Inhibice enzyoé aktiity inhibitory látky l snižuj ující specificky aktiitu daného enzyu ztráta ta aktiity ůž ůže e být dočasn asná,, aktiita se obnoí odstranění inhibitoru (např.. dialysa, geloá filtrace, )) reerzibilní inhibitory ireerzibilní inhibice ztráta ta aktiity je neratná (za noráln lních podínek), aktiita obykle ubýá postupně čase Reersibilní inhibitory E + S I EI K ES k 2 ES K is I K ii αk 2 ESI E + P EI + P [E][I] K is [EI] [ES][I] K ii [ESI] obecné schea reersibilní inhibice K ES ronoážná konstanta reakce enzyu se substráte, te, obykle platí K ES ~ K K is ronoážná inhibiční konstanta (slope - sěrnico rnicoá) K ii ronoážná inhibiční konstanta (intercept - úsekoá) plná inhibice (α0),( parciáln lní inhibice (0<( 0<α<) jsou to disociační konstanty - nižší hodnota znaená ětší inhibici
Rychlost inhiboané reakce "zdánliý" paraetr ' faktor x "skutečný" paraetr ' ax ' + K kopetitiní (K ii ) nekopetitiní (K ii K is K i ) akopetitiní (K is ) sěsn sná (K ii 0, K ii Inhibice ii K is is, K is 0) ' ax ax ax /( + [I]/K i ) ax /( + [I]/K ii ) ax /( + [I]/K ii ) K' K ( + [I]/K is ) K K /( + [I]/K ii ) K ( + [I]/K is )/( + [I]/K ii ii ) poocí hodnot z tabulky pak lze zkonstruoat kinetickou ronici Kopetitiní inhibice inhibitor i substrát t se áží do stejného aktiního ísta enzyu - kopetice (obykle jsou strukturně podobné) při i elké nadbytku substrátu tu se li inhibitoru "překon ekoná" " a rychlost dosáhne půodního axia ax (K ii ) i, kop ax [I] K + + K is určen ení inhibiční konstanty: soubor priárn rních LB grafů pro každou danou [ I ] získá se soubor sěrnic a úseků úseky stejné K K' K is [0,0] ' ax [ I ] narůst stá sěrnice ax [ I ]0 K' ' ax 2
Určen ení inhibičních konstant (kop.) sěrnice K i "sěrnico rnicoá" úsek K i "úsekoá" K is K ii [ 0,0 ] [ I ] [ 0,0 ] [ I ] da sekundárn rní grafy - ýnosy hodnot sěrnic resp. úseků proti odpoídaj dající koncentrací inhibitoru obecný postup pro šechny typy ratných inhibicí Akopetitin opetitiní inhibice angl. uncopetitie inhibitor se áže e pouze na koplex ES a ne na olný E LB pri. ýnosu se získz ská soubor ronoběž ěžek (K is ) K ii ' ax [ I ] narůst stá sěrnice stejné [ I ]0 i, akop K ax [I] + + K is úseky ax K' ' ax obykle pozoroáno u dousubstrátoých toých reakcí K' K [0,0] 3
Inhibice sěsn sná a nekopetitin opetitiní angl. ixed resp. noncopetitie sěsn sná inhibice je obecný případ, p pad, K ii K is K K' ' ax úseky různé [0,0] sěrnice různé ax K' ' ax K is [ I ] narůst stá [ I ]0 K ii nekopetitiní inhibice je speciáln lní případ, pad, K ii K is K i K i [ I ] 50 (zácn cné) Kde bude průse sečík? K is < K ii K is > K ii 4
Sronání účinků ratných inhibitorů typ inhibice: (a) sěsn sná, [ I ] K is 0.5K ii, enší ' ax 0.67 ax, yšší K' 2K2 (b) kopetitiní, [ I ] K is, ' ax ax, yšší K' 2K2 (c) akopetitiní, [ I ] K ii ; enší ' ax 0.5 ax a K' 0.5K (d) nekopetitiní, [ I ] K is K ii ; enší ' ax 0.5 ax, K' K Inhibice substráte te (nadbytke) E + S K K ES k 2 ES S ax + + KS ES 2 Ukázka liu rostoucí zhlede ke K : bez inhibice, /K >> 00 /K 00 /K 0 /K E + P [ES] [ES ] do aktiního ísta se naáže e druhá olekula substrátu tu speciáln lní případ pad akopetitiní inhibice 2 5
Ireersibilní inhibice áží se koalentně do aktiního ísta zničí skupinu ainokyseliny enzyu, která se účastní biokatalytické reakce znikne eli pená nekoalentní interakce a xanthinoxidasa) H H interakce (allopurinol důležité pro studiu průběhu enzyoé reakce - lze tak určit, které ainokyseliny se na nín podílí ukázka reakce chyotrypsinu a diisopropylfluorfosfátu (DFP), edoucí ke koalentní odifikaci serinu aktiní íst stě Titrace enzyoé aktiity ire. inhibitore postupné přidáání inhibitoru, aktiita (resp. reakční rychlost) lineárn rně klesá s nožst stí přidanp idaného inhibitoru "bodě ekialence" je látkol tkoé nožst stí enzyu n E (resp. jeho aktiních íst) roné látkoéu nožst stí přidaného inhibitoru n I lze tak jednoduše e určit a nožst stí enzyu n E např.. DFP a cholinesterasa, těžké koy a -SH skupina [0,0] [ I ] 6
"Seberažedn edné" substráty ty noráln lně prakticky nereaktiní po naázání do aktiního ísta enzyu proběhne část enzyoé reakce, přičep ež znikne eli reaktiní eziprodukt, co se koalentně naáže e aktiní ístě angl. "suicidal inactiators", nebo také "echanis- based inactiators" cílený nárh n léči l - neškodn kodné buněč ěčné prostřed edí, inaktiují pouze "sůj" specifický enzy podobný transitníu stau u nor. substrátu tu Specifické značen ení enzyů reaktiní skupina na analogu substrátu tu nebo inhibitoru Tag značka (fluorescein, biotin, ) 7
Actiity-based enzye profilling sronáac ací studie apoání enzyoého profilu Cílená odifikace postranních skupin E-H 2 (Lys) R-CS E-SH (Cys) 2 trinitrobenzensulfonoá H 3 S 2 kyselina (subst.) isothiocyanát aldehyd R-CH (adice - thioočoina) oina) 2 (+ redukce borohydride) R Cl-Hg CH p-chlorerkuri benzooá k. aleiidy, např.. EM 2 S S 2 (adice) E-- (His) H HC C C C 2 H 5 C 2 H 5 CH 5,5'-dithio dithio-bis( bis(2-nitrobenzooá k.) DTB, Ellanoo činidlo (substituce) diethylpyrokarbonát t (alkoxylace) 8
Cílená odifikace postranních skupin E-H (Ser) CH(CH 3 ) 2 F P C S F H2 CH(CH 3 ) 2 diisopropylfluorfosfát fenylethylsulfonylfluorid DFP (fosforylace) PMSF (sulfonylace) E-- (Tyr) H C( 2 ) 4 tetranitroethan (nitrace) C-CH 3 -acetyliidazol AI (acetylace) E-- H (Arg) H 2 + H 2 CH 3 CH 3 2,3-butandion (kondenzace) H fenylglyoxal (kondenzace) 9