NÁZOV PRÁCE: CIEĽ PRÁCE: PRÁCA 3 NEGATÍVNE ZOBRAZENIE MIKROORGANIZMOV. FIXÁCIA A DIAGNOSTICKÉ FARBENIE BAKTÉRIÍ. A) Naučiť sa negatívne zobrazenie mikroorganizmov (MO). B) Naučiť sa prípravu fixovaného preparátu k farbeniu MO. C) Zvládnuť mikroskopickú techniku olejovou imerziou. D) Naučiť sa Gramovo farbenie. E) Naučiť sa farbenie bakteriálnych endospór. F) Naučiť sa pomocný KOH test. POSTUP PRÁCE: A 1. Do kvapky farbiva 2 % kongočervene na podložnom sklíčku pomocou bakteriologického očka asepticky rozsuspendujte malé množstvo kultúry MO. 2. Hranou druhého sklíčka, resp. drôtom očka urobte ťahom tenký náter. 3. Náter nechajte voľne vysušiť pri laboratórnej teplote. 4. Preparát ponorte na sekundu do 1 % HCl. 5. Vysušte a pozorujte mikroskopom preparáty oboch modelových B ako i preparát Vašej izolovanej B. B 1. Do kvapky destilovanej vody na odmastenom čistom podložnom sklíčku pripravte riedku suspenziu kultúry. 2. Suspenziu rozotrite očkom do tenkej vrstvy podľa pokynov učiteľa. Nezabudnite na sklíčko vyznačiť názov mikroorganizmu, najvhodnejšie je písať mäkkou ceruzkou na nálepku. 3. Preparát nechajte vyschnúť voľným odparením vody pri laboratórnej teplote. 4. Podložné sklíčko uchopte medzi palec a ukazovák náterom hore a rýchlo ho niekoľkokrát pretiahnite plameňom kahana. Nezabudnite, že preparát mikroorganizmov, musí byť pred začatím fixácie dokonale suchý!
C Pri mikroskopickom pozorovaní baktérií sa zvyčajne začína pracovať ihneď s imerzným objektívom. Doporučuje sa však najprv nájsť vhodný obraz v zornom poli pri menšom zväčšení. 1. Umiestnite stred farebného náteru do centra svetelného lúča mikroskopu. 2. Na toto miesto kvapnite malú kvapku imerzného oleja. Práca 3 3. Pri kontrole pohľadom zboku zasuň 100x zväčšujúci objektív a ponorte ho do kvapky oleja. 4. Umiestnite kondenzor do najvyššej polohy a kondenzorovú clonku otvorte na maximum. 5. Pri pozorovaní okulárom obraz zaostrujte výhradne mikroskrutkou! D (Gramovo farbenie) Fixované preparáty farbite podľa nasledujúcej schémy: 1. prevrstvite kryštálovou violeťou 60 s 2. prevrstvite Lugolovým roztokom 30 s 3. prevrstvite alkoholom max 10 s 4. opláchnite vodou 5. prevrstvite safranínom 60 s 6. opláchnite vodou Všetky kvapaliny vždy pridávajte a zlievajte z podložného sklíčka jedným smerom! Výsledok: G + sú modrofialové, G - sú červené Najčastejšie chyby pri farbení podľa Grama: 1. V preparáte sú zrazeniny alebo kryštáliky farbív ak farbíme ešte teplý fixovaný preparát ak sme všetky použité roztoky nezlievali a preparát neoplachovali rovnakým smerom ak je zle prefiltrované farbivo 2. Mikroorganizmy sú len slabo zafarbené ak odfarbujeme etanolom príliš dlho 3. Grampozitívne baktérie a javia ako gramnegatívne ak náter nebol dostatočne vysušený pred fixáciou ak sa použije stará kultúra
E (Farbenie bakteriálnych endospór) Fixované preparáty farbite podľa nasledujúcej schémy: 1. preparát umiestnite na horúcu platňu a prevrstvite malachitovou zelenou 2. zahrievajte 5 min, dopĺňajte farbivo tak, aby nezaschlo 3. opláchnite vodou 4. prevrstvite safranínom 60 s 5. opláchnite vodou Výsledok: endospóry sú zelené, vegetatívne bunky sú červené Práca 3 F (pomocký KOH test) 1. Do kvapky 3 % KOH na podložnom sklíčku pridajte bohaté očko z kultúry. 2. Pomaly odťahujte očko od sklíčka smerom nahor a sledujte, či sa tvorí viskózna hmota. Výsledok: G- baktérie tvoria "nitku" (pozitívny KOH test).
Práca 3 PROTOKOL 3 NÁZOV PRÁCE: NEGATÍVNE ZOBRAZENIE, FIXÁCIA A DIAGNOSTICKÉ FARBENIE BAKTÉRIÍ. MENO: SKUPINA: DÁTUM: 1. Popíšte použitý postup negatívneho zobrazenia. 2. Zakreslite výsledky mikroskopického pozorovania Neagtívne zobrazenie: c) modelové baktérie: názov MO: tvar a usporiadanie buniek: názov MO: tvar a usporiadanie buniek: d) Vaša baktéria: Vaša baktéria: tvar a usporiadanie buniek:
Práca 3 3. Uveďte, čo je fixácia, aký je jej význam. 4. Stručne charakterizujte diagnostické farbenie. 5. Ktoré štruktúry mikroorganizmov majú diagnostický význam? 6. Gramovo farbenie: a) stručne uveďte princíp farbenia: b) napíšte význam farbenia: c) opíšte v bodoch použitý postup farbenia:
Práca 3 d, zakreslite výsledky mikroskopického pozorovania preparátov GRAM: Vaša vlastná baktéria 7. Farbenie bakteriálnych endospór: d) stručne uveďte princíp farbenia: e) napíšte význam farbenia: f) opíšte v bodoch použitý postup farbenia:
g) zakreslite výsledky mikroskopického pozorovania preparátov Endospóry: Práca 3 8. Uveďte princíp KOH testu a účel, na ktorý sa používa. Aké iné testy možno použiť za podobným účelom? 9. Uveďte výsledky KOH testu do nasledujúcej tabuľky: Testovaná baktéria Gramovo farbenie farba buniek záver v preparáte KOH test (pozn.: ťahá, resp. neťahá sa nitka) Vaša vlastná baktéria