD4+, CD25-, GITR-). 35 mirna bylo zvýšeně exprimováno v T regulačních lymfocytech (včetně mir-223, -146, -21, -22, -23a a b, - 24, -214, -155 a další) a 33 mirna bylo sníženě exprimováno v T regulačních lymfocytech (včetně mir-142-5p a -3p, mir-30b, c, e a členy rodiny Let-7) 230. Je zajímavé, že míra exprese mnoha mirna specifických pro T regulační lymfocyty je přímo závislá na míře exprese transkripčního faktoru FOXP3 232-234. Přestože již dříve zmiňovaná mir-155 je postradatelná pro diferenciaci a supresní funkci Treg, její zvýšená exprese řízená transkripčním faktorem FOXP3 je rozhodující pro zvýšenou citlivost Treg k jejich klíčovému růstovému faktoru IL-2. Z funkčních studií vyplynulo, že homeostáza Treg zprostředkovaná pomocí mir-155 je udržována pomocí regulace SOCS1, negativního regulátoru IL-2 signalizace. Konstitutivně zvýšená exprese mir-155 řízená pomocí FOXP3 zajišťuje dostatečnou fosforylaci STAT5 v přítomnosti omezeného množství IL-2 a udržuje T regulační lymfocyty v kondici v konkurenčním prostředí 232. Naopak nedostatek mir-155 u Treg vedl ke snížení celkového počtu Treg, snížení proliferačního potenciálu, sníženou IL-2 signalizaci a 5x zvýšenou expresi proteinu SOCS1 232. Kohlhass et al. také studovali vliv mir-155 na vývoj a funkci Treg. Zjistili, že u myší postrádajících mir-155 se nachází snížené počty Treg v thymu a slezině, ale se zachovanou supresní funkcí. Dále zaznamenali, že mir-155 je potřebná pro vývoj Treg, ovšem může být postradatelná pro proliferaci a přežívání v periferii 235. Rouas et al. studovali expresní profil mirna v naivních T regulačních lymfocytech (CD4+, CD25+) izolovaných z pupečníkové krve v porovnání s konvenčními T lymfocyty (CD4+, CD25-) zdravých dárců. Pomocí TaqMan Low Density Array a následnou validací pomocí qpcr potvrdili 5 mirna rozdílně exprimovaných mezi těmito dvěma populacemi. Tři z nich (mir-21, -181 a -374) byly v naivních T regulačních lymfocytech 36

zvýšeně exprimovány a dvě mirna (mir- 31 a -125a) byly naopak sníženě exprimovány. Pomocí funkčních testů bylo zjištěno, že mir-31 je negativní regulátor FOXP3 a váže se na potenciální cílové místo v 3 UTR oblasti mrna pro FOXP3. Dalším nálezem bylo, že mir-21 působí jako pozitivní, I když nepřímý regulátor exprese FOXP3 236. MiR-146a je stejně jako mir-155 zvýšeně exprimována v Treg. Hladina její exprese se zvyšuje během virové infekce, kdy působí jako negativní regulátor TRAF6, IRAK1 a IRAK2, a ovlivňuje tak na RIG-1 závislou antivirovou dráhu 237, 238. Dr. Curtale et al. se zaměřili na studium mir-146a u T buněčné imunitní odpovědi a poskytli zajímavý pohled na regulaci mir-146a během aktivace T lymfocytů. Zjistili, že hladina mir-146a je nízká v naivních T lymfocytech, naopak zvýšená v paměťových T lymfocytech 213, jelikož při stimulaci TCR receptoru lidských T lymfocytů dochází k indukci exprese mir-146. Z výsledků studie Dr. Curtale je zřejmé, že mnoho signálních drah, nejenom zánětlivých, je ovlivněno regulací mir-146a. Například mir-146a moduluje aktivací zprostředkovanou buněčnou smrt tím, že negativně reguluje s FAS asociovanou doménu smrti a působí tak jako antiapoptotický faktor. Autoři dále zjistili, že nadměrná exprese mir-146a narušuje jak aktivitu aktivačního proteinu 1 (AP-1), tak produkci IL-2 zprostředkovanou aktivací TCR receptoru, což nasvědčuje tomu, že mir-146a působí jako modulátor získané imunity 213. Lu et al. studovali mirna-146a u Treg a zjistili, že mir-146a je nepostradatelná pro schopnost Treg utlumit IFN- zprostředkovanou patologickou zánětlivou odpověď Th1. MiR-146a také negativně reguluje transkripční faktor STAT1 239, který je potřebný pro diferenciaci Th1 efektorových lymfocytů, což je nezbytné pro schopnost Treg suprimovat Th1 imunitní odpověď. Mezi další mirna zapojené do biologie Treg se řadí mir-142-3p, která negativně reguluje produkci camp inhibicí adenylát cyklázy (AC) 9 v CD4+CD25- T lymfocytech a CD4+CD25+ T regulačních lymfocytech 240. Bylo zjištěno, že FOXP3 snižuje expresi mir-142-3p, čímž zajišťujě aktivaci AC9/cAMP signální dráhy u Treg. Tento nový molekulární mechanizmus popisuje schopnost Treg udržovat zvýšenou hladinu camp k zajištění svých supresních funkcí. Navíc tyto nálezy také naznačují, že mirna kontrolující expresi AC mohou omezit konečnou hladinu camp v různých buněčných typech. Supresní aktivita Treg byla potlačena po podání camp antagonisty 38. V poslední době stále více studií poukazuje na důležitost mirna ve vývoji imunitního systému a imunitní odpovědi. Důležitou roli v řízení buněčné smrti imunokompetentních buněk hrají mir-181a a mir-223, 37

další mirna regulují základní prvky adaptivní imunity jako je prezentace antigenu (mir-155) a T receptorové signalizace (mir-181a) 188, 204. 2.3.4. mirna a nové možnosti terapie Přestože byly mirna objeveny teprve před 18 lety, jejich význam v regulaci imunitního systému prokazatelně roste. Jeden z nejcharakterističtějších znaků mirna jako terapeutických cílů je jejich schopnost regulovat desítky až stovky cílových genů jedné signální dráhy, což je činí extrémně výkonnými regulátory. Mohou tak ovlivňovat řadu fyziologických procesů včetně vývoje a regulace imunitního systému. Přesné mechanizmy účinku většiny mirna nejsou známy, avšak jako hlavní cíle těchto malých molekul se jeví spíše transkripční faktory, kofaktory a modifikátory chromatinu, než receptory a jejich ligandy, či zánětlivé mediátory 241. Příklad působení mir-181a v imunitním systému sdudoval Dr. Li et al. v biologii TCR. Signalizace TCR receptoru a rozpoznávání antigenu je kontrolováno fosforylacemi a defosforylacemi zajišťovanými pomocí více jak 40 různých kináz a fosfatáz. Mnohem větší účinek na signalizaci TCR receptoru má utlumení jedné mirna - mir-181a, než utlumení jednotlivých fosfatáz pomocí RNA interference 227. Schopnost mirna regulovat řadu genů v rámci jedné signální dráhy z nich dělá excelentní kandidáty pro cílenou molekulární terapii. 2.4. Autoimunitní onemocnění Autoimunitní reakce a následná onemocnění vznikají, jsou-li narušeny základní mechanizmy autotolerance, kdy fyziologická autoimunita přechází v patologickou. Narušení principu tolerance s následným imunopatologickým zánětem studoval v roce 1900 Paul Ehrlich. Při imunizaci koz erytrocyty jiné kozy vznikaly specifické protilátky mající poškozující charakter. Tento jev nazval Ehrlich autoimunitou jako protiklad k již zavedenému termínu imunita. Autoimunitní reakce může být dvojího typu. Jedná-li se o látkovou (humorální) reakci, dochází k tvorbě autoprotilátek, které působí cytotoxicky, nebo se podílí na tvorbě a ukládání imunokomplexů. Při buněčně zprostředkovaných reakcích dochází ke vzniku zánětu, který je způsoben aktivací cytotoxických (T C ) a pomocných (T H 1) lymfocytů a makrofágů. Patogenita daných autoprotilátek či T-lymfocytů by měla být potvrzena s využitím experimentálních zvířat 38

nebo reprodukcí patologické reakce in vitro. Choroby s neznámým autoantigenem a neprokazatelným přenosem na zvířecí modely jsou považovány za autoimunitní pouze na základě účinnosti některých imunosupresiv či díky podobnostem s jinými experimentálními modely. 2.4.1. Genetické faktory ovlivňující vznik autoimunit Různí jedinci jsou jinak náchylní ke vzniku autoimunitního onemocnění. Tato predispozice je spojena s genetickou výbavou jedince a různými rizikovými faktory. U lidí s genetickou predispozicí se nemusí vždy autoimunitní onemocnění vyvinout. Mezi 3 hlavní skupiny genů se sklonem k autoimunitním onemocněním řadíme: Imunoglobuliny T buněčné receptory Hlavní histokompatibilní komplex (MHC). První dvě skupiny jsou zahrnuty v rozpoznávání cizorodých antigenů a jsou vrozeně variabilní se sklonem k rekombinaci. Tyto variace umožňují imunitnímu systému odpovídat na velice široké spektrum cizorodých antigenů, ale na druhou stranu mohou také vzniknout lymfocyty reagující proti vlastním antigenům. Třetí skupinu tvoří MHC molekuly. Některé alotypy MHC II třídy jsou spojené s následujícími autoimunitami: HLA DR2 - Systémový Lupus Erythematosus (SLE), narkolepsie, roztroušená skleróza, negativně koreluje s diabetem mellitu I typu. HLA DR3 Sjögrenův syndrom, Myastenia gravis, SLE a Diabetes mellitus I typu HLA DR4 - Rheumatoidní arthritida, Diabetes mellitus I typu a Pemphigus vulgaris. Nejznámější korelace s molekulou MHC I třídy HLA B27 je Bechtěrevova choroba (Ankylosing spondylitis). 39

2.4.2. Klasifikace autoimunitních onemocnění. Autoimunitní onemocnění dělíme na systémová a orgánově specifická neboli lokalizovaná v závislosti na hlavních klinicko-patologických rysech tohoto onemocnění. Mezi systémová autoimunitní onemocnění řadíme například: SLE, Sjögrenův syndrom, sklerodermie a rheumatoidní artritida. Tato onemocnění jsou spjatá s tvorbou autoimunitních protilátek, které nejsou tkáňově specifické. Mezi orgánově specifická neboli lokalizovaná autoimunitní onemocnění řadíme: Endokrinologická onemocnění: Diabetes mellitus I typu, Hashimotova thyreoitida, Addisonova choroba Gastrointestinální onemocnění: celiakie, Crohnova choroba, Perniciozní anaemie Dermatologická onemocnění: Pemphigus vulgaris, Vitiligo Hematologická onemocnění: Autoimunitní hemolytická anaemie, Idiopatická trombocytopenická purpura Neurologická onemocnění: Myastenia gravis 2.4.3. Diabetes mellitus Diabetes mellitus (DM), česky cukrovka, zastarale úplavice cukrová je souhrnný název pro skupinu chronických onemocnění multifaktoriální etiologie, jejichž hlavním znakem je hyperglykémie (Klener P a kol. Diabetes mellitus. In Klener P a kol. Vnitřní lékařství. Galén, Druhé, doplněné vydání, 2001: 725-742). Rozlišují se 2 základní typy: diabetes I. typu a diabetes II. typu, které vznikají důsledkem absolutního nebo relativního nedostatku inzulinu. Oba dva typy diabetu mají podobné příznaky, ale odlišné příčiny vzniku. V prvotních stádiích diabetu I. typu jsou ničeny buňky slinivky břišní, které produkují hormon inzulin, vlastním imunitním systémem. Proto se řadí mezi autoimunitní choroby. Diabetes II. typu je způsoben sníženou citlivostí tkání vlastního těla k inzulinu. 40

Počet léčených diabetiků v ČR každým rokem stoupá (viz Tab 2). Trvale vyšší zastoupení mezi diabetiky vykazují ženy (zhruba o 10 %). Chronické komplikace se dlouhodobě vyskytují u 27 % léčených diabetiků. DM 1. typu DM 2. typu Sekundární DM celkem diabetes 2010 55 811 739 859 10 560 806230 2009 55 414 717365 10542 783321 2008 54 474 708 847 10 240 774 000 2007 52 813 692 074 10 074 755 000 2006 51 070 686 159 11 299 749 000 2000 46 446 599 868 8 504 654 164 1997 39 020 555 883 5 402 600 306 1975 - - - 234 071 Tab 3: Počet diabetiků v ČR v jednotlivých letech (Ústav zdravotnických informací a statistiky ČR). Diabetes mellitus 1. typu (DM1), označovaný také jako inzulin-dependentní Diabetes mellitus (IDDM) začíná obvykle v dětství či dospívání. V některých případech je možný i pozdní vznik tohoto onemocnění po třicátém roce věku, pak ho označujeme jako LADA (latent autoimmune diabetes in adults), tedy pomalu probíhají cukrovka dospělých. V České republice trpí DM1 přibližně 7 % diabetiků a je pro něj charakteristická úplná absence inzulínu v těle. Jedná se o onemocnění se značným socioekonomickým dopadem a celosvětově stoupajícím výskytem. V Českém registru dětského diabetu bylo za období 1989-2003 zachyceno 3454 pacientů s DM1 ve věku 0 14 let s prudce narůstající incidencí 7-18 případů/100 000 dětí/rok (Cinek O, Šumník Z, Vavřinec J. Dětský Diabetes mellitus v České republice: stále více a čím dál dříve. Čas. Lék. Čes., 2005, 144: 266-271). Za destruktivní autoimunitní insulitidu je zodpovědná infiltrace pankreatických Langerhansových ostrůvků lymfocyty typu Th1, jejichž cytokiny podporují cytotoxické Tc lymfocyty v destrukci beta buněk 242. Důsledkem postupné autoimunitní destrukce klesá počet beta buněk až pod kritickou mez, kdy se objeví první klinické 41

příznaky DM1 (Klener P a kol. Diabetes mellitus. In Klener P a kol. Vnitřní lékařství. Galén, Druhé, doplněné vydání, 2001: 725-742). Zajímavým zjištěním je výskyt DM1 u pacientů s určitou výbavou HLA (human leukocyte antigen) genů (viz Graf 1). Graf 1: Meta-analýza asociačních studií mezi HLA II třídy DR3/DR4 a diabetem mellitu I typu 243. Poměr šancí (odds ratio) = 0 žádná spojitost s onemocněním, poměr šancí >1 riziko onemocnění se zvyšuje, poměr šancí < 1 riziko onemocnění se zmenšuje. Léčba DM1 v současné době spočívá zejména v pravidelném měření glukózy v krvi a injekčním podávání inzulínu. Tato léčba je ekonomicky nákladná, neřeší příčinu onemocnění a v případě nedůsledného dávkování vede k rozvoji diabetických komplikací. Jedinou kauzální léčbou by byla prevence ztráty β buněk pankreatu a zachování jejich funkce. Několik klinických studií založených na kauzální léčbě DM1 již proběhlo, bohužel však bez velkého úspěchu 244. Hledání nových terapeutických přístupů zaměřených především na léčbu narušených imunoregulačních funkcí vedoucích ke vzniku T1D je velice žádoucí. Díky novým poznatkům vedoucím k porozumění biologie Treg se tyto specializované regulační lymfocyty dostávají do popředí a zdají se být slibnou léčebnou modalitou zejména autoimunitních onemocnění. Na laboratorních modelech bylo zjištěno, že Treg potlačují autoimunitní reakce při takových onemocněních jako je diabetes, lupus Crohnova choroba a roztroušená skleróza 245. U non- 42

obézních (NOD) diabetických myší byl zjištěn významný deficit imunoregulačních CD4+CD25+ T lymfocytů produkujících IL-10 a TGF-beta a převaha Th1 lymfocytů, které spouští autoimunitní destrukci β-buněk pankreatu prostřednictvím cytotoxických Tc lymfocytů 246. Určitou naději léčby přináší fakt, že u některých pacientů s dlouhodobě probíhajícím onemocněním stále zůstává určité množství ostrůvků s persistujícími β buňkami a se zbytkovým barvením na inzulin 247. Tyto poznatky naznačují, že autoimunitní destrukce ostrůvků pankreatu může být lokalizovaná podobně jako kropenatý vzhled kůže u autoimunitního onemocnění vitiligo, anebo léze, které vznikají během ataků při roztroušené skleróze. V současné době probíhá klinické hodnocení testující bezpečnost a účinnost léčby pacientů s DM1 podáním polyklonálních Treg. (viz kapitola. 2.1.6 Možnosti využití Treg v terapii). Schéma terapie pomocí modifikovaných Treg je shrnuto v Obr 9. Ve schématu vidíme použití Treg izolovaných z pupečníkové krve, které se vyznačují vyšší supresní aktivitou 248 a vykazují vyšší stabilitu FOXP3 oproti paměťovým CD45RO Treg 249. 43

Obr. 9 Navržený mechanizmus terapie DM1 pomocí geneticky modifikovaných autologních Treg nebo Treg izolovaných z pupečníkové krve exprimujících antigen-specifické TCR receptory nebo s geneticky modifikovanou poruchou funkce související se vznikem DM1, anebo obojím současně. Autologní Treg jsou nejprve expandovány in vitro a poté jsou podány pacientům s DM1. Případně mohou být podány také polyklonální Treg, které směřují do místa zánětu, kde uplatňují své supresivní funkce pomocí tzv. infekční tolerance produkcí IL-10, CTLA4 nebo IL-2 deplece a modulací funkce DC. 44

2.5. Průtoková cytometrie Průtoková cytometrie je metoda umožňující měření a analýzu fyzikálně-chemických vlastností jednotlivých buněk nebo jiných biologických částic během jejich průchodu laserovým paprskem. Hlavními měřenými parametry jsou velikost, objem, index lomu, exprese povrchových i intracelulárních proteinů. Před začátkem analýzy musí být suspenze buněk označena fluorochromem nebo fluorescenční protilátkou. Takto označené buňky vstupují do cytometru, kde dochází k laminárnímu proudění a buňky se seřazují v centru proudu. Každá buňka prochází systémem jednotlivě a po ozáření laserovým paprskem jsou snímány její fyzikálně-chemické vlastnosti. Ve chvíli, kdy buňka kříží světelný paprsek, dochází k lomu a rozptylu světla, který podle směru a úhlu lomu bývá označován jako přímý rozptyl - forward scatter (FSC) a boční rozptyl - side scatter (SSC). Zatímco FSC je úměrný velikosti buňky, SSC udává granularitu (vnitřní strukturu) buněk. Excitované záření je detekováno fotometry, převedeno na číselný tvar a zpracováno počítačem. Získaná data jsou nejčastěji zobrazena v dvojrozměrném grafu (tzv. dot plot ), kde každé buňce odpovídá jedna tečka. V Tab. 4 jsou znázorněny používané flourochromy, které je možno měřit na námi používáném přístroji BD FACS Aria TM Cell Sorter (BD Biosciences, San José, CA, USA). 45

Laser KONFIGURACE DETEKTORŮ U FACS ARIA Vlnová délka emitované Fluorochrom fluorescence Barva fluorochromu Fluorescein isothiokyanát (FITC) 518 nm zelená Green fluorescein protein (GFP) 530 nm zelená MODRÝ LASER (488 nm) Phycoerythrin (PE) 575 nm žlutá Propidium iodid (PI) 617 nm žlutá Phycoerythrin-cyanin 5 (PE-Cy5 také PC5) 670 nm červená Peridin-chlorophyll-cyanin 5.5 (PerCP-Cy 5.5) 690 nm červená Phycoerythrin-cyanin 7 (PE-Cy7 také PC7) 760 nm infračervená HeNe, ČERVENÝ LASER (633 nm) Allophycocyanin APC 660 nm červená Allophycocyanin-cyanin 7 (APC-Cy7) 780 nm infračervená FIALOVÝ LASER Pacific blue 455 nm modrá (407 nm) DAPI 450 nm modrá Tab. 4: Konfigurace detektorů u přístroje FACS ARIA Speciální aplikací průtokové cytometrie je třídění buněk na základě předem známých parametrů. Buňky poskytující odpovídající fluorescenční signál jsou nabity v elektrickém poli o vysokém napětí, které je vytvořeno mezi speciálními vychylovacími destičkami a následně tříděny do sběrných zkumavek, jak je patrné z obrázku 10. 46

Obr. 10: Schéma třídění buněk průtokovým cytometrem 47

3. CÍLE DISERTAČNÍ PRÁCE A) Stanovit rozdílně exprimované mirna v T regulačních lymfocytech pacientů s autoimunitním onemocněním DM1 1) Z periferní krve pacientů s DM1 a zdravých dárců vyizolovat pomocí průtokové cytometrie CD4+CD25+CD127- Treg a CD4+CD25- konvenční T lymfocyty. 2) Z těchto buněk vyizolovat RNA obohacenou o krátké RNA a ověřit jejich čistotu a kvalitu. 3) Pomocí Human TaqMan Low Density Array (TLDA)najít mirna rozdílně exprimované v Treg pacientů s DM1. 4) Porovnat expresní profil mezi Treg konvenčními CD4+ T lymfocyty. B) Porovnat mirna profil aktivačních versus tolerogenních dendritických buněk zdravých dárců generovaných in vitro. 1) Z periferní krve zdravých dárců generovat pomocí maturačních koktejlů aktivační a tolerogenní DC. 2) Z těchto buněk vyizolovat RNA obohacenou o krátké RNA a ověřit jejich čistotu a kvalitu. 3) Pomocí human TLDA najít mirna rozdílně exprimované mezi aktivačními a tolerogenními DC. 48

4. METODY 4.1. Studie A: Stanovit rozdílně exprimované mirna v T regulačních lymfocytech pacientů s autoimunitním onemocněním DM1 4.1.1. Soubor pacientů Soubor Po podepsání informovaného souhlasu bylo pacientům s diabetem mellitu I léčených v diabetologickém centru FN Brno odebráno 60 ml periferní heparinizované krve. Kontrolní skupina lymfocyty zdravých dárců byly izolovány z tzv. buffy coatů (BC), což je frakce nesrážlivé krve tvořená převážně leukocyty a krevními destičkami. BC byly odebírány z Tkáňového a transfúzního oddělení FN Brno. označení pohlaví měsíc/rok narození měsíc/rok diagnózy věk v den odcěru délka trvání DM1 diab 32 M I/1990 V/1998 19 11 diab 45 Ž VII/1975 IX/2000 34 9 diab 47 Ž V/1970 VIII/1995 39 14 diab 53 M III/1953 VII/1986 56 23 diab 54 Ž XII/1984 VII/1992 25 17 Tab. 5: Charakteristika pacientů s DM1 4.1.2. Separace CD4+, CD25+, CD127- Treg pomocí průtokové cytometrie na přístroji FACS ARIA Mononukleární buňky byly izolovány z buffy-coatu zdravého dárce a periferní krve pacienta s diabetem mellitu I. typu pomocí hustotní gradientové centrifugace. Pro separaci Treg bylo použito 80x10 6 periferních monocytů. 1. 50 ml Buffy coat od zdravých dárců nebo 60 ml periferní krev od pacientů naředit 1:1 s HBSS (Hanks balanced salt solution) a navrstvit na Histopaque v poměru 1:2 (tj. 15 ml Histopaque : 30 ml naředěného vzorku krve) 2. Centrifugovat: 1400 rpm (330 x g) / 45 min / 20 C 49

3. Pomocí pasteurovy pipety přenést prstýnek PBMC do dvou 50ml zkumavek + doplnit HBSS do 50 ml 4. Centrifugovat: 1400 rpm (330 x g) / 10 min / 4 C 5. Odstranit supernatant, resuspendovat pelet + doplnit HBSS do 50 ml 6. Centrifugovat: 1400 rpm (330 x g) / 10 min / 4 C 7. Odstranit supernatant, pelet resuspendovat, přenést do jedné 50ml zkumavky a doplnit HBSS do 40 ml 8. Spočítat buňky v Bürkerově komůrce: 10 μl vzorku + 10 μl Trypan Blue (buněčnou suspenzi nutno udržovat při 4 C) 9. Odebrat 80x10 6 buněk na barvení pro průtokovou cytometrii 10. Centrifugovat: 1400 rpm (330 x g) / 10 min / 4 C 11. Slít supernatant a resuspendovat buňky 12. Barvení: CD3-FITC 2μl / 10 6 buněk 160μl / 80x10 6 buněk CD127-PE 2μl / 10 6 buněk 160μl / 80x10 6 buněk CD25-APC 3μl / 10 6 buněk 240μl / 80x10 6 buněk CD4-PE-Cy7 1,8μl / 10 6 buněk 144μl / 80x10 6 buněk 13. Inkubovat 30 min / 4 C ve tmě 14. Doplnit HBSS do 30 ml 15. Centrifugovat: 1400 rpm (330 x g) / 10 min / 4 C 16. Přidat 18,4 ml HBSS a přes filtr oddělující jednotlivé buňky rozpipetovat po 10x10 6 buněk (2,3 ml) do 8 zkumavek pro FACS ARIA sorter 17. Do doby třídění uchovávat ve tmě při 4 C Na základě CD znaků byly pomocí FACS Aria vytříděny 2 cílové populace buněk: a) CD3 + CD4 + CD25 - konvenční T-lymfocyty b) CD3 + CD4 + CD25 high CD127 low T regulační lymfocyty. Buňky byly tříděny do média RPMI s 20% přídavkem fetálního bovinního séra (FBS). Poté byly promyty v 2x HBSS, spočítány v Bürkerově komůrce, stočeny a peleta byla šokově 50

zamražena v tekutém dusíku a dále uchovávána v -80 C až do izolace RNA. Kritérium pro izolaci RNA bylo vytřídění minimálně 0,35 x 10 6 buněk. 4.1.3. Izolace celkové RNA bohaté na frakci krátkých RNA Pomocí komerční soupravy mirvana (Ambion, USA) byla izolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA. Rozmražený pelet buněk byl okamžitě lyzován a homogenizován. Samotná izolace spočívala ve spojení dvou základních metod, jak naznačuje Obr. 11. V první fázi byla provedena organická extrakce, která vedla k odstranění proteinů a buněčných složek. Následná imobilizace RNA na filtr ze skleněných vláken byla umožněna přídavkem 100% ethanolu, který snížil afinitu RNA k vodě, což se projevilo zvýšenou afinitou této molekuly k pevnému povrchu. Filtr byl několikrát promyt a zachycená RNA byla eluována roztokem o nízké iontové síle. Čistota takto získané RNA byla ověřena spektrofotometricky a vzorek byl zamražen při -80 C. Tento způsob izolace kombinuje výhody obou metod, jakými jsou rychlost, velké výtěžky a vysoká kvalita a čistota získané RNA. Obr. 11: Schématické znázornění izolace celkové RNA bohaté na frakci krátkých RNA (Applied Biosystems) 1. Přidat 400 μl lyzačního roztoku k peletu buněk 2. Přidat 40 μl homogenizačního roztoku a promíchat 3. Inkubovat 10 min na ledu 4. Přidat 400 μl směsi fenol:chloroform a promíchat 51

5. Centrifugovat: 13400 rpm (12100 x g) / 5 min / pokojová teplota 6. Přenést vodnou fázi (vrchní) do nové mikrozkumavky 7. Přidat 1,25 x (objem přenesený v bodě 6) 100% ethanolu (laboratorní teplota) 8. Umístit filtr do nové mikrozkumavky 9. Pipetovat po 700 μl směsi lyzát/ethanol na filtr 10. Centrifugovat: 13400 rpm (12100 x g) / 10 s 11. Odstranit filtrát a opakovat body 9-10 (přefiltrovat celý objem z bodu 7) 12. Odstranit filtrát a aplikovat 700 μl promývacího roztoku 1 na filtr 13. Centrifugovat: 13400 rpm (12100 x g) / 10 s 14. Odstranit filtrát a aplikovat 500 μl promývacího roztoku 2/3 na filtr (tento krok zopakovat 2x) 15. Centrifugovat: 13400 rpm (12100 x g) / 10 s 16. Odstranit filtrát a znovu centrifugovat při 13400 rpm (12100 x g) / 1min 17. Přemístit filtr do nové mikrozkumavky 18. Napipetovat 50 μl elučního roztoku předehřátého na 65 C do středu filtru 19. Centrifugovat: 13400 rpm (12100 x g) / 30 s 20. Změřit koncentraci a ověřit čistotu RNA na spektrofotometru NanoDrop 2000 21. Zkumavky s eluátem, který obsahuje vyizolovanou RNA, uschovat při -80 C. 4.1.4. Technologie mirna qrt-pcr arrays TaqMan Low Density Array obsahuje 384 jamek umožňujících 368 jednotlivých TaqMan mirna stanovení současně (365 jednotlivých mirna, 3 endogenní kontroly). S využitím speciálních sad primerů pro reverzní transkripci je možné provést vysoce specifickou qrt-pcr (kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase) v krátké době a zároveň eliminovat chyby vznikající při opakovaném pipetování. Reverzní transkripce (RT) je děj, při kterém dochází k přepisu genetické informace z RNA do DNA. V přírodě se vyskytuje především u retrovirů, které využívají speciální enzym reverzní transkriptázu. Hlavním problémem při kvantifikaci mirna je jejich krátká délka (okolo 22 nukleotidů), která neumožňuje použití běžných RT primerů. Z tohoto důvodu jsou využívány primery o 52

smyčkovité struktuře, které specificky rozpoznávají 3 konec zralých mirna, jak je znázorněno na Obr. 12. Obr.12: Schématické znázornění reverzní transkripce mirna Jednotlivé primery jsou uspořádány do 8 skupin po 48. Toto uspořádání umožňuje provést reverzní transkripci všech mirna v 8 oddělených RT reakcích, které jsou následně pipetovány do 8 plnících otvorů desky pro qrt-pcr, jak je znázorněno na Obr. 13. Obr. 13: TaqMan Low Density Array Kvantitativní PCR v reálném čase (qrt-pcr) je založena na principu klasické polymerázové řetězové reakce. Hlavním rysem je kvantifikace amplifikované DNA v každém amplifikačním cyklu. Vysoká specifita reakce je zajištěna třemi oligonukleotidy - dvěma primery a jednou sondou, na jejímž 5 konci je navázán reporter, který slouží jako zářič 53

(6-karboxyfluorescein), a na 3 konec se váže zhášeč (NFQ, nonfluorescent quencher) s připojenou molekulou MGB (minor groove binder), která stabilizuje vazbu DNA-sonda a umožňuje tak použití těchto sond o krátkých délkách. Je-li sonda v inaktivním stavu, emitované světlo je zhášeno z důvodu přesně definované vzdálenosti mezi zářičem a zhášečem, jak je patrné z Obr. 14. V průběhu qrt-pcr dochází k navázání sondy ke komplementárním sekvencím primerů. Následná tvorba nového řetězce (elongace) vede k rozrušení sondy vlivem 5 exonukleázové aktivity Taq polymerázy, čímž je ukončen proces zhášení a vznikající fluorescenční záření, jehož intenzita vzrůstá s počtem cyklů, je zaznamenáváno detektorem. Obr. 14: Schématické znázornění qrt-pcr (Applied Biosystems) 54

Reverzní transkripce byla provedena s využitím speciálních primerů o smyčkovité struktuře, které byly uspořádány do 8 skupin (Human Pool 1-8). Toto uspořádání umožnilo provést reverzní transkripci pro všech 368 mirna v 8 oddělených RT reakcích. 1. Připravit RT reakční směs (pro 8 reakcí / 1 vzorek) dle tab č. 6: Směs pro reverzní transkripci pro 1 vzorek tj. 8 reakcí Reagencie Množství 100 mm dntps (s dttp) 1,8 μl MultiScribe TM Reverse Transcriptase, 50 U/ml 10x Reverse Transcription (RT) Buffer Rnase Inhibitor, 20 U/μl Nuclease-free water CELKEM Tab 6: Reakční směs pro reverzní transcripci 18,0 μl 9,0 μl 1,13 μl 33,08 μl 63,0 μl 2. Do každé z 8 PCR zkumavek napipetovat objem odpovídající 75 ng celkové RNA a zkumavky umístit na led 3. Přidat 7 μl RT směsi do každé z 8 zkumavek 4. Přidat 1 μl Human Pool 1-8 do příslušných PCR zkumavek 5. Mírně zamíchat a inkubovat na ledu minimálně 5 min 6. Nastavit program termocykleru: Typ kroku Čas (min.) Teplota ( C) HOLD 30 16 HOLD 30 42 HOLD 5 85 HOLD 4 Tab 7: Nastavení cykleru pro reverzní transkripci 7. Umístit PCR zkumavky do termocykleru, objem nastavit na 10 μl a spustit reakci 55

cdna byla dále použita pro TLDA založených na principu RTqPCR dle následujícího postupu: 1. Objem jednotlivých RT reakcí přenést do 1,5ml centrifugačních zkumavek 2. Ke každé RT reakci přidat 615 μl vody 3. Do dalších osmi 1,5ml zkumavek napipetovat 50 μl TaqMan Universal PCR Master Mix (2x) 4. Přenést 50 μl jednotlivých naředěných RT reakcí do zkumavek připravených v bodě 3 5. Zkumavky promíchat, krátce centrifugovat a umístit na led 6. Napipetovat 8 x 100 μl jednotlivých směsí do plnících otvorů desky pro qrt-pcr (viz Obr. 13) 7. Centrifugovat: 1400 rpm (330 x g) / 3 x 1 min/ 8. Zapečetit desku a odstřihnout plnící otvory 9. Nastavit režim pro nové měření v programu 7900HT Version 2.3 Sequence Detection Systems 10. Použít univerzální teplotní profil: 50 C / 2 min 95 C / 10 min 95 C / 30 s 60 C / 1 min 40x 11. Zahájit qrt-pcr reakci 56

4.2. Studie B: Porovnat mirna profil aktivačních versus tolerogenních dendritických buněk zdravých dárců generovaných in vitro 4.2.1. Generování DC in vitro: varianta A: Aktivační DC (maturace IFN, LPS) varianta: B Tolerogenní DC (maturace TGFβ, IL-10) Dendritické buňky byly generovány z monocytů izolovaných z buffy coatů zdravých darců získaných z Tkáňového a transfúzního oddělení FN Brno. DEN1 IZOLACE PBMC A NASAZENÍ MONOCYTŮ 1. Vyizolovat PBMC z buffy coatu viz kapitola 4.1.2. 2. Separovat monocyty pomocí plastické adherence: 90 milionů PBMC resuspendovat ve 30 ml média A (viz Tab. 8) a po 5 ml nasadit na 6 Petriho misek (PM) o průměru 6 cm, tj. 15 mil PBMC na misku a kultivovat v termostatu po dobu 2 h při 37 C a 5 % CO 2 DNAsa Glutamin A X-VIVO 10 AB sérum 10 mg / ml 200mM Pro 6 misek 30 ml 600 ul 300 ul 300 Tab 8: Složení média A 3. Z PM odsát neadherentní buňky - jamky 2-3x lehce opláchnout médiem, odsát médium 4. PM promýt 5 ml roztoku Hanks - jamky 1-2x opláchnout roztokem Hanks 5. Do každé PM přidat 5 ml média B. (viz Tab. 9) X-VIVO AB Glutamin IL-4 GM-CSF B 10 sérum 200mM 40 000 U/ml 100 000 U/ml Pro 6 misek 30 ml 600 ul 300 ul 300 ul 300 ul Tab 9: Složení média B 57

DEN 3 VÝMĚNA MÉDIA, PŘIDÁNÍ TOLEROGENNÍCH CYTOKINŮ Varianta A: Aktivační DC (maturace IFN, LPS) 1. odstranit 2,5 ml starého média a přidat 5 ml nově připraveného média B do každé misky PM 2. kultivovat v inkubátoru po dobu dalších 3 dní při 37 C a 5 % CO 2 do další výměny média Varianta: B Tolerogenní DC (maturace TGFβ, IL-10) 1. odstranit 2,5 ml starého média, přidat 5 ml nově připraveného média B do každé misky PM + TGF-B (2ng/ml) a IL-10 (1ng/ml) 2. kultivace v inkubátoru po dobu dalších 3 dní při 37 C a 5 % CO 2 do další výměny média DEN 6 MATURACE AKTIVAČNÍMI A TOLEROGENNÍMI CYTOKINY 5. různých variant DC: Kontrolní DC bez maturace: A. DC kontrolní, pouze 6 dnů kultivace ve standardním médiu B Maturované DC: B. DC aktivační maturované po dobu 6 h v přítomnosti LPS (200ng/ml) a IFN (50ng/ml) C. DC aktivační maturované po dobu 24 h v přítomnosti LPS (200ng/ml) a IFN (50ng/ml) D. DC tolerogení, 6-denní kultivace v médiu B s přídavkem TGFβ (2ng/ml) a IL-10 (1ng/ml), poté medium vyměněno za nové s dalším přídavkem TGFβ (2ng/ml) a IL-10 (1ng/ml) a kultivováno po dobu 6h maturace E. DC tolerogení, 6-denní kultivace v médiu B s přídavkem TGFβ (2ng/ml) a IL-10 (1ng/ml), poté medium vyměněno za nové s dalším přídavkem TGFβ (2ng/ml) a IL-10 (1ng/ml) a kultivováno po dobu 24h maturace Maturace probíhala po dobu 6 nebo 24 h při 37 C a 5 % CO 2. 58

Všechny varianty DC byly zamraženy na PM na -80 C až do izolace RNA. Výrobce Množství Aktivita IL-4 GM-CSF IFN- DNase I PeproTech PeproTech PROSPEC Roche 100 g 300 g 100 g 100 mg 5 x 10 6 U/mg 1 x 10 7 U/mg 5 x 10 6 U/mg 2000 U/mg Rekonstituce c = 0,1-1,0 mg/ml c = 0,1-1,0 mg/ml c = 100 g/ml c = 100 g/ml Ředění Zásobní koncentrace. Konečná koncentrace. Výrobce Množství Hanks Hanks Hanks Hanks 40 000 U/ml 100 000 U/ml (2000 ng/ml) (10 000 ng/ml) 400 U/ml 1000 U/ml (20 ng/ml) (100 ng/ml) 5000 ng/ml 10 mg/ml 50 ng/ml 0,1 mg/ml LPS TGF- 1 IL-10 L-Gln Calbiochem PeproTech PeproTech Invitrogen 5 mg 1 g 10 g Aktivita 2 x 10 7 U/mg 5 x 10 5 U/mg Rekonstituce Ředění Zásobní koncentrace. ph 3,0; c = 50 g/ml c = 0,1-1,0 mg/ml H 2 O Hank Hanks 20 000 ng/ml 200 ng/ml 1000 ng/ml 200 mm Konečná 200 ng/ml 2 ng/ml 1 ng/ml 2 mm koncentrace. Tab. 10: Příprava reagencií pro kultivaci a maturaci 4.2.2. Izolace RNA a provedení TLDA array Izolace RNA a TLDA a array byla provedena dle protokolu viz. kapitola: 4.1.3. a 4.1.4. 59

5. VÝSLEDKY 5.1. Studie A 5.1.1. Celkové výtěžky a čistota izolované RNA Celková RNA byla izolována z Treg a T norm 5ti pacientů s DM1 a 6ti zdravých dárců (viz Tab. 11). Koncentrace a čistota RNA byly měřeny pomocí přístroje NanoDrop ND-2000. Celková koncentrace izolované RNA se pohybovala v rozmezí 8,7-203,1 ng/μl. Čistota byla hodnocena na základě poměrů absorbancí A260/A280 a A260/A230. Medián čistoty měřené pomocí poměru A260/A280 byl 1,89. Integrita u náhodných vzorků RNA byla měřena pomocí čipů Agilent 2100, hodnoty RIN se pohybovaly v rozmezí 8-9,5. označení vzorku sort c (ng/ul) A260/A280 70ng/reakci 1 BC1 CD3+CD4+CD25-34,47 1,95 2,03 2 BC1 CD3+CD4+CD25+127-37,55 2,01 1,86 3 BC2 CD3+CD4+CD25-52,64 2,02 1,33 4 BC2 CD3+CD4+CD25+127-22,23 1,91 3,15 5 BC3 CD3+CD4+CD25-45 1,92 1,56 6 BC3 CD3+CD4+CD25+127-8,7 1,74 8,05 7 BC5 CD3+CD4+CD25-32,6 1,94 2,15 8 BC5 CD3+CD4+CD25+127-9,1 1,86 7,69 9 BC6 CD3+CD4+CD25-71,9 1,98 0,97 10 BC6 CD3+CD4+CD25+127-37,3 1,92 1,88 11 BC8 CD3+CD4+CD25-203,1 1,94 0,34 12 BC8 CD3+CD4+CD25+127-62,4 1,85 1,12 13 DIAB CD3+CD4+CD25-18,90 1,68 3,70 14 DIAB CD3+CD4+CD25+127-31,4 1,82 2,23 15 DIAB 45 CD3+CD4+CD25-102,3 1,93 0,68 16 DIAB 45 CD3+CD4+CD25+127-40 1,82 1,75 17 DIAB 47 CD3+CD4+CD25-123,3 1,88 0,57 18 DIAB 47 CD3+CD4+CD25+127-36,7 1,81 1,91 19 DIAB 53 CD3+CD4+CD25-34,8 1,94 2,01 20 DIAB 53 CD3+CD4+CD25+127-14,2 1,77 4,93 21 DIAB 53 CD3+CD4+CD25-20,1 1,83 3,48 22 DIAB 53 CD3+CD4+CD25+127-14,8 1,83 4,73 23 DIAB 54 CD3+CD4+CD25-131,7 1,9 0,53 24 DIAB 54 CD3+CD4+CD25+127-193,8 1,76 0,36 Tab. 11: Koncentrace, čistoty a ředění RNA použité ve studii A 60

Obr. 15: Analýza integrity RNA pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer, RIN = 9,2 5.1.2. Zpracování a analýza dat TLDA microrna array Relativní exprese 365 lidských mirna a 3 endogenních kontrol byly získány pomocí TaqMan Array Human MicroRNA Panel v 1.0. Hodnoty CT byly vypočítány pomocí programu 7900HT Version 2.3 Sequence Detection Systems (SDS 2.3). Exprese jednotlivých mirna byla dále normalizována prostřednictvím malé jaderné RNA RNU6B. Za účelem odlišit Treg pacientů s diabetem mellitu od Treg zdravých osob jsme provedli statistické vyhodnocení v programu Tiger (MultiExperiment Viewer, The institute for genomic research). Pomocí nepárové SAM (significance analysis of microarray) analýzy jsme nalezli zvýšenou expresi mir-510 (~100krát, p=0,05) a sníženou expresi mir-342 (~2krát, p<0,0001) a mir- 191 (~3krát, p=0,0079). Tab. 12, Obr. 16 1a,b,c). mirnas Treg ZD a* Treg DM1* p-hodnoty b hsa-mir-342 63,4 ± 0,88 31,83 ± 0,6 <0,0001 hsa-mir-191 18,97 ± 6,13 7,03 ± 1,55 0,0079 hsa-mir-510 0,01 ± 0,01 1,12 ± 0,72 0,05 hsa-mir-155 15,74 ± 5.28 7.84 ± 4.1 0.1 Tab. 12: Porovnání normalizované hladiny exprese mirna u Treg pacientů s DM1 a Treg zdravých kontrol. * Hladina exprese (střední hodnota ± SD) normalizovaná k RNU6B a Zdravé kontroly b Dle Mann-Whitney U-testu mezi 2 skupinami c Fold change = násobná změna 61

Obr. 16: Rozdílně exprimované mirna u Tregs DM1 pacientů a zdravých dárců. Dalším cílem naší studie bylo porovnat expresní profil Treg s konvenčními T lymfocyty pomocí párové SAM analýzy. Nalezli jsme signifikantně zvýšenou hladinu mir-146 u Treg oproti konvenčním T lymfocytům a 8 specifických mirna (mir-20b, -31, -99a, -100, -125b, -151, -335 a -365) se signifikantně sníženou hladinou u Treg (viz Tab. 13). Pomocí těchto 9 mirna a hierarchického klastrování jsme byli schopni rozlišit Treg od konvenčních T lymfocytů (viz Tab. 13 Obr. 17). 62

mirna Hladina v konvenčních T lymfocytech* Hladina v Treg p-hodnoty a FC b hsa-mir-31 6,29 ± 1,94 0,84 ± 0,63 0,000008-7,50 hsa-mir-151 0,71 ± 0,3 0,15 ± 0,07 0,000131-4,72 hsa-mir-335 0,32 ± 0,13 0,09 ± 0,08 0,000168-3,68 hsa-mir-125b 1,65 ± 0,96 0,1 ± 0,1 0,000286-15,91 hsa-mir-20b 0,42 ± 0,24 0,10 ± 0,08 0,000964-4,28 hsa-mir-99a 0,97 ± 0,58 0,17 ± 0,16 0,001298-5,67 hsa-mir-100 0,83 ± 0,51 0,11 ± 0,15 0,001441-7,87 hsa-mir-365 0,55 ± 0,31 0,14 ± 0,09 0,001830-3,89 hsa-mir-146a 13,33 ± 7,61 112,82 ± 59,70 0,000426 8,46 Tab. 13: Rozdílně exprimované mirna u Treg v porovnání s konvenčními T lymfocyty. * Hladina exprese (střední hodnota ± SD) normalizovaná k RNU6B a Dle párového t-testu b Fold change = násobná změna Obr. 17: Porovnání expresních profilů mirna u Treg a konvenčních T lymfocytů. 63

5.1.3. Validace vybraných dat pomocí jednotlivých mirna esejí A) Rozdílná exprese mezi Treg diabetiků a Treg zdravých dárců Na nezávislém souboru 4 pacientů s diabetem a 4 zdravých dárců jsme validovali vybrané mirna. Expresi mir-191, mir-342 a mir-510 jsme porovnávali mezi Treg zdravých dárců a Treg pacientů s diabetem melitu. Pro zjištění signifikance mezi těmito dvěma soubory jsme použili nepárový t-test. Jelikož jsme pomocí TLDA array naměřili vyšší hladiny mir-155 u Treg zdravých dárců oproti Treg diabetiků, a i když toto pozorování nebylo signifikantní, z důvodu významnosti této mirna v imunitním systému jsme se ji rozhodli také validovat na nezávislém souboru vzorků. MiR-155 a mir-510 byly signifikantně sníženy u Treg pacientů s diabetem melitu (p=0,0114 a p=0,0178), u mir-342 a mir-191 jsme potvrdili trend snížené hladiny u Treg diabetiků (viz Tab. 14, Obr. 18, 19, 20, 21). mirnas Treg BC a* Treg DM1* p- hodnoty b has-mir-155 13,40 ± 1,414 5,520 ± 1,674 0,0114 hsa-mir-342 95,93 ± 53,73 23,19 ± 8,935 0,2301 hsa-mir-191 29,80 ± 16,57 3,532 ± 1,069 0,1646 hsa-mir-510 0,009685 ± 0,001578 N=4 0,004538 ± 0,0001924 0,0178 Tab. 14: Porovnání normalizované hladiny exprese mirna u Treg pacientů s DM1 a Treg. zdravých kontrol validační fáze * Hladina exprese (střední hodnota ± SD) normalizovaná k RNU6B a Zdravé kontroly b Dle nepárového t-testu mezi 2 skupinami 64

Obr. 18: Rozdílně exprimovaná mir-155 u Tregs DM1 pacientů a zdravých dárců. Obr. 19: Rozdílně exprimovaná mir-510 u Tregs DM1 pacientů a zdravých dárců. 65

Obr. 20: Rozdílně exprimovaná mir-191 u Tregs DM1 pacientů a zdravých dárců. Obr. 21: Rozdílně exprimovaná mir-342 u Tregs DM1 pacientů a zdravých dárců. B) Rozdílná exprese mezi Treg a konvenčními T lymfocyty Na základě statistické signifikance (p hodnota, násobná změna fold change) a předchozích záznamů na PubMed jsme vybrali 3 mirna pro další validaci. MiR-31 a mir-125b sníženě exprimované v Treg oproti konvenčním T lymfocytům, a mir-146 v Treg zvýšeně exprimovanou oproti konvenčním T lymfocytům. Pro validaci jsme použili nezávislý soubor 8 párových vzorků. Pro stanovení statistické signifikance jsme použili párový Wilcoxonův test. 66

Potvrdili jsme sníženou expresi u Treg pro mir-31 a mir-125b a zvýšenou expresi mir-146 u Treg(viz Tab. 15, Obr. 22, 23 a 24). mirna Hladina v konvenčních T lymfocytech* Hladina v Treg* p-hodnoty a hsa-mir-31 16,09 ± 11,48 1,475 ± 1,005 0,0078 hsa-mir-125b 2,307 ± 2,579 0,1742 ± 0,3156 0,0078 hsa-mir-146a 51,64 ± 45,86 235,2 ± 234 0,008 Tab. 15: Rozdílně exprimované mirna u Treg v porovnání s konvenčními T lymfocyty validace. * Hladina exprese (střední hodnota ± SD) normalizovaná k RNU6B a Dle párového Wilcoxon rank testu Obr. 22: Rozdílně exprimovaná mir-146 u Treg v porovnání s konvenčními T lymfocyty validace. 67

Obr. 23: Rozdílně exprimovaná mir-125b u Treg v porovnání s konvenčními T lymfocyty validace. Obr. 24: Rozdílně exprimovaná mir-31 u Treg v porovnání s konvenčními T lymfocyty validace. 68

5.2. Studie B 5.2.1. Izolace RNA Celková RNA byla izolována z dendritických buněk odvozených od 2 zdravých dárců. Aktivační a tolerogení DC byly kultivovány in vitro za pomoci různých maturačních koktejlů. Koncentrace a čistota RNA byly měřeny pomocí přístroje NanoDrop ND-2000. Celková koncentrace izolované RNA se pohybovala v rozmezí 219,53-424,43 ng/μl, Čistota byla hodnocena na základě poměrů absorbancí A260/A280. Medián poměru A260/A280 byl 1, 93. Integrita u náhodně vybraných vzorků RNA byla měřena pomocí čipů Agilent 2100, hodnoty RIN se pohybovaly v rozmezí 8-9,5. označení vzorku c (ng/ul) A260/A280 ředění 10x 100ng/reakci 1 DC 28 IL-10 TGFbeta 6hod 225,02 2,01 22,502 4,44 2 DC 28 IL-10 TGFbeta 24hod 267,95 2,02 26,795 3,73 3 DC 28 LPS IFN 6hod 254,53 1,91 25,453 3,93 4 DC 28 LPS IFN 24hod 211,52 1,92 21,152 4,73 5 DC 33 IL-10 TGFbeta 24hod 326,22 1,74 32,622 3,07 6 DC 33 0hod 304,64 1,94 30,464 3,28 7 DC 28 0hod 219,53 1,86 21,953 4,56 8 DC 33 IL-10 TGFbeta 6hod 351,52 1,98 35,152 2,84 9 DC 28 LPS IFN 6hod 378,51 1,92 37,851 2,64 10 DC 28 LPS IFN 6hod 424,43 1,94 42,443 2,36 Tab. 16: Koncentrace a čistoty izolované RNA. 5.2.2. Zpracování a analýza dat TLDA microrna array Relativní exprese 365 lidských mirna a 3 endogenních kontrol byly získány pomocí TaqMan Array Human MicroRNA Panel v 1,0. Hodnoty C T byly vypočítány pomocí programu 7900HT Version 2,3 Sequence Detection Systems (SDS 2,3). Exprese jednotlivých mirna byla dále normalizována prostřednictvím malé jaderné RNA RNU6B. MiRNA, které se mezi jednotlivými skupinami lišily více jak 2x větší expresí, byly schopné pomocí heat mapy a hierarchického klastrování v programu Tiger rozlišit jednotlivé skupiny mezi sebou. 69

Fold change log 2 scale mir-196b mir-7 mir-542-5p mir-429 mir-509 mir-659 mir-486 mir-17-3p mir-133b mir-95 mir-379 mir-203 mir-139 mir-30a-3p mir-9 mir-518e mir-449b mir-10a A) SROVNÁNÍ NEMATUROVANÝCH DC S TOLEROGENÍMI DC PO 6 A 24 HODINÁCH MATURACE Při porovnání nematurovaných DC a tolerogeních DC maturovaných v přítomnosti TGFβ po dobu 6 h bylo nalezeno 18 rozdílně exprimovaných mirna, přičemž 10 mirna mělo sníženou expresi v tolerogenních DC (mir-7, -542-5p, -429, -509, -659, -95, -9, -518e, -449b, -10a) a 8 zvýšenou expresi v tolerogenních DC (mir-196b, -486, -17-3p, -133b, -379, m-203, -139, -30a-3p) (viz Obr. 25). Po 24 h maturace se v tolerogeních DC zvýšila exprese u 9 mirna (mir-10a, -203, -449b, -618, - 210, -213, -218, -219, -518b) a snížila u 7 mirna (mir-509, -145, -596, -659, -134, -149, -214), (viz, Obr, 26). 3 2 1 0-1 -2-3 -4-5 -6-7 undcs toldcs Obr. 25: Porovnání exprese 18 mirna v nematurovaných a tolerogenních DC po 6 h maturace. 70

Fold change log 2 scale mir-218 mir-213 mir-203 mir-618 mir-210 mir-518b mir-10a mir-219 mir-659 mir-449b mir-596 mir-149 mir-509 mir-134 mir-145 mir-214 4 2 0-2 undcs toldcs -4-6 -8 Obr. 26: Porovnání exprese 18 mirna v nematurovaných a tolerogenních DC po 24 h maturace. 71

B) SROVNÁNÍ TOLEROGENÍCH DC S AKTIVAČNÍMI DC PO 6 A 24 HODINÁCH MATURACE Při porovnání aktivačních DC a tolerogeních DC maturovaných po dobu 6 h bylo nalezeno celkem 31 rozdílně exprimovaných mirna, z nichž pouze 4 vykazovaly sníženou expresi v tolerogeních DC (mir-155, -7, -9, -182), zbývajících 27 mirna (mir-133b, -17-3p, -148a, -199a, -379, -422b, -629, -130a, -214, -432, -487b, -194, -202, -23b, -596, let-7f, mir-100, -106b, -126, -134, -141, -148b, -29c, -362, -542-5p, -572, -576) bylo u tolerogeních DC v porovnání s aktivačními DC exprimováno zvýšeně (viz Obr, 27). Po 24 h maturace se v tolerogeních DC zvýšila exprese u 5 mirna ( mir-193b, -213, -221, -27a a -27b) a naopak snížila u 12 mirna (mir-125a, -130a, -135a, -147, -155, -210, -214, -215, -449, -7, -9 a -99b) (viz Obr, 28). 72

Fold change log 2 scale mir-155 mir-106b mir-29c let-7f mir-362 mir-100 mir-126 mir-148b mir-422b mir-182 mir-7 mir-148a mir-23b mir-130a mir-629 mir-133b mir-9 mir-194 mir-432 mir-17-3p mir-141 mir-199a mir-576 mir-596 mir-572 mir-134 mir-379 mir-214 mir-487b mir-202 mir-542-5p 14 12 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8 actdcs toldcs Obr. 27: Porovnání exprese 31 mirna v aktivačních a tolerogenních DC po 6 h maturace. 73

Fold change log 2 scale mir-155 mir-27a mir-221 mir-125a mir-210 mir-7 mir-9 mir-135a mir-99b mir-130a mir-27b mir-449 mir-193b mir-213 mir-214 mir-215 mir-147 15 10 5 actdcs toldcs 0-5 -10 Obr. 28: Porovnání exprese 17 mirna v aktivačních a tolerogenních DC po 24 h maturace. 74

C) SROVNÁNÍ NEMATUROVANÝCH DC S AKTIVAČNÍMI DC PO 6 A 24 HODINÁCH MATURACE Při porovnání nematurovaných DC s aktivačními DC maturovanými po dobu 6 h bylo nalezeno celkem 23 rozdílně exprimovaných mirna, z nichž pouze 6 vykazovalo zvýšenou expresi v aktivačních DC (mir-155, -7, -9, -182, -210 a -10a) a 17 mirna sníženou expresi u aktivačních DC (mir-134, -145, -379, -542-5p, -659, -429, -518f, -509, -127, -139, -214, -335, -518e, -565, -572, -576, -95) v porovnání s neovlivněnými DC (viz Obr, 29). Po 24 h maturace se v aktivačních DC snížila exprese u 9 mirna (mir-134, -145, -379, -542-5p, -149, -575, -489, -629 a -221) a naopak zvýšila u 20 mirna (mir-10a, -155, -182, -210, -7, -30a-3p, -133b, -203, -449b, -486, -9, -135a, -146a, -147, -181d, -193a, -194, -20b, -214, -99b) (viz Obr. 30). 75

Fold change log 2 scale mir-155 mir-565 mir-335 mir-7 mir-576 mir-542-5p mir-509 mir-182 mir-429 mir-572 mir-139 mir-379 mir-659 mir-518f mir-95 mir-134 mir-145 mir-9 mir-210 mir-518e mir-214 mir-127 mir-10a 14 12 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 -8 untreated DC 6h activated DC 6h Obr. 29: Porovnání exprese 23 mirna v aktivačních DC s neovlivněnými DC po 6 h maturace. 76

Fold change log 2 scale mir-146a mir-155 mir-221 mir-181d mir-193a mir-20b mir-629 mir-135a mir-7 mir-542-5p mir-99b mir-182 mir-194 mir-203 mir-149 mir-9 mir-133b mir-379 mir-486 mir-30a-3p mir-134 mir-145 mir-489 mir-9 mir-210 mir-575 mir-214 mir-449b mir-10a mir-147 15 10 5 undcs ActDCs 0-5 -10 Obr. 30: Porovnání exprese 29 mirna v aktivačních DC s neovlivněnými DC po 24 h maturace. 77