MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ

MASARYKOVA UNIVERZITA V BRNĚ Př írodově decká fakulta Disertač ní práce MODULACE FUNKČ NÍ AKTIVITY FAGOCYTŮ LÁTKAMI S PROZÁNĚ TLIVÝMI, PROTIZÁNĚ TLIVÝMI A ANTIOXIDAČ NÍMI ÚČ INKY Mgr. Lucie GALLOVÁ Brno 2006

Bibliografická identifikace Jméno a příjmení autora: Mgr. Lucie Gallová Název disertační práce: Modulace funkční aktivity fagocytů látkami s prozánětlivými, protizánětlivými a antioxidačními účinky Název disertační práce anglicky: The modulation of the functional activity of phagocytes by substances with pro-inflammatory, anti-inflammatory and anti-oxidant effects Studijní doktorský program: BIOLOGIE Studijní obor: IMUNOLOGIE Školitel: Doc. RNDr. Antonín Lojek, Csc. Rok obhajoby: 2006 Klíčová slova v češtině: fagocyty, cytokiny, reaktivní kyslíkové a dusíkové metabolity, zánět, oxidativní stres, antioxidanty Klíčová slova v angličtině: phagocytes, cytokines, reactive oxygen and nitrogen species, inflammation, oxidative stress, antioxidants

Mgr. Lucie Gallová, Masarykova univerzita v Brně, 2006

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala svému školiteli Doc. RNDr. Antonínu Lojkovi, CSc. za odborné vedení, předání cenných zkušeností a všestrannou podporu. Dále děkuji Mgr. Lukáši Kubalovi, Ph.D. za poskytnuté rady a možnost podílet se zajímavých projektů. Dále můj dík patří všem spolupracovníkům Laboratoře patofyziologie volných radikálů: Mgr. Martině Pavelkové, Ph.D., MVDr. Ivě Papežíkové, Ph.D., Lence Vystrčilové, Blance Panakové, RNDr. Haně Čížové, Ph.D. a RNDr. Milanu Čížovi, Ph.D. a studentům za ochotnou pomoc při praktickém řešení problémů a za vytváření přátelské atmosféry. A v neposlední řadě mé velké díky patří rodičům, prarodičům, sestře Petře, Šárce a její rodině a všem blízkým přátelům za lásku, podporu a trpělivost.

OBSAH SOUHRN 6 ABSTRACT 13 1. ÚVOD 19 1. 1. IMUNITNÍ SYSTÉM 19 1. 2. Role PROFESIONÁLNÍCH FAGOCYTŮ 19 1. 3. OXIDATIVNÍ VZPLANUTÍ 22 1. 3. 1. Reaktivní kyslíkové metabolity 22 1. 3. 2. Reaktivní dusíkové metabolity 1. 4. OXIDATIVNÍ STRES 24 26 1. 5. CYTOKINY 1. 6. ZÁNĚT 1. 6. 1. Zánětlivá odpověď 30 32 32 1. 6. 2. Role cytokinů v patologii onemocnění spojených s akut. a chron. zánětem 33 1. 6. 3. Systémová zánětlivá odpověď 34 1. 7. PŘEHLED TESTOVANÝCH CYTOKINŮ 36 1. 8. ANTIOXIDANTY 40 1. 8. 1. Rostlinné polyfenoly a jejich antioxidační účinky 42 1. 8. 2. Carvedilol a jeho antioxidační účinky 43 2. CÍLE A Č LENĚ NÍ PRÁCE 46 3. PŘ EHLED POUŽ ITÝCH METOD 48 4. VÝSLEDKY A DISKUSE 49 4. 1. IL-10 does not affect oxidative burst and expression of selected surfaced antigen on human blood phagocyte in vitro 49 4. 2. Dealcoholated red and white wines reduce the oxidative stress associated to inflammation in rats 60 4. 3. The infleunce of carvedilol on the production of reactive oxygen and nitrogen species by phagocytes 84 5. ZÁVĚ R 89 6. SEZNAM POUŽ ITÉ LITERATURY 92 7. Ž IVOTOPIS 103 8. SEZNAM PUBLIKACÍ A KONFERENCÍ 104 9. PŘ ÍLOHA 106 10. SEZNAM POUŽ ITÝCH ZKRATEK 122

SOUHRN Fyziologickou odpovědí organismu na stav ohrožení je místní prozánětlivá a systémová protizánětlivá reakce. Při narušení integrity, ať už jde o infekci či trauma, začne organismus mobilizovat nejprve složky přirozené imunity, kde ústřední úlohu vykonávají profesionální fagocyty. Zánětlivá reakce je spjata s tvorbou multifunkčních prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů a se změnami v metabolické aktivitě profesionálních fagocytů související se zvýšenou produkcí reaktivních kyslíkových (RKM) a dusíkových metabolitů (RDM). Na koncentraci a vzájemném poměru těchto regulačních a cytotoxických produktů aktivovaných fagocytů je závislý průběh a výsledek zánětlivé odpovědi. Koordinovaná zánětlivá reakce soustřeďuje potenciál obranných procesů do postiženého místa, čímž se snižuje riziko poškození ostatních tkání. Nicméně přechod prozánětlivých cytokinů, cytotoxických reaktivních metabolitů a často také patogenních mikroorganismů, z původně místního zánětlivého ložiska do celkové cirkulace je příčinou systémové zánětlivé odpovědi organismu (SIRS). SIRS je komplexní obrannou reakcí vytvářející podmínky pro přežití organismu při závažných infekčních chorobách, polytraumatech a po náročných chirurgických zákrocích. V organismu jsou vždy přítomné protizánětlivé a antioxidační systémy, které kontrolují průběh zánětlivé reakce a brání poškozování vlastních struktur. Nicméně v akutních stádiích, kdy invaze prozánětlivých a/nebo cytotoxických metabolitů převýší jejich kapacitní možnosti, nejsou schopny stávající situaci zvrátit a nastává nespecifická destrukce vlastních buněk a tkání. Zvýšená produkce volných RKM a RDM vede k narušení prooxidační/antioxidační rovnováhy ve prospěch oxidačních procesů tento stav je označován jako oxidativní stres. Oxidativní stres má důležitý vliv na celkový výsledek zánětlivé odpovědi. V poslední letech řada studií uvádí, že právě oxidativní stres hraje kritickou úlohu v patologii mnoha onemocnění. Mezi nejznámější choroby na jejichž iniciaci či rozvoji se podílí reaktivní metabolity (RM) patří ateroskleróza, kardiovaskulární a nádorová onemocnění, cukrovka, revmatoidní artritida, neurodegenerativní onemocnění, septický šok, plicní onemocnění či urychlené stárnutí a jiné. Nicméně kritická role fagocytů v zánětlivých procesech souvisí nejen se schopností produkovat cytotoxické RM, ale také regulační hormony - cytokiny. Cytokiny zastávají výhradní místo v iniciaci a kontrole zánětlivé reakce a to především regulačními mechanismy modulující aktivitu profesionálních fagocytů na různých úrovních. Dokonce existuje vzájemný vztah mezi hladinou cytokinů a výsledkem zánětlivé reakce. Lze tedy shrnout, že vhodná regulace metabolické aktivity profesionálních fagocytů by mohla být jedním z klíčových mechanismů, které by mohly vést k zamezení vzniku či rozvoji 6

SOUHRN oxidativního poškozování tkání a mohly být využity v prevenci a léčbě zánětlivých onemocnění spojených s oxidativním stresem. Předkládaná disertační práce je proto zaměřena na otázku modulace fyziologických a patofyziologických funkcí fagocytů vybranými prozánětlivými, protizánětlivými nebo antioxidačními substancemi v zánětlivých procesech. První část disertační práce se zabývá otázkou regulace aktivity krevních fagocytů vybranými prozánětlivými a protizánětlivými rekombinantními cytokiny in vitro. Rekombinantní cytokiny představují užitečné nástroje pro studium buněčné biologie imunitních a zánětlivých pochodů a jejich dostupnost otevírá řadu možností klinického použití při orgánových transplantacích, nádorových onemocnění a onemocnění spojených s poruchami imunity. Výběr cytokinů a jejich koncentrací byl odvozen z výsledků klinické studie. V naší práci jsme se zaměřili na objasnění mechanismu protizánětlivého účinku interleukinu-10 (IL-10) a jeho možné využití v imunomodulační terapii. Dále nás zajímala úloha prozánětlivých cytokinů: IL6, IL-8, tumor nekrotizující faktor alfa (TNFα) a jejich kombinované působení s IL-10. Protizánětlivé účinky IL-10 byly podrobněji sledovány na změně metabolické aktivity lidských fagocytů plné krve v přítomnosti/nepřítomnosti IL-6, IL-8, TNFα. V našich experimentálních podmínkách byly prokázány silné prozánětlivé vlastnosti TNFα již v časných inkubačních intervalech v případě spontánní chemiluminiscence (CL). Naopak po 2h inkubaci plné krve s TNFα nedošlo v žádné z testovaných koncentrací k významnému ovlivnění spontánní CL odpovědi. Tyto výsledky jsou v souladu s tvrzením, že TNFα patří mezi cytokiny akutní fáze zánětu, který je zodpovědný za iniciaci zánětlivé reakce, a proto se jeho účinky projevují velmi rychle. Ostatní testované cytokiny (IL-6, IL-8, IL-10) neovlivňovaly produkci RKM nestimulovaných neutrofilů. Naopak významné navýšení tvorby RKM bylo pozorováno po inkubaci IL-6, IL-8 nebo TNFα s fagocyty aktivovanými částicemi opsonizovaného zymozanu (OZP) nebo phorbol 12-myristát 13-acetátem (PMA). Stimulační účinky IL-6 a IL-8 na CL odpověď aktivovaných fagocytů se na rozdíl od TNFα projevily výrazněji až po delší inkubační době (2h). Získané výsledky podporují fakt, že priming fagocytů antigenním či jiným stimulem (INFγ, TNFα) má za následek mohutnější zánětlivou odpověď. Naopak, za fyziologických podmínek vyvolají tyto regulační molekuly pouze malou nebo žádnou odpověď fagocytů. 15-ti minutová inkubace krve s IL-10 v koncentračním rozmezí 400-1600 pg/ml nevyvolala statisticky významné změny CL aktivity neutrofilů aktivovaných OZP nebo PMA oproti kontrole. Předpokládané inhibiční vlastnosti IL-10 se neprojevily ani po 2 hodinách inkubace. Naopak, překvapivě byl pozorován statisticky významný nárůst produkce RKM při 2h inkubaci OZP-aktivovaných neutrofilů s IL-10 v koncentraci 1200 a 1600 pg/ml. Pro potvrzení výsledků CL metody a získání komplexnějších 7

SOUHRN informací byla použita metoda průtokové cytometrie. Tato metoda potvrdila, že TNFα je silný stimulátor intracelulární produkce RKM nestimulovanými i aktivovanými neutrofily a monocyty. IL-6 významně zvyšoval spontánní a OZP-aktivovanou CL odpověď neutrofilů a PMA-aktivovanou CL monocytů. Naopak, IL-10 nezpůsoboval změny ve spontánní ani aktivované produkci RKM neutrofilů a monocytů. Dalším mechanismem, kde mohou cytokiny významně modulovat aktivitu profesionálních fagocytů a jejich zapojení do zánětlivého procesu, je exprese povrchových antigenů zodpovědných za adhezi a migraci fagocytů do zánětlivého ložiska. Exprese povrchových molekul CD11b, CD15, CD62L, CD31 byla měřena na neutrofilech a monocytech metodou průtokové cytometrie. Cytokiny TNFα a IL-6 zvyšovaly expresi CD11b a CD15 a potlačovaly CD62L u obou buněčných typů. IL-8 významně zvyšoval expresi CD11b na neutrofilech a CD15 na neutrofilech a monocytech a neovlivňoval expresi CD62L. Protizánětlivý IL-10 nemodifikoval expresi žádného ze sledovaných povrchových antigenů. Exprese CD31 nebyla ovlivněna žádným z testovaných cytokinů. Avšak buňky jsou jen zřídka vystaveny působení pouze jednoho cytokinu a mnohem pravděpodobněji odpovídají na více synergicky a/nebo antagonisticky působících cytokinů a dalších bioaktivních molekul. Pro získání realističtějšího obrazu o komplexním působení cytokinů byly v našich experimentech analyzovány kombinované účinky cytokinů. Byla testována simultánní inkubace IL-10 s jednotlivými prozánětlivými cytokiny. IL-10 při simultánní inkubaci neměl žádný efekt na stimulační účinky prozánětlivých cytokinů na produkci RKM a expresi povrchových antigenů. Ani 60-ti minutová preinkubace krve s IL-10 neprokázala dostatečnou kapacitu inhibovat či alespoň snížit produkci RKM a expresi povrchových receptorů stimulovanou prozánětlivými cytokiny ve srovnání s analogickými vzorky, které nebyly preinkubovány s IL-10. Výsledky této studie objasňují mechanismus protizánětlivého působení IL-10 na úrovni produkce RKM a exprese adhezivních molekul v časných stádiích. Získané výsledky svědčí o tom, že IL-10 nepřímo kontroluje aktivitu krevních fagocytů. Dále nám tato studie přináší lepší informace o úloze IL-6, IL-8 a TNFα v regulaci aktivity fagocytů v zánětlivých procesech. V oblasti léčby řady zánětlivých onemocnění začala být v posledních letech věnována velká pozornost účinkům rostlinných polyfenolů a jejich možnému terapeutickému využití. Tyto látky jsou obsaženy v zelenině, ovoci, čaji a v hojné míře ve víně a jako takové jsou součástí běžného jídelníčku. Skladba jídelníčku s vyšším obsahem tuků, sacharidů a vůbec životní styl ve středomořských zemí je do jisté míry blízký životnímu stylu v České republice. Nicméně i přes tuto podobnost je v těchto zemích mnohem nižší výskyt kardiovaskulárních onemocnění. Tento jev je obecně označován jako francouzský paradox a je pravděpodobné, že 8

SOUHRN významnou roli sehrává právě konzumace vína, která je v těchto středomořských zemích vyšší. Většina prospěšných účinků umírněné konzumace vína je přisuzována vlastnostem polyfenolů, kam patří: taniny, 3-hydroxystilbeny, fenolové kyseliny a flavonoidní látky, zejména pak quercetin, catechin a epicatechin. Řada studií uvádí, že polyfenolické látky prokazují antioxidační a protizánětlivé aktivity, které udržují organismus ve zdraví a je možné je využít v prevenci kardiovaskulárních a nádorových onemocnění. Nicméně existují jen omezené informace o mechanismu těchto prospěšných účinků, distribuci v organismu, metabolismu a exkreci těchto látek. Druhá část disertační práce byla proto věnována studiu účinků polyfenolických látek a jejich úloze v modulaci oxidativního stresu spojeného se zánětem. Hlavní cílem této části bylo sledovat možné prospěšné antioxidační a protizánětlivé účinky umírněné konzumace vína související s vyšším obsahem polyfenolických složek v červeném a bílém víně. Abychom vyloučili možné ovlivnění výsledků etanolem, bylo v experimentech použito dealkoholizované červené (dealcoholated red wine - DRW) a bílé (dealcoholated white wine - DWW) víno. Po dobu 15 dnů byla potkanům podávána jedna z následujících diet; (a) dieta obohacená o 35% (v.v-1) (DRW), (b) dieta obohacená o 35% (v.v-1) (DWW) a (c) kontrolní dieta. V naši studii bylo využito snadno hodnotitelného zánětlivého modelu granuloma pouch indukovaného carrageenanem, ve kterém je zánětlivý proces spojený s oxidativním stresem. Vzhledem k tomu, že antioxidační mechanismy se uplatňují různými cestami bylo k objasnění podstaty mechanismu účinků využito více rozdílných metod poskytující komplexnější informace o cestě působení testovaného antioxidantu. Granulomatózní tkáň a exudát bohatý na polymorfonukleární leukocyty (PMNL) byly využity pro analýzu zánětlivého procesu. Byla měřena hmotnost zánětlivé tkáně granulomu; objem, osmolarita, obsah proteinů a koncentrace prostaglandinu E2 v exudátu, dále počet PMNL v exudátu, aktivita a exprese inducibilní syntázy oxidu dusnatého (inos) a produkce superoxidu a oxidu dusnatého těmito buňkami ex vivo. Dále byly v plazmě a exudátu analyzovány parametry oxidativního stresu: celková antioxidační kapacita (total antioxidant status - TAS), lipidová peroxidace (thiobarbituric acid reactive substances - TBARS), koncentrace dusitanů a poměr citrulinu/argininu. Nejprve byly testovány vlastnosti dealkoholizovaného vína a jejich antioxidační aktivita v chemických systémech. Chromatografickou metodou bylo potvrzeno, že proces dealkoholizace nezpůsobil žádné změny v celkovém obsahu polyfenolických látek, kterých bylo nalezeno významně více v DRW než DWW (8.64 mm vs. 1.82 mm). Dále bylo prokázáno, že již samotné dealkoholizované víno je silným vychytávačem volných radikálů generovaných chemickými systémy (superoxid, peroxylový radikál, oxid dusnatý). Vychytávací schopnost DRW byla 9

SOUHRN shledána významně vyšší než DWW; v případě oxidu dusnatého dokonce až 12-krát vyšší. Následkem zvýšeného obsahu fenolů u skupin potkanů, kterým byla podávána dieta obohacená o dealkoholizované víno byly některé parametry oxidativního stresu v plazmě i zánětlivém exudátu redukovány. Tyto prospěšné účinky neměly však příčinu v působení kyseliny askorbové, ale byla způsobena antioxidačními vlastnostmi plazmy a exudátu. Tento fakt svědčí o tom, že polyfenoly nebo jejich metabolity si zachovávají dostatečnou aktivitu in vivo. Objemy exudátu, osmolarita a koncentrace proteinů v exudátu byly shledány u všech tří dietetických skupin potkanů obdobné. Celkový obsah proteinů byl daný objemem zánětlivého exudátu. Infiltrace a akumulace leukocytů v postiženém místě je základním mechanismem zánětlivé reakce a je pozoruhodné, že počet PMNL v zánětlivém exudátu byl významně redukován: o 36% u DRW skupiny, o 44% u DWW skupiny. Infiltrace leukocytů je ovlivňována různými faktory zahrnující superoxid a oxid dusnatý. PMNL získané z exudátu u DRW-, DWW-skupin potkanů vykazovaly významnou redukci tvorby superoxidu (50%) a masivní nárůst produkce oxidu dusnatého (200%) při jejich aktivaci PMA ex vivo. Nadbytek produkce superoxidu v kontrolní skupině potkanů pravděpodobně indukoval oxidativní stres, zatímco nadbytek produkce oxidu dusnatého u DRW- a DWW-skupiny má pravděpodobně protizánětlivý účinek, což může vysvětlovat tendenci snižování objemu exudátu a významnou redukci počtu PMNL. Navíc někteří autoři uvádí, že superoxid podporuje infiltraci leukocytů a oxid dusnatý naopak zabraňuje migraci PMNL do postiženého místa in vitro i in vivo. Je tedy pravděpodobné, že jak snížená produkce superoxidu tak zvýšená tvorba oxidu dusnatého aktivovanými PMNL hraje důležitou úlohu v regulaci počtu buněk v zánětlivém místě. Zvýšená koncentrace oxidu dusnatého byla potvrzena výsledky o zvýšeném poměru Lcitrulinu/L-argininu. Masivní nárůst tvorby oxidu dusnatého je indukován inos jejíž exprese a aktivita byla významně zvýšena u DRW-, DWW-skupin oproti kontrole. Dále byl v naší studii pozorován výrazný nárůst hladiny prostaglandinu E2 v exudátu, což pravděpodobně souvisí se zvýšenou expresí a aktivitou cyclooxygenázy 2 (COX2) jako následek vysoké koncentrace oxidu dusnatého. Salvemini et al. dospěl také k podobným závěrů. Je známo, že oxid dusnatý přímo reaguje s alkoxylovými a peroxylovými radikály, čímž zamezuje propagaci řetězové reakce lipidové peroxidace. Také v naší studii byly hodnoty TBARS v plazmě i exudátu DRW-, DWW-skupin potkanů shledány statisticky významně redukovány. Koncentrace dusitanů+dusičnanů v plazmě a exudátu byla natolik vysoká, že přesahovala vychytávací kapacitu obsažených polyfenolů. Nepoměr naměřených parametrů oxidativního stresu v plazmě a exudátu naznačuje, že zánětlivé buňky byly aktivovány zánětlivými mediátory přítomnými in situ. Je pravděpodobné, že polyfenoly jsou inkorporovány do zánětlivých 10

SOUHRN buněk, čímž mohou modulovat expresi a aktivitu enzymů důležitých při oxidativním stresu a zánětlivých procesech, které byly v práci také měřeny. Výsledky získané z této studie poskytují informace o tom, že nealkoholové složky vína nejenom, že zlepšují antioxidační status v místě zánětu, ale také omezují infiltraci buněk do zánětlivého ložiska pravděpodobně cestou zvýšené produkce oxidu dusnatého. Tyto mechanismy by mohly být jedním z hlavních vysvětlení k pochopení preventivních účinků polyfenolických látek v zánětu. Třetí část předkládané disertační práce je zaměřena na studium vztahu carvedilolu a metabolické aktivity krevních fagocytů, objasnění antioxidačních aktivit carvedilolu a jeho možné využití v léčbě a prevenci některých onemocnění spojených s oxidativním stresem. Kardiovaskulární onemocnění jsou řazena k nejčastějším příčinám morbidity a jsou největším zdrojem hospitalizace pacientů vyžadující dlouhodobou léčbu. V České republice zapříčiňují kardiovaskulární choroby více než 50% úmrtí. Léčba těchto onemocnění je však nezřídka kdy spojena s podáváním více léků z různých farmakologických skupin, čímž narůstá riziko vedlejších účinků a negativní interakce podávaných farmak. Tento problém by mohl být částečně vyřešen zavedením carvedilolu do léčebného procesu. Carvedilol je jedinečné kardiovaskulární léčivo s multifaktoriálním terapeutickým potenciálem. Hlavním účinkem carvedilolu je blokace membránových (β1, β2, α1) adrenergních receptorů. Nicméně z farmakologického hlediska je carvedilol vybaven řadou dalších účinků tj. vazodilatační, antihypertenzní, antiaterogenní, antihypertrofní nebo antiischemické. Všechny tyto účinky jsou více či méně spjaty se silnou antioxidační kapacitou carvedilolu. Díky těmto schopnostem je cavedilol vhodný pro léčbu srdečních onemocnění, hypertenze, anginy pectoris dále slouží jako přídatné kardioprotektivum, zejména během ischemie/reperfuze. Ischemicko-reperfuzní poškození tkáně je složitý proces, ve kterém klíčovou úlohu sehrávají krevní fagocyty. Oxidativní stres odvozený od fagocytů a indukovaný RKM a RDM je významným induktorem zánětu a je zahrnut v patologii řady onemocnění zejména kardiovaskulárního systému. Aktivované neutrofily mohou agregovat a ucpávat mikrocévní oblasti. Také samotná adherence aktivovaných neutrofilů na cévní endotel může způsobit porušení cévní stěny toxickým působením RKM. Nicméně mechanismus antioxidačního působení carvedilolu na krevní fagocyty a jeho vliv na tvorbu RKM a RDM nejsou doposud zcela objasněny. Hlavním cílem této části bylo sledovat schopnost aktivovaných profesionálních fagocytů produkovat RKM a RDM po ovlivnění carvedilolem in vitro. V naší studii byla antioxidační aktivita carvedilolu (100µM 0.1µM) testována na různých buněčných modelech. Krevní fagocyty laboratorního potkana byly použity jako model pro sledování produkce RKM a buněčná linie myších makrofágů (RAW 246.7) pro studium exprese inos a produkce oxidu dusnatého. V naší studii 11

SOUHRN carvedilol snižoval v koncentrační závislosti produkci RKM detekovanou jako chemiluminiscenční aktivitu nestimulovaných, ale také aktivovaných krevních fagocytů. Koncentrace carvedilolu nižší než 1µM neměly žádný efekt na metabolickou aktivitu krevních fagocytů. Kvalita inhibičního efektu carvedilolu je závislá na typu použitého aktivátoru: OZP, PMA, vápníkový ionofor A23187 (Ca-I), N-formyl-L-metionyl-L-leucyl-phenylalanin (fmlp). K podobným výsledkům dospěli Dandona et al., Asbrink et al., kteří v experimentech se zvířaty pozorovali významný pokles produkce superoxidu. Naše výsledky dále ukázaly, že kromě přímé schopnosti vychytávat volné radikály196 se na antioxidačním účinku carvedilolu podílí též schopnost carvedilolu modulovat aktivaci NADPH oxidázy. Další důležitou skupinou RM, která ochotně reaguje s RKM za tvorby vysoce reaktivních produktů např. peroxynitritu, jsou RDM. Proto pokud chceme získat celkový obrázek antioxidační účinnosti carvedilolu je vhodné monitorovat též jeho vliv na tvorbu RDM. V předkládané studii byla sledována koncentrace dusitanů a exprese inos, jako nepřímých ukazatelů tvorby oxidu dusnatého. Koncentrace dusitanů byla po 24-hodinové inkubaci makrofágů s carvedilolem (100µM) zcela redukována oproti kontrolnímu vzorku (0.83 ± 0.47µM NO2-/ 2*106 buněk vs. kontrola: 54 ± 1.0µM NO2-/ 2*106 buněk). Carvedilol v koncentaci 10µM měl slabý inhibiční efekt na produkci dusitanů (49.82 ± 1.06µM NO2-/ 2*106 buněk). Tyto výsledky byly ve shodě s výsledky získanými Western-blot analýzou, kde totální inhibice exprese inos byla pozorována jen v případě 24h inkubace makrofágů s 100µM carvedilolem. Získaná data blíže charakterizují mechanismus antioxidačního účinku carvedilolu na produkci RKM krevními fagocyty. Dále z naší studie vyplývá, že carvedilol může ovlivňovat celkovou chemiluminiscenční aktivitu fagocytů cestou inhibice inos a tvorby RDM. 12

ABSTRACT The localized and systemic inflammatory reactions are considered physiological responses to injury. For instance, the early physiological response to infections includes activation of the innate immunity with professional phagocytes playing crucial role in this process.1 Inflammatory reaction is associated with production of pro-inflammatory and antiinflammatory cytokines 2 and with changes in metabolic activities of professional phagocytes producing reactive oxygen (ROS) and reactive nitrogen species (RNS).3 The severity and outcome of the inflammatory reaction is dependent on the ratio and balance of these cytotoxic products. The goal of this process is to localize the inflammatory reaction and prevent unnecessary tissue damage. However, the release of inflammatory cytokines and pathogenic microorganisms into the circulation induce the systemic inflammatory response (SIRS).4 The SIRS then provides a complex defense mechanism against severe infections, injuries and facilitate recovery after complicated surgeries. The presence of anti-inflammatory and anti-oxidative systems influences the course of inflammatory reaction and prevents tissue injury. However, the invasion of pro-inflammatory and/or cytotoxic metabolites in acute stages of infection might overwhelm the capacity of the above defense systems and unspecific destruction of cells and tissues might occur. 5 The increased production of ROS and RNS disturbs the pro-inflammatory and anti-inflammatory balance resulting in an oxidative stress. The oxidative stress influences the outcome of the inflammatory reaction.6,7 and play crucial role in pathology of many diseases.8,9 For instance, cardiovascular, neurodegenerative, pulmonary and cancer diseases, such as atherosclerosis, diabetes, rheumatoid arthritis, septic shock and premature aging are examples of disorders that include oxidative stress in their etiology.10-13 The critical role of phagocytes during inflammation includes producing cytotoxic reactive metabolites and regulatory hormones called cytokines. Cytokines play a crucial role in controlling inflammatory reaction via various mechanisms modulating activity of professional phagocytes on various levels. There is a relationship between levels of cytokines and the outcome of the inflammatory reaction. In summary, influencing the metabolic activity of professional phagocytes might be considered as a promising mechanism that might be utilized for prevention and treatment of oxidative tissue injury associated with oxidative stress. Thus the objective of this dissertation project was to investigate the modulation of physiological and pathophysiological roles of professional phagocytes using selected pro- inflammatory, anti- inflammatory and anti-oxidative molecules in inflammatory processes. The regulation of activity of blood phagocytes with selected recombinant pro- inflammatory and anti-inflammatory cytokines in vitro was investigated. Recombinant cytokines provide useful tools for studying cell biology of immune and 13

ABSTRACT inflammatory processes. In addition, their availability enables clinical application in organ transplantations, treatment of neoplasm and immune disorders. The selection of cytokines in our investigations was based on published clinical studies.14,15 We investigated the antiinflammatory mechanism of interleukin-10 (IL-10) and evaluated its potential for immunomodulative therapies. Furthermore, we studied the role of pro-inflammatory cytokines: IL-6, IL-8, tumor necrosis factor alpha (TNFα) and their relationship with IL-10. The antiinflammatory effects of IL-10 were evaluated using human phagocytes in the whole blood in presence and/or absence of IL-6, IL-8 and/or TNFα. In our experiments, TNFα induced a strong inflammatory response at early time points detected as spontaneous CL. On the other hand, two-hour incubation of the whole blood with TNFα did not produce any significant increase of CL. This is in accord with previously published reports indicating TNFα as cytokine of the acute phase of inflammation initiating inflammatory reaction. Other tested cytokines (IL-6, IL-8, IL-10) did not influence the production of ROS with unstimulated neutrophils. On the other hand, IL-6, IL-8 or TNFα increased formation of ROS in phagocytes activated by opsonized zymosan (OZP) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). In contrast to TNFα, the stimulatory effects of IL-6 and IL-8 detected as increased CL were apparent after longer 2-hr incubation. Our data are supported by the fact that priming of phagocytes using antigenic or other stimuli (INFγ, TNFα) results in the increased inflammatory response. Under physiological conditions, these stimulies cause only small if any increase of production of reactive metabolites by phagocytes. The incubation of blood with IL-10 at concentrations 400-1600 pg/ml for 15 minutes did not increase CL activity of neutrophils activated by OZP or PMA. In addition, anticipated inhibitory properties of IL10 were not observed even after 2-hr incubation. Interestingly, a significant increase of ROS was observed after 2-hr incubation of OZP- activated neutrophils with IL-10 at concentrations 1200 and 1600 pg/ml. These results were confirmed using flow cytometric method. This method also confirmed that TNFα is a strong stimulator of intracellular production of ROS in unstimulated and activated neutrophils and monocytes. IL-6 increased spontaneous and OZP-activated CL response in neutrophils and PMA-activated monocytes. On the other hand, IL-10 did not display any significant influence on spontaneous and activated production of ROS in neutrophils and monocytes. Cytokines also modulates activities of professional phagocytes in inflammation via the expression of adhesive molecules that regulate adhesion and migration of phagocytes to the center of the inflammation. Thus we measured the expression of surface antigens CD11b, CD15, CD62L and CD31 in neutrophils and monocytes using flow cytometry. The treatment of both cell types with TNFα and IL-6 increased the expression of CD11b and 14

ABSTRACT CD15 and decreased CD62L. Although, IL-8 significantly increased the expression of CD11b and CD15 the levels of CD62 were not changed. The treatment of neutrophils or monocytes with anti-inflammatory IL-10 did not influence the expression of any of the tested antigens. Furthermore the expression of CD31 remained unchanged after treatment with TNFα, IL-8, IL6 or IL-10. Since the cells in vivo are rarely exposed to only a single cytokine, the investigation of mixtures of synergistic and/or antagonistic cytokines and other biomolecules is important. Thus we studied the relationship of IL-10 with other pro-inflammatory cytokines. In our experimental conditions, simultaneous incubation of IL-10 with individual pro-inflammatory cytokines did not influence their stimulatory effects on the production of ROS and the expression of surface antigens. In addition, even the 60-min pre-incubation blood with IL-10 (1200 pg/ml) did not affect the stimulatory effects of pro-inflammatory cytokines (1200 pg/ml) on ROS production and the expression of surface antigens. Our results contribute to understanding of the antiinflammatory mechanisms of IL-10 via influencing phagocytes in acute stages. The obtained results suggest that IL-10 does not directly control blood phagocyte activation. These results also provide better information about the contribution of IL-6, IL-8 and TNFα to the regulation of blood phagocyte-mediated inflammatory processes. Recently, plant polyphenols have been studied for their potential to treat inflammatory diseases. Polyphenols found in vegetables, fruits, tea and at high levels also in wines are part of a common diet. Although the diet with higher content of fat, carbohydrates and life style in the Czech Republic is quite similar to Mediterranean diet and life style, the incidence of cardiovascular diseases is much higher. This observation is called the French paradox and is attributed to higher consumption of red wine in Mediterranean countries. The beneficial health effects of wine it credited to polyphenols such as tanins, 3-hydroxystilbens, phenolic acid and flavonoids namely quercetin, catechin and epicatechin. A variety of studies document antioxidantive and anti-inflammatory effects of polyphenols that are thought to be beneficial for prevention of cardiovascular diseases and cancer.18,19 Nevertheless, there is only limited understanding of mechanism of action of polyphenols, their distribution, metabolism and excretion. Therefore, the objective of the second part of this dissertation was to evaluate the beneficial anti-oxidative and anti-inflammatory effects associated with higher content of plyphenols in red and white wine. To eliminate the effect of ethanol, we have used dealcoholated red (DRW) and white wine (DWW), respectively. Groups of rats were fed with (a) diet supplemented with 35% (v/v) DRW, (b) diet supplemented with 35% (v/v) DRW and (c) control diet for 15 days. In the present work, we have used the carrageenan-induced granuloma 15

ABSTRACT in rats as a model in which inflammation and oxidative stress are associated and easily evaluated.20 Because of variety of anti-oxidative mechanisms, we have used multiple methods to evaluate the action of DRW and DWW. The granuloma tissue and exudate rich in polymorphonuclear leukocytes (PMNL) were collected. We weighed granulomas, and measured volume, osmolarity and protein content in the exudates. Furthermore we analyzed the concentration of prostaglandin E2 and PMNL counts in exudates. The activity and the expression of inducible nitric oxide synthase (inos) and the production of superoxide and nitric oxide by PMNL were detected ex vivo. The plasma and exudates were also analyzed for parameters of oxidative stress such as the total antioxidant status (TAS), lipid peroxidation (thiobarbituric acid reactive substance TBARS), and measuring the concentration of nitrites and ratios citrulin/arginine. First, the anti-oxidative activity of dealcoholated wines were tested in chemical systems. We have confirmed using chromatography that the content of polyphenols in DRW (8.64mM) and DWW (1.82mM) was not affected during the evaporation of alcohol. Furthermore, the DRW and DWW scavenged free radicals generated using chemical systems (superoxide, peroxyl radical, nitric oxide). The scavenging activity of DRW was significantly higher than DWW (e.g.12-fold for nitric oxide). In rats, the parameters of oxidative stress were also significantly reduced in both plasma and exudate. Since these effects were caused by anti-oxidative action of plasma and exudates and not via ascorbic acid, the polyphenols and their metabolites are active in vivo. Similar volume of exudate and osmolarity and protein concentration in exudate were observed in the three groups of rats and the total protein content in the exudate was a reflect of their volume. However, the numer of cells in the inflammatory exudate was reduced by 36% and 44% in rats fed DRW- and DWW-diets, respectively. The infiltration of PMNL is affected by many factors including nitric oxide and superoxide. In our study, isolated PMNL from exudates in DRW and DWW treated animals showed a significant decrease of superoxide formation (50%) and increased production of nitric oxide (200%) ex vivo. The overproduction of superoxide in control group most likely induced oxidative stress. On the other hand, the increased production of nitric oxide in DRW and DWW treated animals had anti-inflammatory effect and could explain the trend in small reduction of exudates and reduction of PMNL counts. This is also supported by results published in the literature. 21,22 Thus it is probable plausible that the decreased production of superoxide and increased production of nitric oxide by activated PMNL play an important role in regulation of number of inflammatory cells in the exudates. In addition, the increased ratio citrulin/arginine (parameter of oxidative stress) in DRW and DWW treated animals also supports the increased concentration of nitric oxide. The 16

ABSTRACT increased production of nitric oxide corresponds to increased expression and activity of inos in treated animals. The significant increase of prostaglandin E2 in the exudates of treated animals is likely associated with increased expression and activity of cyclooxygenase 2 (COX2) as consequence of high concentration of nitric oxide. These observations are in according with published data.23 It is known that nitric oxide reacts with alkyl and peroxyl radicals prohibiting the propagation of lipid peroxidation.24 In our study, the TBARS values in plasma and exudates were statistically reduced in DRW and DWW treated animals. The concentration of nitrits and nitrates in plasma and exudates exceeded the scavenging capacity of polyphenols. The difference between parameters of oxidative stress in plasma and exudate suggests that inflammatory mediators present in situ activate inflammatory cells. It is also possible that polyphenols are incorporated into inflammatory cells and modulate the expression of enzymes involved in the oxidative stress and the inflammation. Our studies suggest that non-alcoholic components of wine improve anti-oxidative status during the inflammation and limit infiltration of cells into center of inflammation likely via increased production of nitric oxide. These mechanisms might provide the explanation of preventative effects of polyphenols in inflammation. The objective of the third part of the dissertation was to investigate influence of carvedilol on the metabolic activities of phagocytes and contribute to elucidation of anti-oxidative activities of carvedilol including its potential for treatment or prevention of cardiovascular diseases associated with oxidative stress. Cardiovascular diseases are most prevalent cause of morbidity and long-term hospitalization. In the Czech Republic, the cardiovascular diseases are recognized as causing 50% of all mortalities. The therapy of cardiovascular diseases consists of complex pharmaco-therapeutic modalities increasing risk of side effects and drug-drug interactions. The introduction of carvedilol into therapy could potentially reduce these problem.25 Carvedilol possess multifactorial therapeutic potential.26-28 The main mechanism of action of carvedilol is attributed to blocking adrenergic receptors β1, β2, α1.29,30 Carvedilol has vasodilatatory, antihypertensive, antiatherogenic, antihypertrophic and antiischemic effects. All these effects are more or less associated with its strong anti-oxidative capacity. Therefore, carvedilol is suitable for treatment of cardiovascular disorders such as hypertension and agina pectoris,31 and as cardioprotectant during ischemia and/or reperfusion.25 Ischemic-reperfusion tissue injury is a complex process where phagocytes play a crucial role. Phagocyte-derived oxidative stress associated with the production of ROS and RNS participates in pathology of various diseases including cardiovascular disorders. Aggregated activated neutrophils might occlude capillaries. In addition, the adhesion of activated neutrophils to vascular endothelium 17

ABSTRACT might cause vascular damage via ROS.32 Nevertheless, the mechanism of anti-oxidative effects of carvedilol on blood phagocytes and its influence on ROS and RNS production are not fully understood. Thus the main research objective was to investigate the influence of carvedilol (100µM 0.1µM) on the ability of activated professional phagocytes to produce ROS and RNS in various cell models in vitro. The production of ROS was measured in rat blood phagocytes and RNS was detected in mouse macrophage cell line (RAW 246.7) as the expression of inos and the production of nitric oxide. Carvedilol exhibited a dose dependent decrease of ROS production detected as chemiluminescent activity of unstimulated and activated blood phagocytes at concentrations greater than 1µM. The type of activator used in our studies influenced the quality of the response: OZP, PMA, calcium ionophore A23187 (Ca-I), Nformyl-L-metionyl-L-leucyl-phenylalanine (fmlp). Similar findings were published in case of superoxide.33,34 Our results show that besides the direct radical scavenging activity, carvedilol also exerts its anti-oxidative effects via influencing the activation of NADPH oxidase. Other RM that readily react with ROS forming highly toxic and reactive metabolites i.e. peroxynitrite are RNS. Therefore, our evaluation of anti-oxidative properties of carvedilol also included monitoring the formation of RNS via the expression of inos as an indirect measure of nitric oxide production. The incubation of macrophages with 100µM carvedilol for 24 hrs significantly reduced concentration of nitric oxide (0.83 ± 0.47µM NO2-/ 2*106 cells vs. control 54 ± 1.0µM NO2-/ 2*106 cells). There was only a slight reduction at 10µM carvedilol (49.82 ± 1.06µM NO2-/ 2*106 cells). This is in line with the total inhibition of inos protein levels after 24 hr incubation with 100µM carvedilol detected using the Western blotting analysis. Our study described the mechanism of the anti-oxidative effect of carvedilol on the production of ROS by blood phagocytes. Moreover, our results suggested that carvedilol can affect the total chemiluminescence activity of phagocytes by the modulation of the formation of RNS via inhibition of inos protein expression. 18

1. ÚVOD 1. 1. IMUNITNÍ SYSTÉM Imunitní systém patří k základním homeostatickým mechanismům organismu. Imunitní systém rozpoznává vlastní tkáně organismu a udržuje toleranci vůči nim, ale také má schopnost rozpoznávat a průběžně odstraňovat staré, poškozené nebo jinak pozměněné (mutované) buňky. Další jeho důležitou funkcí je rozpoznávat cizorodé částice a chránit organismus proti patogenním mikroorganismům a jejich toxickým produktům. Mechanismy imunitního systému lze rozdělit na přirozenou a specifickou imunitu. Jako první se do obranných reakcí organismu zapojují mechanismy přirozené imunity. Vnitřní imunitní systém je v těle přítomen konstitutivně v bazální hladině. Je schopný odpovídat velmi rychle na antigenní stimul, čímž je zodpovědný za kontrolu časných fází infekce a je zásadní pro celkový výsledek zánětlivé reakce. Ústřední úlohu obranných mechanismů přirozené imunity plní aktivované profesionální fagocyty. Jejich mikrobicidní vlastnosti jsou založeny především na produkci reaktivních kyslíkových a dusíkových metabolitů a cytokinů, které kontrolují průběh zánětlivé odpovědi a napomáhají reparaci poškozené tkáně. Evolučně mladší, antigenně specifický imunitní systém reaguje na cizorodou strukturu prostřednictvím vysoce specifických molekul: 1) protilátek produkovaných aktivovanými Blymfocyty 2) specifických receptorů T-lymfocytů. Oba imunitní systémy spolu úzce kooperují a jejich funkční aktivity jsou založeny na interakcích buněčných složek. Komunikace přirozené a specifické imunity je založena buď na přímém kontaktu buněk imunitního systému a/nebo na stimulaci buněk pomocí rozpustných mediátorů. Interakce mezi profesionálními fagocyty a T-, B-lymfocyty vedou k sekreci cytokinů iniciující aktivaci řady buněčných funkcí, které hrají důležitou úlohu v nespecifické zánětlivé a specifické imunitní odpovědi. 1. 2. Role PROFESIONÁLNÍCH FAGOCYTŮ Profesionální fagocyty jsou základními efektorovými buňkami přirozené imunity a ústředními buňkami v zánětlivé odpovědi. Tvoří přední linii obranných mechanismů proti invadujícím mikrobiálním patogenům, cizorodým částicím nebo vlastním pozměněným buňkám. Základní vlastností profesionálních fagocytů je schopnost rozpoznávat, fagocytovat a svými cytotoxickými produkty inaktivovat cizorodou částici, často zviditelněnou složkami komplementu. S fagocytózou úzce souvisí proces oxidativního vzplanutí v jehož rámci profesionální fagocyty tvoří cytotoxické, vysoce reaktivní metabolity odvozené od kyslíku a dusíku. Proces fagocytózy a oxidativního vzplanutí tvoří nejdůležitější obranný systém v rámci vnitřní imunity za účelem udržování homeostázy vnitřního prostředí organismu a zamezení 19

1. ÚVOD iniciace a propagace onemocnění. Oba tyto procesy jsou zodpovědné nejen za intracelulární usmrcení fagocytovaných mikroorganismů, ale mohou také iniciovat extracelulární poškození buněk vlastní tkáně. Funkci profesionálních fagocytů v organismu plní dva typy buněk: polymorfonukleární leukocyty (PMNL, zejména neutrofily) a mononukleární leukocyty (krevní monocyty a jejich tkáňové formy - makrofágy). Oba typy fagocytujících buněk jsou přes určité rozdíly v receptorové a enzymatické výbavě velmi podobné. Základním rozdílem je, že neutrofily neexprimují hlavní histokompatibilní komplex II. třídy (MHC II) a neplní tedy funkci antigenprezentujících buněk (APC) na rozdíl od makrofágů. Neutrofily mají význam v antiinfekční obraně zejména proti extracelulárním bakteriím, zatímco makrofágy fagocytují zejména vlastní apoptické buňky a významně se podílí na obraně proti některým intracelulárním parazitům. Krevní monocyty jsou předurčeny, aby se z nich staly dlouze žijící tkáňové makrofágy, zatímco krevní neutrofily jsou krátce žijící konečná stadia (6-8h). Neutrofily jsou hlavními buňkami akutní fáze zánětu - odpovídají velmi rychle na chemotaktický podnět a jsou prvními buňkami, které vstupují do zánětlivého místa. Neutrofily mohou být kromě antigenů aktivovány také cytokiny odvozenými od makrofágů, endoteliálních buněk nebo T lymfocytů. Monocyty/makrofágy hrají důležitou úlohu nejen v přirozené, ale také ve specifické imunitě, kde působí jako antigen-prezentující buňky a aktivátory lymfocytů. Makrofágy jsou především známy jako ústřední scavenger buňky, jejichž úkolem je odstranit intracelulární bakterie, prvoky, mnohobuněčné parazity a nádorové buňky v těle hostitele a eliminovat další zdroje antigenů. Na svém povrchu exprimují MHC I a II, kterými předkládají zpracovaný antigen T lymfocytům a aktivují specifický imunitní systém. Populace makrofágů se vyskytuje téměř ve všech tkáních: krevní monocyty, peritoneální, mikrogliální a mléčné makrofágy, Kuppferovy buňky v játrech (největší rezervoár makrofágů v těle s obrovskou potencí produkovat cytokiny), makrofágy v kostní dřeni, lymfatických orgánech a ve střevě. Proces diferenciace krevních monocytů na funkční tkáňové makrofágy je indukován řadou impulsů: bakteriální produkty lipopolysacharid (LPS), cytokiny a molekuly v mezibuněčné hmotě. Při aktivaci makrofágů dochází ke zvýšení genové transkripce a exprese různých genových produktů, kterými aktivované makrofágy získají speciální vlastnosti např. zvýšení exprese cytochromálních enzymů, které vede k mohutnější tvorbě RKM; nebo zvýšení exprese MHC a některých povrchových receptorů. Mikrobicidní funkce aktivovaných fagocytů jsou založeny především na produkci cytotoxických molekul, především reaktivních metabolitů kyslíku 20

1. ÚVOD a dusíku, které slouží k smrcení fagocytovaných mikroorganismů. Kromě těchto přímých mikrobicidních funkcí mají profesionální fagocyty také důležitou úlohu regulační a reparační. V zánětlivých procesech produkují aktivované makrofágy růstové faktory pro fibroblasty a cévní endotel, které nahrazují poškozenou tkáň; proteázy (kolagenáza, elastáza); angiogenesis factor - stimulují migraci a proliferaci fibroblastů a endoteliálních buněk; metabolity kyseliny arachidonové (prostaglandiny, prostacykliny, leukotrieny, tromboxany) a složky komplementu. Velice důležitými produkty aktivovaných makrofágů v zánětlivé odpovědi jsou regulační molekuly cytokiny. Fakt, že neutrofily produkují mnohem menší množství cytokinů, ve srovnání s makroofágy, je kompenzován podstatně vyšším zastoupením neutrofilů v zánětlivých ložiscích. Cytokiny odvozené od fagocytů zprostředkovávají systémovou zánětlivou odpověď (IL-6, tumor necrosis factor alpha (TNFα), amplifikují zánětlivou reakci (IL-8) a regulují diferenciaci T lymfocytů (IL-12). Cytokiny stimulují další buňky zánětu a jsou zodpovědné za řadu systémových zánětlivých reakcí jako je např. horečka. Prostřednictvím těchto signálních molekul sehrávají profesionální fagocyty významnou roli v regulaci hematopoezy, imunitní, zánětlivé odpovědi a mnoha homeostatických procesech. Reaktivní metabolity (RM) RM jsou definovány jako nestabilní, vysoce reaktivní molekuly radikálové (jedním nebo více nepárovými elektrony ve vnějším orbitalu) nebo neradikálové povahy. RM vznikají v menším množství v organismu i za fyziologických podmínek jako vedlejší produkty některých enzymatických a autooxidačních reakcí. V dýchacím řetězci mitochondrií je utilizováno až 90% přijatého kyslíku. Za fyziologických podmínek je přibližně 1 3% tohoto spotřebovaného kyslíku nedokonale redukováno na superoxidový radikál a další RKM. Dalšími zdroji RKM jsou autooxidace cytochromu P450 v transportním elektronovém řetězci endoplazmatického retikula, autooxidace monoaminů (dopamin, epinefrin, norepinefrin), flavinů a hemoglobinu v přítomnosti přechodných kovů nebo oxidace redukčních ekvivalentů (NADH-redukovaná forma nikotinamid adenindinukleotidu, NADPH-redukovaná forma nikotinamid adenindinukleotid fosfátu, FAD-flavin adenindinukleotid) v dýchacím řetězci mitochondrií. V případě nedostatku L-argininu nebo tetrahydrobiopterinu (BT4) v buňce se na tvorbě superoxidu mohou také podílet konstitutivní isoformy NOS. Reaktivní metabolity mohou tedy vznikat i ve zdravém organismu, nicméně k mohutnému nárůstu jejich produkce dochází zejména především v obranných pochodech vnitřní imunity proti infekcím, v zánětlivých procesech, v případě tkáňového poškození, otravách, různých onemocněních a jako následek 21

1. ÚVOD chirurgických zákroků. Nicméně nejvýznamnějším zdrojem RKM a RDM jsou aktivované profesionální fagocyty v procesu oxidativního vzplanutí. 1. 3. OXIDATIVNÍ VZPLANUTÍ Za fyziologických podmínek jsou fagocyty v klidovém stavu a energii získávají anaerobní glykolýzou, jejich aerobní metabolismus je velmi nízký. Po antigenní stimulaci fagocytů, dochází k významným metabolickým změnám zvýší se spotřeba kyslíku, metabolismus glukosy a tvoří se velké množství RM radikálové i neradikálové povahy. Ústředním enzymem oxidativního vzplanutí profesionálních fagocytů je membránová NADPH oxidáza, která katalyzuje jedno-elektronovou redukci molekulárního kyslíku na superoxidový anionový radikál. Antigenní stimulace vede k fosforylaci cytoplazmatických podjednotek NADPH oxidázy, jejich vazbě na membránovou složku a tvorbě aktivního enzymu. Antigenních stimulů existuje celá řada: bakterie, houby, viry, prvoci. Mezi nejefektivnější iniciační stimuly oxidativního vzplanutí, které jsou často přítomné v zánětlivém místě, patří opsonizované mikroorganismy, složky komplementu (C5a), leukotrien B4 (LTB4) a N-formylované oligopeptidy bakteriálního původu, které jsou aktivně sekretovány nebo jsou uvolňovány lyzí mikroorganismů a v neposlední řadě cytokiny: IFNγ, TNFα, IL-1, IL-8, IL-6 aj.. 1. 3. 1. Reaktivní kyslíkové metabolity Superoxidový aniontový radikál ( O2-) vzniká různými cestami jednoelektronové redukce molekulárního kyslíku za fyziologických a také patologických stavů. Poločas rozpadu superoxidu je velmi krátký (několik sekund) a nesetká-li se s jinou molekulou, dochází ke spontánní nebo enzymaticky urychlené dismutaci superoxiddismutázou (SOD) na peroxid vodíku a molekulární kyslík Díky svému zápornému náboji neprostupuje superoxid biologickými membránami a jeho účinky se uplatňují převážně intracelulárně a v místě jeho vzniku. I přesto, že patří ke slabším oxidantům, je schopen přímého oxidativního poškození. Patofyziologický význam superoxidu spočívá na schopnosti redukovat ionty přechodných kovů vázaných na proteiny a podporovat jejich vstup do Fentonovy reakce. Nicméně podstatná část vyprodukovaného superoxidu slouží spíše jako substrát pro vznik dalších reaktivních forem kyslíku a dusíku radikálové/neradikálové povahy. Dalším poměrně málo reaktivním metabolitem je peroxid vodíku (H2O2), který na rozdíl od superoxidu, snadno prostupuje membránami a může tak působit i na vzdálenějších místech. Reakce peroxidu vodíku s biomolekulami je pomalá, ale v přítomnosti volných iontů přechodných kovů (Fe2+, Cu+) v tzv. Fentonově reakci se pohotově redukuje na vysoce reaktivní hydroxylový radikál. Může sám působit jako oxidant, ale větší část slouží jako 22