PRÁCA Č. 7 NÁZOV PRÁCE: RAST MIKROORGANIZMOV, METÓDY STANOVENIA POČTU MIKROORGANIZMOV

Transkript

1 PRÁCA Č. 7 NÁZOV PRÁCE: RAST MIKROORGANIZMOV, METÓDY STANOVENIA POČTU MIKROORGANIZMOV CIEĽ PRÁCE: A) Stanoviť počet buniek v suspenzii pomocou analytickej čiary získanej meraním absorbancie turbidimetricky. B) Určiť koncentráciu živých buniek kultivačnou metódou na agarových platniach na základe počtu kolónií. C) Stanoviť počet buniek priamym mikroskopickým počítaním v Bürkerovej komôrke D) Stanoviť sušinu buniek po sušení v sušiarni s infračerveným ohrevom. POSTUP PRÁCE: A 1. Sterilný fyziologický roztok asepticky rozdávkuj po 5 ml do 6 sterilných bakteriologických skúmaviek s kovovým uzáverom a označ ich: SP Hustú suspenziu Saccharomyces cerevisiae vo fyziologickom roztoku postupnými krokmi rieď na horeuvedené hodnoty riedenia, a to zmiešaním 5 ml suspenzie a 5 ml sterilného fyziologického roztoku. Jedna skúmavka so sterilným fyziologickým roztokom bez kvasinky slúži ako slepý pokus (SP). Takýmto spôsobom pripravíš tzv. dvojkové riedenie. Každé riedenie priprav vždy novou sterilnou pipetou! Pred každým riedením obsah každej skúmavky dobre premiešaj! Správne nariedená suspenzia buniek by mala v najnižšom riedení slabo opaleskovať. V prípade potreby suspenziu rieď v ďalších krokoch. 3. Zmeraj absorbanciu jednotlivých riedení pri 550 nm na Langeho fotometri (nefelometri) a zostroj analytickú čiaru A = f(ried.). B 1. Priprav 150 ml SLA a po sterilizácii asepticky nalej 6 Petriho misiek. 2. Priprav desiatkové riedenie zo suspenzie kvasiniek pripravenej v práci A) od 10-1 po 10-5 (vždy 1 ml z vyššieho riedenia a 9 ml sterilného riediaceho roztoku). 3. Z troch najnižších riedení suspenzie kvasiniek asepticky napipetuj po 200 µl na povrch stuhnutého živného média vo vopred vyznačených Petriho miskách (2 paralelky pre každé riedenie). Suspenzie začni dávkovať od najnižšieho riedenia, čo ti umožní pracovať s 1 pipetou pri všetkých riedeniach. 4. Suspenzie v Petriho miskách asepticky rozprestri po celej ploche média sterilnou hokejkou. Suspenzie začni "rozhokejkovávať" od najnižšieho riedenia, čo ti umožní pracovať s 1 hokejkou pri všetkých riedeniach. 5. Platne inkubuj pri laboratórnej teplote až do budúceho cvičenia v prevrátenej polohe. 6. Stanov počet vyrastených kolónií kvasiniek pri každom riedení. Z paralelných stanovení zober priemer. Do úvahy berieme len platne s počtom vyrastených kolónií kvasiniek Výsledok uveď ako počet buniek na objem pôvodnej vzorky a porovnaj výsledky stanovenia počtu buniek mikroskopickým počítaním.

2 C 1. Na čistú Bürkerovu komôrku upevni krycie sklíčko. 2. Do žliabku komôrky napipetuj zriedenú suspenziu kvasiniek pripravenú v práci A) (slabo opaleskujúcu) a nechaj niekoľko minút stáť. 3. Objektívom 20 zisti, či je na ploche jedného malého štvorca ( 1 / 25 mm 2 ) max buniek kvasiniek. V prípade potreby suspenziu ďalej vhodne zrieď so sterilným fyziologickým roztokom. 4. Pri objektíve 40 spočítaj bunky vo väčšom množstve políčok (najčastejšie pozeráme 5 veľkých štvorcov ohraničených 3 čiarami, t.j. 80 malých štvorcov ohraničených 2 čiarami). Bunky ležiace alebo sa dotýkajúce hraničných čiar štvorcov sa počítajú iba vtedy, ak ide o hornú alebo pravú stranu štvorca. 5. Výsledok vyjadri ako počet buniek kvasiniek v 1 ml suspenzie P = p z kde, P počet buniek v 1 ml pôvodnej vzorke p priemerný počet buniek na ploche malého štvorca 1 / 25 mm 2 z použité riedenie pôvodnej vzorky prepočítaní faktor na 1 ml (1 cm 3 ): 1 / 25 1 / 10 1 / mm 3 D 1. Prístroj KERN MLS vzadu spínačom uvedieme do chodu. 2. Z ponuky menu vyberieme metodiku BIOMASA. 3. Na vyvolanie metodiky stlačíme print. 4. Stlačíme štart. 5. Otvoríme poklop váh. 6. Na hliníkovú misku vložíme prázdnu acetátovo-celulózovú filtračnú membránu určenú na sušenie. 7. Stlačíme TARE. 8. Poklop sušiarne zatvoríme čím sa automaticky naštartuje program sušenia. 9. Po ukončení sušenia na displey odčítame hmotnosť prázdnej membrány. 10 Vysušenú a odváženú acetátovo-celulózovú filtračnú membránu položíme na fritu (spodná časť lievika). 11 Obe časti lievika (hornú aj spodnú) vzájomne spojíme tesne štipcom. 12. Presne 5 ml dobre zhomogenizovanej vzorky MO odpipetujeme a nalejeme do filtračného zariadenia. 13. Pripojíme vákuovú vývevu čím zabezpečíme odťah filtrátu. 14. Filtračný koláč na membráne niekoľkokrát dobre premyjeme fyziologickým roztokom (odstránenie zložiek média) tak, aby na stranách skleného lievika nezostala žiadna biomasa. 15. Filtračný lievik rozoberieme, membránu s biomasou opatrne vyberieme a vložíme do sušiarne s infračerveným ohrevom. 16. Pri sušenie membrány s odfiltrovanou biomasou postupujeme rovnako ako pri sušení prázdnej membrány (opakujeme sušenie podľa bodov 5 až 9). 2

3 Postup pri dvojkovom riedení: Postup pri desiatkovom riedení: Schéma Bürkerovej komôrky: 3

4 PROTOKOL 7 NÁZOV PRÁCE: RAST MIKROORGANIZMOV, METÓDY STANOVENIA POČTU MIKROORGANIZMOV MENO: DÁTUM: SKUPINA: ÚLOHY 1. Uveďte základné metódy na stanovenie počtu mikroorganizmov a ich princípy. 2. Napíšte postup a podmienky stanovenia počtu kvasiniek (uveďte riedenie, živné médium...): a) turbidimetrickou metódou: b) kultivačnou metódou c) priamou mikroskopickou metódou: 3. Uveďte výsledky a spôsob výpočtu pri stanovení počtu buniek kvasiniek v 1 ml suspenzie: a) kultivačnou metódou b) mikroskopickým počítaním 4

5 4. Výsledky stanovení počtu mikroorganizmov spracujte do tabuliek: Turbidimetrické stanovenie A 550 (a) A 550 (b) A 550 (x) Platňová kultivačná metóda Počet KTJ (a) Počet KTJ (b) Počet KTJ (x) Počet buniek v 1 ml suspenzie Priame mikroskopické počítanie (a) (b) (c) (d) (x) Počet buniek v 1 ml suspenzie 5. Nakreslite analytické čiary pre stanovenie počtu buniek ako závislosť A 550 = f(počet buniek). 6. Pomocou hmotnosti suchej prázdnej membrány, suchej membrány s odfiltrovanými kvasinkami a objemu kultivačného média vypočítaj hmotnostnú koncentráciu sušiny (sušina) kvasiniek na objem 1l kultivačného média ( C biomasy g/l). 7. Získané výsledky vyhodnoťte a zdvôvodnite. 5