}w!"#$%&'()+,-./012345<ya

MASARYKOVA UNIVERZITA FAKULTA INFORMATIKY }w!"#$%&'()+,-./012345<ya Vývoj algoritmu pro detekci kapes v proteinech DIPLOMOVÁ PRÁCE Bc. Andrej Kuročenko Brno, podzim 2014

Prohlášení Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Všechny zdroje, prameny a literaturu, které jsem při vypracování používal nebo z nich čerpal, v práci řádně cituji s uvedením úplného odkazu na příslušný zdroj. Bc. Andrej Kuročenko Vedoucí práce: RNDR. Barbora Kozlíková, Ph.D. ii

Poděkování Tímto děkují RNDr. Barboře Kozlíkové, Ph.D. za vedení této diplomové práce. Také za čas věnovaný konzultacím, trpělivost, vstřícnost a cenné rady. iii

Shrnutí Analýza struktur molekul proteinů je v poslední době jedním z hlavních témat v biochemickém výzkumu. Vznikly nástroje pro detailní snímání těchto struktur a ukládaní jejich reprezentací do obsáhlých databází. Na základě těchto dat bylo vyvinuto mnoho nástrojů pro vizualizaci molekul proteinů a jejich struktur. Také vznikly nástroje pro analýzu a následnou vizualizaci různých útvarů a speciálních vazebních míst molekul proteinů. V této diplomové práci je čtenář seznámen s proteiny a jejich strukturami. Dále jsou představeny útvary, jež taková struktura může obsahovat a jsou zajímavé z hlediska interakcí molekul proteinů s jinými malými molekulami ligandy. Diplomová práce se pak zaměřuje na kapsy na povrchu molekul proteinů, analyzuje existující přístupy k detekci kapes. Hlavně pak se zaměřuje na přístupy využívající Voroného diagram a Delaunayho triangulaci. Cílem diplomové práce je navrhnout vlastní řešení detekce kapes na povrchu molekul proteinů vycházející z Voroného diagramu. Následně tento algoritmus implementovat do programu CAVER Analyst. iv

Klíčová slova Protein, kapsa, molekula, aktivní místo, Java, CAVER, CAVER Analyst. v

Obsah 1 Úvod................................... 3 2 Proteiny a jejich struktura....................... 5 2.1 Co je to protein.......................... 5 2.1.1 Funkce proteinu..................... 5 2.2 Povrch proteinu.......................... 6 2.3 Struktura proteinu........................ 6 2.3.1 Aktivní místo....................... 8 2.4 Analýza volného prostoru v proteinech............ 8 2.4.1 Póry............................ 8 2.4.2 Tunely........................... 9 2.4.3 Asymetrické tunely.................... 9 2.4.4 Kanály........................... 10 2.4.5 Dutiny........................... 11 2.4.6 Kapsy........................... 11 3 Detekce kapes v molekulách proteinů............... 13 3.1 Úvod................................ 13 3.2 Technické pojmy.......................... 13 3.2.1 α koule.......................... 13 3.2.2 Delaunayho triangulace................. 13 3.2.3 Voroného diagram.................... 14 3.3 Obecné přístupy k detekci kapes................ 15 3.3.1 Detekce kapes za pomocí sondy ve tvaru koule... 15 3.3.2 Detekce kapes pomocí 3D mřížky........... 16 3.3.3 Detekce kapes porovnáváním.............. 16 3.3.4 Detekce pomocí α koulí, Voroného diagramu a Delaunayho triangulace...................... 17 4 Vlastní řešení detekce kapes v molekulách proteinů....... 19 4.1 CAVER Analyst.......................... 19 4.1.1 Voroného diagram v CAVER Analyst......... 20 4.1.2 Vnější uzly Voroného diagramu............ 20 4.2 Teoretické předpoklady..................... 21 4.2.1 Analýza cesty....................... 21 1

4.2.2 Detekce kapes....................... 21 4.3 Popis algoritmu.......................... 23 4.3.1 Analýza Voroného diagramu, sestavení cest..... 23 Krok 1: Filtrace sousedních uzlů............ 23 Krok 2: Evoluce postupu................ 24 Krok 3: Vlastnosti uzlů cest............... 24 4.3.2 Analýza cest, detekce kapes............... 25 4.3.3 Vizualizace kapes v molekule proteinu........ 27 4.4 Implementace algoritmu..................... 28 4.5 Zakomponování algoritmu do aplikace CAVER Analyst... 29 4.6 Srovnání s existujícím algoritmem............... 31 4.6.1 Srovnání výsledků detekce kapes............ 31 Příklad 1: molekula 1ACJ................ 31 Příklad 2: molekula 1QIF................ 32 Příklad 3: molekula 1ESA................ 33 Příklad 4: molekula 2P3B................ 34 4.6.2 Srovnání rychlosti.................... 36 5 Závěr................................... 37 5.1 Plány do budoucna........................ 37 2

Kapitola 1 Úvod Molekuly proteinů jsou všudypřítomné v buňce živých organismů a vykonávají různé funkce nezbytné pro život. Většina těchto funkcí probíhá v interakci s jinými molekulami tzv. ligandy. Tyto interakce jsou zprostředkovány specifickými aminokyselinami nacházejícími se na určitých pozicích (v tzv. aktivních místech, více v sekci 2.3.1) v molekulách proteinů. Lokace těchto pozic a zkoumání struktury proteinů je nezbytná k lepšímu pochopení funkcionality různých typů proteinů a také k pochopení, jak a s jakými ligandy tyto interakce probíhají. Zkoumání aktivních míst pomůže odpovědět na otázky, zda aktivní místa interagující s podobnými ligandy mají rovněž podobnou strukturu a zda pomocí této struktury lze předpovědět funkce celého proteinu. Snaha o pochopení fungování proteinů a jejích interakcí je důsledkem pokroku v určování proteinových struktur pomocí rentgenové krystalografie [26] a nukleární magnetické rezonance [16]. Desítky tisíc proteinových struktur a malých molekul ligandů bylo nasnímáno výše zmíněnými metodami a uloženo do proteinové data banky PDB [9]. Díky tomu existuje rozmanitá kolekce struktur, které lze zkoumat algoritmicky za využití různých geometrických přístupů. Tyto algoritmy poskytují možností analýzy prostorové konfigurace těchto struktur, která je zásadní z pohledu reaktivity dané struktury. V důsledku toho lze předpovědět různé vlastnosti a chování daných struktur v kombinaci s různými ligandy. Navíc při použití moderních grafických karet lze dosáhnout významného zdokonalení a zrychlení použitých geometrických algoritmů. Jednou ze základních zkoumaných částí molekul proteinů, která má významný vliv na reaktivitu daného proteinu, jsou aktivní místa. Jedná se o volný prostor se schopností navázat na sebe malou molekulu ligandu. Aktivní místa se mohou nacházet hluboko uvnitř proteinu, ale i na jeho povrchu 2.2. Právě problémem detekce aktivních míst nacházejících se na povrchu proteinů se zabývá tato diplomová práce. Cílem práce je detekovat tzv. kapsy 2.4.6, což jsou prohlubně konkávního tvaru dostupné z povrchu proteinu. Právě v některých kapsách je možné následně detekovat přítomnost aktivního místa. K této znalosti je však zapotřebí dalších biochemic- 3

1. ÚVOD kých znalostí tykajících se aminokyselin v okolí detekovaných kapes. Za uplynulá léta bylo představeno velké množství způsobů, jakými lze výše zmíněné kapsy detekovat. Mezi nejčastější metody detekce patří analýza povrchu molekuly za použití sond (popsána v sekci 3.3.1), dělení do 3D mřížky (sekce 3.3.2) nebo využití pseudo-struktur jako jsou Delaunayho triangulace a Voroného diagram (sekce 3.3.4). Po popisu již existujících řešení je součástí této diplomové práce návrh a implementace vlastního přístupu k detekci kapes v molekulách proteinů. Tento přístup je vychází z Voroného diagramu následně je zaintegrován do programu CAVER Analyst [2], který se zabývá analýzou a vizualizaci proteinových struktur. Poslední část diplomové práce se věnuje porovnání výsledků detekce kapes pomocí vlastního přístupu s jedním z existujících a nejčastěji používaným řešením. 4

Kapitola 2 Proteiny a jejich struktura 2.1 Co je to protein Proteiny jsou jedním ze základních stavebních prvků buněk všech živých organismů. Mají na starost téměř každý úkol, který daná buňka musí vykonat, určují její tvar a vnitřní uspořádání, vyrábí potřebné látky a zbavují se nepotřebných. Pomocí proteinů může buňka komunikovat s okolím přijímáním různých signálů a odesíláním odpovědí. Soubor proteinů v buňce určuje její zdravotní stav a funkci. 2.1.1 Funkce proteinu Proteiny jsou makromolekuly složeny z různých aminokyselinových řetězců, které vznikají pomocí syntézy z informace uložené v genech (DNA). Veškeré známé proteiny jsou tvořeny různými kombinacemi pouze dvaceti aminokyselin. Každá molekula proteinu může obsahovat jeden či více takovýchto řetězců, jejichž unikátní uspořádání a typ určuje funkci molekuly, jako například: Metabolická funkce některé typy proteinů jsou specifické tím, že dokáží vytvářet určitý typ látky pomocí biochemické reakce (katalýza). Tyto proteiny se nazývají enzymy a mají na svém povrchu nebo uvnitř sebe tzv. aktivní místa (viz 2.3.1) umožňující již zmíněnou reakci. Strukturální funkce typ proteinů, který se stará o tvar buněk, slouží jako spojovací materiál či tvoří základ kostí, mimo jiné rovněž nehtů, vlasů, srsti, atd. Komunikační funkce další skupina proteinů slouží jako komunikační média, mohou měnit tvar i aktivitu v závislosti na metabolických signálech či zprávách z okolních buněk. 5

2. PROTEINY A JEJICH STRUKTURA 2.2 Povrch proteinu Povrch proteinové molekuly je důležitý z hlediska zkoumání jejích vlastností. Obsahuje totiž různé útvary (viz 2.4), jež definují funkcionalitu proteinu. Povrch proteinu se nejčastěji popisuje následujícími třemi typy (viz Obrázek 2.1): 1. Van der Waalsův povrch každý atom je reprezentován koulí, jejíž poloměr odpovídá Wan der Waalsovu poloměru daného atomu. Tento typ povrchu slouží ke znázornění prostoru, který daná molekula proteinu zabírá [10]. Wan der Waalsův povrch je pak definován jako vnější povrch sjednocení všech koulí těchto atomů každý atom je reprezentován jako koule o velikosti Van der Waalsova poloměru. 2. Solvent accessible surface (SAS) tento typ povrchu, který definovali Lee a Richards [3] je rozšířením Van der Waalsova povrchu. Jeho cílem je zobrazit všechny oblasti molekuly, které jsou dostupné pro malou molekulu solventu (např. vody). Tvar a velikost molekuly solventu jsou aproximovány koulí, která se nazývá sonda. SAS tedy odpovídá Van der Waalsovu povrchu, který je zvětšen o poloměr sondy. Vznik SAS si lze představit jako valení koule (sondy) po Van der Waalsově povrchu, kdy výsledný SAS je tvořen pozicemi středu sondy. 3. Solvent excluded surface (SES) tento typ povrchu [10] je konstruován podobným způsobem jako SAS. Místo trasování středu sondy valící se po atomech se bere v úvahu vnější obálka sondy. Jiná definice popisuje SES jako topologickou hranici sjednocení všech možných pozic sondy, ve kterých sonda neprochází skrz žádný atom. SES povrch je složen ze tří možných typů vzorků, které může sonda vytvořit. Jedná se o konvexní sférické vzorky, které vznikají když se sonda dotýká právě jednoho atomu. Dalším typem jsou toroidní vzorky vzniklé při dotyku sondy s právě dvěma atomy. Třetí typ je tvořen konkávními sférickými vzorky, které vznikají, když sonda leží ve fixní pozici a dotýká se právě tří atomů. 2.3 Struktura proteinu Pro práci s proteinovými strukturami v počítačovém programu je nejdříve potřeba vytvořit virtuální reprezentaci prostorového uspořádání molekuly. Toho lze docílit rentgenovou krystalografií či nukleární magnetickou rezonancí. Metody umožňují nasnímat pozice atomů v daném čase a převést je 6

2. PROTEINY A JEJICH STRUKTURA r SAS SES Van der Waals Sonda Obrázek 2.1: Typy povrchů molekul do standardizovaného formátu. Jedním z nejběžnějších a nejčastěji používaných formátů je formát PDB [9]. Strukturu proteinu lze členit do čtyř základních kategorií podle úrovně abstrakce (viz Obrázek 2.2): Primární struktura znázorňuje celé aminokyselinové řetězce a jejich pořadí s polypeptidovými vazbami. Tato unikátní struktura proteinu určuje jeho funkci. Sekundární struktura jedná se o abstrahované zobrazení opakujících se částí aminokyselinového řetězce spojených vodíkovými vazbami. Terciární struktura oproti sekundární struktuře se jedná o prostorové zobrazení celé molekuly. Kvartérní struktura tento typ abstrakce lze použít u proteinů skládajících se z více domén (polypeptidových řetězců). Tyto domény jsou vzájemně prostorově uspořádány. Obrázek 2.2: Ukázka proteinových struktur. Zleva primární, sekundární, terciální a kvartérní struktura. (Převzato z http://www.bioinfo.org. cn/book/biochemistry/chapt07/sim1.htm) 7

2. PROTEINY A JEJICH STRUKTURA 2.3.1 Aktivní místo Proteinové molekuly enzymy obsahují specifická místa na svém povrchu nebo ve vnitřních dutinách, která dokáží na sebe vázat jiné volné molekuly (ligandy, substráty, molekuly solventu, molekuly vody, atd.). Tyto volné molekuly se pohybují v okolí proteinů a za určitých podmínek může proběhnout katalytická reakce mezi nimi a daným proteinem. Tím lze volnou molekulu transformovat na jinou. Výše zmíněná specifická místa se nazývají vazebná neboli aktivní místa. U již dobře strukturně popsaných proteinů je pozice aktivního místa známa, avšak u nově vzniklých syntetických proteinů je potřeba jej vyhledat. Neexistuje univerzální technika či algoritmus se 100% úspěšností vyhledávání. Většina existujících algoritmů a nástrojů se soustředí na nalezení pozice aktivního místa u specifické skupiny proteinů a u ostatních skupin nemá často tak vysokou úspěšnost. Hledání aktivního místa má velký význam při výrobě nových léků nebo jiných chemických látek (například látek pro rozklad toxinů). Při kontaktu aktivního místa proteinu s ligandem dojde bud k modifikaci proteinu nebo ligandu samotného. Tohoto jevu lze využít k modifikaci vlastností proteinů nebo při výrobě nové látky z nějaké jiné. 2.4 Analýza volného prostoru v proteinech Každá proteinová molekula má poměrně komplikovanou jak povrchovou, tak i vnitřní strukturu. Obsahuje různé výběžky, rýhy, vnitřní dutiny a prohlubně. Tyto útvary jsou zajímavé z hlediska samotného fungování proteinu a jejich studium je důležité za účelem hledání a vytváření nových katalyzátorů a léků. Pro odlišení již zmíněných útvarů se používají pojmy jako póry, kapsy, tunely, kanály, vnitřní dutiny. Aby nedocházelo k chybné interpretaci textu, budou v následujícím textu popsány tyto útvary s jejich vizualizací a existující programy pro jejich vyhledávání. 2.4.1 Póry Póry jsou speciálním typem kanálů. Zprostředkovávají přesun iontů či jiných molekul přes biologické membrány. Nejčastějším nástrojem pro jejich vyhledávání je PoreWalker4 [22]. Ukázku póru lze vidět na obrázku 2.3. 8

2. PROTEINY A JEJICH STRUKTURA Obrázek 2.3: Příklad póru v proteinu, vytvořeno v programu CAVER Analyst [2]. 2.4.2 Tunely Tunely jsou v podstatě cesty spojující vnitřní dutinu proteinové molekuly (aktivní místo) s okolním soventem, v němž se molekula nachází. Pro jejich vyhledávání se používají programy CAVER 3.0 [15], MOLE 2.01 [23] a MolAxis2 [36]. Ukázku tunelu lze vidět na obrázku 2.4. 2.4.3 Asymetrické tunely Asymetrický tunel se od klasického tunelu liší tvarem svého povrchu. Asymetrický tunel lépe kopíruje jeho skutečný tvar a lépe tak vystihuje i biochemickou podstatu tunelu. Biochemické vlastnosti (hydrofobicitu či parciální náboj) okolí tunelu lze rovněž promítnout na povrch tunelu pomocí barevné škály. Uživatel má tak možnost okamžitě zhodnotit kompatibilitu fyziko-chemikálních vlastností tunelu s vlastnostmi ligandu, pro který byl tunel spočten. Ukázku asymetrického tunelu lze vidět na obrázku 2.4. 9

2. P ROTEINY A JEJICH STRUKTURA Obrázek 2.4: Pr íklad tunelu v proteinu. Vlevo asymetrický, vpravo symetrický tunel. Vytvor eno v programu CAVER Analyst [2]. 2.4.4 Kanály Kanály jsou cesty procházející skrz proteinovou molekulu, pr ic emž oba konce spojují okolní solvent, v ne mž se molekula nachází. Ukázku kanálu lze vide t na obrázku 2.5. Obrázek 2.5: Pr íklad kanálu v proteinu, vytvor eno v programu CAVER Analyst [2]. 10

2. PROTEINY A JEJICH STRUKTURA 2.4.5 Dutiny Jako dutina je označováno prázdné místo uvnitř molekuly, které není přímo dostupné z povrchové části proteinu. Dutiny představují z biochemického hlediska velmi významné útvary, protože se v nich může nacházet aktivní místo proteinu. Právě přítomnost a dostupnost aktivního místa má zásadní vliv na reaktivitu daného proteinu. Ukázku dutin v molekule proteinu lze vidět na obrázku 2.6. Obrázek 2.6: Příklad dutiny v proteinu. Aktivním místo se nachází v největší dutině. Vytvořeno v programu CAVER Analyst [2] 2.4.6 Kapsy Jako kapsu označujeme prohlubeň na povrchu proteinové molekuly, která může rovněž obsahovat aktivní místo. Účelem této diplomové práce je návrh vlastního přístupu k detekci kapes na povrchu proteinu a následná 11

2. P ROTEINY A JEJICH STRUKTURA implementace a integrace do aplikace CAVER Analyst [2]. Ukázku kapes v molekule proteinu lze vide t na obrázku 2.7. Obrázek 2.7: Pr íklad kapes na povrchu proteinu. Detekováno programem Fpocket [28], vizualizováno v programu PyMOL [25] 12

Kapitola 3 Detekce kapes v molekulách proteinů 3.1 Úvod Povrch proteinových molekul často obsahuje aktivní místa, která na sebe vážou ligandy ze svého okolí a interagují s nimi. Taková aktivní místa jsou nejčastěji umístěna v takzvaných kapsách (viz 2.4.6), jež mají konkávní tvar. Jelikož povrch proteinu je hrbolatý, je potřeba rozlišovat, kdy se jedná o kapsu a kdy pouze o menší prohlubeň. Pokud je kapsa rozsáhlejší, je třeba určit, zda jde o jednu velkou kapsu nebo o více propojených kapes. 3.2 Technické pojmy V této podkapitole jsou definovány technické pojmy a pomocné struktury použity k popisu existujících i nového vlastního přístupu k detekci kapes v proteinových molekulách. 3.2.1 α koule Pojem α koule je při zkoumání vlastností molekuly použit pro popsání prostoru mezi čtyřmi atomy, přičemž všechny čtyři atomy se dotýkají okraje α koule jsou ve stejné vzdálenosti od jejího středu (viz Obrázek 3.1). Poloměr α koule je dán pozicí čtveřice atomů. Pokud například atomy budou uspořádány za sebou, poloměr bude nekonečně velký. Obecně platí, že α koule ve vnitřní struktuře molekuly mají menší poloměr než na povrchu. Pojem α koule vychází z definice α shape [8]. 3.2.2 Delaunayho triangulace Delaunayho triangulace [1] je speciální případ triangulace na množině bodů P, kdy sousední body tvoří vrcholy trojúhelníků takových, že žádný bod p P neleží uvnitř kružnice opsané danému trojúhelníku. Výsledný diagram je úzce spojen s Voroného diagramem [30], protože středy opsaných 13

3. DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ r atomy -koule Obrázek 3.1: α koule s poloměrem r ležící mezi čtyřmi atomy kružnic tvoří vrcholy polygonů Voroného diagramu. Graf vzniklý Delaunayho triangulací je duálním grafem k Voroného diagramu (viz Obrázek 3.2). 3.2.3 Voroného diagram Voroného diagram vznikne rozdělením uzlů p P grafu G do oblastí ve tvaru konvexních polygonů, kdy v každé oblasti je pouze jeden uzel p a všechny body v dané oblasti jsou blíže k danému uzlu než k ostatním bodům z P (viz Obrázek 3.2). Obrázek 3.2: Delaunayho triangulace na bodech množiny P (černě) se zobrazenými opsanými kružnicemi (šedě) a duální Voroného diagram (červeně) 14

3.3 Obecné přístupy k detekci kapes 3. DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Existuje velké množství různých algoritmů, které se snaží co nejlépe a nejpřesněji najít kapsy s aktivním místem na povrchu proteinové molekuly. Některé algoritmy využívají poznatku, že kapsa má konkávní tvar a snaží se ji detekovat analýzou geometrické struktury molekuly. Jiné algoritmy se pokoušejí najít podobnost okolí již detekovaných kapes s místy na povrchu jiných molekul, které mají podobnou strukturu. Další algoritmy používají tzv. pseudo-struktury. Následuje podrobný popis existujících přístupů k detekci kapes a programů, které je využívají. 3.3.1 Detekce kapes za pomocí sondy ve tvaru koule Jeden z nejjednodušších přístupů k detekci kapes v proteinové molekule je za použití sond ve tvaru koule. Postup je podobný tomu pro získání povrchu molekul (viz 2.2). Vychází z 3D struktury molekuly. Podle typu proteinu se zvolí velikosti pro velkou a malou sondu [17]. Tyto sondy se postupně valí po molekule a zaznamenávají povrch. Jako kapsy jsou následně označeny ty prohlubně, do kterých se vešla malá sonda, ale velká už nikoliv (viz Obrázek 3.3). Tento algoritmus je použit v programech POCASA [33] a PASS [11]. Obrázek 3.3: Detekce kapes v molekule proteinu pomocí malé (vlevo) a velké (vpravo) sondy. Atomy, které tvoří povrch molekuly, jsou zvýrazněny šedou barvou. 15

3.3.2 Detekce kapes pomocí 3D mřížky 3. DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Molekulární struktura se rozdělí do husté 3D mřížky, která je sestrojena z kostek a každá kostka má vlastní souřadnici [x, y, z] (viz Obrázek 3.4). U těchto bodů se následně zjistí, zda reprezentují volné prostranství, či nikoliv (v jejich vnitřním prostoru se nacházejí atomy). Poté se hledají shluky bodů s volným prostranstvím kapsy jež jsou dostupné okolnímu solventu. Nevýhodou této metody je neúspěšnost hledání kapes, které jsou orientovány ve 45 vůči ortogonálním osám. Tento nedostatek se řeší přidáním čtvrté, kubické [13], osy. Mezi programy využívající tuto metody patří např. POCKET [6], LIGSITE [20], PocketPicker [31] nebo PocketDepth [35]. Obrázek 3.4: Detekovaná kapsa v molekule proteinu pomocí mřížky ve zjednodušeném 2D modelu. Červeně je znázorněna neprázdná část mřížky s atomy, modře pak volné prostranství vyznačující kapsu. 3.3.3 Detekce kapes porovnáváním V této metodě se vychází z předpokladu, že molekulární funkce proteinu závisí na struktuře molekuly. Algoritmy používající tento způsob detekce porovnávají okolní strukturu kapes s aktivními místy dobře známých molekul se strukturou novějších či méně prozkoumaných molekul a podle shody u nich predikují aktivní místa, či doporučují ligandy, které by mohly s daným místem reagovat. Porovnávací algoritmus se dělí na dvě části. První částí je hodnotící funkce, která podle předem definovaných kritérií převádí strukturu molekuly na interní reprezentaci. Druhou část tvoří databáze známých aktivních míst, která obsahuje již ohodnocené kapsy s aktivními místy. Detekce kapes 16

3. DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ pak probíhá ohodnocením nových struktur hodnotící funkcí a porovnáním oproti databázi již známých aktivních míst. Algoritmy se liší podle toho, s jakou strukturou pracují. Například Con- Cavity [4], Apoc [19] a PocketAlign [34] používají okolní aminokyseliny kapes a jejich chemické vlastnosti. PARIS [14] používá soubor všech okolních atomů, DoGSiteScorer [29] pouze určitých typů atomů. 3.3.4 Detekce pomocí α koulí, Voroného diagramu a Delaunayho triangulace Algoritmus vyvinutý v rámci této diplomové práce je založen na znalosti Voroného diagramu (viz 3.2.3), proto jednotlivé, již existující přístupy používající stejné nástroje, budou popsány podrobněji než ostatní. Fpocket k detekci kapes na povrchu proteinových molekul využívá algoritmus [28] pomocných struktur Voroného diagram a α koule. Proces detekce kapes je rozdělen do tří kroků: Vypočítají se α koule pro celou strukturu proteinové molekuly za použití Voroného diagramu. Z těchto koulí se vyfiltrují příliš malé či naopak příliš velké podle parametru minimálních a maximálních povolených rozměrů koulí. Odstraní se tak prostor nedostupný okolnímu solventu nebo naopak vnější prostor molekuly. Ke každé ze získaných koulí se poznamená, jakých typů atomů se dotýkají. Prochází se výsledky prvního kroku a rozdělují se do shluků, nejdříve podle jejich pozice. Všechny shluky obsahující jednu α kouli se odstraní, pro ostatní se spočítá jejich molekulární hmotnost. Tyto shluky se dále spojují, pokud jejich těžiště jsou blízko sebe nebo pokud shluky sdílí určitý počet α koulí. Potenciální kapsy se ohodnotí v závislosti na výskytu určitých atomů v jejich okolí (ty, jež se dotýkají α koulí) za účelem zjištění typů ligandů, které by se mohly vázat na potenciální aktivní místo. CAST algoritmus [18], stejně jako předchozí, používá Voroného diagram a Delaunayho triangulaci pro detekci kapes a dutin v proteinové molekule. Výstup algoritmu navíc obsahuje informaci o velikosti kapsy, její hloubce, obvodu a ploše dostupné solventu. Tento algoritmus byl následovně rozšířen o webovou databázi a klienta CASTp [7]. Pomocí něj si může kdokoliv zadáním kódu molekuly v PDB [9] formátu nechat vypočítat kapsy a dutiny. Výsledky jsou zaslány zájemci na emailovou adresu. Více podrobné výsledky jsou pak k vidění na webových stránkách. 17

3. DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ SplitPocket program [27] detekuje potencionální kapsy na povrchu proteinové molekuly pomocí Delaunayho triangulace a algoritmu pro diskrétní tok [12]. Predikce kapes je pro každou strukturu prováděna dvakrát. Poprvé se analyzuje struktura včetně ligandů, následně struktura bez nich. V dalším kroku se porovnává struktura detekovaných kapes s ligandem a bez něho. Změna struktury téže kapsy indikuje interaktivitu částí molekuly v kapse a ligandu. Program je rovněž vystaven na webovém serveru, kde lze vizualizovat kapsy na zvolených molekulách proteinů pomocí PDB [9] formátu. 18

Kapitola 4 Vlastní řešení detekce kapes v molekulách proteinů Cílem této diplomové práce je navrhnout vlastní řešení k detekci kapes v molekulách proteinů a implementovat navržený algoritmus do programu CAVER Analyst [2]. V této kapitole je čtenář obeznámen s programem CA- VER Analyst (viz 4.1) a s teorií (viz 4.2), z níž vychází návrh vlastního algoritmu (sekce 4.3) a jeho implementace (viz 4.4). Nakonec jsou výsledky porovnány s jedním z existujících programů pro detekci kapes v molekulách proteinů (sekce 4.6). 4.1 CAVER Analyst Program CAVER Analyst [2] vznikl jako grafické rozhraní pro program CA- VER [15], což je softwarový nástroj pro výpočet transportních cest, tunelů a kanálů ve statických i dynamických makromolekulárních strukturách. CA- VER je konzolový program, který vrací výstupy v textové podobě. Tento přístup je vhodný pro spouštění v dávkovém režimu na velmi výkonných počítačích. Analýza výstupu programu CAVER není však uživatelsky přívětivá, vizuální analýza zcela chybí. Za tímto účelem vznikl nástroj CA- VER Analyst (dříve CAVER Viewer), který v jádru využívá již zmíněný nástroj CAVER. CAVER Analyst přináší pohodlné grafické rozhraní (viz Obrázek 4.1) pro vizualizaci molekul proteinů, jejich povrchu a struktur. Dále slouží k intuitivnímu nastavení výpočtů tunelů, kanálů, atd., a vizualizaci těchto výpočtů. To vše lze provést jak pro statické, tak i pro dynamické struktury molekul proteinů. CAVER Analyst je multiplatformní program napsaný v jazyce Java za použití Netbeans platformy [5]. V současné době využívá programu CA- VER ve verzi 3.0.1. Vlastní řešení algoritmu pro detekci kapes v molekulách proteinů je založeno na Voroného diagramu. Nejdříve je tedy nutné popsat, jakým způsobem je Voroného diagram reprezentován v programu CAVER Analyst. 19

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ 4.1.1 Voroného diagram v CAVER Analyst CAVER Analyst má zabudovanou podporu pro výpočet Voroného diagramu pro libovolnou molekulu proteinu díky tomu, že v jádru využívá program CAVER, který tuto funkcionalitu podporuje. Voroného diagram je reprezentován uzly a hranami. Uzly Voroného diagramu leží ve středu kružnic Delaunayho triangulace (viz Obrázek 3.2). Hrany reprezentují spojení mezi sousedními uzly. Každý uzel je identifikován unikátním číslem a nese s sebou dodatečné informace souřadnice udávající jeho pozici v 3D struktuře molekuly, poloměr α koule vyplňující prostor mezi okolními atomy, identifikační čísla sousedních Voroného uzlů (každý uzel má maximálně čtyři sousedy) a další, pro tuto práci nepodstatné informace. 4.1.2 Vnější uzly Voroného diagramu Některé z Voroného uzlů slouží pouze k uchycení hrany, která rozděluje dva atomy na okraji struktury molekuly (viz Obrázek 3.2). Takové uzly se nacházejí v nekonečnu (v programu reprezentováno velkou vzdáleností cca. 100 10000 Å od povrchu molekuly proteinu) a mají nastaven speciální příznak. Dále v textu jsou tyto uzly označeny jako vnější Voroného uzly. Obrázek 4.1: Ukázka programu CAVER Analyst, konkrétně vizualizace molekuly 1DMP, jejího povrchu a vypočítaných tunelů. 20

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ 4.2 Teoretické předpoklady V této sekci jsou popsány teoretické předpoklady, na základě kterých je navržen a implementován vlastní algoritmus sloužící k detekci kapes na povrchu molekul proteinů. 4.2.1 Analýza cesty Navržený algoritmus vychází ze znalostí, že kapsy mají konkávní tvar, nacházejí se na povrchu molekuly, a že sít Voroného vrcholů a hran je dostatečně hustá, aby pokryla celý povrch molekuly. Budeme-li postupovat po Voroného hranách z vnějšího Voroného uzlu směrem dovnitř molekuly, pak se šířka Voroného hrany (poloměr α koule v místě jejího počátku) bude postupně snižovat, jak se bude přibližovat povrchu molekuly. Znatelné zúžení nastane při vstupu hrany dovnitř molekuly proteinu, jelikož mezi atomy je mnohem méně místa než na povrchu. Další rozvoj šířek Voroného hrany závisí na vnitřní struktuře proteinové molekuly. Bude-li hrana procházet např. středem tunelu, bude šířka větší oproti případu, kdy by hrana procházela mezi blízkými atomy (viz Obrázek 4.2). Obrázek 4.2: Zjednodušená ukázka cesty sestavené z Voroného hran (modře) uvnitř tunelu (červeně) s odbočkami (zeleně) mezi okolní atomy (černě). Na obrázku lze vidět, že šířka cesty v tunelu je větší, než šířka cest mimo tunel. 4.2.2 Detekce kapes Budeme-li vycházet z povrchu molekuly proteinu vytvořeného velkou koulí (viz Obrázek 3.3), pak se šířka cesty sestavené z Voroného hran v případě kapsy nesníží významně ihned po vstupu hrany pod povrch molekuly pro- 21

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ teinu, ale až v následujících krocích. Průměr koule pro vytvoření povrchu u enzymů je odhadován na cca 3 Å (je to dáno běžnými rozměry enzymů, velikostí jejich vnitřních útvarů a vzdáleností mezi jejich atomy). Tento jev je zobrazen na obrázku 4.3. Šířka cest je následně analyzována pomocí grafů na obrázku 4.4. Jedná se však o velmi zjednodušený model. Přesné modely budou reprezentovány na skutečných datech dále v textu. 0 0 4 Obrázek 4.3: Ukázka dvou Voroného vnějších uzlů (s číslem 0), a analya šířky Voroného hran (zobrazeno červenými kruhy) směřujících dovnitř molekuly. Skutečný povrch molekuly je zobrazen světlé modrou čárou, povrch vytvořený koulí o velkém průměru (viz Obrázek 3.3) je zobrazen černou barvou. Atomy jsou reprezentovány šedými kruhy. Pravá cesta prochází kapsou a její šířka se nemění tak rychle jako šířka levé cesty. Obrázek 4.4: Grafy s logaritmickou osou y zobrazující šířky Voroného hran z obrázku 4.3. Na pravém grafu lze detekovat kapsu tím, že po proniknutí pod povrch molekuly se šířka hrany téměř nemění narozdíl od levého grafu. 22

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ 4.3 Popis algoritmu Vlastní algoritmus je kvůli lepšímu popisu a jednodušší implementaci rozdělen na tři části: 1. analýza Voroného diagramu a sestavení cest (4.3.1), 2. analýza cest a detekce kapes (4.3.2), 3. vizualizace detekovaných kapes (4.3.3). Tyto části jsou dále samostatně popsány. 4.3.1 Analýza Voroného diagramu, sestavení cest První část algoritmu má za úkol z Voroného diagramu na vstupu vytvořit seznam cest vedoucích z vnějšku molekuly proteinu dovnitř skrz povrch. Níže je popsán způsob, jakým se filtrují Voroného uzly a sestavují do cest, datové struktury reprezentující uzly na sestavených cestách a řešení nedostatků původního návrhu. Krok 1: Filtrace sousedních uzlů Vstupem této části algoritmu je Voroného diagram vypočítaný nad danou strukturou molekuly proteinu, výstupem jsou cesty reprezentovány uzly a pomyslnými hranami mezi nimi. Analýza Voroného diagramu začíná na jeho vnějších uzlech 4.1.2. Pro každý vnější uzel se v paměti vytváří vlastní cesta přidáváním sousedů. Soused může být přidán do cesty pouze za splnění následujících podmínek: 1. Sousední uzel není doposud použit v žádné jiné cestě. 2. Sousední uzel leží blíže ke středu dané struktury molekuly proteinu než aktuálně analyzovaný uzel. 3. Vektor hrany mezi aktuálním uzlem a jeho sousedem má odchylku maximálně 90 s vektorem hrany mezi vnějším uzlem dané cesty a jeho bezprostředním sousedem (první a druhý uzel na cestě). První podmínka zajistí jedinečnost každé cesty, druhá a třetí podmínka udržuje potřebný směr, filtruje irelevantní hrany a vybírá pouze ty, jež prochází povrchem molekuly. 23

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Krok 2: Evoluce postupu Původní verze algoritmu se spokojila s prvním sousedním uzlem splňujícím výše uvedené podmínky, avšak tento způsob mohl zvýhodnit kratší (slepé) cesty a přeskočit lepší (delší) cesty, které navíc procházejí kapsou. Proto byl algoritmus upraven, aby kontroloval již zmíněné podmínky pro každého ze čtyř sousedů aktuálně analyzovaného uzlu. Pokud podmínky jsou splněny více než jedním sousedem, z aktuální analyzované cesty se vytvoří kopie a její analýza probíhá zvlášt. Analýza cesty končí, pokud podmínkám nevyhoví žádný ze sousedů aktuálního uzlu. Krok 3: Vlastnosti uzlů cest Pro každý uzel z analyzovaných cest se poznamená šířka cesty v daném bodě (poloměr α koule) a pořadí uzlu. Pokud se uzel nachází v bezprostřední blízkosti povrchu molekuly vytvořeného velkou koulí, tato skutečnost se poznačí nastavením příznaku. Příznak se nastaví, pokud šířka cesty klesne pod hodnotu 3 Å (viz 4.2.2). Vizualizovaný výstup algoritmu lze vidět na obrázku 4.5. Obrázek 4.5: Ukázka výstupu prvního kroku algoritmu pro detekci kapes v molekulách proteinů. Na obrázku jsou vidět cesty vedoucí po Voroného hranách z vnějšího prostoru skrz povrch dovnitř molekuly. Červenými kuličkami jsou znázorněny uzly s příznakem, že se nachází blízko povrchu molekuly (viz 4.3.1). 24

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Sestavení cest lze vidět na pseudokódu první části algoritmu 4.1, který vrací stromovou strukturu (les) cest. Pro následující krok algoritmu je potřeba tento les převést do lineární podoby do množiny samostatných cest. Algoritmus 4.1 Analýza Voroného diagramu, sestavení cest visited {} outerp athn odes convert (voronoi.outern odes) tov isit {outerp athnodes} while tov isit do actual tov isit.pop () visited actual for all n c actual.neighbours do Filtrace nevhodných sousedů if closert ocenter (n, actual) = n & deviation (actual, n) < 90 then pathnode convert (n) Provázání předchůdců actual.children {pathn ode} pathn ode.parent actual Nastavení příznaků if actual.radius > 3 Å & n.radius < 3 Å then pathn ode.nearsurf ace true end if tov isit {pathnode} end if end for end while return outerp athn odes 4.3.2 Analýza cest, detekce kapes Druhá část algoritmu má za úkol detekovat cesty, které vedou kapsou na povrchu molekuly proteinu. Vstupem algoritmu jsou všechny cesty z prvního kroku 4.3.1. V aktuálně zpracovávané cestě se nejprve dohledá uzel A s příznakem, který označuje, že uzel je v těsné blízkosti povrchu molekuly. Poté se postupně analyzují uzly na cestě, které leží za uzlem A. Pokud jejich šířka je v intervalu 50%; +25% vzhledem k šířce uzlu A, nastaví se jim příznak, že se nacházejí v kapse. Jakmile šířka aktuálního uzlu vyjde z hranic intervalu, analýza cesty končí. Nakonec se cesty s detekovanými kapsami filtrují podle délky 25

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ kapsy (počet uzlů s příznakem, že leží v kapse). Je-li délka kapsy menší než minimální povolená délka, pak se cesty zahazují. Minimální povolenou délku lze nastavit parametrem algoritmu a výchozí hodnota je 5. Pro lepší pochopení druhého kroku je přiložen pseudokód 4.2. Také jsou k dispozici ukázky analyzovaných dat na obrázku 4.6. Obrázek 4.6: Ukázka dat analyzovaných v druhém kroku algoritmu. Na grafech jsou vyobrazeny šířky cest (v Å). Horní graf reprezentuje cestu procházející kapsou (šířka cesty po průniku povrchem téměř neklesá). Spodní graf reprezentuje cestu, která kapsou neprochází (šířka hrany se významně mění po průniku povrchem molekuly). 26

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Algoritmus 4.2 Detekce kapsy na cestě z Voroného uzlů result {} for all path paths do surfacenode getnearsurfacenode (path) Ignorují se cesty neprocházející povrchem if surfacenode then minr surfacenode.radius 0.5 maxr surfacenode.radius 1.25 node surf acen ode.next c 0 Detekce uzlů v kapse while node & node.radius minr; maxr do c c + 1 node node.next end while Příliš mělké kapsy se ignorují if c MIN_P OCKET _LENGT H then node surf acen ode.next while c 0 do node.inp osket true node node.next end while result path end if end if end for return result 4.3.3 Vizualizace kapes v molekule proteinu Poslední krok algoritmu má za úkol vizualizovat nalezené kapsy v grafickém rozhraní programu CAVER Analyst. Vstupem tohoto kroku jsou cesty obsahující uzly, které se nacházejí v kapse proteinové molekuly. Tato skutečnost je reprezentována příznakem u daných uzlů. Kapsa je vizualizována výplní jejího prostoru koulemi. Tyto koule se kreslí na pozicích uzlů s výše zmíněným příznakem (nastavovaný v druhém kroku algoritmu 4.3.2) s poloměrem α koule 3.2.1 v daném místě. Aby výplň kapsy byla souvislá, mezi jednotlivými koulemi se vykreslí dalších x překrývajících se koulí, což vytváří požadovaný vizuální efekt. Hod- 27

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ notu x lze měnit parametrem algoritmu. Příklad vizualizace lze vidět na obrázku 4.7. Obrázek 4.7: Ukázka výstupu třetího kroku algoritmu pro detekci kapes v molekulách proteinů. Na obrázku jsou vidět detekované kapsy, jejichž prázdný prostor je vyplněný koulemi červené barvy. 4.4 Implementace algoritmu Algoritmus, stejně jako aplikace CAVER Analyst, je implementován v programovacím jazyce Java a je přímo zakomponován do programu. Samotná implementace je rozdělena do tří kroků odpovídajících výše popsanému algoritmu 4.3. Při vývoji byl kladen důraz na čistotu a malou invazivnost do již stávajícího kódu. Implementace obsahuje jednu datovou strukturu PathNode, která reprezentuje samostatný uzel na cestě 4.3.1. Cesta je opět reprezentována prvním uzlem cesty PathNode, který nemá odkaz na předky (atribut parent), ale odkazuje na další uzel cesty (atribut children). Jedná se o spojovaný seznam [21]. Do stávajícího programu byly přidány tři nové komponenty (viz Obrázek 4.8): 1. PathAnalyzingService analyzuje Voroného diagram a vytváří cesty. Odpovídá prvnímu kroku algoritmu 4.3.1. 2. PocketFindingAlgorithm v cestách na vstupu vyhledává ty, jež 28

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ prochází kapsami a dává je na výstup. Tato komponenta poskytuje funkcionalitu popsanou ve druhém kroku algoritmu 4.3.2. 3. PocketVizualizer vizualizuje nalezené kapsy. Poskytuje funkcionalitu popsanou v třetím kroku algoritmu 4.3.3. Vstupním bodem celého algoritmu je komponenta grafického rozhraní MoreSitesPoreDetectionTopComponent. Komponenta se ovládá pomocí interakce s uživatelem (např. kliknutím na tlačítko), pomocí ní lze pohodlně zadávat konfigurace a spouštět samotný algoritmus. Obrázek 4.8: Diagram tříd zobrazující strukturu implementace navrženého algoritmu k detekci kapes v molekulach proteinů. Žlutou barvou jsou vyobrazeny třídy již existující v programu CAVER Analyst, zelenou barvou jsou zobrazeny třídy přidané za účelem této diplomové práce. 4.5 Zakomponování algoritmu do aplikace CAVER Analyst Jedním z požadavků v zadání této diplomové práce bylo zakomponování vyvinutého algoritmu do aplikace CAVER Analyst. Úloha spočívá v navázání vstupů algoritmu na grafické prvky (tlačítka pro spuštění, formulář pro úpravu parametrů). Dalším z nutných kroků je grafická interpretace výsledků. 29

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Grafické rozhraní programu CAVER Analyst je strukturováno podle komponent, které mají rozdělené funkce počítání tunelů, interakce se strukturou molekuly atd. Detekce kapes je jednou z takovýchto funkcionalit a zaslouží si vlastní komponentu. Tento krok bude proveden následovně v další verzi programu CAVER Analyst. Prozatím pro vývoj algoritmu k detekci kapes bylo vymezeno místo v komponentě k detekci pórů. Integraci lze vidět na obrázku 4.9. Dalším z prvků přidaných do ovládání je možnost uložení cest do souborů na disk ve formátu CSV [24] pro další zpracování. Například zobrazení grafů šířek cest (viz Obrázek 4.6) pomocí programu GNUPlot [32]. Data se ukládají do pracovního adresáře programu CAVER Analyst do složky pockets. Obrázek 4.9: Ukázka integrace ovládání algoritmu k detekci kapes v molekulách proteinů do programu CAVER Analyst (v hnědém obdélníku). Pomocí grafických prvků lze měnit parametry algoritmu minimální délku kapes (viz 4.3.2) a granularitu výplně pro vizualizaci kapsy (viz 4.3.3). Vizualizace výsledků (detekovaných kapes) se provádí do speciálního renderovaciho okna programu CAVER Analyst určeného k těmto účelům. Možný výstup lze vidět na obrázku 4.7. Obsáhlejší popis, jak vizualizace funguje, se nachází v kapitole 4.3.3. 30

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ 4.6 Srovnání s existujícím algoritmem V této části kapitoly je vlastní algoritmus porovnáván s jíž existujícím řešením pro detekci kapes v molekulách proteinů Fpocket 3.3.4. Nejdříve je porovnán vizuální výstup a detekované kapsy. Dále je srovnána rychlost a nedostatky obou algoritmů. 4.6.1 Srovnání výsledků detekce kapes Při hodnocení výsledků je třeba brát v potaz rozdílný přístup k detekci kapes oběma algoritmy. Program Fpocket detekuje kapsy podle shluků α koulí v blízkosti povrchu molekuly a tyto shluky dále filtruje podle typu okolních atomů. Algoritmus vytvořený v rámci této diplomové práce naopak vyhledává všechny prohlubně na povrchu molekuly proteinu, které odpovídají určitým parametrům a nijak je dále nefiltruje. Dalším faktorem je rozdílná vizualizace výsledků. Kapsy detekovány programem Fpocket jsou vizualizovány obarvením okolního povrchu podle výskytu α koulí. Výstup vlastního algoritmu se vizualizuje jako výplň kapes. Z níže uvedených výsledků lze soudit, že způsob použitý v programu CAVER Analyst přesněji znázorňuje lokaci kapsy oproti programu Fpocket. Žádný z algoritmů není schopen detekovat kapsy se 100% přesností. Vlastní algoritmus detekuje i prohlubně bez aktivních míst. Zatímco program Fpocket občas dokáže špatně vyhodnotit shluky α koulí a detekuje kapsy uvnitř molekul nebo naopak ve výběžcích povrchu namísto prohlubní. Za účelem srovnání výsledků byly vybrány čtyři molekuly proteinů s PDB ID: 1ACJ, 1QIF, 1ESA a 2P3B. První dvě molekuly jsou lehčí (molekulární hmotnost okolo 20000 u), zbyle dvě jsou těžší (cca 60000 u). V příkladech uvedených níže jsou znázorněny velikosti molekul a počet atomů v jednotlivých molekulách. Dále je uveden počet detekovaných kapes jednotlivými algoritmy s odůvodněním těchto výsledků. Na vstupu vlastního algoritmu byl parametr minimální délky kapsy nastaven na hodnotu 7 (počet uzlů na cestě). Příklad 1: molekula 1ACJ Podle PDB databáze je molekula složena z 4107 atomů a její molekulární hmotnost je 60991, 47 u. Z tabulky 4.1 lze vidět, že oba algoritmy detekovaly téměř stejný počet kapes, které se navíc překrývají (viz Obrázek 4.10). Lze tedy soudit, že 31

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ detekce proběhla správně. Použitý algoritmus CAVER Analyst Fpocket Počet detekovaných kapes 20 17 Tabulka 4.1: Počet detekovaných kapes programy CAVER Analyst a Fpocket na molekule 1ACJ. Obrázek 4.10: Ukázka detekovaných kapes na molekule 1ACJ. Oranžovými skvrnami na povrchu jsou zobrazeny kapsy detekovány programem Fpocket. Červeně pak kapsy detekovány vlastním algoritmem. Příklad 2: molekula 1QIF Podle PDB databáze molekula je složena z 4247 atomů a její molekulární hmotnost je 60737, 20 u. Podobně jako v prvním případě algoritmy detekovaly podobný počet kapes (viz Tabulka 4.2). V tomto případě je však počet kapes detekovaný programem Fpocket větší. Je to dáno tím, že program detekoval některé kapsy špatně, uvnitř molekuly. Většina detekovaných kapes oběma algo- 32

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ ritmy, nacházejících se skutečně na povrchu proteinu, se opět překrývá (viz Obrázek 4.11). Použitý algoritmus CAVER Analyst Fpocket Počet detekovaných kapes 17 19 Tabulka 4.2: Počet detekovaných kapes programy CAVER Analyst a Fpocket na molekule 1QIF. Obrázek 4.11: Ukázka detekovaných kapes na molekule 1QIF. Oranžovými skvrnami na povrchu jsou zobrazeny kapsy detekovány programem Fpocket. Červeně pak kapsy detekovány vlastním algoritmem. Příklad 3: molekula 1ESA Podle PDB databáze molekula je složena z 1832 atomů a její molekulární hmotnost je 26160, 40 u. V tomto případě se analýza počtu detekovaných kapes (viz Tabulka 4.3) a vizuálního výstupu (viz Obrázek 4.12) téměř neliší od předchozí molekuly. 33

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ Použitý algoritmus CAVER Analyst Fpocket Počet detekovaných kapes 9 10 Tabulka 4.3: Počet detekovaných kapes programy CAVER Analyst a Fpocket na molekule 1ESA. Obrázek 4.12: Ukázka detekovaných kapes na molekule 1ESA. Oranžovými skvrnami na povrchu jsou zobrazeny kapsy detekovány programem Fpocket. Červeně pak kapsy detekovány vlastním algoritmem. Příklad 4: molekula 2P3B Podle PDB databáze molekula je složena z 1602 atomů a její molekulární hmotnost je 22594, 99 u. V poslední analyzované molekule je velký rozdíl v počtu detekovaných kapes oběma algoritmy (viz Tabulka 4.4). Tyto výsledky ovlivňují dva faktory. Prvním faktorem je skutečnost, že kapsy detekovány programem Fpo- 34

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ cket jsou velmi rozsáhlé a zasahují najednou do několika prohlubní (viz Obrázek 4.13). Zatímco kapsy detekovány vlastním algoritmem jsou lokalizovány do jednotlivých prohlubní. Druhým faktorem je neschopnost vlastního algoritmu filtrovat kapsy podle typu okolních atomů. Obrázek 4.13: Ukázka detekovaných kapes na molekule 2P3B. Oranžovými skvrnami na povrchu jsou zobrazeny kapsy detekovány programem Fpocket. Červeně pak kapsy detekovány vlastním algoritmem. Použitý algoritmus CAVER Analyst Fpocket Počet detekovaných kapes 17 5 Tabulka 4.4: Počet detekovaných kapes programy CAVER Analyst a Fpocket na molekule 2P3B. Z výše uvedených výsledků lze soudit, že vlastní algoritmus je schopen detekovat většinu kapes podobně jako program Fpocket a je tedy úspěšný. Navíc kapsy detekované vlastním algoritmem jsou lépe lokalizovatelné na vizuálním výstupu. 35

4. VLASTNÍ ŘEŠENÍ DETEKCE KAPES V MOLEKULÁCH PROTEINŮ 4.6.2 Srovnání rychlosti Táto část kapitoly se zabývá srovnáním rychlosti detekce kapes obou algoritmů. Měření rychlostí je provedeno na stejném vzorku molekul jako při porovnávání výsledků (sekce 4.6.1). Oba algoritmy jsou testovány na počítači s procesorem Intel Core i5 (3 GHz) a 8 GB operační paměti. U vlastního algoritmu je měřená rychlost jeho jednotlivých částí (sestavení cest, detekce kapsy a vizualizace). Zatímco u programu Fpocket je měřen celkový čas a to pomocí příkazu time v linuxové konzoli. Výsledky měření jsou uvedeny v tabulce 4.5. CAVER Analyst Fpocket 1ACJ (4.2 p + 0.002 f + 0.006 v) 4.2 s 2.5 s 1QIF (6.4 p + 0.005 f + 0.006 v) 6.4 s 3.1 s 1ESA (1.1 p + 0.001 f + 0.001 v) 0.9 s 0.8 s 2P3B (0.8 p + 0.001 f + 0.001 v) 0.8 s 0.7 s Tabulka 4.5: Měření rychlosti detekce kapes (v sekundách) v molekulách proteinu programy CAVER Analyst a Fpocket. Čas detekce vlastního algoritmu je rozdělen na jednotlivé části: p sestavení cest, f detekce kapes, v vizualizace. Z výše uvedených výsledků lze vidět, že program Fpocket je rychlejší, než vlastní algoritmus. Zejména pak na větších molekulách. Je nutno ovšem podotknout, že vlastní algoritmus byl implementován intuitivně bez ohledu na výkon. Zrychlení by se dalo vyřešit optimalizováním procesu vytváření cest (např. paralelizací). 36

Kapitola 5 Závěr Táto práce poskytuje lehký úvod do problematiky zkoumání molekul proteinů a hledání aktivního místa. Popisuje různé typy struktur a útvarů v proteinech a přináší přehled existujících přístupů k detekci kapes v molekulách proteinů. Dále představuje vlastní řešení detekce kapes v molekulách proteinů za pomocí Voroného diagramu a vysvětluje implementaci řešení do programu CAVER Analyst. Na konci jsou prezentovány výsledky práce a srovnání s jiným úspěšným řešením. 5.1 Plány do budoucna Zde jsou uvedeny nápady pro budoucí práci a zlepšení vlastního algoritmu: Nastavení parametrů algoritmu podle typu molekul v současné verzi je většina parametrů (např. poloměr koule pro vytvoření povrchu) algoritmu zabudována do kódu, nebo manuálně nastavitelná pomocí uživatelského rozhraní aplikace CAVER Analyst. Do budoucna by bylo dobré prozkoumat rozsáhlou databázi již detekovaných kapes u různých typů molekul proteinů a sestavit ideální parametry pro tyto typy molekul. Zkoumání biochemických vlastností v současné době algoritmus vyhledává jakékoliv prohlubně na povrchu proteinových molekul. Dalším krokem by mohla být biochemická analýza okolí struktur nalezených kapes, což pomůže více zpřesnit výsledky. Optimalizace výkonu naměřené výsledky rychlosti detekce kapes (sekce 4.6.2) ukázaly náročnost vlastního algoritmu na výpočetní čas, kterou však lze dále optimalizovat. 37

Bibliografie [1] Okabe A, Boots B a Sugihara K. Spatial Tessellations: Concepts and Applications of Voronoi Diagrams. In: New York: Wiley, 1992, s. 52 57. [2] Kozlikova B et al. CAVER Analyst 1.0: graphic tool for interactive visualization and analysis of tunnels and channels in protein structures. In: Bioinformatics 30 (2014), s. 2684 2685. [3] Lee B a Richards FM. The interpretation of protein structures: estimation of static accessibility. In: Journal of Molecular Biology 55 (1971), s. 379 380. [4] John A. Capra et al. Predicting Protein Ligand Binding Sites by Combining Evolutionary Sequence Conservation and 3D Structure. In: BMC Bioinformatics 5(12) (2009). [5] Oracle Corporation. The NetBeans Platform. URL: https://netbeans. org/features/platform/ (cit. 26. 12. 2014). [6] Levitt DG a Banaszak LJ. POCKET: A computer graphics method for identifying and displaying protein cavities and their sur-rounding amino acids. In: J Mol Graph 10 (1992), s. 229 234. [7] Joe Dundas et al. CASTp: computed atas of surface topography of proteins with structural and topographical mapping of functionally annotated residues. In: Nucl. Acids Res. 34 (2006), W116 W118. [8] H. Edelsbrunner, D. G. Kirkpatrick a R. Seidel. On the shape of a set of points in the plane. In: IEEE Trans. Inform. Theory IT29 (1983), s. 551 559. [9] F.C.Bernstein et al. The Protein Data Bank: A Computer-based Archival File For Macromolecular Structures. In: J. of. Mol. Biol. 112 (1977), s. 535. [10] Richards FM. Areas, volumes, packing and protein structure. In: Annu Rev Biophys Bioeng 1977 (1977), s. 151 76. 38