MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE STUDIUM LASEREM INDUKOVANÉHO OXIDATIVNÍHO ZNAČENÍ PROTEINŮ Bakalářská práce Lukáš Tomíček Vedoucí práce: doc. Mgr. Jan Preisler, Ph.D. Brno 2012

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Lukáš Tomíček Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav Biochemie Studium laserem indukovaného oxidativního značení proteinů Aplikovaná biochemie Studijní obor: Aplikovaná biochemie Vedoucí práce: doc. Mgr. Jan Preisler, Ph.D. Akademický rok: 2011/12 Počet stran: 47 Klíčová slova: FPOP; Fotochemická oxidace; footprinting; MALDI; TOF; matrice; Protein; Elektroforéza; Hmotnostní spektrometrie; Methionin; Cystein; Bradykinin; Laser

Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Degree programme: Field of Study: Supervisor: Lukáš Tomíček Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Study of laser induced oxidative labeling of proteins Applied biochemistry Applied biochemistry doc. Mgr. Jan Preisler, Ph.D. Academic Year: 2011/12 Number of Pages: 47 Keywords: FPOP; Fotochemical oxidation; Footprinting; MALDI; TOF; Matrix; Protein; Electrophoresis; Mass spectrometry; Methionine; Cysteine; Bradykinin; Laser;

Abstrakt V této bakalářské práci se věnujeme rychlé fotochemické oxidaci proteinů a jejich detekcí pomocí metody MALDI-TOF MS. Dále se věnujeme možnosti rozšíření detekce využitím elektroforézy. Bylo zapotřebí se teoretické úrovni seznámit s metodou footprintingu, kterou fotochemická oxidace je, dále pak s MALDI-TOF MS a se zónovou kapilární elektroforézou. Po navržení způsobu dávkování kapilárním vzlínáním se prováděla fotolýza peroxidu vodíku, který slouží jako zdroj hydroxylových radikálů, které právě způsobují samotnou oxidaci. Po ozáření vzorku v křemenné kapiláře se nanesl na MALDI destičku, na které již byla připravena matrice CHC. A vzorek podstoupil analýzu. Kvůli možnosti rozšíření práce a využití kapilární elektroforézy bylo zapotřebí osvojit si základní principy a provést reprodukovatelné měření. K tomu byly vybrány dva modelové vzorky peptidů Angiotensin I a Bradykinin. Abstract In this thesis we study fast photochemical oxidation of proteins and their detection using the MALDI-TOF MS. Furthermore, we extend the possibilities of detection using electrophoresis. It needs to be familiar with the theoretical level by footprinting by photochemical oxidation, followed by a MALDI-TOF MS and capillary zone electrophoresis. After the design of dosing capillary action was carried out photolysis of hydrogen peroxide, which serves as a source of hydroxyl radicals, which itself was caused oxidation. After irradiation the sample in a quartz capillary tube is applied a MALDI plate on which has already been prepared CHC matrix. A sample underwent analysis. The possibility for extension work and the use of capillary electrophoresis was needed to acquire the basic principles and perform reproducible measurements. This model was chosen two samples of peptides Angiotensin I and Bradykinin.

Masarykova univerzita v Brně, Přírodovědecká fakulta Ústav biochemie Kotlářská 2, 611 37 Brno, CZ ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Bakalářský studijní program: Studijní obor: Aplikovaná biochemie Aplikovaná biochemie Student(ka): Lukáš Tomíček Název tématu: Studium laserem indukovaného oxidativního značení proteinů Study of laser induced oxidative labeling of proteins Vedoucí bakalářské práce: Odborný konzultant: doc. Mgr. Jan Preisler, Ph.D. Bc. Lenka Michalcová Datum zadání bakalářské práce: 23. 9. 2011 Datum odevzdání bakalářské práce: 14. 5. 2012 Zpracovatel i vedoucí bakalářské práce berou na vědomí, že práce musí obsahovat i experimentální část. V Brně, dne 23. 9. 2011

Zásady pro vypracování: Cílem bude vývoj a testování uspořádání pro laserem indukované oxidativní značení proteinů. Značení bude testováno pomocí kapilárního reaktoru, případně elektroforézy a hmotnostní spektrometrie s cílem mapování struktury proteinů. Jde o začínající projekt ve spolupráci s partnerskou laboratoří. Seznam odborné literatury: Chen, J.; Rempel D.F.; Gross M.L., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 15502-15504

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat doc. Mgr. Janu Preislerovi, PhD. za odborné vedení, rady a vstřícný přístup. Zároveň děkuji Bc. Lence Michalcové za cenné rady a konzultace ohledně elektroforézy a laserů. Dále bych rád poděkoval Mgr. Ivě Tomalové za rady, připomínky a odborné vedení při práci s MALDI-TOF MS. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 14. května 2012 Jméno Příjmení

OSNOVA ÚVOD... 10 TEORETICKÁ ČÁST... 11 1. RYCHLÁ FOTOCHEMICKÁ OXIDACE PROTEINŮ... 11 1.1. Uspořádání pokusu... 11 1.2. Footprinting... 12 1.3. Hydroxylové radikály... 14 1.4. Laser... 15 2. HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE... 17 2.1. MALDI-TOF MS... 17 2.2. Princip MALDI... 18 2.3. Princip TOF... 18 2.4. Matrice... 20 3. KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA... 21 3.1. Princip... 21 3.2. Varianty kapilární elektroforézy... 23 3.3. Veličiny ovlivňující kapilární elektroforézu... 23 3.4. Instrumentace... 25 CÍLE PRÁCE... 27 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 28 4. Seznam použitých chemikálií... 28 5. Přístroje a software... 29 5.1. Aparatura pro FPOP... 29 5.2. Aparatura pro CZE... 30 VÝSLEDKY A DISKUZE... 31 6. Fotochemická oxidace... 31 6.1. Charakterizace laseru... 31 6.2. Obecný postup dávkování... 32 6.3. Indukce hydroxylových radikálů... 33 7. MALDI-TOF MS... 33 7.1. Příprava matrice... 33 7.2. Nanášení vzorku na MALDI destičku... 34 7.3. FPOP methioninu... 34 7.4. FPOP cysteinu... 36

7.5. FPOP peptidu... 38 8. Zónová kapilární elektroforéza... 40 8.1. Vyhodnocení výsledků... 41 8.2. Analýza angiotensinu I... 41 8.3. Analýza bradykininu... 42 SOUHRN... 45 SUMMARY... 46 LITERATURA... 47

ÚVOD Rychlá fotochemická oxidace proteinů (Fast photochemical oxidation of protein, FPOP) je jednou z metod sloužící ke zkoumání struktury bílkovin. Vystavení vhodného pufru laserovému pulsu z něj indukuje hydroxylové radikály, které způsobí oxidaci postranních řetězců bílkoviny, zatímco vnitřní řetězce zůstanou nenarušeny. Oxidační změny jsou detekovány hmotnostní spektrometrií, většinou pomocí ionizací elektrosprejem (Elektrospray ionization, ESI). V této práci chceme vyzkoušet, detekci pomocí hmotností spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účásti matrice s průletovým analyzátorem (Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS), případně i za pomoci zónové kapilární elektroforézy. 1 MALDI-TOF MS patří v současné době mezi stěžejní nástroje moderních analytických metod. Za pomoci MALDI MS lze studovat a kategorizovat velmi široké spektrum látek. Od biopolymerů jako jsou např. peptidy a sacharidy, přes syntetické polymery a farmaceutika, až po nízkomolekulární organické i anorganické sloučeniny. Ionty, které vzniknou při MALDI jsou nejčastěji detekovány průletovým hmotnostním analyzátorem (TOF). 2 Kapilární elektroforéza (CE) je jednou z elektromigračních separačních metod. Separace se provádí na základě rozdílné pohyblivosti molekul ve stejnosměrném elektrickém poli při konstantním napětí. Zpravidla se molekuly pohybují podle rozdílného náboje analytu. Na základě toho se molekuly rozdělují do zón, ve kterých putují směrem k detektoru. Mluvíme pak o kapilární zónové elektroforéze (CZE). 3 10

TEORETICKÁ ČÁST 1. RYCHLÁ FOTOCHEMICKÁ OXIDACE PROTEINŮ Fast photochemical oxidation of protein (FPOP) je metoda footprintingu, kdy jsou volné řetězce aminokyselin označovány hydroxylovými radikály. Ty jsou produkovány fotolýzou peroxidu vodíku. Stejně jako ostatní chemické techniky footprintingu, musí FPOP zajistit označení pouze nativní konformace. Fotochemická oxidace většinou trvá v řádu milisekund. Použitím pulzního laseru dochází ke snížení doby oxidace pod 1 mikrosekundu. Tím probíhá oxidace hydroxylovými radikály účinněji, jelikož mají nízkou životnost. Jedna z hypotéz tvrdí, že FPOP probíhá rychleji, než se protein stihne rozbalit a zdenaturovat. Tím se nenaruší původní struktura samotné bílkoviny. Při detekci jednotlivých fragmentů je pozorovatelný nárůst molekulové hmotnosti o +16, +32,, dle množství míst, která je možné oxidovat a oxidaci podlehnou (Obr. 1). 4 Obr. 1. Hmotnostní spektra peptidu s patrným nárůstem molekulové hmotnosti po oxidaci; převzato a upraveno 4 1.1. Uspořádání pokusu Vzorek proteinu, který je nanesený v tenké křemenné kapiláře, je ozařován neodymovým laserem Nd:YAG, s vlnovou délkou 266 nm (obr. 2) Proteiny jsou ve 11

vhodném pufru, v tomto případě ve zředěném roztoku peroxidu vodíku. Po ozáření laserem dojde k indukci hydroxylových radikálů, které způsobí oxidaci postranních řetězců proteinu. Dojde ke změně molekulové hmotnosti. Zoxidované molekuly proteinu lze detekovat pomocí MALDI-TOF MS. 4, 5 Obr. 2. Uspořádání FPOP; převzato a upraveno 4 1.2. Footprinting Jedná se o metody studia strukturálního povrchu a interakcí v polypeptidovém řetězci, za pomoci koncového značení proteinů. Footprinting je velice citlivá metoda. Informace se získává pouze z označeného polypeptidového řetězce, zároveň určuje i délku mnoha peptidů a není tak potřeba od sebe zvlášť izolovat jednotlivé fragmenty. V dnešní době jsou známy tři způsoby označování polypetidových řetězců. 6 Při chemické modifikaci N-konce je bílkovina podrobena Edmanově degradaci. Při ní dochází k oddělování aminokyselin postupně od N-konce peptidu. Amino-skupina poté reaguje s fluorescenčním nebo radioaktivním činidlem. To má za následek označení N-konce peptidu. Nevyhnutelně se přitom zničí složená struktura označeného proteinu ještě před detekcí. Informace o proteinu lze získat jen na úrovni primární struktury. Specifická vazba protilátek využívá vazby protilátky na jednom konci aminokyseliny. Vhodným způsobem je na peptid navázat epitop, což je specifické místo antigenu, na které se váží protilátky. Využijeme tedy takový, k němuž je již známa protilátka. Označený komplex epitop-protein se pak detekuje za pomocí rekombinačních DNA technologií. 12

Posledním způsobem označování proteinů je fosforylace na obou koncích. Metoda je založena na specifické vazbě proteinové kinázy. Ta sekvence aminokyseliny, která má být fosforylována kinázou, je připojena k proteinu na úrovni genu. Průzkum struktury proteinu má za následek rozštěpení základního polypetidového řetězce. K dispozici jsou přímé i nepřímé metody zkoumání. Při přímých metodách dochází k okamžitému štěpení polypetidové páteře. Výhodou je, že jsou oproti nepřímým metodám jednodušší na provedení. U nepřímých metod dochází k chemické modifikaci bočního řetězce. Následuje odštěpení sousední polypeptidové vazby. Vzhledem k úpravě rozpouštědla nedochází k narušení hlavního řetězce. Momentálně je známo pět snímacích metod, dvě přímé a tři nepřímé. První přímá metoda je proteolýza. Endoproteázy bývají používány k vymezení struktury bílkovin, jelikož složené strukturní jednotky jsou odolnější vůči proteolýze. Jejich interakce s makromolekulami může blokovat některé štěpné stránky. Mimo jiné se konformační změny projeví v citlivosti na proteolýzu proteinázou. Druhá přímá metoda využívá kyslíkových radikálů, které se připravují Fentonovou reakcí, k rozštěpení základní struktury. Reaktivita peptidů označených kyslíkovými radikály přímo souvisí s přístupností rozpouštědla k základní struktuře. Jedna z nepřímých metod je založena na kombinaci vratných a nevratných změn lysinových reziduí. Po odstranění citraconylové skupin dojde k nevratné acetylaci zbývajících lysinů. Nemodifikované lysynové zbytky se obnovují jen v místech, kde se provedla úprava jako první. Za pomoci lysinu se kompletně tráví polypeptidové řetězce. Endoproteázy vytvářejí fragmenty, které končí na prvním místě modifikace. Další nepřímá metoda využívá kyanylace. Při této metodě se zvyšuje ph, které způsobuje pozvolné pomalé štěpení peptidové vazby v S-cyanocysteinu. Po otočení upraveného řetězce dojde k rozštěpení. Zbytky cysteinu, které nezreagovaly, se musí předem zablokovat. Kyano-skupina přenáší volný sulfhydryl, tj. neupravený cystein stejného peptidu. Poslední nepřímý způsob, na který se zaměřuji ve své práci, využívá oxidaci methioninových zbytků. Oxidace methioninů je pozorována jako snížení množství peptidových fragmentů generovaných pomocí vhodného rozpouštědla. Jestliže úprava zabraňuje štěpení, stejně jako je tomu při využití oxidace methioninových zbytků, musí se rozsah štěpení pečlivě kontrolovat. Je potřeba zajistit, aby při pozorování peptidů 13

nebyly vymezeny jen ty nejkratší označené peptidy. Je vhodné využít hydroxylových radikálů vzniklých fotolýzou peroxidu vodíku. 7, 8 1.3. Hydroxylové radikály Hydroxylové radikály pro oxidaci proteinů jsou produkovány fotolýzou peroxidu vodíku při FPOP. Samotná fotolýza peroxidu vodíku je indukována laserem. Vzniklé hydroxylové radikály mají srovnatelnou velikost molekuly s molekulou vody. Tím pádem nedochází k narušování základní struktury peptidu. Snadno oxidují reaktivní postranní řetězce aminokyselin ve vodném roztoku. Hydroxylové radikály jsou velmi reaktivní činidla, která pokryjí širší oblast aminokyselin, než specificky zaměřené reakce, jako je např. acetylace primárních aminů. Relativní reaktivita jednotlivých aminokyselin se řadí takto: cystein (Cys) > methionin (Met) > tryptofan (Trp) > tyrosin (Tyr) > fenylalanin (Phe) > cystin > histidin (His) > leucin (Leu) / isoleucin (Ile) > arginin (Arg) / lysin (Lys) / valin (Val) > serin (Ser) / threonin (Thr) / prolin (Pro) > glutamin (Gln) / kyselina glutamová (Glu) > kyselina asparagová (Asp) / asparagin (Asn) > alanin (Ala) > glycin (Gly). Postraní řetězce aminokyselin, které mají nižší reaktivitu, jako jsou Asp, Asn, Ala, Gly a zbytky aminokyselin, které jdou složitě odhalit Ser, Thr většinou neposkytují dostatek informací k analýze struktury peptidu. Většina aminokyselin poskytuje dostatečnou odezvu a informace k analýze struktury peptidu. 6 Cystein je semi-esenciální α-aminokyselina, obsahující thiolovou skupinu SH. Tvoří v bílkovinách disulfidické můstky a tím se podílí na udržení struktury bílkoviny. Thiolová skupina v cysteinu je nukleofilní a snadno oxidovatelná. Vzhledem k vysoké reaktivitě má četné biologické funkce. Oxidace cysteinu je zobrazena na obr. 3. Methionin je esenciální nepolární α-aminokyselina. Jeho kódujícím kodonem je AUG, což je typický start kodon. Z toho důvodu je methionin většinou první aminokyselinou, ke které se v proteinu napojují další aminokyseliny. Oxidace methioninu je zobrazena na obr. 4. 14

Obr. 3. Oxidace cysteinu Obr. 4. Oxidace methioninu 1.4. Laser Laser, z anglického Light amplification by stimulated emission of radiation, v překladu zesilování světla stimulovanou emisí záření, je optický zdroj elektromagnetického záření. Poskytuje nám světlo v prostorově vymezeném úzkém paprsku o vysoké energetické hustotě. Paprsek světla vycházející z laseru je monochromatický a koherentní, tudíž má jedinou fázi a vlnovou délku. 9 Laser je tvořen aktivním prostředím, rezonátorem a zdrojem energie (obr. 5). Nejčastějšími zdroji energie jsou polovodičové lasery, laserové diody a výbojky, které do aktivního prostředí dodávají energii. Ta vybudí ze základní energetické hladiny elektrony do vyšší energetické hladiny; dojde k excitaci iontů. Jakmile je takto vybuzena většina elektronů, dochází opět k přestupu na nižší energetickou hladinu a tím dojde k emisi energie ve formě fotonů. Pomocí rezonátoru, který je ve většině případů 15

tvořen zrcadly, dochází k odrážení fotonů. Ty zesilují emisi a výsledný světelný paprsek poté opouští laser průchodem přes polopropustné zrcadlo. 9,10 Obr. 5. Schematické zobrazení laseru Neodymový laser Nd:YAG využívá jako aktivní prostředí izotropní krystal ytriumhlinitého granátu (Y 3 Al 5 O 12 ) s příměsí iontů neodymu (Nd 3+ ). Tento laser dokáže běžně poskytnout kontinuální infračervené záření o výkonu 1 kw. Je-li nastaven na pulzní režim je schopen vysílat velice krátké a velice silné záblesky záření. Nejčastějším zdrojem energie u těchto typů laseru bývá xenonová výbojka či laserová dioda. Délka jednoho pulsu se většinou pohybuje od mikrosekund až po pikosekundy. Jeho typickou vlnovou délkou je 1064 nm. Fotonásobením můžeme upravovat vlnovou délku laseru až na 266 nm, při které se zkracuje doba pulsu na několik nanosekund. V medicíně se využívá v oftalmologii k odstranění druhotného šedého zákalu či redukci nitroočního tlaku. Excimerový laser EX50 je pulzní plynový laser, který má aktivní prostředí tvořené zvláštním typem molekul excimery. Tyto molekuly existují jen ve vybuzeném stavu, ke kterému dochází díky srážkám atomů plynů s elektrony o vysoké energii. Při návratu do základní energetické hladiny se excimery rozpadají zpátky na jednotlivé atomy a vydávají záření. Častou plynovou náplní excimerových laserů je kombinace vzácných plynů a halogenů, např. Kr + F 2 pro vlnovou délku 248 nm, Xe + Cl 2 pro 10, 11 vlnovou délku 308 nm. Většina vyzařuje v ultrafialovém spektru. 16

2. HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Hmotnostní spektrometrie lze zařadit v principu mezi separační techniky analytické chemie. MS převádí vzorek na ionizovanou plynnou fázi. Ionty jsou poté separovány dle podílu jejich hmotnosti a náboje m/z. 3 Hmotnostní spektrometrie se využívá k určení hmotnosti částic, stanovení elementárního složení analytu, a pro objasnění chemické struktury molekul, jako jsou peptidy a jiné chemické sloučeniny. Při ionizaci molekuly dochází většinou k ionizaci molekuly a vzniku iontu o jednotkovém náboji. Poté může dojít k rozpadu molekulárního iontu na fragmentový ion a elektricky neutrální částici. Metody hmotnostní spektrometrie mají jak kvalitativní, tak i kvantitativní využití. Lze je použít k identifikaci látek, stanovení struktury sloučenin, určení izotopového složení prvků. Dále je možno využít hmotností spektrometrii ke studiu chování iontů v plynné fázi. V dnešní době patří hmotností spektrometrie k běžně užívané technologii v analytických laboratořích, jež se zaměřují na studování chemických, fyzikálních či 12, 13,14 biologických vlastností látek. 2.1. MALDI-TOF MS Název pochází z anglického Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. V překladu to znamená Hmotnostní spektrometrie s průletovým analyzátorem laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice. Jedná se o spojení hmotnostního průletového spektrometru (TOF) s ionizací laserovou desorpcí za účasti matrice (MALDI). To nám poskytuje možnost analyzovat široké spektrum různých látek. Analyzovaný vzorek se nanese spolu s matricí na speciální destičku, která je většinou vyrobena z nerezové oceli, a vloží se do spektrometru. Uvnitř spektrometru proběhne desorpce a ionizace pomocí pulzního laseru. Vzniklé ionty jsou poté podrobeny detekci a vyhodnoceny dle délky trvání jejich lety k analyzátoru TOF. 17

2.2. Princip MALDI Poprvé tuto ionizační techniku popsali Michael Karas a Franz Hillenkamp se svými kolegy v roce 1985. O rozvoj této metody, při které dochází k ionizaci vzorku pomocí laserové desorpce za účasti matrice, se postaral též Koichi Tanaka, v roce 1987, který ji úspěšně využil pro velké biomolekuly. V roce 2002 obdrželi Nobelovu cenu za chemii vědci John B. Fenn a Koichi Tanaka, za pokroky ve vývoji ionizačních metod pro hmotnostní spektrometrii makromolekul; jedná se především o ionizaci elektrosprejem (ESI) a MALDI. MALDI je tzv. měkká metoda, kdy přednostně vznikají ionizované pseudomolekulární ionty s jedním nábojem [A+H] +. Při vzniku iontů nedochází k výrazné fragmentaci analytu. Po vsunutí vzorku do ionizační komory se ozařuje zpravidla UV pulsy laseru. Laserové pulsy trvají několik málo nanosekund. Energie z laserového pulsu je převážně vstřebána matricí. Ta poté při odpařování sebou strhává částice vzorku, které jsou tak převáděny do plynného skupenství. Excitované molekuly matrice i nadále ionizují molekuly analyzované látky přenosem protonu. Ionty postupují kvůli elektrickému poli do hmotnostního analyzátoru. Hmotnostní spektrometrie MALDI se obvykle používá ke studiu a stanovení peptidů a proteinů, nukleových kyselin, sacharidů, apod. 2.3. Princip TOF 2, 15 Hmotnostní průletový analyzátor TOF (Time-of-Flight) stanovuje ionty, které vznikly ionizačním pulsem, na základě jejich doby letu od iontového zdroje k detektoru. Jejich poměr hmotnosti iontu a náboje iontu m/z je dán vztahem (1), m z t L 2 2 e U 2 (1) kde m je hmotnost iontu, z je náboj iontu, e udává elementární náboj, U označuje urychlovací napětí, t je doba letu iontu analyzátorem a L je délka driftové zóny. Vložené urychlovací napětí U je většinou v rozmezí od 10-20 kv. Kinetická energie je dodávána iontů pomocí soustavy extrakčních mřížek. Ionty, které mají stejnou energii, ale liší se poměrem své hmotnosti a náboje m/z, se pohybují po dané dráze různou rychlostí a dopadají tak na detektor v různém čase. Zvýšit rozlišení 18

MALDI-TOF MS je možné využitím pulzní zpožděné extrakce či iontovým zrcadlem. Tyto prvky korigují disperzi kinetické energie iontů. 15 Zpožděná pulzní extrakce reguluje nerovnoměrně rozloženou počáteční kinetickou energie iontů. Extrakční napětí je vloženo na ionty po uplynutí doby 100 až 1000 ns od laserového pulsu. Toto napětí urychlí ionty, které mají nižší počáteční kinetickou energii a jsou blíž nosiči vzorku oproti iontům o stejném m/z, avšak o vyšší počáteční kinetické energii, které doputují dál od nosiče. Ionty pak dopadnou na detektor současně. Nevýhodou zpožděné pulzní extrakce je, že funguje pouze po předem vymezený interval m/z. Iontové zrcadlo, jinak označováno jako reflektor nebo reflektron, je složené ze soustavy elektrod prstencového tvaru. Na ně je přiváděno napětí o stejné polaritě, jako má urychlovací napětí. Účelem reflektronu je zaostření iontů se stejnou hodnotou m/z, ale rozdílnou kinetickou energií. Ionty, které mají kinetickou energii vyšší, proniknou do soustavy elektrod hlouběji a prodlouží se tak doba jejich letu. Tím se vyrovná doba letu iontů s rozdílnými kinetickými energiemi. Reflektron je vhodný pro malé molekuly, jelikož vysokomolekulární látky se mohou při prodloužení doby letu fragmentovat. Na detektor dopadají vzniklé ionty a dochází k jejich přeměně na elektrony. Jejich signál je kaskádovitě zesilován. Nejčastěji se používá keramická mikrokanálová destička (microchannel plate, MCP). Ta je kruhového tvaru o průměru několika málo centimetrů. Destička má na sobě kanálky, které jsou potaženy polovodičovým materiálem. Dalším typem detektoru je elektronový násobič. Ten pomocí emituje elektrony pomocí dynody, na kterou dopadají ionty. Elektrony poté dopadají na další dynodu a způsobují tak emisi dalších elektronů. Celkem je celá soustava složena z 10 až 20 dynod. Výsledek je zesílený signál, který odpovídá přímo úměrně počtu iontů, jež dopadnou na první dynodu. Schéma přístroje je zobrazeno na obr. 6. 19

Obr. 6. Schéma MALDI-TOF MS Po měření MALDI-TOF MS získáme výsledek ve formě hmotnostního spektra, ve kterém pozorujeme píky analytu, matric, a popř. nečistot. Vlastnosti a vzhled hmotnostního spektra závisí hlavně na použité energii laseru, především na tzv. hustotě výkonu. Jedná se o výkon laserového pulsu vztažený na plochu. Dále závisí na kvalitě 15, 16 vzniklých krystalů vzorku s matricí. 2.4. Matrice Nejčastěji se používají jako matrice aromatické kyseliny. Volí se takové, jež dobře absorbují při vlnové délce laseru, který se v přístroji využívá. Matrice by zároveň měla krystalizovat spolu se vzorkem, avšak bez vedlejších reakcí. Zároveň musí mít jistou fotostabilitu vůči laserovému pulsu, a také být stabilní ve vakuu. Nejběžněji využívané matrice jsou organické kyseliny. Matrice 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina (Sinapinic acid, SA) se většinou používá pro molekuly jako např. proteiny. Vzorec kyseliny je na obr. 7. Matrice 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (2,5-dihydroxybenzoic acid / gentisic acid, DHB) se využívá pro stanovení lipidů. Vzorec matrice, viz obr. 7. Kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová (α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid, CHC) se jako matrice využívá pro peptidy a menší molekuly, s velikostí do 10 000 Da. Vzorec kyseliny je zobrazen na obr. 7. 17 20

a) b) c) Obr. 7. Vzorce matric, a) SA, b) DHB, c) CHC 3. KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA Jako první elektroforetický jev byl popsán nenahodilý pohyb částic v koloidním roztoku, v roce 1892. Brzy na to, švédský elektrochemik Arne Tiselius, sestrojil zařízení, které umožnilo rozdělit proteiny krevního séra, vložené do elektrického pole, na základě jejich rozdílné mobility. V roce 1948 za tento objev obdržel Nobelovu cenu. V šedesátých letech vědci objevili novou metodu kapilární izotachoforézu určenou k analýze malých organických i anorganických iontů. V roce 1981 byla vědci J. W. Jorgensonem a K. D. Lukacsovou popsána separace různých iontů, např. aminokyselin, dipeptidů, aj. v kapiláře. V dnešní době se ve většině biochemických laboratoří využívá především gelová elektroforéza, která umožňuje kvalitní a účinnou separaci bílkovin. 18 3.1. Princip Základním principem elektroforézy je migrace elektricky nabitých částic ve stejnosměrném elektrickém poli, které je tvořeno vloženým konstantním napětím mezi dvě elektrody z inertního materiálu, většinou platiny. Prostředí mezi elektrodami je v zónové elektroforéze (ZE) tvořeno základním elektrolytem. Ten zajišťuje dostatečnou elektrickou vodivost celého systému. Při kapilární elektroforéze (CE) ionty jsou přitahovány k opačně nabité elektrodě anionty jsou přitahovány ke kladné elektrodě, kationty k záporné elektrodě a neutrální částice nejsou přitahovány vůbec a pohybují se v důsledku elektroosmotické toku; vysvětlen bude později. Molekuly se rozdělí na 21

základě rozdílných pohyblivostí v elektrickém poli. Dochází k separaci do jednotlivých zón, které se pohybují konstantní rychlostí. 19 Rychlost pohybu elektricky nabité částice v elektrickém poli o jednotkové intenzitě určuje tzv. elektroforetická pohyblivost µ e. Rychlost iontů je definována vztahem č. 2, E (2) kde υ udává rychlost migrujícího iontu, µ e je elektroforetická pohyblivost a E je intenzita elektrického pole. Na částici o náboji Q v elektrickém poli o intenzitě E působí dvě síly (obr. 8). Síla elektrická F 1 uvádí částici do pohybu. Velikost odporu viskózního prostředí udává síla F 2, která částici brzdí. Obr. 8. Síly působící na nabitou částici Síly působící na nabitou částici jsou dány vztahem (3) a (4), F 1 Q E (3) F 2 k 6 r (4) kde Q je náboj iontu, E je intenzita elektrického pole, koeficient k je závislý na velikosti a tvaru částice (r) a na viskozitě prostředí η, υ je rychlost iontu. V roztoku slabého elektrolytu se vyskytují vedle sebe nabité a nenabité molekuly. Podíl nabitých iontů je dán stupněm disociace α. Disociaci slabých kyselin a zásad lze ovlivnit vhodnou volbou ph základního elektrolytu. Tím se zároveň ovlivní i separace těchto látek. 3 22

3.2. Varianty kapilární elektroforézy Vzhledem k provedení a uspořádání pokusu existuje pět hlavních druhů kapilární elektroforézy. Jedná se o kapilární zónovou elektroforézu, micelární elektrokinetickou kapilární chromatografii, kapilární gelovou elektroforézu, kapilární izoelektrickou fokusaci a izotachoforézu. V této práci bude využita jen kapilární zónovou elektroforézu, o které bodu uvedeny základní informace. Kapilární zónová elektroforéza (CZE) má jeden základní elektrolyt, který dostatečně vede elektrický proud. Provádí se bez jakéhokoliv nosiče nabitých částic v tenké skleněné kapiláře. Obecné zapojení CE je patrné z obr. 9. Konce kapiláry jsou ponořeny v zásobnících se základním elektrolytem, spolu s elektrodami. Vzorek je dávkován na jednom konci kapiláry a při průchodu kapilárou dochází na základě rozdílné pohyblivosti v elektrickém poli a velikosti molekuly k separaci do zón. Díky difúzi dochází k rozmývání zónových rozhraní. Výsledkem jsou poté píky s gausovským profilem. Vzhledem k rozdílné mobilitě analytu mohou vznikat i asymetrické píky. Velkou výhodou zónové elektroforézy je schopnost během jedné separace od sebe oddělit jak anionty, kationty, tak i neutrální částice využitím elektroosmotického toku (EOF). 20 Obr. 9. Schéma uspořádání CE 3.3. Veličiny ovlivňující kapilární elektroforézu Mezi hlavní parametry ovlivňující účinnost kapilární elektroforézy patří Jouleovo teplo, elektroosmotický tok, interakce analyzovaného vzorku a základního 23

elektrolytu se stěnami kapiláry. V neposlední řadě také způsob dávkování vzorku a jeho detekce. Jouleovo teplo vzniká ve vodiči v tomto případě v pufru, kterým je naplněná kapilára při průchodu elektrického proudu. Vznikající teplo je odváděno stěnou kapiláry, proto nedochází při kapilární elektroforéze k přehřívání systému oproti plošnému uspořádání elektroforézy. U proteinů či u další teplotně nestabilních analytů může vést příliš vysoká teplota k jejich rozkladu, popř. denaturaci. Proto je žádoucí Jouleovo teplo minimalizovat. Jedním ze způsobů je použít nižší separační napětí, ale tím pádem prodloužíme dobu samotné separace a snížíme účinnost. Dalším způsobem, jak snížit Jouleovo teplo, je snížení vodivosti separačního pufru, což má za následek snížení hodnoty protékajícího proudu, a rovněž k menší produkci tepla. Nejčastěji se 20, 21 však pro minimalizaci vznikajícího tepla používají kapiláry s malým průřezem. Elektroosmotický tok (EOF) zpravidla proudí základním elektrolytem, kterým je naplněna kapilára, směrem k záporné elektrodě. Snižuje tím celkovou dobu separace a k detektoru unáší i částice, které migrují opačným směrem. Elektroforetická pohyblivost anionů je záporná, u kationů naopak kladná. Z toho vyplývá, že použijemeli kladné separační napětí, budou se kationy pohybovat rychleji než aniony. Neutrální částice se pohybují stejnou rychlostí jako je rychlost EOF, jelikož jejich elektroforetická pohyblivost je nulová. Elektroosmotický tok lze ovlivnit teplotou, pomocí ph použitého elektrolytu, iontovou silou elektrolytu a vnitřním povrchem kapiláry. Silanolové skupiny, které jsou na vnitřních stěnách kapiláry, disociují v prostředích o vyšších ph a tím vytvářejí záporný náboj stěny kapiláry (5). Záporný náboj na sebe naváže kladné ionty ze základního elektrolytu a vzniká tzv. Steinerova vrstva. SiOH SiO H (5) Reakce se stěnou kapiláry je nežádoucí, jelikož po navázání separované částice na stěnu kapiláry dochází ke zvětšení EOF, k rozšiřování píků a celkově ke snížení účinnosti separace. Navázání analytu na stěnu kapiláry lze zamezit úpravou základního elektrolytu, např. přidání vhodného organického rozpouštědla. Nejčastěji se využívá metanol či etanol. Někdy se volí extrémní hodnoty ph nebo se do elektrolytu přidá inertní sůl, např. NaCl. To, jakým způsobem elektrolyt upravíme, záleží na typu separované látky. 22 24

3.4. Instrumentace Aparatura pro kapilární elektroforézu se skládá z rezervoáru pufru, kapiláry, detektoru. Používají se křemenné nebo skleněné kapiláry, které jsou potaženy ochranou polyimidovou vrstvou. Kapilára by jinak byla velmi křehká. Polyimidová vrstva se musí v místě, kde prochází detektorem, odstranit. Nejčastěji se využívají kapiláry s vnitřním průměrem 50 až 75 μm, v rozmezí délek od 25 do 100 cm. Dávkování vzorku je možno provádět dvěma způsoby. Prvním způsobem je elektrokinetické dávkování, které se provádí za pomoci elektrického proudu po daný vymezený časový interval. Nadávkované množství analytu se poté vypočítá z rovnice (6), Q r 2 E t c ( EOF b ) s (6) kde Q je množství nadávkovaného analytu, r je poloměr kapiláry, E je intenzita elektrického pole, t je doba dávkování, μ je mobilita molekul analytu, μ EOF je mobilita 22, 23 EOF, λb je vodivost analytu, λs je vodivost pufru. Druhý způsob dávkování je hydrodynamicky. Toho lze docílit buď tlakem na straně vzorku, vytvořením vakua na straně detektoru nebo rozdílem hladin. Nadávkované množství lze vypočítat z Poiseuilleovy rovnice (7), 4 d P t c Q 128 l (7) kde Q je množství nadávkovaného analytu, d je průměr kapiláry, ΔP je rozdíl tlaků na začátku a konci kapiláry, t je délka injektáže, c je koncentrace analytu, η je viskozita 22, 23 analytu, l je celková délka kapiláry. Detektor v kapilární elektroforéze může být jakéhokoliv typu. Je potřeba, aby s ním šlo stanovit široké množství analytů, ať se jedná o složité makromolekuly či jednoduché částice ať už anorganického nebo organického původu. Nejběžněji využívaným detektorem pro kapilární elektroforézu je absorpční UV-Vis detektor. Je velmi univerzální a lze jej díky tomu využít ke stanovení nepřeberného množství analytů. Jedno z omezení pro absorpční detektor je použití pufru. Ten nesmí v žádné z vlnových délek absorbovat a nesmí obsahovat nečistoty, které by mohly rušit samotnou detekci. Právě z toho důvodu, se většinou využívají pufry anorganické, které 25

mají vysokou čistotu a neobsahují ve své struktuře, na rozdíl od organických pufrů, chromofor. Nejčastěji se využívají anorganické pufry fosfátový či borátový. Dalšími typy detektorů, které se dají pro kapilární elektroforézu využít, jsou hmotnostní a fluorescenční. Dále se pak využívá vodivostní, chemiluminiscenční 21, 23, 24 detekce, amperometrická detekce, aj. 26

CÍLE PRÁCE Cílem této práce bylo zvládnout na teoretické, ale i praktické úrovni dvě analytické separační techniky. A to metody hmotnostní spektrometrie MALDI- TOF MS a kapilární zónovou elektroforézu. Jedním z cílů této práce bylo vyzkoušet oxidativní značení hydroxylovými radikály. A detekci pomocí hmotnostní spektrometrické metody zjišťující přístupnost molekulám rozpouštědla. Cílem projektu, pro který zkoušíme oxidativní značení hydroxylovými radikály, je implementace a vylepšení oxidativního značení a jejich společné aplikace v kombinaci s hmotnostní spektrometrií s vysokým rozlišením při studiu strukturních změn různých proteinů. Úkolem bylo navrhnout vhodné uspořádání experimentu a ověřit jeho funkčnost. Za použití laseru o vlnové délce 266 nm, který má na rozdíl od laserů v literatuře nižší energii pulsu, ale vyšší frekvenci. Praktické testy kapilární zónové elektroforézy probíhaly se vzorky bradykininu, v případě MALDI-TOF MS na vzorcích aminokyselin methioninu a cysteinu s peptidu [D-Pro 2, D-Trp 7,9 ]-substance P. Ty byly před detekcí pomocí MALDI-TOF MS vystaven působní laseru, aby proběhla fotochemická oxidace. 27

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4. Seznam použitých chemikálií - Methionin, p.a. čistota (Lachema, ČR) - Cystein, p.a. čistota (Himreaktivkomplekt, Uzbekistán) - [D-Pro 2, D-Trp 7,9 ]-substance P, 99 % (Sigma-Aldrich, Německo) - Peroxid vodíku, 30% (H 2 O 2, Lach-Ner s.r.o, ČR) - Kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová, 98% (Sigma-Aldrich, Německo) dále jen CHC - Acetonitril, 98% (CH 3 CN, Sigma-Aldrich, Německo) dále jen ACN - Kyselina triflouroctová, 98% (CF 3 CO 2 H, Sigma-Aldrich, Německo) dále jen TFA - Kalmix směs peptidů, pro kalibraci MS, složení je uvedeno v Tab. I. Tab. I. Složení směsi kalmix Peptid c (μm) M (g.mol -1 ) monoizotopická Bradykinin (Sigma-Aldrich,Steinheim, Německo) 1 1059,56 Angiotensin I (Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo) 1 1295,68 Renin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo) 2 1759,94 ACTH (Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo) 5 2464,19 - Bradykinin, lidský, syntetický, 99 %, B-3259 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo) - Angiotensin I, lidský, syntetický, 97 %, A-9650 (Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo) - 2-amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol - 99,9% (C 4 H 11 NO 3 ; Sigma Aldrich, Steinherin, Německo) dále jen Tris - Chlorid sodný, p. a. čistota (NaCl, Lachema, Brno, Česká republika) - Hydroxid sodný 98 % (NaOH, Lachema, Brno, Česká republika) - Kyselina chlorovodíková 35% p. a. (HCl, Penta, Chrudim, Česká republika) 28

Veškeré roztoky byly připraveny z redestilované vody, jež byla připravena v křemenné aparatuře (Haraeus, Německo). 5. Přístroje a software - Digitální váhy (RADWAG RADOM, typ: WAX 40/160; Polsko) - Ultrazvuková lázeň (NOTUS-POWERSONIC s.r.o., Vráble, Slovenská republika) - ph-metr (ORION, model 720A; Česká republika) - UV-Vis detektor Spektra 100 (Newport Corporation, Mountain View, California, USA) - nekomerční software vytvořený v programu LabView 6.1 a s převodníkovou A/D kartou BNC-2110 (National Instruments, Austin, Texas, USA) - Zdroj vysokého napětí byl sestavený v Ústavu chemie ing. Pavlem Krásenským - Laser typ LCS-DTL-382QT (Laser - compact Co. Ltd., Moskva, Rusko) - MALDI-TOF MS Autoflex Speed (Bruker Daltonics) - měřič výkonu laseru (Nova ΙΙ - Laser Power Meter & Energy Meter, USA) Výsledky z měření MALDI-TOF MS byly zpracovány softwarem flexanalysis 3.3 (Bruker Daltonics), výsledky z elektroforetického měření byly zpracovány v MS Excel 2007 (Microsoft, USA). 5.1. Aparatura pro FPOP Aparatura pro rychlou fotochemickou oxidaci byla sestrojena za pomoci laseru Nd:YAG s násobičem frekvence, emitujícího záření s vlnovou délkou 266 nm a frekvence až 10 khz. Další součástí je sada čoček, která zaostřuje paprsek laseru do užšího svazku. Křemenná kapilára je uchycena v částečně mechanizovaném držáku. Dávkování vzorku do kapiláry bylo prováděno kapilárním vzlínáním. K přenesení analytu na MALDI destičku bylo prováděno stříkačkou Hamilton, o celkovém objemu 25 µl. Jednotlivé části aparatury jsou ukotveny do optické lavice. Aparatura je zobrazena na obr. 10. Měření a vyhodnocování výsledků bylo prováděno za pomoci MALDI-TOF MS analyzátoru Bruker Daltonics. 29

Obr. 10. Sestava pro FPOP 5.2. Aparatura pro CZE Měření bylo prováděno na aparatuře CE-UV (obr. 11.), pro detekci sloužil komerční UV-Vis detektor Spektra 100. Jako zdroj vysokého napětí je využit přístroj, sestavený na Ústavu chemie ing. Pavlem Krásenkým. Signály z detektoru jsou zaznamenány programem CEUV v prostředí LabView 6.1. Obr. 11. Aparatura CZE, převzato 25 30

VÝSLEDKY A DISKUZE 6. Fotochemická oxidace Rychlá fotochemická oxidace byla podle článku 4, prováděna excimerovým laserem. V našich laboratorních podmínkách je k dispozici neodymový laser. Rozdíl parametrů laserů dle výrobců je uveden v Tab. II. Byl změřen výkon laseru a určena optimální frekvence, při které se vyrovnají rozdíly mezi oběma lasery. Tab. II. Parametry laserů Parametry LCS-DTL-382QT EX50 excimer laser 4 Vlnová délka [nm] 266 248 Max. energie [µj] 3 50 Délka pulsu [ns] 10 17-20 Opakovací frekvence [Hz] 200-10 000 max. 250 6.1. Charakterizace laseru Bylo potřeba zjistit, zdali bude laser, který máme k dispozici schopen vyvinout dostatečný výkon k provedení detekovatelné fotochemické oxidaci. Cílem tohoto experimentu bylo zjistit podmínky, při kterých bude výkon laseru maximální. Měření výkonu bylo provedeno v rozmezí frekvencí od 200 Hz po 5000 Hz. Jedno měření při právě jedné frekvenci trvalo 15 minut. Hodnoty byly odečítány z měřiče výkonu laseru. Jak vyplývá z grafického vyhodnocení výsledků (obr. 12.), nejvyššího výkonu je dosaženo při opakovací frekvenci laseru 2,0 khz, i když stabilita je nižší. 31

Obr. 12. Graf závislosti výkonu laseru na čase, opakovací frekvence jsou udány v grafu 6.2. Obecný postup dávkování Vzorek aminokyseliny či peptidu byl do kapiláry nadávkován pomoci kapilárního vzlínání, do výšky 0,05 1 mm. Průměrné nadávkované množství vzorku bylo vypočteno jako 1 nl. Záměrně je zvolené takto malá dávka vzorku, aby byl laser zaostřený do celého objemu a došlo tak k fotochemické oxidaci v celém množství vzorku. Konec kapiláry, na který je dávkován vzorek, musel být předem zbaven ochranné polyimidové vrstvy. To se provádí jednoduchým opálením, za pomoci zapalovače. Polyimidová vrstva zuhelnatí a zbytky jsou otřeny laboratorní buničinou s ethanolem. Tím získáme křehkou, ale průhlednou část kapiláry, do které následně zaostříme i laserový paprsek. Jednotlivé vzorky byly do kapiláry naneseny v roztoku peroxidu vodíku o koncentraci 15 mm. Koncentrace vzorků aminokyselin byla 1 mg/ml. Analyzovaný roztok byl těsně před experimentem smíchán ve vialce v poměru 1 : 1 aminokyselina, peroxid vodíku. 32

Intens. [a.u.] 6.3. Indukce hydroxylových radikálů Po navzlínání vzorku byla prováděna série ozařování. Vzorek nebyl ozařovaný vůbec, tj. čas 0 sekund, další vzorek byl ozařovaný 5 sekund a poté 10 sekund. Po každém ozáření byl analyt přenesen na MALDI destičku. Každé měření bylo opakováno 5 krát a po měření byla kapilára promyta peroxidem vodíku a redestilovanou vodou. 7. MALDI-TOF MS 7.1. Příprava matrice Na základě literární rešerše byla zvolena jako vhodná matrice pro nanášení vzorku aminokyselin zvolena matrice CHC. Tato matrice je vhodná i pro malé molekuly, jakými právě jsou aminokyseliny. Spektrum samotné matrice je patrné z obr.13. Matrice byla vždy připravována čerstvá. Navážka matrice se pohybovala v rozmezí od 10,0 do 12,0 mg. K navážce bylo přidáno 500 µl acetonitrilu (ACN) 400 µl redestilované vody a 100 µl kyseliny trifluoroctové (TFA). Připravený roztok matrice se vložil na 5 minut do ultrazvukové lázně. Poté se nanášela na destičku způsobem, který spočívá v tom, že roztoky matrice a vzorku se nanesou odděleně. Na destičku se jako první nanese matrice, v těkavém rozpouštědle a nechá se zaschnout. x10 4 172.124 190.136 212.125 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 160 180 200 220 240 260 m/z Obr. 13. Spektrum matrice CHC 33

7.2. Nanášení vzorku na MALDI destičku Po ozáření byl vzorek přenesen na MALDI destičku, na které byla předem nanesená a zaschlá matrice. Vzorek byl vytlačen z kapiláry pomocí stříkačky Hamilton. Po nanesení vzorku na matrici se nechá vzorek zcela zaschnout, a až poté se vkládá do přístroje k analyzování. S MALDI destičkou bylo nutné pracovat v laboratorních nepudrovaných rukavicích, aby nedošlo ke kontaminaci vzorku a celou dobu, co s ní nepracuje, se uchovává v neprodyšné plastové krabičce. 7.3. FPOP methioninu Roztok methioninu byl připraven v koncentraci 1,0 mg/ml. Navážka vzorku byla rozpuštěna v redestilované vodě. Před nanesením do kapiláry, bylo odpipetováno 20 µl roztoku vzorku a smícháno s 20 µl 15 mm peroxidu vodíku, v oddělené vialce. Nepoužívaný roztok byl uchováván v chladu. To samé platilo i pro vzorek cysteinu a peptidu. Po smíchání roztoku methioninu s peroxidem vodíku, se pomocí kapilárního vzlínání nadávkoval do kapiláry ~ 1 nl analytu. Provedla se série ozařování a ozářené vzorky se pak nanesly na MALDI destičku a analyzovaly. Molekulová hmotnost methioninu je 149,21 g.mol -1 a jeho pseudomolekulární pík je velice dobře patrný na obr. 14. Vzhledem k přidanému protonu, je m/z methioninu 150,20. Vzhledem k tomu, že se dobře oxiduje, dochází k částečné oxidaci již po smíchání s roztokem peroxidu vodíku (obr.15). Po prvním ozáření se oxidace ještě znatelnější (obr. 16). Po ozařování vzorku 10 sekund, je již patrný i výskyt druhé oxidované formy methioninu (obr. 17). Zoxidované formy lze odlišit podle nárůstu molekulové hmotnosti o + 16 (tj. první stupeň oxidace) a + 32 (tj. druhý stupeň oxidace). 34

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] x10 4 150.165 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 140 160 180 200 220 240 260 m/z Obr. 14. Hmotnostní spektrum methioninu x10 4 166.158 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 140 160 180 200 220 240 260 Obr. 15. Hmotnostní spektrum methioninu v roztoku s peroxidem vodíku m/z 35

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] x10 4 166.147 5 4 3 2 1 0 140 160 180 200 220 240 260 m/z Obr. 16. Hmotnostní spektrum methioninu methioninu, zoxidovaního do 1. stupně. Ozařování bylo prováděno 5 s x10 4 5 4 166.135 3 2 1 182.262 0 140 160 180 200 220 240 260 m/z Obr. 17. Hmotnostní spektrum methioninu methioninu, zoxidovaního do 1. stupně. Ozařování bylo prováděno 5 s 7.4. FPOP cysteinu Jelikož je cystein velice snadno oxidovatelný již samotným vzdušným kyslíkem, bylo potřeba z vody, která se použila pro přípravu roztoku o koncentraci 1 mg/ml, vypudit kyslík. Voda se tedy nechala 10 minut sytit plynným dusíkem ve vialce, ve které byl připraven zásobní roztok cysteinu. 36

Intens. [a.u.] Před nanášením do kapiláry bylo do připravené vialky napipetovváno 20 µl roztoku vzorku přímo do 20 µl 15 mm peroxidu vodíku. Takto připravený vzorek se téměř okamžitě nechal navzlínat a provedla se fotolýza peroxidu vodíku, za vzniku hydroxylových radikálů, zaostřeným laserovým paprskem. Aby se co nejméně Cys oxidovalo samotným peroxidem. Molekulová hmotnost cysteinu je 121,16 g.mol -1. Kvůli snadné oxidovatelnosti není pík jeho samotného dominantní, ale již je vidět i jeho oxidovaná forma v poměru intenzit cystein : cystin je 1 : 1 (obr. 18.). Hodnota m/z pro cystein je 122,16. Hodnota m/z zoxidované formy je 241,2. Mírné odchylky pozorovaných m/z jsou způsobeny nedokonalou externí kalibrací ma kalibrační směs proteinů, viz. Tab. I. Po smíchání s roztokem peroxidu vodíku byl nárůst oxidovatelné formy o něco málo znatelnější, ale výrazný nárůst nebyl zaznamenán. Naopak po prvním ozáření je nárůst oxidované formy patrný (obr. 19). Poměru intenzit cystein : cystin je 1 : 2. Jakmile je vzorek ozařován po dobu 10 sekund, je výskyt Cystinu mnohem výraznější (obr. 20). Poměr intenzit cystein : cystin je 1 : 4. 4000 3000 2000 1000 122.126 241.120 0 120 140 160 180 200 220 240 m/z Obr. 18. Hmotnostní spektrum cysteinu, s pozorovatelným cystinem 37

Intens. [a.u.] Intens. [a.u.] x10 5 2.0 1.5 1.0 241.201 0.5 122.193 0.0 100 120 140 160 180 200 220 240 m/z Obr. 19. Hmotnostní spektrum cysteinu, s lépe patrným cystinem Ozařování bylo prováděno 5 s. x10 4 6 4 2 241.161 122.178 0 100 120 140 160 180 200 220 240 m/z Obr. 20. Hmotnostní spektrum cysteinu, s výrazným cystinem Ozařování bylo prováděno 10 s. 7.5. FPOP peptidu Substance P je peptid, který je složený z jedenácti aminokyselin. Má hormonální účinky ve střevě a slouží jako neurotransmiter v mozkové tkáni. Je uplatňován při vnímání bolesti. Ve střevě se jeho aktivita projevuje stahy hladké svaloviny. Mimoto má i silné účinky na snižování krevního tlaku. 26 38

Analýza substance P byla prováděna na jiné aparatuře, než měření metioninu a cysteinu. Dávkováno bylo 10 nl vzorku a laser nebyl zcela zaostřen. Nedošlo tedy k oxidaci v celém objemu a ozařování trvalo jen 5 sekund. Molekulová hmotnost [D-Pro 2, D-Trp 7,9 ]-substance P je 1515,18 g.mol -1. Vzhledem k přidanému protonu, je m/z methioninu 1516,20. Jelikož se dobře oxiduje, dochází k oxidaci již po smíchání s roztokem peroxidu vodíku (obr. 15). Po ozáření je oxidace znatelnější (obr. 16). Zoxidované formy lze odlišit podle nárůstu m/z o + 16 (tj. první stupeň oxidace) a + 32 (tj. druhý stupeň oxidace). Obr. 21. Hmotnostní spektrum substance P v roztoku s peroxidem vodíku, s pozorovatelnými oxidovanými formami. Ozařování bylo prováděno 5 s. 39

Obr. 21. Hmotnostní spektrum substance P v roztoku s peroxidem vodíku, s pozorovatelnými oxidovanými formami, 8. Zónová kapilární elektroforéza Cílem bylo zvládnout základní postupy CZE, aby bylo možné později tuto metody využít v kombinaci s FPOP. Před zahájením každého měření byla kapilára kondiciována, tzn., že byla promývána 15 minut 0,1 M NaOH, 5 minut redestilovanou vodou, poté 15 minut 0,1 M HCl a následně opět redestilovanou vodou. Naposled se při zapnutém napětí nechala kapilára 10 minut kondiciovat při EOF základního elektrolytu. Mezi jednotlivými měřeními byla kapilára promývána 5 minut redestilovanou vodou, 10 minut 0,1 M NaOH, 5 minut redestilovanou vodou, 10 minut 0,1 M HCl, opět vodou a nakonec se nechala kondiciovat 5 minut při EOF na základní elektrolyt. Kapilára byla promývána pomocí mikropumpy, aby se zlepšila reprodukovatelnost promývání. Pro měření byla využita křemenná kapilára, potažená polyamidovou ochrannou vrstvou, o celkové délce 37 cm a vnitřním průměru 50 µm. Efektivní délka kapiláry, 40

tj. od konce, kde se provádí dávkování, po detektor, byla 30 cm. Měření bylo prováděno při vlnové délce 205 nm, a separačním napětí v rozmezí od 5 do 13 kv. 8.1. Vyhodnocení výsledků Pro ověření, zda měření je dostatečně reprodukovatelné byla z migračních časů jednotlivých vzorků vypočtena relativní směrodatné odchylka (RSD), dle vzorce (8): s RSD =100 x (8) kde s je směrodatná odchylka migračních časů, x je průměr migračních časů. RSD se udává v procentech. 27 8.2. Analýza angiotensinu I Angionensin I je komerčně dostupný peptidový hormon. Ve své struktuře obsahuje 10 aminokyselinových zbytků (DRVYIHPFHL). Jeho molekulová hmotnost je 1297 g.mol -1 a izolektrický bod pi je 7,2. Tento peptidový hormon patří mezi nejúčinnější vazokonstrikční látky. Vyvolává zvýšení krevního tlaku, ovlivňuje rovněž kůru nadledvin, kde působí jakožto hlavní stimulátor sekrece mineralokortikoidu aldosteronu. 28 Jako základní elektrolyt byl zvolen a připraven roztok 50 mm Tris s 50 mm NaCl. Tento roztok byl pomocí 36 % HCl ztitrován na ph 9,0. 25 Vzorek angiotensinu I, o koncentraci 0,1 mg/ml, byl dávkován hydrodynamicky z výšky 7,0 cm, po dobu 10 s. Do systému bylo vloženo napětí 6 kv, při kterém procházel proud 34,7 µa. Elektrogramy angiotensinu I ze tří experimentů jsou na obr. 23. RSD migračních časů byla 21,4 %. Negativní pík je spojený s EOF, jelikož byl vzorek dávkován z vody. 41

Obr. 23. Elektrogramy angiotensinu I, vzorek 0,1 mg/ml angiotensin I, základní elektrolyt 50 mm Tris/HCl + 50 mm NaCl (ph 9,0). Z toho důvodu, že se nepodařilo dosáhnout dostatečné reprodukovatelnosti separace angiotensinu I, bylo měření vyzkoušeno na dalším vzorku, bradykininu. 8.3. Analýza bradykininu Bradykinin je fyziologicky a farmakologicky účinný peptid o 9 aminokyselinách (RPPGFSPFR). Patří do kininové skupiny bílkovin a je jedním z hormonů krevní plazmy. Jeho molekulová hmotnost je 1060 g.mol -1 a izoelektrický pi je 12,0. Působí dilataci krevních vlásečnic, čímž dochází ke snížení krevního tlaku. 29 Byla provedena separace bradykininu pro roztoky o koncentracích 0,5 a 1,0 mg/ml. Jako základní elektrolyt byl opět využit 50 mm Tris s 50 mm NaCl, ztitrovaný 36 % HCl na ph 9,0. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky. Koncentrovanější vzorek byl dávkován z výšky 4 cm, po dobu 7 sekund. Vzorek s nižší koncentrací byl dávkován z výšky 7 cm, po dobu 10 sekund. Na kapiláru bylo vloženo separační napětí 8 kv, při kterém procházel proud 51,9 µa. Z retenčních časů pro jednotlivá měření (Tab. III.) byly vypočítány relativní směrodatné odchylky. Pro koncentrovanější vzorek byla RSD vypočítána na 5,2 % a výsledky nebyly odlehlé, což dokazuje i grafické vyhodnocení (obr. 24.). U méně 42

koncentrovaného vzorku byla RSD 11,6 % (obr. 25.). Rozdíl je způsoben částečnou sorpcí méně koncentrovaného roztoku na stěnu kapiláry. Bradykinin má pi 12,0 a je tak kladně nabitý, zatímco stěny kapiláry nesou náboj záporný. Negativní pík, jež je na obrázku 23 i 24 vidět, je spojený s EOF, jelikož byl vzorek dávkován z vody. Tab. III. Retenční časy C [mg/ml] Retenční čas [s] 1. 2. měření měření 3. měření 4. měření RSD [%] 1,0 317,6 286,2 309,2 319,1 5,2 0,5 403,4 341,4 372,8 317,6 11,6 Obr. 24. Elektrogram bradykininu, vzorek 1,0 mg/ml Bradykinin, základní elektrolyt 50 mm Tris/HCl + 50 mm NaCl (ph 9,0). 43

Obr. 25. Elektrogram bradykininu, vzorek 0,5 mg/ml Bradykinin, základní elektrolyt 50 mm Tris/HCl + 50 mm NaCl (ph 9,0). 44