Angiogeneze a nádorová onemocnûní

Editorial Angiogeneze a nádorová onemocnûní Prof. MUDr. Pavel Klener, DrSc. I. interní klinika 1. LF UK a VFN, Praha Souhrn Klener P. Angiogeneze a nádorová onemocnûní. Remedia 2002;12:2 8. Novotvorba cév je v znamn m faktorem, kter se podílí na rûstu nádoru a metastazování. Je podán pfiehled mechanismû angiogeneze a v ãet angiogenních a antiangiogenních faktorû. U mnoha nádorov ch onemocnûní (vãetnû hematologick ch malignit) je zv ená angiogeneze povaïována za negativní prognostick faktor, kter znamená zv enou agresivitu nádoru a riziko metastáz. Proto omezení angiogeneze pfiedstavuje atraktivní pfiístup v protinádorové léãbû. Na základû dne ních znalostí je moïné pouïít nejménû tfii rûzné zpûsoby antiangiogenní léãby. Základními pfiístupy jsou inhibice angiogenních faktorû, inhibice endotelové proliferace a stabilizace bazální membrány. Je podán pfiehled angiogenních inhibitorû provûfiovan ch v klinick ch studiích a je zmínûn mechanismus jejich úãinku. Klíãová slova: angiogeneze nádorov rûst antiangiogenní léãba nádorû nové angiogenní inhibitory. Summary Klener P. Angiogenesis and cancer. Remedia 2002;12:2 8. Angiogenesis have shown a major role in tumor growth and metastasis formation. The most important angiogenic and antiangiogenic factors are reviewed. For many cancers (including hematological malignancies) the extent of vascularisation is a negative prognostic indicator signifying aggressive disease and increased potential for metastasis. Thus, antiangiogenic therapy is an attractive approach for antitumor treatment. Based on today s knowledge, at least three strategies for inhibition of angiogenesis are feasible. Inhibition of angiogenic factors, inhibition of endothelial cell proliferation and stabilisation of basement membrane. The developmental status of angiogenesis inhibitors in human clinical trials is presented, including their proposed mechanism of action. Key words: angiogenesis tumor growth antiangiogenic therapy in cancer new angiogenic inhibitors. Úvod Termínem angiogeneze rozumíme proces novotvorby cév, kter nachází uplatnûní jak za fyziologick ch okolností, tak v patogenezi rûzn ch chorobn ch stavû. Má mimofiádn v znam napfi. pro správn v voj embrya, uplatàuje se pfii hojení zlomenin nebo v prûbûhu menstruaãního cyklu pfii reparaci sliznice endometria. Porucha normálního procesu angiogeneze je pfiíãinou nejrûznûj- ích patologick ch stavû. Zv ená novotvorba cév je napfi. odpovûdná za nûkteré fibroproliferaãní pochody, má podíl v patogenezi revmatoidní artritidy, pfii vzniku retinopatie nebo u chronického zánûtu [11]. V posledním desetiletí je angiogeneze stfiedem zv ené pozornosti v onkologii, neboè se jí pfiipisuje v znamná úloha v patogenezi nádorového procesu a metastazování. První doklady podporující hypotézu o závislosti nádorového rûstu a metastazování na stupni angiogeneze pocházejí jiï z 80. let minulého století [10]. Teprve v posledních letech v ak byly podrobnûji popsány mechanismy, kter mi je angiogeneze regulována. Mechanismus angiogeneze Angiogeneze je vícestupàov proces, kter b vá oznaãován jako angiogenní kaskáda. Proces je regulován souborem humorálních pûsobkû, zejména cytokinû, integrinû, adhezních molekul, proteolytick ch enzymû a nízkomolekulárních látek [4]. Jejich interakce jsou znaãnû sloïité a nejsou do v ech podrobností prozkoumány. Za fyziologick ch okolností jsou faktory stimulující novotvorbu cév v rovnováze s faktory antiangiogenními [15]. Ztráta rovnováhy mezi stimulátory a inhibitory angiogeneze se projeví poruchou, jejíï charakter závisí na tom, která ze skupin regulátorû nabyla vrchu. SníÏená koncentrace ãi aktivita angiogenních faktorû má za následek napfi. poruchu hojení ran nebo pomalé hojení zlomenin, naopak jejich zv ená koncentrace mûïe zpûsobit fiadu patologick ch stavû, které jiï byly zmínûny v úvodu. Angiogenní kaskádu lze rozdûlit pfiibliïnû na tfii etapy. Disoluce bazální membrány je iniciální fází. Zpravidla pfiedchází vazodilatace, pfii které se protahuje tvar endotelov ch bunûk, naru uje se plynulost bazální membrány nejen mechanicky, ale téï enzymaticky pûsobením proteolytick ch enzymû. Úãinkem angiogenních faktorû se zvy uje permeabilita membrány umoïàující únik fibrinogenu a plazminogenu z cévy a jejich následnou pfiemûnu na fibrin a plazmin. SíÈ fibrinov ch vláken vytváfií matrici pro rûst novotvofiené cévy, plazmin pfiispívá k disoluci membrány a extracelulární matrix. Proliferace a migrace endotelií jsou stimulovány angiogenními faktory. Endotelové buàky nejprve vytváfiejí na povrchu cévy útvary pfiipomínající pupeny, pozdûji nab vají endotelie lokomoãních schopností a uchytí se na síti vytvofien ch fibrinov ch vláken. Vzniká tak základ nové cévy. Vlastní morfogeneze nové cévy pfiedpokládá aktivaci pericytû, vytvofiení nové 2 Angiogeneze a zhoubná onemocnění

bazální membrány a lumina cévy. Pfiedpokládá zv enou proliferaci fibroblastû a syntézu kolagenu úãinkem PFGF a TGF-α. Angiogenní faktory Angiogenní faktory (tab. 1) b vají nûkdy souhrnnû oznaãovány jako TAF (tumor angiogenesis factors) a stimulují angiogenezi rûzn mi mechanismy a v rûzn ch etapách angiogenní kaskády. Kromû pfiím ch angiogenních faktorû (VEGF, bfgf a HGF) existují i tzv. nepfiímé angiogenní faktory, které zpûsobují zv en v dej faktorû pfiím ch (TGF-α, EGF, PDGF aj.) [2]. VEGF (vascular endothelial growth factor), rûstov faktor pro endotelie, je povaïován za nejv znamnûj í faktor angiogeneze. Bylo identifikováno 6 variant tohoto faktoru (VEGF, PGF placental growth factor, homologní s VEGF, dále VEGF B, C, D a E), tvofiících rodinu VEGF" [28]. Jsou to dimerické glykoproteiny obsahující 8 cysteinov ch zbytkû (obr. 1). UvolÀují se pfieváïnû z fibroblastû a za patologick ch okolností z nádorov ch bunûk, úãinkem EGF a jin ch nepfiím ch angiostimulátorû. Produkce VEGF se zvy uje téï pfii hypoxii pûsobením zvlá tního faktoru oznaãovaného jako hif-1 (hypoxia induced factor) [13]. VEGF se podobnû jako jiné rûstové faktory váïe na specifické receptory lokalizované na membránû endotelov ch bunûk a touto vazbou aktivuje receptorové tyrosinkinázy. Tím se spustí transdukãní kaskáda, jejímï v sledkem je zv ená proliferace cestou ras-mapk, usnadnûná migrace a zv ená permeabilita fosfolipázovou cestou, jak je schematicky znázornûno na obr. 2. Byly identifikovány 3 druhy receptorû pro VEGF, z nichï kaïd je odpovûdn za jiné úãinky tohoto rûstového faktoru [6,35]. Vazba na VEGFR-1 (Flt-1) se projeví stimulací proliferace a migrací endotelií, vazba na VEGFR-2 (Flk-1/KDR) pûsobí zv ení cévní permeability a blokuje apoptózu endotelií. Zv ení permeability je natolik v znamnou vlastností VEGF, Ïe byl dfiíve naz ván VPF (vascular permeability factor). Nepochybnû se uplatàuje parakrinním mechanismem indukovan zv - en v dej proteolytick ch enzymû matrix metaloproteáz (MMP) z fibroblastû, popfiípadû z nádorov ch bunûk [16]. FGF (fibroblast growth factor), rûstov faktor pro fibroblasty, patfií k v znamn m stimulátorûm angiogeneze. Obû jeho formy, acidická (afgf) i bazická (bfgf), jsou v znamn mi mitogeny endotelov ch bunûk. Kromû toho zvy uji expresi proteinu bcl-2, a blokují tak apoptózu endotelií. Mají silnou afinitu k heparinu, coï vysvûtluje jejich vazbu na heparansulfát proteoglukanu v bazální membránû cévy. UvolÀují se z aktivovan ch T-lymfocytÛ, makrofágû nebo z nádorov ch bunûk. Podnût k jejich vazebná extracelulární doména tyrosinkinázová doména VEGFR-1 (Flt-1) VEGFR-2 (Flt-1/KDR) VEGFR-3 (Flt-4) vazba VEGF aktivovan receptor angiogeneze Obr. 1 Dva receptory vytvářejí dimer, na který se váže VEGF a touto vazbou aktivuje tyrosinkinázy v intracelulární doméně receptoru. Tab. 1 NEJV ZNAMNùJ Í ANGIOGENNÍ FAKTORY A JEJICH FUNKCE angiogenní faktor mechanismus úãinku rodina VEGF indukce proliferace endotelií (vascular endothelial growth factor) zv ení permeability bazální membrány VEGF A-E PGF (placental growth factor) FGF mitogenní úãinek na endotelie (fibroblast growth factor) afgf (acidick ) bfgf (bazick ) HGF morfogeneze nové cévy (hepatocyte growth factor) MMP proteol za bazální membrány (matrix metalloproteases) a extracelulární matrix matrilysin stromelysin gelatinázy kolagenázy angiopoetiny komplexní antiangiogenní úãinky, omezení angiopoetin-1 exprese adhezních molekul, aktivace pericytû angiogenin angiotropin PDGF stimulace a proliferace fibroblastû (platelet derived growth factor) a produkce kolagenu PD-ECGF usnadnûní migrace endotelií (platelet derived endothelial cell growth factor) TNF-α aktivace MMP (tumor necrosis factor) EGF nepfiímé úãinky, stimulace v deje VEGF (epidermal growth factor) TGF-α nepfiímé úãinky, stimulace v deje VEGF (transforming growth factor) interleukiny (IL-1, IL-6, IL-8) integriny Schematické znázornûní receptoru pro VEGF (vascular endothelial growth factor) stimulace mitogeneze a migrace endotelií usnadnûní migrace bunûk Angiogeneze a zhoubná onemocnění 3

Vysvětlivky: Ras MAPK FAK dukci adhezních molekul (ICAM-1, VCAM-1) [14]. TNF-α (tumor necrosis factor), faktor nekrotizující nádory, je uvolàován z aktivovan ch monocytû a makrofágû v procesu angiogeneze. Uplatní se pfii degradaci bazální membrány jako aktivátor MMP. Podnûcuje téï v dej nûkter ch cytokinû (IL-1) a adhezních molekul (ICAM-1). Pfii vy í koncentraci mûïe mít paradoxní úãinek. Indukuje intravaskulární koagulaci a mûïe zpûsobit i uzávûr cévy a nekrózu nádoru. MMP (matrix metalloproteases), matrix metaloproteázy, jsou enzymy, které sv m proteolytick m úãinkem pûsobí na bazální membránu endotelií a na extracelulární matrix (matrilysin, kolagenázy, stromelysin, gelatinázy). Tím usnadàují angiogenezi jednak zv ením cévní permeability, jednak vytváfiením prostoru pro novû vznikající cévu. Podporují téï mobilitu endotelií. Mají v znam nejen pro angiogenezi, ale téï pro metastazování, neboè umoïàují invazi nádorov ch bunûk do cév [30]. PD-ECGF (platelet derived endothelial cell growth factor), endotelov destiãkov rûstov faktor, je thymidinfosforyláza s vysokou afinitou k endotelu. Má chemotaktické úãinky a usnadàuje migraci endotelií. PDGF (platelet derived growth factor) je mitogen, kter se uplatàuje v pozdûj- ích fázích angiogeneze. Stimuluje proliferaci fibroblastû a produkci kolagenu a má v znam pro formování nového lumen cévy. Zvy uje syntézu kolagenu. TGF-α (transforming growth factor) a EGF (epidermal growth factor) jsou rûstové faktory, jejichï angiogenní aktivita je pfieváïnû nepfiímá. Stimulují totiï v dej VEGF a FGF. V angiogenní kaskápaxillin VEGF A transdukční kaskáda Ras alterace cytoskeletu migrace endotelií proliferace endotelií VEGF růstový faktor pro endotelie Ras proteinkináza MAPKproteinkináza FAKproteinkináza PLC-γ fosfolipáza C Obr. 2 Bližší komentář v textu Schéma hlavních intracelulárních pochodû po aktivaci receptoru pro VEGF ANGIOGENEZE receptor pro VEGF B transdukce fosfolipázovou cestou DAG PKC IP 3 NOS NO PLC-γ DAG IP 3 PKC Ca ++ NOS proliferace endotelií permeabilita cévy diacylglycerol proteinkináza C inozitoltrifosfát NO syntáza oxid dusnatý NO uvolnûní není pfiesnû znám. Kromû parakrinní sekrece byla prokázána rovnûï autokrinní sekrece endotelov mi buàkami [10,15]. HGF (hepatocyte growth factor), naz van téï scattered factor, je polyfunkãní rûstov faktor produkovan buàkami mezodermálního pûvodu (fibroblasty, makrofágy, endotelie). Je dûleïit m faktorem morfogeneze, tedy i angiogeneze. Stimuluje proliferaci hepatocytû, keratinocytû a endotelií [2]. Angiopoetiny se uplatàují v pozdûj ích fázích novotvorby cév. Patfií mezi nû angiopoetin-1, angiogenin a angiotropin. Mají v raznou chemotaxi k endotelov m buàkám. UsnadÀují vzájemné kontakty endotelií, jejich vazbu k bunûãné membránû a pûsobí aktivaci pericytû, stabilizujících novû vytvofienou cévu. Angiogenin stimuluje endotelové buàky k produkci prostacyklinu (aktivuje fosfolipázu C a fosfolipázu A 2 ), omezuje pro- Tab. 2 NEJV ZNAMNùJ Í ANTIANGIOGENNÍ FAKTORY A JEJICH FUNKCE antiangiogenní faktor trombospondin angiostatin endostatin TGF-β (transforming growth factor) PF-4 (platelet factor 4) interferon-α a β interleukiny (IL-12, IL-18) inhibitory proteol zy TIMPs (tissue inhibitors of matrix metalloproteases) PAI (plasminogen activation inhibitor) mechanismus úãinku inhibiãní protein s komplexními antiangiogenními úãinky inhibice endoteliální proliferace indukce apoptózy endotelií omezení proliferace, zv ení produkce trombospondinu chemokin inhibující proliferaci endotelií inhibice endotelové proliferace inhibice migrace endotelií inhibice proteolytick ch enzymû (matrix metaloproteáz) inhibice tvorby plazminu 4 Angiogeneze a zhoubná onemocnění

Vznik angiogenního fenotypu v primárním nádoru neovaskularizace expanze nádoru karcinom in situ" vznik angiogenního klonu céva PF-4 (platelet factor 4) je protein uvol- Àovan z α-granulí krevních destiãek. Omezuje vazbu FGF na receptory a inhibuje proliferaci endotelií indukovanou VEGF. Spolu s IL-8 patfií do rodiny CXC chemokinû. Interferon-α a interferon-β omezují angiogenezi pravdûpodobnû tlumiv m úãinkem na proliferaci endotelií. Inhibitory proteol zy jsou produkovány klidov mi endotelov mi buàkami. Brání fragmentaci bazální membrány. Patfií mezi nû inhibitory metaloproteáz (TIM- Ps) nebo inhibitor aktivátoru plazminogenu (PAI). TGF-β (transforming growth factor) pûsobí zv en v dej trombospondinu a inhibici endotelové proliferace a mimetastazování mikroinvaze Obr. 3 dû se uplatní je tû vût í poãet cytokinû, zejména IL-1 (zvy uje expresi endotelov ch receptorû, stimuluje mitogenezi), IL-6 (má vliv na migraci endotelií), IL-8 (sv mi chemotaktick mi úãinky pfiispívá ke snadnûj í migraci endotelií), interferon-γ (zvy uje sekreci TNF-α, IL-1 a IL-8), GM-CSF (stimuluje makrofágy k v deji angiogenních faktorû). V znamná úloha pfiipadá téï integrinûm, coï jsou heterodimerické transmembránové proteiny modulující adhezi a migraci bunûk. Jsou exprimovány endotelov mi buàkami úãinkem angiogenních faktorû. Antiangiogenní faktory Antiangiogenní faktory (tab. 2) udrïují rovnováhu s angiogenními faktory. Jejich potlaãení umoïní angiogenezi. Mezi nejv znamnûj í a spolehlivû identifikované faktory patfií následující. Trombospondin, protein interagující s extracelulární matrix. Je produkován fibroblasty pod kontrolou supresorového genu p53. Pfii mutaci tohoto genu (napfi. u maligního nádoru) se koncentrace trombospondinu sniïuje, coï umoïní aktivitu angiogenních faktorû. Angiostatin je proteolytick produkt plazminogenu po jeho degradaci elastázou nebo nádorov mi proteázami. Selektivnû blokuje proliferaci endotelií, zvy uje koncentraci E-selektinu v endoteliích a posiluje jejich adhezní aktivitu [19]. Endostatin je fragment kolagenu XVII, má podobné vlastnosti jako angiostatin. Oba faktory indukují apoptózu endotelií [27]. Vzájemné ovlivnûní nádorov ch bunûk a endotelií VEGF (vascular endothelial growth factor) bfgf (fibroblast growth factor bazick ) MMP (matrix metalloproteases) HGF (hepatocyte growth factor) nádorová buàka VEGF (vascular endothelial growth factor) bfgf (fibroblast growth factor bazick ) EGF (epidermal growth factor) PDGF (platelet derived growth factor) IL-6 (interleukin-6) IL-8 (interleukin-8) endotelie Obr. 4 Endotelové mitogeny stimulují nádorové buňky k výdeji angiogenních působků, mitogeny z nádorovývh buněk stimulují proliferaci endotelií. Je možná i autokrinní stimulace. Angiogeneze a zhoubná onemocnění 5

Tab. 3 P EHLED LÁTEK ZKOU EN CH K INHIBICI ANGIOGENEZE inhibitory stimulátorû pfiirození antagonisté angiogenních faktorû ABT-510 (thrombospondin mimetic peptid) neovastat rekombinantní angiostatin rekombinantní endostatin rekombinantní PF-4 neutralizace angiogenních faktorû monoklonální protilátky proti VEGF (bevacizumab) proti bfgf blokáda receptorû pro angiogenní faktory solubilní receptory pro VEGF inhibice vazby na receptory suramin tecogalan inhibice receptorov ch kináz semaxanib (SU 5416) SU 6668 ZD 4190 inhibitory endotelové proliferace fumagilin AGM 1470 interferon-α a β thalidomid linomid stabilizátory bazální membrány prinomastat marimastat batimastat CAI (karboxyamidotriazol) minocyclin jiné inhibitory angiogeneze inhibitory integrinû vitaxin 2-methoxyestradiol clarithromycin cytostatika antracykliny taxany inhibitory topoizomerázy I inhibitory NO syntázy grace. Antagonizuje úãinky EGF a podporuje stabilitu bazální membrány. V razn antiangiogenní úãinek byl zji - tûn téï u nûkter ch dal ích cytokinû, zejména u IL-12 a IL-18, které oslabují migraãní schopnosti endotelií. Angiogeneze u nádorového onemocnûní Angiogeneze má klíãov v znam pro rûst nádoru. Rostoucí nádorové loïisko mûïe bez cévního zásobení dosáhnout nejv e rozmûru 1 2 mm 3. Pfii dal ím rûstu nestaãí prostá difuze kyslíku k dostateãnému zásobení proliferujících nádorov ch bunûk. Vzniklá hypoxie pûsobí genetickou nestabilitu, v hostilním prostfiedí vznikají mutace (napfi. mutace genu p53, a tím potlaãení produkce antiangiogenního trombospondinu). Objevuje se nov fenotyp nádorov ch bunûk charakterizovan zv enou produkcí angiogenních pûsobkû [5]. Tato zmûna, kterou se zahájí proces patologické angiogeneze, se oznaãuje jako angiogenní switch". BuÀky nádoru a endotelie se vzájemnû ovlivàují parakrinním mechanismem, dochází i k autokrinní stimulaci, jak je znázornûno na obr. 3. Vysoká aktivita NO syntázy v nádorové tkáni pûsobí vzestup koncentrace NO, kter potencuje mitogenní úãinek VEGF. Kromû toho produkují nádorové buàky téï proteolytické enzymy rozru ující bazální membránu, a usnadàují tak nejen migraci endotelií, ale i migraci nádorov ch bunûk a jejich metastazování. Migrující endotelie jsou zdrojem specifick ch integrinû zaji tujících jejich Ïivotnost. Kapilární morfogenezi podporují je tû dal í pûsobky (napfi. E-selektin). Vaskularizace nádorového loïiska umoïní perfuzi nádoru a jeho dal í (exponenciální) rûst. âím je angiogeneze intenzivnûj í, tím je prognóza onemocnûní hor í a riziko metastáz vût í (obr. 4). Tento poznatek má své praktické dûsledky, neboè stupeà angiogeneze mûïe poslouïit jako uïiteãn prognostick faktor. NejÏivûj í angiogeneze b vá na okraji nádoru, kde lze její intenzitu posoudit v histologick ch fiezech. Fokální oblasti (tzv. hot spots) lze spolehlivûji urãit napfi. pouïitím monoklonálních protilátek proti cévním endoteliím nebo protilátkami proti adhezním molekulám (CD31, CD34) ãi protilátkami proti von Willebrandovu faktoru. Citliv m ukazatelem kapilární denzity je téï stanovení koncentrace akvaporinu-1 (AQP-1), faktoru pûsobícího synergicky s VEGF a v znamnû zvy ujícího cévní permeabilitu [34]. PouÏití tûchto metod umoïní kvantitativní hodnocení, které je uïiteãn m prognostick m faktorem u mnoha solidních nádorû (u karcinomu prsu, plic, ledviny, kolorekta, moãového mûch fie, dûloïního hrdla, prostaty nebo u maligního melanomu) [36]. Korelace stupnû angiogeneze s prognózou nádorového onemocnûní má, jak se zdá, obecnou platnost, neboè bylo zji tûno, Ïe i u nádorov ch onemocnûní krvetvorné tkánû je v pfiítomnosti bohaté mikrovaskularizace kostní dfienû (tzv. MVD microvessel density) prognóza onemocnûní hor í. Mimo to ãetné studie prokázaly zv enou expresi angiogenních faktorû (VEGF a FGF) a receptorû pro nû u akutních leukémií, myelodysplastického syndromu, chronické lymfatické leukémie, nehodgkinsk ch lymfomû a u mnohoãetného myelomu [1,16,24]. Ukázalo se, Ïe stupeà koncentrace angiogenních faktorû, stejnû jako MVD, má prediktivní hodnotu [8,12]. Inhibice angiogeneze jako zpûsob protinádorové léãby Poznání úlohy angiogeneze pro rûst nádoru a jeho metastazování vedlo logicky ke hledání zpûsobu, jak úãinnû angiogenezi potlaãit, a tak zpomalit nebo zastavit rûst nádoru. V zkum se na rûzn ch pracovi tích zamûfiil na rûzné etapy angiogenního procesu. V zásadû lze zkou- ené angiogenní prostfiedky rozdûlit do tfií hlavních skupin [21], (tab. 3). Pfiirození antagonisté angiogeneze a inhibitory stimulátorû Existuje nûkolik moïností [7,15,17]. PouÏití pfiirozen ch antagonistû umoïnila rekombinantní technika jejich pfiípravy. Patfií mezi nû ABT-510 (thrombospondin mimetic peptid TSP-1), kter má vlastnosti pfiirozeného trombospondinu a blokuje odpovûd na angiogenní podnûty. Inhibuje aktivitu endotelií a podporuje jejich apoptózu. V experimentu byla prokázána jeho schopnost v raznû potlaãit rûst rûzn ch transplantovan ch nádorû. V prvních fázích klinického zkou ení je téï rekombinantní angiostatin, endostatin a neovastat, popsan podrobnûji dále. Do skupiny pfiirozen ch inhibitorû patfií také rekombinantnû pfiipraven destiãkov faktor 4 (PF-4). V souãasné dobû se zkou í u nemocn ch s Kaposiho sarkomem, maligním melanomem a adenokarcinomem ledviny. Po systémovém podání mizí velmi rychle z cirkulace a dosud se hledá optimální dávka. Naopak jeho intralezionální aplikace byla u Kaposiho sarkomu bezpeãná. Neutralizace úãinku angiogenních faktorû lze dosáhnout rûzn mi zpûsoby, které jsou schematicky znázornûny na obr. 5. Je to pfiedev ím pûsobením monoklonálních protilátek proti FGF a VEGF [25]. Nejvíce studována je humanizovaná my í protilátka proti VEGF nazvaná bevacizumab. Pro vysokou antiangiogenní úãinnost na experimentálních modelech bylo jiï zapoãato s jejím klinick m zkou ením u rûzn ch nádorû. Dal- í moïností je blokáda receptorû pro an- 6 Angiogeneze a zhoubná onemocnění

Hlavní zpûsoby inhibice VEGF (vascular endothelial growth factor) 2 inhibice blokádou extracelulární domény receptoru monoklonálními protilátkami VEGF-receptor receptorové tyrosinkinázy VEGF giogenní faktory. K blokádû lze pouïít solubilní VEGF receptory, které obsadí vazebná místa a vytvofií na membránov ch receptorech inaktivní heterodimery neschopné signální transdukce [23]. Vazbû rûstov ch faktorû (vãetnû angiogenních) na specifické receptory brání chemoterapeutikum suramin. Interferenci s vazbou bfgf na receptory endotelií pûsobí nízkomolekulární peptidoglykan tecogalan. Provûfiuje se v první etapû klinického zkou ení u karcinomu prsu, plic a u Kaposiho sarkomu. Zdá se, Ïe má i pfiímé protinádorové úãinky [33]. Nejúãinnûj í se zdají b t nízkomolokulární slouãeniny pûsobící jako inhibitory receptorov ch kináz [22,26]. Semaxanib (SU 5416) blokuje pfiedev ím receptory VGFR-1 (Flt-1) a c-kit (ligand pro SCF exprimovan na myeloblastech). Je to indolinová slouãenina, jejíï vzorec je na obr. 6. Ve II. etapû klinického zkou ení se podával v dávce 190 mg/m 2 /den 2x t dnû intravenóznû. Léãba byla dobfie sná ena, podle pfiedbûïn ch v sledkû potencovala úãinek chemoterapie. Souãasnou blokádou receptorû c-kit (které jeví zv enou expresi u myeloidních leukemiích) mûïe semaxanib potencovat svûj antiangiogenní úãinek téï úãinkem antileukemick m. Receptory VGFR-2 (Flk-1/KDR) blokuje pfiípravek SU 6668 vyvíjen firmou Sugen. Jeho v hodou je i souãasná blokáda receptorû FGFbR a PDGFR. Podobné inhibiãní úãinky má také GGP 41251 (Novartis). V laboratofiích AstraZeneca byl pfiipraven perorální inhibitor inhibující oba typy receptorû pro VEGF (Flt-1 a Flk-1), s kódov m oznaãením ZD4190. Omezuje nejen proliferaci endotelií, ale v raznû sniïuje i permeabilitu bazální membrány. Genová terapie se mûïe uplatnit ve formû protismûrn ch oligodeoxynukleotidû proti mrna pro VEGF nebo pouïitím specifick ch ribozymû. Ribozym nazvan angiozym je v souãasné dobû provûfiován u pokroãil ch malignit ve druhé etapû klinického zkou ení [32]. Inhibice endoteliální proliferace V polovinû 80. let byly zji tûny inhibiãní úãinky na proliferaci endotelií u fumagilinu (extraktu z houby Aspergilus fumigatus), kter se v ak pro znaãnou toxicitu nejevil jako perspektivní. Zato jeho syntetick derivát AGM-1470 angiogenesis modulator) je prakticky netoxick a má je tû v raznûj í inhibiãní úãinky. Chemicky jde o o-chloracetylkarbamoyl-fumagilol. Inhibuje translokaci membránov ch bioproteinû a inhibuje transkripãní faktor Ets-1. Po úspû ném testování v experimentu byly zahájeny i klinické zkou ky u Kaposiho sarkomu (léãeno více neï 100 nemocn ch). PÛvodní dávka 9,3 mg/m 2 /obden byla pozdûji eskalována. Pfiekroãení dávky nad 70 mg/m 2 je v ak provázeno známkami neurotoxicity. Byla popsána regrese metastáz u pokroãilého karcinomu ãípku. Léãba v ak musí b t dlouhodobá. Zajímavou látkou je thalidomid. Jeho antiangiogenní úãinky byly nepochybnû pfiíãinou malformací plodu, které pûsobilo jeho podávání tûhotn m Ïenám. Mechanismus antiangiogenního úãinku nebyl dosud plnû objasnûn. Pravdûpodobnû moduluje úãinek integrinû, ale mûïe pûsobit téï pfiímou vazbou na DNA [29]. První klinické studie ukázaly pfiízniv úãinek u karcinomu prostaty (po dávce 1 200 mg/den), probíhají studie u gliomû a u karcinomu prsu. Zkou í se i nov derivát 3-aminothalidomid. Inhibiãní úãinky na proliferaci mají téï combrestatiny, v taïky z africké rostliny Combretum cafrum, které indukují apoptózu endotelií a destabilizují mikrotubuly. Aminosterolové slouãeniny skvalaminy mají pravdûpodobnû podobn mechanismus úãinku. Proliferaci endotelií tlumí téï interferon-α a interferon-β. Klinické zku- enosti jsou zejména s pouïitím interferonu-α v léãbû progredujích hemangiomû. Stabilizace bazální membrány a extracelulární matrix Intaktní bazální membrána znesnadàuje invazi endotelií, a proto mûïe mít v znam inhibice enzymû, které tuto matrix rozru ují [18]. Tyto enzymy se souhrnnû oznaãují jako matrix metaloproteázy (MMP). Patfií mezi nû intersticiální kolagenázy, gelatináza, matrilysin a stromelysiny. Inhibici tûchto enzymû pûsobí TIMPs (tissue inhibitors of metalloproteases). Z pfiirozen ch inhibitorû se zkou í 1 inhibice angiogenních faktorů monoklonálními protilátkami 3 nejúčinnější inhibicí angiogenních faktorů je inhibice receptorových tyrosinkináz buněčná membrána Obr. 5 Kromě neutralizace VEGF monoklonálními protilátkami (MP) je možné použít MP k blokádě extracelulární domény receptoru. Nejúčinnější se zdá inhibice receptorových kináz. N H CH 3 neovastat, purifikovan extrakt ze Ïraloãích chrupavek. Aãkoliv jeho hlavním úãinkem je inhibice proteolytick ch enzymû (zejména MMP-2, MMP-9 a MMP- 12), lze jej povaïovat za multifunkãní antiangiogenní pfiípravek, neboè souãasnû blokuje vazbu angiogenních faktorû na receptory. Podává se ve formû roztoku per os v dávce 240 ml dennû [9]. Pfiíznivé v sledky II. etapy klinického zkou- ení byly podkladem pro zahájení III. fáze klinického zkou ení u bronchogenního karcinomu a u adenokarcinomu ledviny. Nev hodou pfiirozen ch inhibitorû je jejich relativnû krátk poloãas. Byla v ak pfiipravena téï fiada syntetick ch inhibitorû, napfi. prinomastat AG 3340 (Agouron), kter blokuje zejména aktivitu gelatinázy, stromelysinu I a kolagenázy 3. Je k dispozici v perorální formû. Marimastat a batimastat jsou nízkomoleku- O N H Obr. 6 Strukturní chemický vzorec semaxanibu CH 3 Angiogeneze a zhoubná onemocnění 7

lární slouãeniny, které váïou zinek nutn k aktivaci metaloproteáz. Byly zkou- eny s dobr mi úãinky u nemalobunûãného karcinomu plic a u karcinomu prostaty. Sná enlivost léãby byla dobrá, z neïádoucích úãinkû se ãasto uvádûly bolesti kloubû a únava. Z dal ích inhibitorû metaloproteáz lze uvést karboxyamidotriazol (CAI). Také antibiotikum ze skupiny tetracyklinû minocyclin inhibuje angiogenezi svou antikolagenázovou aktivitou. Jiné moïnosti angiogenní inhibice Jak jiï bylo uvedeno, v procesu angiogeneze se uplatàují rûzné biomodulátory, zejména integriny. Monoklonální protilátky proti integrinûm mohou blokovat stimulaãní úãinek integrinû na apoptózu. K dispozici je napfi. vitaxin, protilátka proti α v -β 1 integrinu [37]. JestliÏe novotvofiená céva roste na fibrinové matrici, zdá se logické, Ïe omezení tvorby fibrinu mûïe rovnûï brzdit angiogenezi a rûst nádoru. Prokázali jsme omezení rûstu implantovaného fibrosarkomu u my í po pfiedbûïné aplikaci heparinu nebo defibrázy [20]. Pfiímá inhibice angiogeneze je v ak úãinnûj í, a proto se v zkum orientuje na provûfiování antiangiogenního úãinku rûzn ch látek. V experimentu byly takové úãinky zji tûny u makrolidového antibiotika claritromycinu a u antimykotika clotrimazolu. Novou látkou, s jejímï klinick m testováním se má zaãít v leto ním roce, je 2-methoxyestradiol (2NE2). Po perorálním podání vykazuje jak protinádorovou, tak antiangiogenní aktivitu [31]. Antiangiogenní úãinky byly popsány téï u nûkter ch induktorû diferenciace, jako jsou retinoidy nebo deltanoidy, a u inhibitorû NO syntázy. Stojí téï za zmínku, Ïe nûkterá protinádorová chemoterapeutika a nûkterá jiná léãiva mají v raznou antiangiogenní komponentu. Z cytostatik byly antiangiogenní úãinky zji tûny u taxanû, antracyklinov ch antibiotik, mitoxantronu a u inhibitorû topoizomerázy I. Tyto úãinky pfietrvávají v období, kdy se vyvine rezistence nádorov ch bunûk k danému cytostatiku, neboè u endotelií se rezistence nevyvíjí (jsou geneticky stabilní). Vzhledem k rozdíln m mechanismûm úãinku chemoterapie a antiangiogenních látek se zdá velmi racionální kombinace obou léãebn ch metod. Praktické zku enosti v ak jsou v tomto smûru omezené. Stejnû tak nelze nyní posoudit v hody souãasného podání rûzn ch inhibitorû angiogeneze, i kdyï se tato moïnost jeví jako perspektivní. Závûr Pfies slibné vyhlídky je antiangiogenní terapie zatím v sadou v zkumn ch pracovi t. Je to zpravidla léãba dlouhodobá a její hodnocení je ve srovnání s úãinky chemoterapie pomûrnû obtíïné. Je proto tfieba v tomto smyslu korigovat zprávy sdûlovacích prostfiedkû pfiisuzující tûmto lékûm zcela mimofiádné úãinky, a pfiedejít tak zbyteãnému stresu nemocn ch a jejich pfiíbuzn ch, kter pramení ze zbyteãného shánûní nedostupn ch lékû. Tento pfiíspûvek vznikl s podporou grantu v zkumného zámûru MSM 111100004. Literatura [1] Aguayo A, Kantarjian H, Manshouri T, et al. Angiogenesis in acute and chronic leukemias and chronic leukemias and myelodysplastic syndromes. Blood 2000;96:2240 45. [2] Borset M, Hjorth-Hansen H, Seidel C, et al. Hepatocyte growth factor and its receptor c-met in multiple myeloma. Blood 1996;88: 3998 4004. [3] Brooks PC. Cell-adhesion moleculs in angiogenesis. Cancer Metastasis Rev. 1996;15: 187 94. [4] Carmeliet P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000;6:389 95. [5] Carmeliet P, Jain RK. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 2000;407:249 57. [6] Clauss M. Molecular biology of the VEGF and VEGF receptor family. Semin Thromb Hemost 2000;26:561 69. [7] Deplanque G, Harris AL. Anti-angiogenic agents: clinical trial design and therapies in development. Eur J Cancer 2000;36:1713 24. [8] Eidner N. Tumoral vascularity as a prognostic factor in cancer patients. The evidence of continues to grow. J Pathol 1998;184:119 22. [9] Falardeau P, Champagne P, Poyet P, et al. Neovastat, a naturally occuring multifunctional antiangiogenic drug, in phase III clinical trials. Semin in Oncol. 2001;28:620 25. [10] Folkman J, Klagsburn M. Angiogenic factors. Science 1987;235:442 47. [11] Folkman J. Angiogenesis-dependent diseases. Semin in Oncol. 2001;28:536 42. [12] Fox SB. Tumor angiogenesis and prognosis. Histopathology 1997;30:294 301. [13] Fukumura D, Jain RK. Role of nitric oxid in angiogenesis and microcirculation in tumors. Cancer Metastasis Rev. 1998;17:77 89. [14] Gabrilove JL. Angiogenic growth factors: Autocrine and paracrine regulation of survival in hematologic malignancies. Oncologist 2001;6 (suppl.5):4 7. [15] Gastl G, Hermann T. Steurer M, et al. Angiogenesis as a target for tumor treatment. Oncology 1997;54:177 184. [16] Giles F. The vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway: A therapeutic target in patients with hematological malignancies. Oncologist 2001;6(Suppl.4):32 39. [17] Hagedorn M, Bikfalvi A. Target molecules for anti-angiogenic therapy: from basic research to clinical trials. Crit Rev Oncol Hematol 2000;34:89 110. [18] Harris AL. Angiogenesis for cancer therapy. Lancet 1997;349:13 15. [19] Harris AL. Are angiostatin and endostatin cures for cancer? Lancet 1998;351:1598 99. [20] Klener P, Bubeník J, Donner L. Influence of heparin and defibrase on transplantability of syngeneic tumors in mice. Neoplasma 1978;25:631 35. [21] Kruger EA, Duray PH, Price DK, et al. Approaches to preclinical screening of antiangiogenic agents. Semin.in Oncol. 2001;28: 570 76. [22] Laird AD, Vajkoczy P. Shawver LK, et al. SU 6668 is a potent antiangiogenic and antitumor agent that induces regression of established tumors. Cancer Res 2000;60:4152 60. [23] Lin P, Sankar S, Shan S, et al. Inhibition of tumor growth by targeting tumor endothelium using a soluble vascular endothelial growth factor receptor. Cell Growth Differ. 1998;9: 49 58. [24] Lundberg LG, Lerner R, Sundelin P, et al. Bone marrow in polycythemia vera, chronic myelocytic leukemia, and myelofibrosis has an increase vascularity. Am J Pathol 2000;157: 15 19. [25] McMahon G. VEGF receptor signaling in tumor angiogenesis. Oncologist 2000;(Suppl.1)5: 3 10. [26] Mendel DB,Laird AD, Smolich BD, et al.: Development of SU 5416, a selective small molecule inhibitor of VEGF receptor tyrosine kinase activity, as an anti-angiogenesis agent. Anti-Cancer Drug Design 2000;15:29 41. [27] O Reilly MS, Boehm T, Shing Y, et al. Endostatin: An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth. Cell 1997;88: 277 85. [28] Pinedo HM, Slamon DJ. Translational research: The role of VEGF in tumor angiogenesis. Oncologist 2000;(Suppl.1)5:1 2. [29] Rajkumar SV, Witzih TE. A review of antiangiogenesis and antiangiogenic therapy with thalidomide in multiple myeloma. Cancer Tret Rev 2000;26:351 62. [30] Raza SL, Cornelius LA. Matrix metalloproteinases: Pro-and anti-angiogenic activities. J Invest Dematol 2000;5:47 54. [31] Rosen L. Antiangiogenic strategies and agents in clinical trials. Oncologist 2000;5(Suppl.1):20 27. [32] Sandberg JA, Sproul CD, Blanchard KS, et al. Acute toxicology and pharmacokinetic assessment of a ribozyme (Angiozyme) targeting vascular endothelial growth factor receptor mrna in Cynomolgis monkey. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2000;19: 153 62. [33] Shaheen RM, Davis DW, Liu W, et al. Antiangiogenic therapy targeting tyrosine kinase receptor for vascular endothelial growth factor receptor inhibits the growth of colon cancer liver metastasis and induces tumor and endothelial cell apoptosis. Cancer Res 1999;59:5412 16. [34] Vacca A, Frigeri A, Ribattri D, et al. Microvessel overexpression of aquaporin-1 parallels bone marrow angiogenesis in patients with active multiple myeloma. Brit J Haematol 2001;113: 415 21. [35] Veikkola T, Karkkainen M, Claesson-Welsh L, et al. Regulation of angiogenesis via vascular endothelial growth factor receptors. Cancer Res 2000;60:203 212. [36] Weidner N, Semple JP, Welch VR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis. Correlation in invasive breast carcinoma. A Engl J Med 1991;324:1 8. [37] Zetter BR. Angiogenesis and tumor metastasis. Ann Rev Med 1998;49:407 424. 8 Angiogeneze a zhoubná onemocnění