I N V E S T I C E D O R O Z V O J E V Z D Ě L Á V Á N Í TENTO PROJEKT JE SPOLUFINANCOVÁN EVROPSKÝM SOCIÁLNÍM FONDEM A STÁTNÍM ROZPOČTEM ČESKÉ REPUBLIKY Laboratorní práce č. 10 Bílkoviny Pro potřeby projektu MAN zpracovala: Mgr. Lenka Horutová
Úkol č. 1: Koagulace albuminu teplem zkumavka, gumička, teploměr, gáza (vata), nálevka, filtrační kruh, vodní lázeň, kahan, síťka, varný kruh roztok vaječného bílku, destilovaná voda Bezpečnost práce: Zahříváme opatrně! Vaječný bílek protřepeme s 50 ml destilované vody a přefiltrujeme vatou nebo gázou v nálevce. Nalijeme asi 3 ml filtrátu do zkumavky. Teploměr připevníme gumičkou ke zkumavce tak, aby roztok bílku byl ve stejné výšce se rtuťovou nádobkou teploměru. Zkumavku s teploměrem upevníme svisle do stojanu, zahříváme ve vodní lázni velmi pomalu a za neustálého míchání lázně. Jakmile roztok zbělá a stane se neprůhledným, zapíšeme teplotu. Poznámka: Všechno chemické sklo musí být čisté a na ředění bílku použijeme destilovanou vodu, jinak vzniká zákal. Obr. 1 Bílek ve zkumavce a teploměr Obr. 2 Vodní lázeň Obr. 3 Sraženina Teplota koagulace:
Teoretické úkoly: 1. Co tvoří základní jednotku bílkovin? 2. Jedná se o funkční nebo substituční deriváty karboxylových kyselin? 3. Uveďte aspoň 2 zástupce napište jejich vzorec a pojmenujte je. Odpovědi (3): Princip: Formu, v níž bílkoviny fungují v organismech, označujeme jako nativní. Působením řady fyzikálních a chemických vlivů se nativní konformace porušuje a bílkoviny přecházejí na méně uspořádanou formu náhodného klubka. Narušují se vodíkové můstky, iontové vazby. Peptidické vazby se neštěpí. Snižuje se rozpustnost bílkoviny. Proces může být vratný pak hovoříme o vratné denaturaci. Po odstranění činidla se vrací bílkovina do nativní formy. Většinou se však jedná o nevratnou ireverzibilní denaturaci. Úkol č. 2: Biuretová reakce bílku zkumavka vodný roztok bílku, 1% roztok síranu měďnatého, 10% roztok hydroxidu sodného Do zkumavky nalijeme 1 ml roztoku vaječného bílku. Přidáme asi pět kapek roztoku CuSO 4 a 1 ml roztoku NaOH.
Obr. 4 Biuret z bílku a měďnatá sůl Obr. 5 Biuret z močoviny Úkol č. 3: Biuretová reakce močoviny zkumavky, držák na zkumavky, kahan močovina, 1% roztok síranu měďnatého, 10% roztok hydroxidu sodného, indikátorový papírek 0,5 g močoviny zahříváme v suché zkumavce malým plamenem. Po chvíli začne unikat plyn, který identifikujeme čichem nebo navlhčeným univerzálním indikátorovým papírkem. Po vychladnutí reakční směsi přidáme 1 ml roztoku NaOH a pět kapek roztoku CuSO 4. Protřepeme. Poznámka: Bílkovinu lze dokázat biuretovou reakcí ve výluhu masa, hrachu apod. Chemická rovnice (1): H 2 N-CO-NH 2 + H 2 N-CO-NH 2 =>..+ NH 3 biuret
Obr. 6 Navlhčený indikátorový papírek Obr. 7 Stupnice ph a univerzální papírek Úkol č. 4: Xanthoproteinová reakce zkumavky, držák na zkumavky, kahan roztok vaječného bílku, 45% kyselina dusičná Ve zkumavce zahříváme 2 ml roztoku bílku a 1 ml HNO 3. Pozorování (2):
Obr. 8 Zahřívání bílku a HNO 3 Obr. 9 Sraženina Úkol č. 5: Důkaz sirných aminokyselin malá kádinka, trojnožka, kahan, síťka, tyčinka roztok vaječného bílku, 0,5% roztok octanu olovnatého, 10% roztok hydroxidu sodného Do 3 ml roztoku (CH 3 COO) 2 Pb v malé kádince přidáme roztok NaOH. Vytvoří se bílá sraženina. Roztok mícháme a přidáváme NaOH tak dlouho, dokud se sraženina nerozpustí. Do čiré směsi přidáme 1 ml roztoku vaječného bílku a mírně zahřejeme.
Obr. 10 NaOH a (CH 3 COO) 2 Pb Obr. 11 Po přidání bílku a zahřátí Úkol č. 6: Izolace globulinů z hrachu miska, tyčinka, zkumavka, lžička, filtrační papír, nálevka mouka z hrachu, chlorid sodný, fyziologický roztok (ve 100 ml destilované vody rozpustíme 0,9 g NaCl) Lžičku jemně mleté mouky z hrachu smícháme s 25 ml fyziologického roztoku na řídkou kaši. Zfiltrujeme přes skládaný filtr. K 5 ml filtrátu přidáváme destilovanou vodu a pozorujeme srážení globulinů. K suspenzi sraženiny přidáme trochu pevného NaCl. Úkol č. 7: Srážecí reakce zkumavky roztok vaječného bílku, 0,5% roztok octanu olovnatého, 5% roztok síranu měďnatého, 3% roztok dusičnanu stříbrného Do 3 zkumavek dáme 2 ml roztoku bílku. K prvnímu roztoku přidáme roztok (CH 3 COO) 2 Pb, k druhému roztoku přidáme roztok CuSO 4 a do třetí zkumavky přidáme roztok AgNO 3.
Obr. 12 Bílek a (CH 3 COO) 2 Pb, bílek a CuSO 4, bílek a AgNO 3 Obr. 13 Bílek a (NH 4 ) 2 SO 4, Na 2 SO 4, NaCl, KCl, MgSO 4, C 2 H 5 OH Úkol č. 8: Vysolování bílkovin zkumavky roztok vaječného bílku, síran amonný krystalický, nasycené roztoky (krystalické látky) síran sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, síran hořečnatý, etanol (aceton, éter) Do 6 zkumavek dáme 5 ml roztoku bílku. Postupně přidáváme do jednotlivých zkumavek několik krystalků (NH 4 ) 2 SO 4, několik ml Na 2 SO 4, NaCl, KCl, MgSO 4, C 2 H 5 OH - protřepeme. Vznikají sraženiny, které můžeme rozpustit přidáním 5 ml vody.