Bc. Anna Hynková. Modulation of the ankyrin TRPA1 receptor by divalent cations

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: BIOCHEMIE Studijní obor: Biochemie Bc. Anna Hynková Modulace ankyrinového receptoru TRPA1 divalentními kationty Modulation of the ankyrin TRPA1 receptor by divalent cations Diplomová práce Školitel: prof. RNDr. Jiří Hudeček, CSc. Práce vznikla v oddělení buněčné neurofyziologie Fyziologického ústavu AV ČR v Praze pod odborným vedením RNDr. Viktorie Vlachové, DrSc. Praha, 2012

Prohlášení Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze 10. května 2012 Anna Hynková 2

Poděkování Ráda bych především poděkovala své konzultantce, paní doktorce Viktorii Vlachové za cenné rady, ochotu, vstřícnost a veškerou pomoc při řešení této diplomové práce. Díky ní jsem měla možnost pracovat na velmi zajímavém projektu a získat přehled o problematice TRP receptorů. Dále patří můj velký dík mé kolegyni Lucii Suré, která mě naučila potřebné laboratorní techniky a byla vždy ochotná mi poradit. V neposlední řadě děkuji také svému školiteli, panu profesorovi Jiřímu Hudečkovi za rady při psaní diplomové práce. 3

ABSTRAKT TRPA1 je jediným zástupcem ankyrinové podrodiny TRP (transient receptor potential) iontových kanálů. Tento iontový kanál je převážně exprimován na senzorických neuronech, v srdci, mozku a plicních fibroblastech, kde může být aktivován podněty různých senzorických modalit, včetně širokého spektra dráždivých nebo pálivých látek, které potenciálně ohrožují živý organismus: isothiokyanáty, akrolein, cinnamal a jeho deriváty, nikotin a různé produkty oxidativního stresu. Kromě těchto chemických látek může být TRPA1 kanál také aktivován a současně inaktivován nitrobuněčnými vápenatými ionty. Přesné mechanizmy těchto regulačních dějů jsou však zatím neobjasněné. TRPA1 je neselektivním iontovým kanálem, který je propustný pro vápenaté ionty, ale odhady relativní propustnosti získané v různých laboratořích se velmi liší (od 0,84 do 7,9), tyto hodnoty navíc silně závisejí na délce a způsobu aktivace iontového kanálu. Ukazuje se, že míra modulace TRPA1 kanálu dvojmocnými kationty je závislá na typu a celkovém množství procházejících iontů, jež dynamicky modulují jeho aktivitu. Výsledková část předložené diplomové práce přináší nové poznatky týkající se účinku vápenatých iontů, jejichž zvýšená koncentrace v extracelulárním prostředí přechodně zvyšuje a poté následně inhibuje aktivitu TRPA1 receptoru vyvolanou chemicky a depolarizací membránového potenciálu. Práce charakterizuje modulační účinek některých dalších dvojmocných kationtů, které mohou podobně jako vápenaté ionty účinně zvyšovat pravděpodobnost otevření iontového kanálu tím, že procházejí pórem do intracelulárního prostředí, odkud modulují jeho aktivitu. Součástí diplomové práce bylo také aktivně přispět k týmové studii zaměřené na identifikaci specifické oblasti cytoplazmatického C-konce lidského TRPA1 receptoru, která by mohla představovat vazebnou doménu pro vápenaté ionty. Studie přispívá k upřesnění molekulární struktury TRPA1 receptoru a tím i k bližší specifikaci účinné chemické struktury látek s potenciálním modulačním účinkem, jež by mohly být předlohou pro vývoj nových přesně cílených analgetik. Klíčová slova: ankyrinový receptor, iontový kanál, přechodný receptorový potenciál, transdukce signálu, divalentní kationty, bodová mutace N855S 4

ABSTRACT (in Czech) TRPA1 is the only mammalian member of the ankyrin type subfamily of transient receptor potential (TRP) ion channels. This channel is widely expressed in many cell types and tissues, including sensory neurones, heart, brain, and lung, where it detects stimuli of different sensory modalities, including a broad spectrum of potentially harmful irritants and pungent compounds, such as isothiocyanates, thiosulfinates, acrolein, cinnamaldehyde derivatives, eugenol, nicotine, as well as multiple products of oxidative stress. In addition to these chemicals, TRPA1 channel can be also activated and, concurrently, inhibited by intracellular calcium, however, the exact mechanisms of this regulation are still unclear. TRPA1 is a nonselective cation channel, permeable for calcium ions, however, relative scattered data on TRPA1 channel selectivity provide divergent estimates ranging from 0,84 to 7,9; in addition, these values strongly depend on the activation mode of the channel. It appears that the extent to which calcium ions dynamically modulate TRPA1 depends on the total amount of cations permeating the ion channel pore. This diploma thesis contributes to the understanding of this topic by (i) investigating the effects of extracellular calcium ions on chemically and voltage- induced activity of human TRPA1 channels expressed in HEK293T cells, (ii) characterizing the modulatory effects of some other divalent cations and exploring their ability to substitute for calcium ions, (iii) identification and characterization of the C terminal intracellular domain that is predicted to bind calcium ions in human TRPA1 receptor. The results of this thesis reveal new mechanisms involved in the modulation of TRPA1 by divalent cations and may eventually allow us to understand the physiological roles these processes may play in thermal and inflammatory pain. Key words: ankyrin receptor, ion channel, transient receptor potential, signal transduction, divalent cations, point mutation N855S 5

OBSAH ABSTRAKT... 4 ABSTRACT... 5 OBSAH... 6 SEZNAM ZKRATEK... 7 1. Úvod... 9 2. Literární přehled... 11 2.1. Fyziologická úloha a exprese TRPA1 kanálu... 11 2.2. Regulace TRPA1 buněčnými signálními drahami... 13 2.2.1. Heterologní desenzitizace TRPA1... 13 2.2.2. Senzitizace TRPA1 buněčnými signálními drahami... 14 2.2.3. Aktivace TRPA1 chladem a mezidruhové rozdíly... 15 2.3. Strukturální vlastnosti TRPA1... 16 2.4. Agonisté TRPA1... 18 2.5. Aktivace a inaktivace (desenzitizace) TRPA1 - Ca 2+... 21 3. Cíle práce... 23 4. Experimentální část... 24 4.1. Použitý materiál a chemikálie... 24 4.1.1. Chemikálie... 24 4.1.2. Biologický materiál... 24 4.1.3. Přístroje a pomůcky... 24 4.2. Tkáňové kultury, transfekce a molekulárně biologické konstrukty... 25 4.3. Elektrofyziologická technika patch clamp... 25 4.4. Experimentální roztoky... 26 4.5. Příprava DNA konstruktů... 27 4.5.1. PCR mutageneze... 27 4.6. Hodnocení záznamů a statistická analýza... 31 5. Výsledky... 32 5.1. Modulace membránových proudů vyvolaných aktivací TRPA1 cinnamalem a Ca 2+ z extracelulární strany... 32 5.1.1. Aktivace TRPA1 receptoru vápenatými ionty... 32 5.1.2. Inaktivace TRPA1 receptoru vápenatými ionty... 35 5.2. Modulace napěťové aktivace... 37 5.2.1. Test citlivosti TRPA1 k depolarizujícímu membránovému potenciálu... 37 5.2.2. HB-ICS IV na začátku měření a po 60 75 s od protržení buněčné membrány... 38 5.2.3. HCa-ICS na začátku měření a po 60 75 s od protržení buněčné membrány... 39 5.3. Vliv intracelulární chelatace na TRPA1... 40 5.4. Modulace TRPA1 Ba 2+ ionty... 42 5.5. Modulace TRPA1 Mg 2+ ionty... 44 5.6. Modulace TRPA1 Zn 2+ ionty... 45 5.7. Funkční charakterizace mutantu N855S... 46 6. Diskuze... 48 7. Závěr... 54 8. Seznam literatury... 55 6

SEZNAM ZKRATEK AA AITC Ard camp cdna CNS ATP DAG DMSO DMNP-EDTA dntp ECS EDTA EGTA FBS GDI GFP GPCRs aminokyselina allyl isothiokyanát ankyrin repeat domain, ankyrinová doména cyklický adenosin monofosfát DNA získaná přepisem RNA centrální nervová soustava adenosin trifosfát diacylglycerol dimethylsulfoxid fotolabilní derivát ethylendiamintetraoctové kyseliny deoxynukleotidtrifosfát extracelulární roztok ethylendiamintetraoctová kyselina ethylenglykoltetraoctová kyselina fetální hovězí sérum selektivní filtr, který je součástí póru iontového kanálu zelený fluorescenční protein receptory spřažené s G-proteiny (G-protein coupled receptors) HB-ICS intracelulární roztok obsahující 5 mm EGTA a 3 mm CaCl 2 HCa-ICS intracelulární roztok obsahující 10 mm EGTA a 10,24 mm CaCl 2 HEDTA (2-hydroxyethyl)ethylendiamintrioctová kyselina HEK293T lidské ledvinné embryonální buňky 293T htrpa1 lidský receptor TRPA1 ICS intracelulární roztok IP 3 inositol trifosfát mtrpa1 myší receptor TRPA1 P pórový helix PAR 2 proteasou aktivovaný receptor 2 PIP 2 fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát PKA proteinkinasa A PKC proteinkinasa C 7

PLC fosfolipasa C S1 S6 označení transmembránových domén 1 až 6 monomeru proteinu TRPA1 SEM střední chyba průměru T 50 THC TRP čas dosažení poloviční účinné inhibice δ-9-tetrahydrocannabinol přechodný receptorový potenciál ( transient receptor potential ) TRPA1 TRP ankyrinový receptor podtypu 1 Trpa1 gen TRPA1 proteinu Trpa1 -/- vyřazený gen TRPA1 proteinu TRPV1 TRP vaniloidní receptor podtypu 1 WT divoký typ TRPA1 receptoru ( wild-type ) 15d PGJ 2 15-deoxy- -12,14-prostaglandin J 2 8

1. ÚVOD Iontové kanály TRP (z anglického transient receptor potential ) jsou významnou skupinou transdukčních molekul. Některé z těchto receptorů jsou exprimovány na periferních zakončeních primárních aferentních senzorických neuronů, kde umožňují převádět podněty různých modalit na elektrický signál. Transdukční TRP kanály mohou být aktivovány nejen klasickým mechanizmem ligand-receptor, ale také vnějšími podněty fyzikálního charakteru: změnou teploty, změnou osmotického tlaku, světlem, deformací nebo depolarizací buněčné membrány. Díky těmto vlastnostem hrají různé sestřihové varianty TRP receptorů důležitou roli v převodu senzorických informací různých modalit (zrak, čich, sluch, mechanické nebo teplotní vnímání) a podílejí se na celé řadě dalších buněčných procesů (např. doplňování zásob intracelulárního vápníku, modulace buněčného cyklu, regulace homeostázy Ca 2+ a Mg 2+ ), čímž představují zřejmě jeden z evolučně nejstarších obranných mechanizmů živých organismů /1,2/. Savčí TRP receptory jsou kódovány 28 geny a podle strukturální příbuznosti jsou rozděleny do 6 podrodin: kanonické (TRPC), vaniloidní (TRPV), melastatinové (TRPM), polycystinové (TRPP), mukolipinové (TRP-ML) a ankyrinové (TRPA) /3/. Receptor TRPA1 je jediným zástupcem ankyrinové rodiny TRP receptorů u savců. Poprvé byl vyklonován v roce 1999 z lidských fibroblastů /4/, ale úloha tohoto proteinu jako iontového kanálu nebyla rozpoznána. Molekulární mechanizmy aktivace TRPA1 kanálu byly studovány až od roku 2003, kdy byl tento receptor identifikován v nociceptivních drahách /5/. Při studiu TRPA1 receptoru byly využity dříve získané poznatky o příbuzných TRP receptorech, neboť některé strukturální a funkční znaky mají TRP receptory společné. Jedním z takových charakteristických znaků je polymodalita, tj. schopnost integrovat signály různé povahy (chemické či fyzikální) a různého původu (intraa extracelulárního) /1/. Zatím bylo popsáno jen několik typů vzácných onemocnění u člověka, jejichž příčinou je porucha funkce některého z TRP proteinů: například rodiny TRPML a TRPP jsou pojmenovány po lidských chorobách mukolipidóze (typu IV) a polycystickém onemocnění ledvin /6/. Neustále však přibývají nové informace získané z nedávných rozsáhlých genomických studií, které umožnily identifikaci genů, pro které byla prokázána souvislost s porušenou funkcí senzorického systému /7,8,9,10/. 9

V nedávné době bylo zjištěno, že bodová mutace N855S proteinu lidského TRPA1 receptoru v transmembránové oblasti je zodpovědná za vzácné dědičné onemocnění familiární epizodický bolestivý syndrom /11/. Přestože autoři studie předložili hypotézu, že aminokyselinový zbytek N855 je součástí 4. transmembránové domény, přičemž jeho mutace může ovlivňovat citlivost TRPA1 k Ca 2+, molekulární mechanizmus tohoto onemocnění zatím není znám. TRPA1 je neselektivní iontový kanál. To znamená, že je propustný jak pro monovalentní, tak pro divalentní kationty. Lze jej aktivovat chemickými podněty, ale také chladem (<17 C), depolarizací membránového potenciálu nebo vápenatými ionty z intracelulární strany /5,12,13,14/. Nejdůležitější roli v regulaci TRPA1 hrají vápenaté ionty, které kromě své úlohy nosičů náboje mají dva protikladné účinky: významně aktivují kanál z intracelulární strany a současně jeho aktivitu postupně snižují (desenzitizují) zatím neznámým mechanizmem /2/. Ukazuje se, že některé fyziologicky významné dvojmocné kationty mohou účinek vápenatých iontů částečně nahradit, mnohé však aktivitu TRPA1 receptoru modulují zcela odlišným způsobem /15,16,17/. Molekulární mechanizmus, kterým dvojmocné kationty regulují aktivitu TRPA1 receptoru, není dosud dostatečně prozkoumán. Tato diplomová práce si klade za cíl studium účinků, kterými ionty vápenaté, barnaté, zinečnaté a hořečnaté ovlivňují membránové proudy vyvolané aktivací TRPA1 iontového kanálu specifickým agonistou, cinnamalem. Práce se pokouší odpovědět na otázku, zda se modulační vliv vápenatých iontů uplatňuje prostřednictvím domény TRPA1 receptoru obsahující asparagin na pozici 855, a určit, které vlastnosti tohoto aminokyselinového zbytku jsou rozhodující pro určení míry modulace TRPA1 iontového kanálu dvojmocnými kationty. 10

2. LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1. Fyziologická úloha a exprese TRPA1 kanálu Všechny živé organismy jsou závislé na schopnosti reagovat na podněty ve svém okolí. Dovednost rozpoznat míru nebezpečí a správně odpovědět na příslušný podnět rozhoduje o jejich přežití /1/. V nervové soustavě slouží pro detekci potenciálně nebezpečných podnětů a varování před rizikem nebezpečí primární senzorické neurony. Těla těchto neuronů se nacházejí v gangliích zadních kořenů míšních, periferní axony inervují tkáně a jejich zakončení reagují na senzorické podněty, přičemž centrální axony jsou propojeny s míchou, kde synaptickou cestou předávají signály centrálnímu nervovému systému (CNS). Pro vyvolání nocicepční signalizace je zapotřebí práh dostatečně vysoký na to, aby se většina okolních podnětů neprojevila bolestivě, ale zároveň dostatečně citlivý, aby byl organismus včas informován o blížícím se nebezpečí. Hlavními nervovými buňkami zajišťujícími tento klíčový poplašný systém jsou nociceptory, primární aferentní senzorické neurony detekující a odpovídající na škodlivé podněty /18,19/. Na periferních zakončeních nociceptorů jsou exprimovány receptory, které svými vlastnostmi určují, zda a za jakých podmínek bude přijímaný signál (mechanický, teplotní nebo chemický) převeden na nervový vzruch. Důležitou skupinou těchto transdukčních molekul jsou TRP (transient receptor potential) iontové kanály /1/. Savčí TRP receptory jsou kódovány 28 geny a podle strukturální příbuznosti jsou rozděleny do 6 rodin: kanonické (TRPC), vaniloidní (TRPV), melastatinové (TRPM), polycystinové (TRPP), mukolipinové (TRP-ML) a ankyrinové (TRPA) /3/. Z informací, které jsou v současné době dostupné, vyplývá, že TRP receptory hrají v živých organismech velmi důležitou roli. Jsou spojené s některými patofyziologickými procesy: bolestí, srdeční hypertrofií, ischemickou buněčnou smrtí a hypersenzitivitou respiračního reflexu /6,20/. Jejich patologií proto mohou vzniknout vážné zdravotní následky. Byla popsána celá řada dědičných onemocnění, která jsou připisována právě TRP receptorům /21,22/. Díky několika důležitým vlastnostem TRP kanálů jsou tyto proteiny ideálním cílem terapeutického zásahu při vývoji nových látek s analgetickým účinkem: - v rámci jednotlivých TRP rodin není příliš velká strukturní homologie, a proto je možné získat subtypově-selektivní sloučeniny, 11

- TRP kanály jsou součástí některých dobře popsaných signálních drah, zejména těch zprostředkovaných receptory na buněčném povrchu (receptory spřažené s G-proteiny nebo receptory pro růstové faktory) a - mutace v mnoha genech kódujících TRP kanály způsobují různá onemocnění /6/. Jediným zástupcem ankyrinové rodiny TRP receptorů u savců je receptor TRPA1. V roce 2003 byl identifikován v nociceptivních drahách a od té doby jsou studovány molekulární mechanizmy jeho aktivace /5/. Iontové kanály TRPA1 jsou v nejvyšší míře exprimovány společně s receptory TRPV1 na neuronech ganglií zadních kořenů míšních a na neuronech trigeminálních ganglií, které jsou specializovanými senzory různých škodlivých podnětů /5,18/. Nacházejí se také hojně v dýchacím traktu savců na zakončeních vagálních senzorických neuronů, kde se podílejí např. na vyvolání reflexu kašle při působení některých škodlivin /6/. Charakteristickou vlastností některých TRP kanálů (včetně TRPA1) je jejich polymodalita, tj. schopnost reagovat na signály různé povahy (chemické či fyzikální) a různého původu (intra- a extracelulární). TRPA1 lze aktivovat chemicky endogenními i exogenními látkami, mezi které patří substance, jež mají schopnost vyvolávat bolest nebo neurogenní zánět. Kromě chemické aktivace je TRPA1 receptor aktivován též chladem (<17 C), depolarizací membránového potenciálu nebo vápenatými ionty z intracelulární strany /14/. Protein TRPA1 je významnou měrou exprimován ve vláskových buňkách vnitřního ucha a předpokládalo se, že by mohl fungovat jako mechanicky aktivovatelný transdukční kanál převádějící akustické podněty na elektrický signál /23/. Tato hypotéza byla ale vyvrácena dvěma na sobě nezávislými studiemi, v nichž byl myším vyřazen funkční gen pro TRPA1 receptor. Obě studie prokázaly, že experimentálním myším zůstaly zachovány všechny sluchové funkce. Tyto studie však přinesly současně velmi zajímavé výsledky prokazující významnou úlohu TRPA1 při vnímání škodlivých podnětů. Trpa1 -/- myši vykazovaly silný deficit v somatosenzorickém vnímání chemických látek a pozměněné vnímání chladových podnětů /18,24,25/. Mechanosenzitivita kanálu TRPA1 byla také potvrzena na nervově-kožních preparátech /26/. V případě lidského TRPA1 receptoru byla prozatím popsána jedna mutace, která způsobuje dědičné onemocnění tzv. familiární epizodický bolestivý syndrom. Jedná se o autozomálně dominantní mutaci ve čtvrté transmembránové doméně S4 (konkrétně N855S), odhalenou genetickým průzkumem u členů jedné rodiny z Kolumbie (USA). 12

Onemocnění se projevuje krutými bolestmi zejména v horní části těla, které jsou vyvolány stavy vyčerpání, hladovění a chladu /11/. 2.2. Regulace TRPA1 buněčnými signálními drahami 2.2.1. Heterologní desenzitizace TRPA1 V přetrvávající přítomnosti aktivátorů TRPA1 receptoru se odpověď iontových kanálů postupně snižuje, molekulární mechanizmus tohoto jevu prozatím není zcela objasněn /27/. Jedním z mechanizmů, který se může uplatňovat in vivo, je desenzitizace vyvolaná aktivací jiného neselektivního kanálu, který je exprimován na primárních nociceptorech společně s TRPA1. Bylo prokázáno, že TRPA1 receptory mohou být desenzitizovány nepřímo prostřednictvím TRPV1 receptoru fosfatidylinositol-4,5-bisfosfátovou cestou závislou na Ca 2+/28/. V takové situaci jsou nejprve receptory TRPV1 aktivovány specifickým agonistou - kapsaicinem, což způsobí okamžitý, masivní a dlouhotrvající vtok vápenatých iontů otevřenými TRPV1 kanály a výlev z intracelulárních zásobníků. Zvýšená koncentrace intracelulárního vápníku mění poměr aktivit kinas a fosfatas a štěpí membránový fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP 2 ), čímž oslabí aktivitu TRPA1 /28,29/ (obr. 1). Obr. 1 Heterologní a homologní desenzitizace TRPA1 (převzato z /29/ ). Homologní desenzitizaci způsobují látky, které kanál aktivují, např. kovalentně modifikují (allyl isothiokyanát, AITC). V případě heterologní desenzitizace je aktivován nejdříve TRPV1 receptor kapsaicinem, čímž dojde ke vtoku Ca 2+ iontů do intracelulárního prostoru. Vápník aktivuje dráhu fosfolipasy C (PLC), tím je hydrolyzován membránový fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP 2 ), který pravděpodobně desenzitizuje TRPA1. 13

2.2.2. Senzitizace TRPA1 buněčnými signálními drahami Bylo popsáno mnoho TRP receptorů, jejichž aktivita je regulována receptory spřaženými s G-proteiny (GPCRs) /30/. TRPA1 receptor je aktivován bradykininem /14/, mediátorem zánětu, jenž uplatňuje svůj účinek interakcí s B 2 receptorem (jedním ze skupiny GPCRs) /31,32/. Aktivace B 2 bradykininového receptoru vede k aktivaci dráhy fosfolipasy C (PLC), k jejímž důsledkům patří i štěpení PIP 2 na diacylglycerol (DAG) a inositol trifosfát (IP 3 ). Inositol trifosfát způsobuje výlev Ca 2+ z intracelulárních zásob, zatímco DAG aktivuje proteinkinasu C (PKC); DAG může být také převeden na polynenasycené mastné kyseliny (např. kyselinu arachidonovou) pomocí DAG lipasy /33/. Vápenaté ionty vylité z intracelulárních zásob přímo aktivují TRPA1 vazbou na charakteristickou doménu (tzv. EF-hand ) lokalizovanou na N-konci kanálu /34,35/ (ale také možná na jiné Ca 2+ -vazebné domény, které nebyly dosud identifikovány). PKC fosforyluje TRPV1 a tím jej senzitizuje /36/, čímž zvyšuje vstup Ca 2+ z extracelulárního prostoru do intracelulárního prostředí. Zvýšená intracelulární koncentrace Ca 2+ dále aktivuje TRPA1. Kromě dráhy PLC může být TRPA1 senzitizován aktivací cyklického adenosin monofosfátu/protein kinasy A (camp/pka) bradykininem v neuronech zadních kořenů míšních. Bradykinin aktivuje B 2 receptor, jenž stimuluje Gαq aktivovanou podjednotku, která aktivuje syntézu camp adenylát cyklasou. camp aktivuje proteinkinásu A (PKA), která senzitizuje TRPA1. Podobný mechanizmus senzitizace TRPA1 se uplatňuje při aktivaci proteasou aktivovaného receptoru 2 (PAR 2 ). Podrodina PAR receptorů patří ke specifické skupině GPCRs, které jsou štěpeny proteasami uvnitř extracelulárního N-konce, čímž je odkryta řetězová doména, jež váže ligandy aktivující receptor /37,38/. PAR 2 po aktivaci uvolňuje aktivovanou podjednotku Gαq, jež následně aktivuje dráhu fosfolipasy C (obr. 2). 14

Obr. 2 Senzitizace TRPA1 buněčnými signálními drahami (převzato z /29/ ). Vazba agonisty na protein B 2 či PAR 2 vede k aktivaci dráhy PLCβ mechanizmem spřaženým s Gαq proteinem. PLCβ rozštěpí fosfatidylinositol- 4,5-bisfosfát (PIP 2 ) na diacylglycerol (DAG) a inositol trifosfát (IP 3 ); IP 3 způsobí vylití intracelulárních Ca 2+ iontů a ty přímo senzitizují (aktivují) TRPA1 vazbou na jeho N-konec. DAG aktivuje protein kinázu C (PKC), jež fosforyluje TRPV1, zvyšuje pravděpodobnost otevření, a tím dojde ke zvýšenému vstupu extracelulárních Ca 2+ iontů do nitra buňky. DAG může být dále štěpen lipasou na arachidonovou kyselinu (zde AA). Jedním z produktů metabolismu AA je 15d-PGJ 2, který přímo aktivuje TRPA1; další prostaglandiny senzitizují TRPV1. B 2 receptor dále stimuluje Gαq podjednotku, která aktivuje syntézu camp adenylát cyklasou. camp aktivuje proteinkinasu A (PKA), která senzitizuje TRPA1. 2.2.3. Aktivace TRPA1 chladem a mezidruhové rozdíly Empirická zkušenost ukazuje, že chemické látky, které modulují aktivitu TRPA1 receptoru, ovlivňují také práh pro vnímání teplotních podnětů. Například isothiokyanáty obsažené v hořčici, česneku, cibuli nebo skořici vyvolávají pocit palčivého tepla, ale také mohou modulovat vnímání chladu. Původní studie, jež charakterizovaly TRPA1 receptor na primárních nociceptivních neuronech, prokázaly, že tento iontový kanál lze kromě chemických látek aktivovat také chladem (<17 C) /5,14/. Mnoha dalším laboratořím (včetně té, ve které vznikla tato diplomová práce) se však nepodařilo přímou aktivaci TRPA1 chladem (snížení teploty z 24 C na 8 C) v heterologním expresním systému prokázat. Očekávané výsledky fenotypizací myší s vyřazeným funkčním genem pro TRPA1 skutečně prokázaly necitlivost experimentálních zvířat k charakteristickým dráždivým 15

látkám, vedly však ke kontroverzním závěrům vzhledem k možné úloze TRPA1 jako senzoru pro bolestivý chlad; zatímco dvě studie prokázaly zřetelné rozdíly v chování myší setrvávajících na podložce o teplotě 0 C /24,39/, jiné studie fyziologickou úlohu TRPA1 ve vnímání bolestivého chladu neprokázaly /25,40/. Přestože není zcela zřejmé, zda je TRPA1 teplotním senzorem pro vnímání bolestivého chladu in vivo, předpokládá se, že z evolučního hlediska představuje protein, jehož molekulární struktura byla postupně optimalizována pro detekci teplotních podnětů. Funkční studie na TRPA1 receptorech vyklonovaných ze senzorických orgánů nižších živočišných druhů ukazují, že TRPA1 iontové kanály mohou být aktivovány nikoliv chladem, ale překvapivě zvýšením okolní teploty (>33 C) /41/. Například u hadů TRPA1 receptory zajišťují schopnost detekce teplokrevných živočichů v infračervené oblasti a podle fylogenetického vztahu mezi nižšími a vyššími druhy hadů se zdá, že citlivost těchto receptorů byla předmětem evolučního tlaku /42,43/, čímž byla zajištěna přesnější detekce teplotních změn. Překvapivé a mnohdy protikladné účinky teploty na TRPA1 receptory molekulárně identifikované na různých živočišných druzích inspirovaly celou řadu studií, které pomocí molekulárně biologických technik přinesly velmi cenné informace o struktuře a funkci tohoto proteinu /44/. Na základě těchto studií se zdá pravděpodobné, že komplex iontového kanálu TRPA1 obsahuje specifickou teplotně citlivou doménu, která v případě savčích ortologů mění svou konformaci chladem. 2.3. Strukturální vlastnosti TRPA1 Molekulární strukturu lidského kanálu TRPA1 tvoří 1119 aminokyselin (sekvence viz Příloha 1) /45/, které jsou topologicky uspořádány do šesti transmembránových domén (S1 S6) a cytoplazmaticky orientovaného N- a C-konce. TRPA1 kanál je homotetramerem těchto podjednotek symetricky uspořádaných v plazmatické membráně (obr. 3). N-konec monomeru obsahuje patnáct až sedmnáct ankyrinových domén (Ard). Ankyrinový motiv je krátká sekvence tvořená nejčastěji 33 aminokyselinami, složená ze dvou antiparalelních α-helixů spojených β-otáčkou /42,46/. Těmto doménám je připisována funkční úloha protein-proteinových interakcí /46/, citlivosti vůči podnětům z vnějšího prostředí (mechanický nebo osmotický tlak, teplo a chemické látky) a buněčným poslům (vápenaté ionty) /42/. V rámci ankyrinových domén byly identifikovány dvě skupiny cysteinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu elektrofilních látek na TRPA1: Cys 414 a 421 v 11. ankyrinové doméně a Cys 621, 641 a 665 v ankyrinové doméně 16

nejblíže k C-konci /47,48/. Ve 12. ankyrinové doméně (AA 468 480) se nachází sekvenční motiv podobný EF-hand, který je běžným motivem pro vazbu Ca 2+ iontů /35/. C-konec je vytvářen výrazně nižším počtem aminokyselin (asi 154) než N-konec (asi 720). Prozatím na něm není predikována žádná konzervovaná doména, ale obsahuje značné množství kladně nabitých aminokyselinových zbytků, proto se lze domnívat, že se některé z nich budou podílet na modulaci receptoru, nebo na interakci s negativně nabitými molekulami nebo rezidui ve svém okolí /1/. A EF-hand C C C C C 1 2 4 3 Obr. 3 Topologie kanálu TRPA1 (převzato z /1/ ). A. Podjednotka kanálu je uspořádána do šesti transmembránových domén (1-6), cytoplazmatického N- a C- konce. Na N-konci je vyznačen EF-hand pro vazbu Ca 2+ a Cys zbytky, na kterých probíhá kovalentní modifikace receptoru. B. Homotetramer podjednotek utvářejících kanál TRPA1. 5 6 B 1 2 3 4 N C 5 6 5 6 3 4 1 2 2 1 4 3 6 5 6 5 4 3 2 1 Transmembránové domény jsou vzájemně propojeny hydrofilními kličkami, přičemž kličky mezi segmenty S5 a S6 obsahující krátký pórový helix (P) se podílejí na vytvoření centrálního póru kanálu. Součástí vně orientované části póru je selektivní filtr ( GDI ), jenž reguluje propustnost kanálu pro jednomocné a dvojmocné kationty, zřejmě ale také pro organické kationty většího průměru /13,49,50/. Modul póru iontového kanálu (S5-P- S6) patří mezi nejvíce konzervované oblasti napříč rodinou TRP kanálů. Oproti tomu jsou N- a C-koncové části u všech TRP receptorů nejméně konzervované, a proto se předpokládá, že obsahují funkční domény, které určují specifické vlastnosti jednotlivých podtypů receptorů /1/. 17

V roce 2011 byla pomocí kryoelektronové mikroskopie popsána struktura myšího TRPA (mtrpa1) s rozlišením 16 Å (obr. 4). Primární sekvenční analýzou bylo předpovězeno, že 22% aminokyselin je součástí transmembránových domén a extracelulárních kliček, 64% tvoří N-konec a 14% C-konec. Podle modelů je N-konec mtrpa1 uspořádán do 12 ankyrinových domén (rezidua 31 437) a ohebnější oblasti, na niž navazuje první transmembránová doména (rezidua 438 721). Cytoplazmatická oblast TRPA1 je uspořádána v kompaktní strukturu zavěšeného košíku. Důležitá cysteinová rezidua myšího TRPA1 (C415, C422, C622) tvoří jakousi kapsu pro vazbu ligandů C415 a C422 umístěné na jedné ohebné smyčce interagují s C622 umístěném na ohybné smyčce umístěné na sousední podjednotce /51/. Vazebný signál je převeden zřejmě za významného přispění C-konce /12,52/ do vnitřní části póru, jež zajišťuje vrátkování iontového kanálu /53/. 90 0 Obr. 4 Kryoelektronová struktura mtrpa1, pohled ze strany (převzato z /51/ ). Modře jsou označeny transmembránové části proteinu, růžově cytoplazmatické. Uvnitř kanálu se nachází dutina. 2.4. Agonisté TRPA1 Receptory TRPA1 mohou být aktivovány řadou látek endogenního či exogenního původu. Všechny tyto látky mají schopnost vyvolávat u člověka bolest či neurogenní zánět. Exogenní aktivátory TRPA1 jsou látky rostlinného původu (cinnamaldehyd, tymol, alicin, gingerol, karvakrol, mentol), isothiokyanáty obsažené v hořčici, wasabi a křenu (allyl isothiokyanát), látky obsažené v slzných a výfukových plynech (akrolein) nebo α,β-nenasycené aldehydy v cigaretovém kouři. Mezi agonisty a částečné agonisty TRPA1 18

patří též některé návykové psychotropní látky (kanabinoidy, nikotin) a rovněž celková anestetika (propofol, izofluran, desfluran), která aktivují nociceptivní neurony (obr. 5) /1/. Endogenními aktivátory TRPA1 mohou být například produkty oxidativního stresu (H 2 O 2, OH vzniklý Fentonovou reakcí a další reaktivní formy kyslíku) /1,54/, chlornanový anion ClO -, produkty peroxidace lipidů, cyklopentanonové prostaglandiny a isoprostany /55/. Název allyl isothiokyanát Výskyt hořčice, křen česnek skořice Typ vazby na TRPA1 Struktura alicin cinnamal akrolein mentol slzný plyn, výfukové plyny kovalentní modifikace Cys mechanizmem Michaelovy adice nebo alkylace C H 2 N S S CH 2 H 2 C S O O C H 2 O H máta nekovalentní vazba na 5. transmembránovou doménu H 3 C CH 3 OH Název THC nikotin propofol izofluran Výskyt konopí tabák anestetika Typ vazby na TRPA1 nekovalentní interakce nekovalentní interakce Struktura C H 3 H 3 C CH 3 O HO C 5 H 11 Obr. 5 Příklady chemických aktivátorů TRPA1. N H 3 C CH 3 OH CH 3 N C H 3 CH 3 F F CH 3 F Cl O F F Obecně lze rozdělit agonisty TRPA1 podle jejich chemického složení do tří skupin: a) látky elektrofilní povahy, které se vážou na TRPA1 kovalentně /48,56/ b) látky nepolární, které reverzibilně interagují s TRPA1 nekovalentně na principu ligand-receptor c) látky vázající se nekovalentně na 5. transmembránovou doménu. Elektrofilní agonisté kanálu TRPA1 obsahují elektrofilní uhlík nebo síru, které podléhají nukleofilnímu ataku thiolové skupiny cysteinu nebo aminoskupiny lysinu, které se nacházejí na N-konci receptoru (viz též kapitolu 2.3., str. 16). Například nukleofilní merkaptoskupina cysteinu může atakovat α,β-nenasycenou vazbu cinnamaldehydu mechanizmem známým jako Michaelova adice (obr. 6). Aktivátory jako jsou 19

isothiokyanáty (např. allyl isothiokyanát) nebo isokyanáty mohou reagovat s cysteiny a/nebo lysiny za vzniku (di)thiokarbamátů a thiomočoviny /48,57,58/. O N H 2 HS OH cystein O + cinnamal β α O N H 2 S OH O Obr. 6 Vazba cinnamalu na merkaptoskupinu cysteinu. Thiolová (tj. SH-) skupina cysteinu atakuje β-uhlík nenasycené vazby cinnamalu mechanizmem známým jako Michaelova adice. Agonisté TRPA1 jsou účinnější se vzrůstající elektrofilní povahou a/nebo reaktivitou molekuly jako potenciálního Michaelova akceptoru. Bylo zjištěno, že aktivitu agonisty určuje spíše jeho reaktivita, než samotná jeho struktura. Příkladem může být benzyl thiokyanát, který není schopen aktivovat TRPA1, na rozdíl od benzyl isothiokyanátu, který je agonistou receptoru (obr. 7) /59/. Aktivita agonisty TRPA1 závisí na reverzibilitě nebo ireverzibilitě vzniklé vazby a propustnosti membrány pro daného agonistu /55/. N benzyl isothiokyanát S Obr. 7 Porovnání reaktivity benzyl isothiokyanátu a benzyl thiokyanátu. Obě látky obsahují thiokyanátovou funkční skupinu podobné velikosti, ale jednoduchý charakter vazby C S v benzyl thiokyanátu snižuje elektrofilicitu celé molekuly oproti benzyl isothiokyanátu. S benzyl thiokyanát N Mezi agonisty TRPA1 patří také řada látek neelektrofilní povahy. Na receptor se vážou nekovalentně, nejspíše přímou vazbou na principu ligand-receptor. Vazba ligandů, jako jsou např. δ-9-tetrahydrocannabinol (THC) nebo nikotin (obr. 5), je do značné míry vratná. Odpovědi TRPA1 na tyto látky zůstávají neměnné i po substituci kritických cysteinových zbytků /48,58/. Na rozdíl od elektrofilních ligandů nepotřebuje THC pro aktivaci TRPA1 intracelulární polyfosfáty jako kofaktory /60/. 20

Do třetí skupiny látek aktivujících TRPA1 prozatím spadá pouze mentol. Mentol je nepolární látka obsažená v mátě, která způsobuje pocit chladu při aplikaci na kůži nebo na mukózní membrány dýchacích cest /61/. Původně byl mentol považován výhradně za A H 3 C CH 3 CH 3 OH B Obr. 8 Vazba mentolu na 5. transmembránovou doménu TRPA1. A. Struktura mentolu. B. Část homologního modelu mtrpa1 TM5 a TM6 jsou transmembránové domény 5 a 6, modře a červeně jsou označena rezidua kritická pro vazbu mentolu, červený G878 je druhově specifický pro mtrpa1 (převzato z /67/ ). agonistu receptoru TRPM8 /62,63/, později bylo zjištěno, že je schopen ovlivňovat i jiné receptorové proteiny odlišné od TRPM8 /64,65/. Na receptor TRPA1 podle prvotních studií neměl mentol žádný účinek /5/, studie z roku 2006 však ukázala, že inhibuje proudy TRPA1 vyvolané chladem nebo působením cinnamalu /56/. O rok později se ukázalo, že mentol má bimodální účinek na mtrpa1: při submikromolárních a nízkých mikromolárních koncentracích se stává agonistou receptoru, při vyšších koncentracích však působí jako antagonista /66/. Vazebné místo pro mentol bylo identifikováno (jako dosud pro jedinou látku nepolární povahy) v 5. transmembránové doméně TRPA1 /67/ (obr. 8). 2.5. Aktivace a inaktivace (desenzitizace) TRPA1 - Ca 2+ V modulaci receptoru TRPA1 hrají významnou roli vápenaté ionty. V jedné z prvních studií zabývajících se vlivem vápenatých iontů na TRPA1 bylo zjištěno, že výlevem Ca 2+ z intracelulárních zásob dochází k aktivaci TRPA1 a odpovědi na agonisty (AITC) jsou značně zesíleny v přítomnosti extracelulárního Ca 2+/68/. Později bylo doloženo, že v regulaci TRPA1 vápenatými ionty nehraje roli kalmodulin ani jiné proteiny vázající vápník, ale že se Ca 2+ pravděpodobně vážou přímo na TRPA1, konkrétně na strukturu podobnou doméně EF-hand na N-konci kanálu /34,35/. Kromě aktivace TRPA1 mají extracelulární Ca 2+ ionty stejně důležitou schopnost inaktivovat (desenzitizovat) kanál /34,69/. Bylo pozorováno, že proudy vyvolané agonistou bez přítomnosti vápníku byly nejprve silně zvýšeny, avšak poté téměř zcela vymizely v řádu sekund po přidání Ca 2+ z extracelulární strany /69/. Z toho bylo usuzováno, že iontový kanál může být aktivován Ca 2+ ionty procházející pórem, např. přímou interakcí s pórem, nebo jen samotným zvýšením koncentrace Ca 2+, nezávisle na aktivaci kanálu. Ukázalo se, 21

že zatímco aktivace TRPA1 může být vyvolána bez předchozího otevření iontových kanálů například vylitím intracelulárního vápníku pomocí fotolýzy DMNP-EDTA (fotolabilní chelatační látka, která při působení UV záření uvolní v intracelulárním prostoru Ca 2+ ), k inaktivaci dojde jen po předchozím otevření kanálů /13,70,71,72/. Přestože jsou oba procesy spojeny se zvýšením intracelulární koncentrace vápníku, aktivace a desenzitizace tak zřejmě nesdílejí stejný molekulární mechanizmus. Pokud existují dvě možná vazebná místa pro vápenaté ionty, musí se přinejmenším lišit afinitou. 22

3. CÍLE PRÁCE Předložená diplomová práce se zabývá řešením následujících experimentálních otázek: - Charakterizovat časový průběh modulace TRPA1 vápenatými ionty. - Stanovit, jaké koncentrace volných dvojmocných kationtů účinně modulují TRPA1 z extracelulární a intracelulární strany za definovaných experimentálních podmínek. - Určit míru potenciace a inaktivace TRPA1 pro dvojmocné kationty Ba 2+, Mg 2+ a Zn 2+. - Pokusit se zjistit, do jaké míry souvisejí funkční změny specifické mutace N855S lidského TRPA1 s Ca 2+ citlivostí. 23

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1. Použitý materiál a chemikálie 4.1.1. Chemikálie - Sigma-Aldrich, USA: HEPES, NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl 2, ZnCl 2, glukosa, CsCl, CsOH (99% roztok), NaOH, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, EDTA, EGTA, HEDTA, dimethylsulfoxid (DMSO, 99,9% roztok), cinnamal, MgATP, poly-l-lysin, Trizma base, DNA primery, ampicilin - Lachema, ČR: BaCl 2 - PENTA, ČR: kyselina octová 99% - Life Technologies, USA: OPTI-MEM I médium, barvivo SYBR Safe DNA Gel Stain - Agilent Technologies, USA: QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit, polymerasa PFu Ultra - Qiagen, USA: QIAprep Spin Miniprep Kit - IBA GmbH, SRN: činidlo pro Magnet-assisted Transfection (MATra) - SERVA Electrophoresis GmbH, SRN: pepton z kaseinu, extrakt z kvasinek (yeast extract), agaróza - Invitrogen, USA: trypsin 4.1.2. Biologický materiál - Buňky linie HEK293T - cdna htrpa1 ve vektoru pcmv6-xl4 (OriGene) - plazmid GFP (TaKaRa) - fetální bovinní sérum (FBS, PAN Biotech GmbH) - kompetentní bakteriální buňky XL10-Gold linie E. coli 4.1.3. Přístroje a pomůcky - Zesilovač Axopatch 200B (Molecular Devices) - Invertovaný mikroskop Eclipse TS100-F (Nikon) - Horizontální tahač elektrod P-97 (Sutter Instruments Co.) - Laminární box VBH C2 (Steril) (Schoeller Instruments) - Inkubátor MCO-36AIC (Sanyo) 24

- Autokláv Sanyo MAC 235EX (Sanyo) - Osmometr Vapro (Wescor) - ph metr 3510 ph Meter (Jenway) - Magnetická míchačka 1100 Hotplate & Stirrer (Jenway) - Centrifuga Rotilabo-mini centrifuge (Carl Roth GmbH) - PCR zařízení Mastercycler personal (Eppendorf) - Elektroforetické zařízení Consort Mini Electrophoresis Power Supply E143 (Sigma-Aldrich) - Spektrofotometr NanoDrop 1000 (NanoDrop Technologies) - DNA sekvenátor ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems) - Třepačka Shaker Incubator NB-205 (N-Biotek) - Vortex MS 2 Minishaker (IKA) - Automatické pipety (Gilson, Nichipipet EX) 4.2. Tkáňové kultury, transfekce a molekulárně biologické konstrukty Buňky HEK293T byly kultivovány v médiu OPTI-MEM, které bylo doplněno 5% fetálním hovězím sérem, na miskách pokrytých poly-l-lysinem s hustotou přibližně 180 000 buněk/cm 2. HEK293T buňky byly přechodně transfekovány rekombinantní cdna lidského TRPA1 receptoru (TRPA1) nebo konstrukty (uvedeny níže) ve vektoru pcmv6-xl4 v koncentraci zhruba 300-400 ng na misku. Pro identifikaci pozitivně transfekovaných buňek při elektrofyziologických měřeních byly buňky současně transfekovány zeleným fluorescenčním proteinem (GFP) neseným ve vektoru pqbi 25, a to v koncentraci 300 ng/misku. Transfekované buňky byly po pasážování rozmístěny na sklíčka pokrytá poly-l-lysinem. Pro pasážování buněk byly použity roztok PBS (phosphate buffered saline) a Versenův roztok obsahující trypsin. 4.3. Elektrofyziologická technika patch clamp Elektrické proudy z povrchu celých buněk (konfigurace whole-cell) byly snímány elektrofyziologickou technikou patch clamp obvykle 24 až 48 h po transfekci. Pro každou skupinu pokusů bylo studováno 5 až 8 pozitivních buněk na každém sklíčku z nejméně tří nezávislých transfekcí. Whole-cell proudy byly snímány zesilovačem Axopatch 200B s použitím programu pclamp10. K měření jsme použili elektrody z borosilikátového skla 25

(o vnějším průměru 1,65 mm) naplněné intracelulárním roztokem, které po naplnění vykazovaly odpor v rozmezí od 3 do 5 MΩ. Sériový odpor byl obvykle menší než 10 MΩ a byl kompenzován na 70%. Experimenty byly prováděny při pokojové teplotě (23 25 C). 4.4. Experimentální roztoky Kontrolní extracelulární roztok obsahoval (mm): NaCl (160), KCl (2,5), CaCl 2 (1), MgCl 2 (2), HEPES (10), glukosa (10), ph bylo upravováno pomocí NaOH na hodnotu 7,3. Osmolarita extracelulárního roztoku byla 320 mmol.kg -1. Poznámka: zkratka mm (popř. M) znamená mmol.dm -3 (respektive mol.dm -3 ). Pro plnění elektrod byl použit intracelulární roztok (HB-ICS), který obsahoval (mm): CsCl (145), EGTA (5), HEPES (10), CaCl 2 (3), ATP (2), ph bylo upravováno pomocí CsOH na hodnotu 7,3. Agonista TRPA1 receptoru, cinnamaldehyd, byl připravován z 0,1 M zásobního roztoku v dimethylsulfoxidu (DMSO), který byl skladován v chladu. Měření byla prováděna s roztokem cinnamalu o celkové koncentraci 100 µm. Další extracelulární roztoky měly podobné složení, lišily se pouze v druhu a koncentraci divalentního kationtu. Všechny obsahovaly (mm): NaCl (150) a HEPES (10). Druhy a koncentrace divalentních iontů v jednotlivých ECS jsou uvedeny v tabulce 1. Extracelulární roztok obsahující 2,2 mm Zn 2+ byl připravován smícháním 22 µl 1M vodného roztoku ZnCl 2 s 10 ml roztoku bez iontů nebo s 10 ml roztoku obsahujícího 2 mm CaCl 2. Tabulka 1 Druhy a koncentrace divalentních kationtů v ECS Druh divalentního iontu Chemická látka Koncentrace (mm) Ca 2+ CaCl 2 2 H 2 O 2 10 Ba 2+ BaCl 2 2 10 Mg 2+ MgCl 2 2 Bez iontu HEDTA 2 26

Pro zjišťování vlivu chelatace na IV-charakteristiky kanálů TRPA1 byl kromě běžného intracelulárního roztoku použit intracelulární roztok (HCa-ICS) o složení (mm): CsCl (145), HEPES (10), EGTA (10), CaCl 2 (10,24), ATP (2), ph bylo upraveno pomocí CsOH na hodnotu 7,3. Pro přípravu agarózového gelu byl použit 50x TAE pufr (50 ml) o složení: Tris-báze (12,11 g), 99% kyselina octová (2,85 ml), EDTA (0,73 g), doplnit do 50 ml destilovanou vodou. Pro provedení elektroforézy byl 50x TAE pufr zředěn 50x za vzniku 1x TAE pufru. Fosfátový pufr PBS obsahoval (mm): NaCl (137), KCl (2,7), KH 2 PO 4 (1,47) a Na 2 HPO 4 (4,3), ph bylo upraveno pomocí NaOH na hodnotu 7,3. Versenův roztok obsahující trypsin byl připraven rozpuštěním 0,2% trypsinu a 10 mg EDTA v 50 ml PBS pufru, výsledné ph bylo 7,3. LB médium pro pěstování kompetentních bakterií obsahovalo 1% pepton, 0,5% extrakt z kvasinek a 1% NaCl. Složky média byly rozpuštěny v deionizované vodě a směs byla 20 min sterilizována při 121 C. 4.5. Příprava DNA konstruktů 4.5.1. PCR mutageneze Pro provedení bodových mutací byl použit kit firmy Stratagene QuikChange XL Site- Directed Mutagenesis Kit. DNA lidského ankyrinového receptoru byla zaklonována do vektoru pcmv6-xl4 /73/ (obr. 9). Obr. 9 Struktura vektoru pcmv6-xl4; převzato z /73/. 27

1) Navržení primerů obsahujících mutaci Navrhli jsme primery pro záměnu asparaginu 855 za arginin, glutamin a serin (N855R, N855Q a N855S). Primery by měly splňovat několik základních kriterií: délku okolo 40 párů bází, obsah GC párů kolem 40 až 50%, mutace by měla být u obou komplementárních primerů nejlépe uprostřed a každý z primerů by měl končit nejméně jedním či dvěma G nebo C nukleotidy. Teplota tání by neměla být vyšší než 78 C. Sekvence primerů byla následující: - mutace N855S, AAT AGT SENSE: 5'- CAA AGA TTT GAA AGT TGT GGA ATT TTT ATT G -3' ANTISENSE: 5'- CAA TAA AAA TTC CAC AAC TTT CAA ATC TTT G -3' - mutace N855R, AAT AGG SENSE: 5'- CAA AGA TTT GAA AGG TGT GGA ATT TTT ATT G -3' ANTISENSE: 5'- CAA TAA AAA TTC CAC ACC TTT CAA ATC TTT G -3' - mutace N855Q, AAT CAG SENSE: 5'- CAA AGA TTT GAA CAG TGT GGA ATT TTT ATT G -3' ANTISENSE: 5'- CAA TAA AAA TTC CAC ACT GTT CAA ATC TTT G -3'. 2) Příprava mutantních plazmidů Do tenkostěnné PCR zkumavky jsme pipetovali následující směs: 1 µl templátové DNA (200 ng/µl) 1 µl sense primeru (25 µm) 1 µl antisense primeru (25 µm) 1 µl dntp mix (10 mm) 3 µl Quik Solution Doplnit ultračistou vodou do objemu 50 µl Přidat 1 µl PFu Ultra DNA polymerasy Takto připravenou reakční směs jsme krátce promíchali a umístili do PCR zařízení, na němž byly nastaveny následující reakční podmínky: 28

95 C, 1 min 95 C, 50 s 51 C, 50 s 68 C, 16 min 68 C, 10 min 4 C, nekonečno 34 cyklů Po proběhnutí PCR reakce jsme přidali 1 µl Dpn1 endonukleasy a výslednou směs inkubovali 1 hodinu při 37 C. 3) Agarózová horizontální elektroforéza Pro ověření, zda se podařilo připravit požadovaný PCR produkt, jsme smíchali 5 µl PCR produktu s 2 µl barviva Gel pilot loading dye a 1 µl DNA markeru s 2 µl barviva Gel pilot loading dye a provedli vizualizace na agarózové horizontální elektroforéze. Připravili jsme 1% agarózový gel: 600 µl 50x TAE pufru jsme smíchali s 0,3 g agarózy a 29,4 ml destilované vody. Směs jsme rozpustili v mikrovlnné troubě, ochladili pod tekoucí vodou a poté do ní přidali 20 µl barviva SYBR Safe DNA Gel Stain (10 000x zředěné). Směs s barvivem jsme nalili do formy s hřebenem a nechali v temnu ztuhnout. Do elektroforetické vany jsme nalili 1x TAE pufr a umístili do něj připravený gel. Do jamek gelu jsme nanesli vzorky DNA a DNA markeru, které byly elektroforeticky rozděleny při napětí 90 V (po cca. 50 minutách). Po proběhnutí elektroforézy jsme gel vizualizovali pomocí UV lampy v temné místnosti. 4) Transformace mutovaného plazmidu do XL10-Gold ultrakompetentních buněk kmene E. coli teplotním šokem Z mrazicího boxu (-85 C) jsme vytáhli ultrakompetentní buňky a rozmrazili je na ledu. Pro každou reakci jsme pipetovali 45 µl buněk do předchlazených mikrozkumavek. K buňkám jsme přidali 2 µl β-me mix z kitu. Směs jsme inkubovali na ledu a jemně ji promíchávali po dobu deseti minut každé dvě minuty. Poté jsme do směsi přidali 2 µl PCR produktu rozštěpeného Dpn I endonukleasou, směs jsme promíchali a inkubovali na ledu po dobu 30 minut. Mezitím jsme ve vodní lázni (42 C) ohřáli LB médium. Po 30-minutové inkubaci na ledu jsme mikrozkumavky ponořili do vodní lázně ohřáté na 42 C na dobu 45 s. Pak jsme je opět 2 min inkubovali na ledu. K výsledné směsi jsme přidali 200 µl LB média a zkumavky inkubovali 1 hodinu při 37 C za stálého třepání 29

(225-250 rpm). Po inkubaci jsme směs nanesli a rozetřeli na agarovou plotnu (s přidaným ampicilinem; 2 µg/ml) a plotnu nechali v přes noc inkubátoru (37 C, 5% CO 2 ) v zavěšené poloze. Druhý den jsme z každé agarové plotny odebrali dvě kolonie, každou kolonii přemístili do plastové zkumavky typu Falcon se 6 ml LB média a 12 µl ampicilinu a nechali přes noc inkubovat za stálého třepání při 37 C. Po inkubaci jsme plastové zkumavky typu Falcon vyvážili a centrifugovali 10 min při 7000 rpm. Po centrifugaci jsme odlili supernatant a provedli izolaci plazmidové DNA metodou miniprep. 5) Izolace plazmidové DNA z narostlých kolonií metodou miniprep a následné ověření mutace sekvencí Pro izolaci plazmidové DNA metodou miniprep jsme použili kit QIAprep Spin Miniprep Kit a postupovali podle protokolu výrobce (protokol o použití kitu za pomoci mikrocentrifugy). Resuspendovali jsme peletu bakteriálních buněk v 250 µl pufru P1 (do něj byla před izolací přidána RNasa A) a přenesli ji do mikrocentrifugační zkumavky. Do směsi jsme přidali 250 µl pufru P2 a jemně ji 4x až 6x promíchali. Dále jsme přidali 350 µl pufru N3 a opět jemně 4x až 6x míchali se směsí. Směs jsme následně centrifugovali 10 min za použití stolní mikrocentrifugy při 17 900x g. Po centrifugaci jsme odlili supernatant na kolonku, kterou jsme centrifugovali 30 až 60 s. Odlili jsme tekutinu, která protekla skrz kolonku. Na kolonku jsme pipetovali 0,5 ml PB pufru a opět jsme ji centrifugovali 30 až 60 s. Odlili jsme tekutinu, která protekla skrz kolonku. Následně jsme kolonku promyli 0,75 ml PE pufru a centrifugovali 30 až 60 s. Odlili jsme tekutinu, která protekla, a samotnou kolonku ještě 1 min centrifugovali pro odstranění přebytečného promývacího pufru. Kolonku jsme umístili do čisté mikrozkumavky (1,5 ml) a eluovali z ní DNA pomocí 50 µl EB pufru nebo vody. Pufr (voda) působil 1 min a poté jsme kolonku ještě centrifugovali 1 min. Po eluci jsme spektrofotometricky stanovili koncentraci DNA v jednotlivých vzorcích na přístroji NanoDrop. Výsledek mutageneze byl ověřen sekvenováním, které provedl Dr. Jürgen Felsberg, CSc. ze Střediska sekvenování Mikrobiologického ústavu AV ČR. 30

4.6. Hodnocení záznamů a statistická analýza Veškerá data jsme analyzovali pomocí programu Clampfit 10.2 (Molecular Devices). Jednotlivé grafy jsme vytvářeli v programu SigmaPlot 10.0 (Systat Software). Pro vynesení časové závislosti proudových odpovědí TRPA1 na agonistu a divalentní ionty jsme pomocí programu Clampfit 10.2 vytvořili průměrné hodnoty proudových odpovědí. Hodnoty pro chybové úsečky byly vypočteny vydělením standardní odchylky odmocninou z počtu buněk, ze kterých jsme udělali průměr. Pro srovnávání proudových odpovědí TRPA1 na vápenaté ionty s odpovědí na jiné divalentní ionty jsme provedli v programu Clampfit 10.2 normalizaci na hodnoty proudových odpovědí na agonistu receptoru. Mírou potenciace receptoru vápenatými ionty se rozumí podíl největší proudové odpovědi receptoru na Ca 2+ a průměru hodnot proudových odpovědí v 51. až 59. sekundě záznamu (tj. doba mezi aplikací agonisty a Ca 2+ ). Z proudových odpovědí kanálů TRPA1 jsme vypočítali vodivost podle vztahu: /, kde V rev je reverzní potenciál buňky, V membránový potenciál a I proud. Závislost vodivosti na napětí jsme proložili Boltzmannovou funkcí, která má tvar: /!"#, kde G max je maximální dosažitelná vodivost buňky, G min minimální dosažitelná vodivost, z je vrátkovací náboj ( gating charge ), F představuje Faradayovu konstantu (F = 96 485 C.mol -1 ), R univerzální plynovou konstantu (R = 8,314 J.K -1.mol -1 ), T je absolutní teplota, V je napětí a V 1/2 napětí, při kterém vodivost dosahuje poloviny svého maxima. Statistickou významnost jsme určovali pomocí Studentova t-testu, rozdíl hodnot byl považován za významný při P < 0,05 (P je pravděpodobnost). Hodnoty jsou uvedeny ve tvaru průměr±střední chyba průměru (SEM). Koncentraci volných Ca 2+ iontů v buňce po chelataci jsme vypočítali pomocí programů CaBuf a WebmaxC. 31

V (mv) 5. VÝSLEDKY 5.1. Modulace membránových proudů vyvolaných aktivací TRPA1 cinnamalem a Ca 2+ z extracelulární strany 5.1.1. Aktivace TRPA1 receptoru vápenatými ionty Pro měření proudových odpovědí vyvolaných aktivací TRPA1 kanálů v přítomnosti agonisty a divalentních kationtů jsme používali protokol, jenž je znázorněn na obr. 11. 50 0-50 0 200 400 t (ms) Obr. 10 Napěťový ramp. Lineární zvýšení membránového potenciálu z -80 mv do +80 mv opakující se v intervalech 1 s. Základem tohoto měření je tzv. napěťový ramp (obr. 10), to je lineární zvýšení membránového potenciálu od -80 mv do +80 mv rychlostí 1 V/s, které se opakuje v intervalech 1 sekundy. Pro ověření, zda jsou v buňce přítomny funkční kanály TRPA1, byla ještě před provedením protokolu použita série 100 mv napěťových pulzů (od -80 do +200 mv, po +20 mv), která je podrobně popsána v kapitole 5.2.1.. Proudové odpovědi byly zaznamenávány v kontrolním roztoku bez divalentních iontů (prvních 10 s měření) a poté v přítomnosti agonisty cinnamalu (100 µm), který byl aplikován na buňku po 40 s (světle žluté pole v obr. 11A). Do grafu byly vyneseny hodnoty membránového proudu měřeného při napětí -80 mv a +80 mv, výsledná křivka je časovým průběhem průměru a střední chyby průměru hodnot ze 13 nezávislých měření (n = 13). Tento typ analýzy se ukázal jako nejvhodnější způsob zobrazení a kvalitativního porovnání časového průběhu membránových proudů za různých experimentálních podmínek. Cinnamal prochází membránou buněk a kovalentně modifikuje TRPA1 receptor z cytoplazmatické strany to se projeví postupným zvýšením aktivity kanálů. Po odmytí cinnamalu z extracelulárního prostoru roztokem bez divalentních iontů (na obr. 11A je znázorněno mezi 50. a 60. sekundou záznamu) aktivace přetrvávala, přičemž proudová odpověď se jen lehce snížila (cca o 15%), což nasvědčuje tomu, že u většiny iontových kanálů přetrvávala aktivace kovalentní modifikací. Poté jsme aplikovali extracelulární roztok (ECS) obsahující 2 mm Ca 2+ (zelené pole v obr. 11A). Na obr. 11 je vidět rychlé a výrazné zvýšení aktivity, které je následované pozvolnou inaktivací, která byla v časovém intervalu přesahujícím 10 minut nevratná. Přestože stimulační protokol byl pro všechna měření neměnný, existovaly patrné rozdíly 32