Seminář izolačních technologií



Podobné dokumenty
Izolace nukleových kyselin

Seminář izolačních technologií

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

Molekulárně biologické metody v mikrobiologii. Mgr. Martina Sittová Jaro 2014

RNA Blue REAGENS PRO RYCHLOU PŘÍPRAVU ČISTÉ A NEDEGRADOVANÉ RNA (katalogové číslo R011, R012, R013)

Hybridizace nukleových kyselin

IZOLACE DNA (KIT DNeasy Plant Mini)

Typy nukleových kyselin. deoxyribonukleová (DNA); ribonukleová (RNA).

MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200

Izolace genomové DNA ze savčích buněk, stanovení koncentrace DNA pomocí absorpční spektrofotometrie

THE CHOICE OF THE MOST SUITABLE TECHNIQUE FOR ISOLATION OF NUCLEIC ACIDS AT DEPARTMENT OF ANIMAL MORPHOLOGY, PHYSIOLOGY AND GENETICS

DUM č. 3 v sadě. 37. Bi-2 Cytologie, molekulární biologie a genetika

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

První testový úkol aminokyseliny a jejich vlastnosti

Metody práce s proteinovými komplexy

DYNEX nabízí komplexní řešení v oblasti zpracování a analýzy biologických materiálů pomocí molekulárně biologických metod.

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

Izolace nukleových kyselin

Imunochemické metody. na principu vazby antigenu a protilátky

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

Column DNA Lego Kit UNIVERZÁLNÍ SOUPRAVY PRO RYCHLOU IZOLACI ČISTÉ DNA (Katalogové číslo D201 + D202)

IZOLACE, SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I. Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Předmět: KBB/BB1P; KBB/BUBIO

MagPurix Viral Nucleic Acid Extraction Kit

a) Primární struktura NK NUKLEOTIDY Monomerem NK jsou nukleotidy

In vitro testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství. Mgr. Jana Horáková

Metody testování humorální imunity

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Interakce proteinu p53 s genomovou DNA v kontextu chromatinu glioblastoma buněk

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

MagPurix Viral/Pathogen Nucleic Acids Extraction Kit B

Metody molekulární biologie

Stanovení koncentrace (kvantifikace) proteinů

Základní vlastnosti proteinů

IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT NUCLEOSPIN FOOD)

Molekulární základy dědičnosti. Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA

Nukleové kyseliny Replikace Transkripce translace

Molekulární diagnostika

Izolace nukleových kyselin

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Nukleové kyseliny Replikace Transkripce, RNA processing Translace

ENZYMY A NUKLEOVÉ KYSELINY

Exprese genetické informace

Ivo Papoušek. Biologie 6, 2017/18

Monitorování hladiny metalothioneinu a thiolových sloučenin u biologických organismů vystavených působení kovových prvků a sloučenin

Genetika zvířat - MENDELU

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

IZOLACE DNA POMOCÍ CTAB PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR

Molekulárn. rní. biologie Struktura DNA a RNA

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Molekulárně biologické a cytogenetické metody

(molekulární) biologie buňky

OBSAH. PP Master Mixy PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

IZOLACE DNA PRO STANOVENÍ GMO METODOU PCR (KIT GENELUTE)

Determinanty lokalizace nukleosomů

Ivo Papoušek. Biologie 8, 2015/16

Schéma průběhu transkripce

BUNĚČNÁ TRANSFORMACE A NÁDOROVÉ BUŇKY

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

POLYPEPTIDY. Provitaminy = organické sloučeniny bez vitaminózního účinku, které se v živočišném těle mění působením ÚV záření nebo enzymů na vitaminy.

PŘÍBALOVÁ INFORMACE. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 IDNA250. In vitro diagnostický zdravotnický prostředek

DUM č. 11 v sadě. 37. Bi-2 Cytologie, molekulární biologie a genetika

ve srovnání s eukaryoty (životnost v řádu hodin) u prokaryot kratší (životnost v řádu minut) na životnost / stabilitu molekuly mají vliv

Tkáňový homogenizátor MagNA Lyser od společnosti Roche

Pražské analytické centrum inovací Projekt CZ / /0002 spolufinancovaný ESF a Státním rozpočtem ČR

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti. Vztah struktury a funkce nukleových kyselin. Replikace, transkripce

Biologie buňky. systém schopný udržovat se a rozmnožovat

Příprava vzorků pro proteomickou analýzu

NUKLEOVÉ KYSELINY. Základ života

Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Absorpční spektroskopie při biologické analýze molekul

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE NUKLEOVÝCH KYSELIN

2. Srovnání postupů izolace DNA kolonky vs. paramagnetické částice

Zkušební okruhy k přijímací zkoušce do magisterského studijního oboru:

Struktura a funkce nukleových kyselin

"Učení nás bude více bavit aneb moderní výuka oboru lesnictví prostřednictvím ICT ". Základy genetiky, základní pojmy

Radiační odstraňování vybraných kontaminantů z podzemních a odpadních vod

NUKLEOVÉ KYSELINY. Složení nukleových kyselin. Typy nukleových kyselin:

Tematické okruhy k SZZ v bakalářském studijním oboru Zdravotní laborant bakalářského studijního programu B5345 Specializace ve zdravotnictví

Analýza magnetických mikročástic mikroskopií atomárních sil

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

Struktura nukleových kyselin Vlastnosti genetického materiálu

Tématické okruhy pro státní závěrečné zkoušky

Hybridizace. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

Nukleosidy, nukleotidy, nukleové kyseliny, genetická informace

1. Definice a historie oboru molekulární medicína. 3. Základní laboratorní techniky v molekulární medicíně

Metody testování humorální imunity

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti ELEKTROMIGRAČNÍ METODY

Praktický kurz Příprava buněčného lyzátu, izolace celkové RNA pomocí kolonek/tripure reagent, stanovení koncentrace RNA

studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v množství dané molekuly mrna v dané buňce a v daném

List protokolu QIAsymphony SP

laktoferin BSA α S2 -CN α S1 -CN Popis: BSA bovinní sérový albumin, CN kasein, LG- laktoglobulin, LA- laktalbumin

Pracovní listy pro žáky

Nukleové kyseliny Replikace Transkripce translace

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY

Centrální dogma molekulární biologie

Transkript:

Seminář izolačních technologií Zpracoval: Karel Bílek a Kateřina Svobodová Podpořeno FRVŠ 2385/2007 ÚMFGZ MZLU v Brně Projekt FRVŠ 2385/2007 1

Strukturní typy NK Lineární molekuly jednořetězcové DNA a RNA dvouřetězcové DNA a RNA Kružnicové molekuly jednořetězcové DNA a RNA dvouřetězcové DNA a RNA Projekt FRVŠ 2385/2007 2

Lokalizace jaderné DNA Projekt FRVŠ 2385/2007 3

Struktura DNA ze dvou polydeoxyribonukleových řetězců komplementární antiparalelní 5-3 a 3-5 vodíkové můstky stabilní při ph 4-9,5 Projekt FRVŠ 2385/2007 4

16 20 kb 37 genů rrna trna geny CO (c-oxidáza) ND1 ND6 (NADHdehydrogenáza) geny pro ATPázy aj. mtdna Projekt FRVŠ 2385/2007 5

Informace - NK informace primárně obsažená v nukleotidové sekvenci (primárně proto, že jinde taková informace není) genetická proto, že se dědí GI je ve formě nukleotidů obvykle informace o prim. struktuře polypeptidů a prim. struktuře DNA nebo RNA v DNA nebo RNA je info o prim. str. proteinu DNA obs. info o prim. struktuře biologicky funkční RNA (trna, rrna, sirna aj.) RNA sekv. může obs. info o prim str. DNA Projekt FRVŠ 2385/2007 6

DNA : RNA genetický kód mtdna, chdna, jaderná DNA kóduje proteiny obsahuje SNPs může mutovat mikrosatelity v každé buňce stejná stabilní informace jaká RNA? v jaké tkáni? záleží na stáří mrna protein mrna = protein Projekt FRVŠ 2385/2007 7

RNA savčí buňka obsahuje cca 10-5 ug v eukariotické buňce je v jeden čas transkribováno cca 12tis. genů (tj. cca 500tis. mrna). rrna (28S,18S, 5S) 80-85% trna, snrna 15-20% mrna 1-5% 0.5kb 20kb ve 15-20tis. kopií a cca 200polyA délka prům. proteinu je 200-400 aa Projekt FRVŠ 2385/2007 8

RNA RNA purine AG / pyrimidine CU rrna (5S, 18S, 28S) trna (struktura jetelového lístku, cca 80 aa) mrna 5 čepička 3 polya, mrnas zaujímá cca 1/100 celkové RNA half-life z několika min. (eukario. reg. proteins) až několik let (semena a spóry) heparin loops internal loops klubka snrna, sirna Projekt FRVŠ 2385/2007 9

Nestabilita NK přítomnost nukleáz v buňce zdroje interní při homogenizaci vzorku zdroje externí laboratoř a laboratorní pomůcky prachové částice (bakterie,plísně) lidská pokožka RNázy velmi stabilní (až 240 C/4 hod) nevyžadují kofaktory účinné v nízkých koncentracích obtížná inaktivace kontaminace RNázami Projekt FRVŠ 2385/2007 10

Stabilizace a uložení NK DNA dny při 4 C týdny měsíce při -20 C roky při -70 C stabilizace RNA ve vzorku při odběru v okamžiku odběru RNA se stává extrémně nestabilní redukce specifických i nespecifických druhů mrna enzymatická degradace NK (DNázy, RNázy) okamžité zmrazení v tekutém dusíku a uložit při -80 C stabilizační roztoky: RNAlater vzorky krve určené k izolaci DNA (RNA) odebrat do chelatačních roztoků (EDTA kyselina etylendiaminotetraoctová) skladovat obvykle 1-5 dní při 4-8 C (DNA) dlouhodobě lze odběry skladovat při -20 C vzorky určené k izolaci RNA zpracovat optimálně do 4 hodin Projekt FRVŠ 2385/2007 11

Homogenizace vzorku Mechanické zpracování mechanicky N 2 ultrazvukem rotační píst protláčení buněk malým otvorem mixováním Rozrušení buněčných stěn nebo virových nukleokapsidů působením enzymů (lysozym a celulázy) rozpuštění biomembrán a denaturace proteinů detergentem (např. Triton X-100 a laurylsíran sodný) + EDTA Enzymatické kroky pro odstranění kontaminant Proteináza K nebo pronáza E RNáza nebo DNáza Projekt FRVŠ 2385/2007 12

Odběr vzorků popis vzorků čerstvý vzorek (samovolný rozklad vzorku) mrna z jiných tkání (studium genové exprese) tkáně a orgány odběr více zvířat (AA + aa = Aa) forenzní odběr (odběr řadového policisty ) vystříhat se inhibitorů jednotlivé buňky (např. prokaryotických organizmů nebo kvasinek), laserové mikrodisekce virové částice purifikované centrifugačními technikami NK v elektroforetických gelech nebo produkty PCR Projekt FRVŠ 2385/2007 13

Typy metod pro izolaci nukleových kyselin Metody využívající rozdílné rozpustnosti fenolové extrakce a etanolové nebo izopropanolové precipitace (srážení) obecně rozšířené, široké aplikace vhodné pro vysokomolekulární genomové NK Metody adsorpční DNA se váže na křemičité sklo v přítomnosti chaotropní látky vhodné zejména pro rychlou purifikaci plazmidů a malýchfragmentů DNA Centrifugace v hustotním gradientu izopyknické centrifugace v gradientu CsCl vhodné při velkém množství a pro vysokou čistotu možnost frakcionace podle velikosti v sacharózových gradientech Projekt FRVŠ 2385/2007 14

Centrifugace Projekt FRVŠ 2385/2007 15

Adsorpční metody rychlá metoda vysoký výtěžek (malé fragmenty) vysoká čistota Oxid křemičitý (kolonky) chaotropní soli guanidin thiokyanát nebo guanidin hydrochlorid jodid sodný Síla vazby závisí na typu nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) iontové síle ph roztoku Promývání pro odstranění proteinů a dalších kontaminant Eluce DNA pufrem s nízkou koncentrací solí nebo H 2 O Projekt FRVŠ 2385/2007 16

Mechanismus interakce DNA s kolonkou Projekt FRVŠ 2385/2007 17

Izolace mrna Klasické totalrna, separace na mrna, rrna a trna pomocí např. elektroforezy, centrifugace aj. Afinitní využívající afinitu poly(a) konce u mrna a biotinem značené oligo(dt) sondy sonda se v lyzátu selektivně váže na mrna hybridní molekuly biotinylované dta mrna jsou imobilizovány na pevném podkladu pokrytém streptavidinem Projekt FRVŠ 2385/2007 18

Afinitní izolace mrna Streptavidin (bakterie Streptomyces avidinii) nebo Avidin Projekt FRVŠ 2385/2007 19

Fenolová extrakce promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu (popř. směs fenolu a chloroformu) NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze (chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím kroku) centrifugace oddělení spodní (organická fáze) tvořené fenolem a chloroformem mezifáze (denaturované proteiny a zbytky buněk) horní vodné fáze (rozpuštěné NK) vysrážení nukleových kyselin etanolem popř. izopropanolem shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku Projekt FRVŠ 2385/2007 20

Analýza a kvantifikace NK SPEKTROFOTOMETRICKÁ METODA vhodné pro měření vzorků, které jsou dostatečně čisté nukleové kyseliny absorbují UV záření s maximem absorbance v oblasti vlnové délky okolo 260 nm (ssdna má o 20-30% větší absorbanci než dsdna) z hodnot optické hustoty lze koncentraci a čistotu vzorku stanovit podle empirických vztahů stupeň čistoty NK se stanovuje z poměru abs. 260/280 nm při znečištění vzorku proteiny (280 nm), bude vypočtený poměr výrazně nižší a stanovení koncentrace NK nebude přesné 40xOD260 = koncentrace RNA (ug/ml) OD260 1 je 40ug/mL proteiny 260 nm polysacharidy 230 nm FLUORESCENČNÍ METODA vhodné u vzorků s nízkou koncentrací NK nebo znečištěných využívá se komplex etidiumbromidu/nk vzniká viditelné červenooranžové světlo o vlnové délce 590 nm Projekt FRVŠ 2385/2007 21

Projekt FRVŠ 2385/2007 22

Projekt FRVŠ 2385/2007 23

Izolační automaty -Automatizace Projekt FRVŠ 2385/2007 24

??? z čeho izolujeme z krve z mléka z chlupu cena rutina Projekt FRVŠ 2385/2007 25

Děkuji Vám za pozornost Renčín

Použitá literatura a zdroje Rapley R., Manning D. L. (1998): RNA Isolation and Characterization Protocols. Publisher: Humana Press, Page Count: 280, ISBN: 0896034941 Stratagene, Brilliant SYBR Green SideStep QRT-PCR Master Mix, 2-Step (Instruction Manual - Catalog #400906) www.stratagene.com Ralf M.Zimmermann and Edward C.Cox (1994): DNA stretching on functionalized gold surfaces. Nucleic Acids Research, Vol. 22, No. 3 492-497 RNA Blue (návod), http://www.top-bio.cz/htm/rna_blue-ti.asp QIAGEN, QIAamp DNA Mini Kit and QIAamp DNA Blood Mini Kit Handbook, 2003, www.qiagen.com Marvan F. et al. (1998): Morfologie hospodářských zvířat. Brázda, Praha, 303 s. ISBN 80-209-0273-2 Chomczynski P. (1993) A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques 15, 532-7. Essential Cell Biology: Bruce Alberts, Dennis Bray, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts + Peter Walter (1998): An Introduction to the Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., ISBN 0815320450 Projekt FRVŠ 2385/2007 27