VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY

VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX BŘEZEN 2010 ČÍSLO 1 E ditorial Vážení čtenáři, první číslo časopisu Vojenské zdravotnické listy v roce 2010 Vám přináší sedm příspěvků, které zahrnují jak původní vědecké práce, tak přehledové články autorů z Fakulty vojenského zdravotnictví Univerzity obrany i dalších domácích institucí. V jednom z příspěvků je spoluautorem i zahraniční člen autorského kolektivu ze spřátelené instituce v Koreji Korean Research Institute of Chemical Technology. Ačkoli v minulosti publikovalo v našem časopise nezanedbatelné množství zahraničních autorů, do dnešní doby nebyl časopis zahrnut do uznávaných světových vědeckých databází, které by otočily zraky jiných světových vědců k článkům publikovaným v tomto časopise. Práce publikované ve VZL jsou dosud málo citovány. Jedním z důvodů je pravděpodobně i specifičnost tohoto vojensko-zdravotnického časopisu společně v kombinaci s jazykem otištěných prací článků publikovaných ve VZL v angličtině je zatím bohužel jen velmi málo. Existují sice i česky psané časopisy, které jsou akceptovány cizími bibliografickými databázemi, jejich počet je však omezený. Mým úkolem, jakožto nového editora časopisu Vojenské zdravotnické listy, je pokusit se slovy některých kolegů o nemožné, což znamená zreformovat časopis tak, aby se mohl během několika let ucházet o zařazení do prestižních vědeckých databází a být v této oblasti vlajkovou lodí Fakulty vojenského zdravotnictví, potažmo celé Univerzity obrany. Jak ale dosáhnout tak ambiciózního cíle? Na základě četných diskusí s kolegy z naší fakulty i jiných českých a zahraničních pracovišť máme vytyčeno několik kroků, které musíme uskutečnit, chceme-li dospět k tomuto cíli. Některé z těchto kroků budou zejména pro zastánce tradice nepříjemné, avšak z hlediska dosažení vytčeného cíle jsou tyto kroky nezbytné. Jedná se především o přijímání a publikování příspěvků pouze v anglickém jazyce, které by mělo nastat po přechodném období v letech 2010 2011, kdy budou publikovány ještě práce v českém jazyce přijaté redakcí v letech 2009 a 2010. Změnou, která zřejmě nejvíce zasáhne do dosavadní tradice vydávání VZL, je plánovaná změna názvu tohoto odborného periodika. Od roku 2012 předpokládáme přejmenování časopisu z původního názvu Vojenské zdravotnické listy na prozatímní pracovní název Military Medical Science Letters. Tento název je, jak jsem předeslal, názvem pracovním, který lze na základě diskuse během následujících dvou let ještě pozměnit. Kromě těchto relativně razantních změn by měly přijít změny, které budou mít menší dopad na autory, avšak měly by zvýšit mezinárodní prestiž časopisu. Nejdůležitější změnou je získání významných zahraničních vědců do redakční rady VZL. Proto se obracím na všechny autory a čtenáře VZL, zda by mně pomohli při výběru vhodných kandidátů do tohoto pro každý časopis důležitého orgánu. Závěrem bych rád poukázal na to, že dostat se mezi elitní časopisy určitě není snadné, ale není to ani utopie. Příkladem může být českobudějovický Journal of Applied Biomedicine, vydávaný Zdravotně sociální fakultou Jihočeské univerzity. Jeho první číslo spatřilo světlo světa v roce 2003 a v roce 2009 se časopis dostal do nejuznávanější databáze všech vědeckých databází Web of Science. Doufám a pevně věřím, že s Vaší pomocí, s pomocí vedení Fakulty vojenského zdravotnictví a s pomocí managementu Univerzity obrany tohoto cíle také dosáhneme. Doc. Ing. Kamil Kuča, Ph.D. Editor VZL

2 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 SROVNÁNÍ NEUROPROTEKTIVNÍHO ÚČINKU NOVĚ SYNTETIZOVANÝCH OXIMŮ (K250, K251) A OXIMŮ ZAVEDENÝCH V AČR (OBIDOXIM, HI-6) NA TABUNEM INTOXIKOVANÝCH POTKANECH 1 Jiří KASSA, 1 Jana ŽĎÁROVÁ KARASOVÁ, 3 Sandra TESAŘOVÁ, 1 Kamil MUSÍLEK, 2 Kamil KUČA, 1 Jiří BAJGAR 1 Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, katedra toxikologie, Hradec Králové 2 Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Centrum pokročilých studií, Hradec Králové 3 Sedmá polní nemocnice Armády České republiky, Hradec Králové Souhrn Na samcích potkana kmene Wistar byl testován neuroprotektivní účinek nově syntetizovaných oximů (K250, K251) a srovnáván s efektem oximů zavedených do zdravotnické výbavy AČR jako antidotum první pomoci (obidoxim) nebo lékařské pomoci (HI-6). Schopnost oximů eliminovat tabunem navozené akutní příznaky neurotoxicity byla hodnocena pomocí funkční pozorovací baterie 24 hodin po otravě tabunem. Získané výsledky ukázaly, že neuroprotektivní účinek nově syntetizovaného oximu K251 je o něco vyšší než účinek obidoximu a oximu HI-6, ale rozdíl v neuroprotektivní účinnosti výše uvedených oximů nebyl příliš výrazný. Oxim K250 je naopak méně účinný při eliminaci tabunem vyvolaných příznaků akutní neurotoxicity ve srovnání s obidoximem i oximem HI-6. Klíčová slova: Tabun; Funkční pozorovací baterie; HI-6; Obidoxim; K250; K251; Atropin; Potkan. A Comparison of the Neuroprotective Efficacy of Newly Synthesized Oximes (K250, K251) and Oximes Introduced into the Czech Army (Obidoxime, HI-6) in Tabun-Poisoned Rats Summary The neuroprotective efficacy of newly synthesized oximes (K250, K251) and the oximes introduced into the Czech Army for the first aid (obidoxime) and medical aid (HI-6) was compared in male Wistar rats. The potency of oximes to eliminate tabun-induced acute neurotoxic effects was evaluated with the help of a functional observational battery 24 hours following tabun intoxication. The obtained results demonstrate that the neuroprotective efficacy of newly synthesized oxime K251 is a little higher in comparison with the potency of obidoxime and HI-6 to eliminate tabun-induced acute neurotoxicity but the difference is not too high. On the contrary, another newly synthesized oxime K250 is less effective than obidoxime and HI-6 in elimination of tabun-induced acute neurotoxic effects. Key words: Tabun; Functional observational battery; HI-6; Obidoxime; K250; K251; Atropine; Rat. Úvod Nervově paralytické látky (NPL) představují pro člověka stále relativně vysoké nebezpečí zejména z důvodu rizika zneužití těchto vysoce toxických látek pro válečné či teroristické cíle. Jejich toxický účinek spočívá především v ireverzibilní inhibici enzymu acetylcholinesterasy (AChE, EC 3.1.1.7) a následné akumulaci neuromediátoru acetylcholinu na periferních i centrálních receptorech cholinergního nervového systému (14, 20). Antidotní terapie akutních intoxikací NPL spočívá především v co nejrychlejším podání anticholinergní látky antagonizující účinek nahromaděného acetylcholinu na cholinergních receptorech a reaktivátoru AChE obnovujícího aktivitu inhibované AChE (6, 11). Tabun (O-ethyl-N,N-dimethyl amidokyanofosfát patří mezi nejnebezpečnější NPL z důvodu obtížného terapeutického zásahu do mechanismu jeho toxického účinku. Příčinou obtížné léčitelnosti akutních otrav tabunem je pravděpodobně existence volného elektronového páru na amidové skupině, jež výrazně ztěžuje nukleofilní zásah oximů, a konformační změny v aktivním centru AChE po navázání tabunu (2, 7, 9). Intoxikace tabunem může vyvolat centrálně zprostředkovanou záchvatovitou aktivitu, která rychle progreduje v generalizované toxicko-klonické křeče a může přispět k poškození mozku. Proto je schopnost antidot blokovat akutní neurorotické účinky tabunu, a tak zabránit vývoji ireverzibilních změn v centrálním nervovém systému (CNS), velmi důle-

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 3 žitá pro úspěšnost antidotní terapie. Obecně reaktivátory AChE, zvané podle své chemické struktury oximy, vykazují vyšší účinnost v periferním kompartmentu ve srovnání s centrálním kompartmentem z důvodu jejich obtížného průchodu přes hemato-encefalickou bariéru. Nicméně schopnost oximů proniknout do CNS přes hemato-encefalickou bariéru s následnou reaktivací inhibované AChE byla experimentálně prokázána (4, 18). Ačkoli míra reaktivace inhibované AChE v mozku je nižší ve srovnání s periferním nervovým systémem, je schopnost oximů reaktivovat inhibovanou AChE v CNS důležitá pro přežití a prognózu jedinců exponovaných NPL (11, 14). Obecně běžně používané reaktivátory fosforylované či fosfonylované AChE monopyridiniové a bispyridiniové oximy vykazují minimální účinnost při eliminaci akutních toxických účinků tabunu z důvodu velmi nízké reaktivační účinnosti (11). Poslední zavedený reaktivátor AChE do AČR oxim HI-6, je sice účinnější při terapii akutních otrav somanem než ostatní běžně používané oximy (10, 17), ale jeho účinnost vůči tabunu je velmi nízká (5, 21). Z tohoto důvodu je pátrání po novém reaktivátoru AChE dostatečně účinném proti tabunu dlouhodobým cílem řady výzkumných pracovišť na celém světě. V minulém roce byly na naší katedře syntetizovány dva nové bispyridiniové oximy: K250 (E)-1-(4-carbamoylpyridinium)-4-(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-but-2-en dibromid, K251 (E)-1- -(4-hydroxyiminomethylpyridinium)-4-(4-methylcarbonylpyridinium)-but-2-en dibromid (obr. 1) za účelem zvýšení účinnosti antidotní terapie akutních otrav tabunem, včetně eliminace akutních neurotoxických přiznaků (16). Cílem této studie bylo srovnání schopnosti nově syntetizovaných oximů (K250, K251) a oximů zavedených v AČR (obidoxim, HI-6) eliminovat či alespoň redukovat tabunem vyvolanou akutní neurotoxicitu. Tabunem vyvolané akutní neurotoxické příznaky byly hodnoceny pomocí funkční pozorovací baterie, neinvazivního a poměrně citlivého typu hodnocení široké škály neurobiologických funkcí včetně senzorických, motorických a autonomních nervových funkcí. Materiál a metody Jako pokusná zvířata byli použiti samci bílých potkanů kmene WISTAR chovu VELAZ Praha o hmotnosti 200 220 g. Potkani byli krmeni standardní Larsenovou dietou a vodou ad libitum. Kontrolní i experimentální zvířata byla rozdělena do skupin po 8 zvířatech. Pokusy prováděné na těchto zvířatech byly schváleny Etickou komisí FVZ UO v Hradci Králové. Tabun o čistotě 95 % byl získán z VTÚO Brno. Jeho čistota byla hodnocena acidimetrickou titrací. Všechny oximy byly syntetizovány na katedře toxikologie FVZ UO v Hradci Králové. HON NOH H 2 N O + + N N 2Cl CH 2 OCH - 2 Obidoxim HON + + N N CH 2 OCH 2Cl - 2 HI-6 COOH COCH 3 N N N N HON=HC 2 Br HON=HC 2 Br K250 K251 Obr. 1: Chemická struktura oximů

4 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 Jejich čistota byla analyzována pomocí HPLC. Ostatní chemikálie analytické čistoty byly zakoupeny komerční cestou a použity bez dalšího čištění. Všechny látky byly potkanům podávány intramuskulárně (i. m.) v objemu 0,1 ml/kg hmotnosti. Schopnost obou nově vyvinutých oximů K250 a K251 i oximů zavedených v AČR eliminovat tabunem vyvolané projevy neurotoxicity byla hodnocena na potkanech pomocí funkční pozorovací baterie, která představuje komplexní vyšetření stavu senzitivního, motorického i autonomního nervového systému experimentálních zvířat pomocí hodnocení více než 40 různých parametrů, z nichž některé jsou škálovány (tab. 1), jiné měřeny v absolutních hodnotách (8). Neuroprotektivní účinnost v AČR zavedených oximů (obidoxim, HI-6) a nově syntetizovaných oximů (K250 a K251) byla měřena 24 h po intoxikaci potkanů tabunem v dávce odpovídající 80 % hodnoty LD 50 tabunu. Účinek oximů podávaných i. m. v ekvimolární dávce 50 µmol/kg společně s atropinem (v dávce 21 mg/kg) za 1 min po i. m. otravě potkanů tabunem byl hodnocen stejně jako neurotoxicita tabunu za 24 h po otravě potkanů tabunem. Hodnoty jednotlivých parametrů tabunem vyvolané neurotoxicity u experimentálních zvířat byly statisticky srovnávány s hodnotami získanými od kontrolních zvířat, kterým byl místo tabunu a antidot podáván fyziologický roztok ve stejném objemu (0,1 ml/100 g hmotnosti). Statistické hodnocení získaných výsledků bylo prováděno pomocí analýzy rozptylu s následným hodnocením kontrastů metodou Scheffeho na 95% hladině významnosti (p < 0,05) (19). Výsledky Výsledky ovlivnění tabunem vyvolaných projevů neurotoxicity vybranými oximy v kombinaci s atropinem za 24 hodin po podání tabunu byly rozděleny do 3 částí (aktivita a neuromuskulární koordinace, senzorimotorické funkce a excitabilita a konečně autonomní funkce) a jsou uvedeny v tabulkách 2a až 2c (15). Tabunem bylo ovlivněno celkem 19 měřených parametrů nervových funkcí, včetně polohy, obtížnosti odchytu a manipulace, miózy a vymizení reakce zornice na světlo, snížení svalového napětí, snížení explorativní aktivity, zmenšení šíře stopy po dopadu, snížení síly svalové všech končetin, přijmu potravy, tělesné teploty a spontánní vertikální i horizontální motorické aktivity. Zatímco oxim K250 nebyl schopen eliminovat tabunem vyvolané příznaky akutní neurotoxicity výrazněji než obidoxim a oxim HI-6, druhý testovaný nově syntetizovaný oxim K251 vykázal vyšší počet eliminovaných tabunem vyvolaných příznaků neurotoxicity ve srovnání s obidoximem nebo oximem HI-6, i když rozdíly mezi neuroprotektivním účinkem tohoto oximu a obidoximu či oximu HI-6 nebyly nijak výrazné. U potkanů léčených oximem K251 přetrvávala mióza, snížení síly hrudních i pánevních končetin, příjmu potravin a spontánní vertikální a horizontální motorické aktivity. U potkanů léčených oximem K250 navíc přetrvávala změna polohy a obtížnosti odchytu a manipulace, snížení svalového napětí, explorativní aktivity a šíře stopy po dopadu (tab. 2a až 2c). Diskuse NPL včetně tabunu způsobují centrálně zprostředkované záchvaty, které rychle progredují do generalizovaných tonicko-klonických křečí a přispívají k poškození některých mozkových struktur. Dlouhodobá hyperstimulace muskarinových receptorů v mozku způsobená NPL je zřejmě spojena se zvýšením glutamatergní aktivity vedoucí k excitoxickému poškození mozku, především v oblasti hipokampu, amygdal a piriformní kůry. Expozice experimentálních zvířat nervově paralytickým látkám v dávkách způsobujících křeče tak může vést k ireverzibilnímu poškození mozku, které se projeví ve formě neurobehaviorálních příznaků intoxikace (1). Proto schopnost antidot eliminovat akutní neurotoxické účinky NPL, a tak ochránit otrávené jedince před ireverzibilním poškozením CNS je velmi důležitá pro úspěšnost antidotní terapie akutních intoxikací NPL. Získané výsledky prokázaly, že neuroprotektivní účinnost nově syntetizovaného oximu K250 je výrazně nižší ve srovnání s neuroprotektivními účinky druhého nově syntetizovaného oximu K251, jehož schopnost eliminovat tabunem vyvolané příznaky neurotoxicity je srovnatelná s neuroprotektivní účinností obidoximu, jenž je považován spolu s trimedoximem za nejúčinnější reaktivátor tabunem inhibované AChE mezi dosud používanými oximy (11). Ukazuje se, že významným faktorem ovlivňujícím neuroprotektivní, reaktivační a terapeutickou účinnost oximů vůči NPL, je jejich chemická struktura. Mezi nejvýznamnější strukturální faktory ovlivňující neuroprotektivní, reaktivační a terapeutickou účinnost oximů je počet metylenových skupin v ře-

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 5 Funkční pozorovací baterie Tabulka 1 PARAMETR Poloha v kleci Obtížnost odchytu Obtížnost manipulace POUZE VELIČINY ORDINÁLNÍ A NOMINÁLNÍ 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 sedí/stojí explor. aktivita spí/leží atonie boční poloha přikrčený pasivní normální zvýšená reakce pohyb útěk agrese pasivní normální silná reakce vysoká reakce pokles hlavy Svalový tonus atonie hypotonie normální hypertonie rigidita fasciculace Slzení normální mírné silné krusty Postavení víček Endoexoftalmus Srst otevřená endo normální exo mírně přivřená normální zbarvená rozcuchaná krusty zbarvené zpola přivřená zavřená ptóza zbarvená + rozcuchaná lysina poranění jiné změny piloerekce Kůže normální bledá zarudlá cyanotická pigmentace studená poraněná Salivace normální mírná silná Nosní sekrece normální mírný silný zbarvený Tremor žádný při stimulaci Klonické jevy žádné záškuby Tonické jevy žádné ext. rigidita Chůze normální ataxie Skóre postižení chůze žádné lokální celkový ovliv. pohyb silný nerytm. pohyb opistotonus emprostotonus postižení pánevních končetin mírně abnormální slabý třes silný třes myoklonie křeč otřepávání prostrace zřetelně abnormální prudké skoky postižení hrudních končetin značně abnormální křeč chůze po špičkách shrbená chůze vláčí tělo Ataxie žádná mírná silná Skóre pohyblivosti Aktivita Tenze žádná normální velmi nízká místní (uši) mírně snížená zřetelně snížená zcela nepohyblivá občasná snížená normální zvýšená trvalá stupor Stereotypie žádná hlava trup čištění běh jiné Bizarní chování Reakce na přiblížení Reakce na dotyk žádné hlava trup automutilace abnormální pohyb jiné žádná normální zvýšená energická prudká žádná normální zvýšená energická prudká

6 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 Tabulka 1 pokrač. Reakce na zvuk Reakce na bolest Velikost zornic Reakce na světlo mióza značná mióza mírná normální mydriáza mírná žádná žádná normální zvýšená energická prudká žádná normální zvýšená energická prudká normální mydriáza značná Dopad normální ataktický bok záda vzpřim ze ZP stimul v ZP+ stimul v ZP- Tabulka 2a Hodnoty tabunem vyvolané aktivity a ukazatelů neuromuskulární neurotoxicity měřené 24 hodin po podání tabunu funkční pozorovací baterií (číslo 1 2, 4 14 škálované hodnoty, číslo 3, 15 21 hodnoty v absolutních jednotkách) Statistická významnost: *p < 0,05 (ve srovnání s kontrolními hodnotami) 24 hodin Kontroly Tabun + A + K251 Tabun + A + K250 Tabun + A + Obidoxim Tabun + A + HI-6 Tabun Č. Ukazatel x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s 1 Poloha v kleci 1,00 1,00 3,00* 3,00* 3,00* 3,00* 2 Svalový tonus 0,00 0,00 2,00* 1,00* 2,00* 2,00* 3 Počet vzpřimů 3,88 1,68 0,63* 0,92 0,75* 1,09 1,25 1,04 1,38 1,06 0,75* 0,56 4 Hyperkineze 0,00 0,00 3,00* 0,00 0,00 3,00* 5 Tremor 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6 Klonické jevy 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 7 Tonické jevy 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8 Chůze 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 9 Ataxie 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 10 Skóre chůze 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 11 Skóre pohyblivosti 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 12 Aktivita 4,00 1,00 1,00* 1,00* 1,00 1,00* 13 Dopad ze ZP 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 14 Dopad z VP 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 15 Šíře stopy při dopadu (mm) 102,19 15,80 96,00 19,69 65,25* 42,72 84,13* 16,84 83,00* 9,50 73,88* 12,99 16 Síla hrudních končetin (kg) 5,98 0,50 5,42* 0,66 3,45* 2,21 5,09* 1,27 5,24* 39,00 5,46* 0,34 17 Síla pánevních končetin (kg) 1,24 0,21 0,94* 0,13 0,58* 0,38 0,82* 0,19 0,76* 0,21 0,55* 0,16 18 Síla všech končetin (kg) 17,00 1,83 14,63* 1,55 8,73* 5,51 14,10* 1,84 12,31* 2,21 12,90* 2,08 19 20 21 Vertikální aktivita (No/10 min) Horizont. aktivita (No/10 min) Celková aktivita (No/10 min) 210,13 163,32 50,63* 53,72 6,25* 8,00 6,25* 9,11 154,00 132,00 31,75* 15,83 34,13 30,07 4,75* 5,92 0,95* 1,56 0,88* 2,47 16,75 18,79 6,38* 2,48 244,25 189,45 55,38* 57,79 7,20* 8,00 7,13* 11,43 170,75 145,70 38,13* 18,31 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 7 Tabulka 2b Hodnoty tabunem vyvolaných ukazatelů senzorimotorické a excitační neurotoxicity měřené 24 hodin po podání tabunu funkční pozorovací baterií (škálované hodnoty) Statistická významnost: *p < 0,05 (ve srovnání s kontrolními hodnotami) 24 hodin Kontroly Tabun + A + K251 Tabun + A + K250 Tabun + A + Obidoxim Tabun + A + HI-6 Tabun Č. Ukazatel x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s 1 Obtížnost odchytu 2,00 2,00 1,00* 2,00 1,00* 1,00* 2 Obtížnost manipulace 2,00 2,00 1,00* 2,00 1,00* 1,00* 3 GSC 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4 Tenze 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5 Vokalizace 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6 Stereotypie 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 7 Bizarní chování 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8 Reakce na přiblížení 2,00 2,00 2,00 1,00* 1,00* 1,00* 9 Reakce na dotyk 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 10 Reakce na zvuk 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 11 Reakce na bolest 2,00 2,00 2,00 2,00 2,00 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 Tabulka 2c Hodnoty tabunem vyvolaných ukazatelů autonomní neurotoxicity měřené 24 hodin po podání tabunu funkční pozorovací baterií (číslo 1 7, 10 11, 15 škálované hodnoty, číslo 8 9, 12 14 hodnoty v absolutních jednotkách) Statistická významnost: *p < 0,05 (ve srovnání s kontrolními hodnotami) 24 hodin Kontroly Tabun + A + K251 Tabun + A + K250 Tabun + A + Obidoxim Tabun + A + HI-6 Tabun Č. Ukazatel x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s x/m /+s 1 Slzení 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2 Postavení víček 1,00 1,.00 1,00 1,00 1,00 1,00 3 Endo-exoftalmus 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 4 Srst 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 5 Kůže 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 6 Salivace 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 7 Nosní sekrece 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 8 Urinace 0,00 0,00 0,00 0,00 1,00 0,00 9 Defekace 0,00 2,00 0,00 0,00 0,00 0,00 10 Velikost zornic 0,00 1,00* 2,00* 1,00* 1,00* 1,00* 11 Reakce zornic na světlo 1,00 0,00* 0,00* 0,00* 0,00* 0,00* 12 Příjem potravy (%) 100,00 0,00 57,50* 8,02 16,50* 10,35 44,50* 12,29 57,50* 16,57 52,50* 12,30 13 Hmotnost (g) 205,13 25,54 237,38 25,33 179,00 112,06 226,25 14,99 216,75 29,18 223,88 16,89 14 Rektální teplota ( C) 37,26 0,17 36,91* 0,48 36,26* 0,38 36,38* 0,35 36,51* 0,65 36,45* 0,29 15 Dýchání 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8 n = 8

8 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 tězci spojujícím oba pyridiniové kruhy, poloha funkční oximové skupiny na pyridiniovém kruhu a struktura dalšího substituentu na druhém pyridiniovém kruhu. Pro reaktivaci tabunem inhibované AChE jsou nejvýhodnější tři až čtyři metylenové skupiny ve spojovacím můstku mezi oběma pyridiniovými kruhy a jedna až dvě oximové skupiny v poloze čtyři na pyridiniovém kruhu (3, 13). Rozdíl mezi neuroprotektivní účinností obou nově syntetizovaných oximů je zřejmě způsoben rozdílnou chemickou strukturou substituentu na druhém pyridiniovém kruhu, jež mimo jiné ovlivnila i toxicitu obou oximů a jejich reaktivační a terapeutickou účinnost vůči tabunu (12). Závěrem lze konstatovat, že neuroprotektivní účinek nově syntetizovaného oximu K251 je mírně vyšší ve srovnání s obidoximem, přestože jeho reaktivační a terapeutický efekt nedosahuje účinku obidoximu (12). Rozdíl v neuroprotektivní účinnosti mezi oximem K251 a obidoximem však není natolik výrazný, aby se stal podnětem k zavedení oximu K251 pro terapii otrav tabunem místo v současnosti používaných oximů, především obidoximu a trimedoximu. Poděkování Autoři děkují E. Reslové a J. Uhlířové za technickou spolupráci. Práce byla finančně podpořena účelovými prostředky Výzkumného záměru MO0FVZ0000501. Literatura 1. BAJGAR, J. Organophosphate/nerve agent poisoning: mechanism of action, diagnosis, prophylaxis and treatment. Adv. Clin. Chem., 1996, vol. 38, p. 151 216. 2. CABAL, J. BAJGAR, J. Tabun návrat po padesáti letech. Chem. Listy, 1999, roč. 93, s. 27 31. 3. CABAL, J. KUČA, K. KASSA, J. Specification of the structure of oximes able to reactivate tabun inhibited acetylcholinesterase. Pharmacol. Toxicol., 2004, vol. 95, p. 81 86. 4. CASSEL, G. KARLSSON, L. WAARA, L., et al. Pharmacokinetics and effects of HI-6 in blood and brain of soman-intoxicated rats: a microdialysis study. Eur. J. Pharmacol., 1997, vol. 332, p. 43 52. 5. CLEMENT, JG. SHILOFF, JD. GENNINGS, C. Efficacy of a combination of acetylcholinesterase reactivators, HI-6 and obidoxime, against tabun and soman poisoning of mice. Arch. Toxicol., 1987, vol. 61, p. 70 75. 6. DAWSON, RM. Review of oximes available for treatment of nerve agent poisoning. J. Appl. Toxicol., 1994, vol. 14, p. 317 331. 7. EKSTRÖM, F. AKFUR, C. TUNEMALM, AK., et al. Structural changes of phenylalanine 338 and histidine 447 revealed by the crystal structures of tabun-inhibited murine acetylcholinesterase. Biochemistry, 2006, vol. 45, p. 74 81. 8. FRANTIK, E. HORNYCHOVA, M. Clustering of neurobehavioral measures of toxicity. Homeostasis, 1995, vol. 36, p. 19 25. 9. JOKANOVIC, M. MAKSIMOVIC, M. KILIBARDA, V., et al. Oxime-induced reactivation of acetylcholinesterase inhibited by phosphoramidates. Toxicol. Lett., 1996, vol. 85, no. 1, p. 35 39. 10. KASSA, J. Comparison of two oximes (HI-6 and obidoxime) in soman poisoning in rats. Toxicology, 1995, vol. 101, p. 167 174. 11. KASSA, J. Review of oximes in the antidotal treatment of poisoning by organophosphorus nerve agents. J. Toxicol. Clin. Toxicol., 2002, vol. 40, p. 803 816. 12. KASSA, J. KARASOVA, J. BAJGAR, J., et al. A comparison of the reactivating and therapeutic efficacy of newly developed bispyridinium oximes (K250, K251) with commonly used oximes against tabun in rats and mice. J. Enz. Inhib. Med. Chem., 2009, vol. 24, p. 1040 1044. 13. KUCA, K. JUN, D. MUSILEK, K. Structural requirements of acetylcholinesterase reactivators. Mini Rev. Med. Chem., 2006, vol. 6, p. 269 277. 14. MARRS, TC. Organophosphate poisoning. Pharmacol. Ther., 1993, vol. 58, p. 51 66. 15. MOSER, VC. TILSON, H. MCPHAIL, RC., et al. The IPCS collaborative study on neurobehavioral screening methods: II. Protocol design and testing procedures. Neurotoxicology, 1997, vol. 18, p. 929 938. 16. MUSILEK, K. HOLAS, O. JUN, D., et al. Monooxime reactivators of acetylcholinesterase with (E)-but-2- -ene linker Preparation and reactivation of tabun and paraoxon-inhibited acetylcholinesterase. Bioorg. Med. Chem., 2007, vol. 15, p. 6733 6741. 17. ROUSSEAUX, CG. DUA, AK. Pharmacology of HI-6, an H series oxime. Can. J. Physiol. Pharmacol., 1989, vol. 67, p. 1183 1189. 18. SAKURADA, K. MATSUBARA, K. SHIMIZU, K., et al. Pralidoxime iodide (2-PAM) penetrates across the blood- -brain barrier. Neurochem. Res., 2003, vol. 28, p. 1401 1407. 19. TALLARIDA, R. MURRAY, R. Manual of Pharmacological Calculation with Computer Programs. Springer- -Verlag, New York, 1987. 145 p. 20. TAYLOR, P. Anticholinesterase agents. In HARDMAN, JG. LIMBIRD, LE. (eds). The Pharmacological Basis of Therapeutics. 9 th ed. New York, McGraw Hill, 1996, p. 161 176. 21. WOREK, F. WIDMANN, R. KNOPFF, O., et al. Reactivation potency of obidoxime, pralidoxime, HI-6 and HLö-7 in human erythrocyte acetylcholinesterase inhibited by highly toxic organophosphorus compounds. Arch. Toxicol., 1998, vol. 72, no. 4, p. 237 243. Korespondence: Plk. prof. MUDr. Jiří Kassa, CSc. Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Katedra toxikologie Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové e-mail: kassa@pmfhk.cz Do redakce došlo 31. 3. 2009

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 9 KOLORIMETRICKÉ DETEKTORY ZALOŽENÉ NA ACETYLCHOLINESTERASE A JEJICH KONSTRUKCE 1, 2 Miroslav POHANKA, 3 Vítězslav VLČEK, 2 Jana ŽĎÁROVÁ KARASOVÁ, 1, 2 Kamil KUČA, 2 Jiří CABAL 1 Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, Centrum pokročilých studií, Hradec Králové 2 Univerzita obrany, Fakulta vojenského zdravotnictví, katedra toxikologie, Hradec Králové 3 Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, Agronomická fakulta, Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin, Brno Souhrn Kolorimetrické detektory založené na rekogniční schopnosti acetylcholinesterasy (AChE) jsou vhodným nástrojem pro rychlou a přitom vysoce senzitivní detekci nervově paralytických látek a některých pesticidů založené na inhibici AChE. V tomto přehledovém článku jsou nastíněny základní biochemické metody vhodné pro kolorimetrické stanovení aktivity AChE. Zároveň jsou popsány matrice vhodné pro konstrukci vlastních průkazníků a chemické i fyzikální metody vazby AChE na jejich povrch. Detehit a ChP-71 jsou uvedeny jako typické kolorimetrické detektory pro stanovení nervově paralytických látek. Klíčová slova: Kolorimetrie; Nervově paralytická látka; Acetylcholinesterasa; Průkazník; Detektor. Colorimetric Detectors Based on Acetylcholinesterase and Its Construction Summary Colorimetric detectors based on recognition capability of acetylcholinesterase (AChE) are a suitable tool for fast but sensitive detection of nerve agents and some pesticides based on AChE inhibition. In this review article, basic biochemical methods appropriate for colorimetric estimation of AChE enzymatic activity are presented. Moreover, the available matrices suitable for construction of dipsticks and chemical as well as physical immobilization protocols for AChE binding on matrice surface are described, too. Detehit and ChP-71 are indicated as typical colorimetric detectors for assay of nerve agents. Key words: Colorimetry; Nerve agents; Acetylcholinesterase; Dipstick; Detector. Úvod Pro stanovení přítomnosti nervově paralytických látek (NPL) a některých neurotoxických organofosfátových pesticidů (OP) jsou dlouhodobě využívány enzymy acetylcholinesterasa (AChE; EC 3.1.1.7.) a butyrylcholinesterasa (BChE; EC 3.1.1.8). Enzym acetylcholinesterasa se in natura podílí na cholinergní neurotransmisi. Jeho konkrétní úloha je hydrolýza neurotransmiteru acetylcholinu na cholin a octovou kyselinu v neurosynaptické štěrbině a tím ukončení působení na cholinergní receptory (9). Ve větší míře se AChE rovněž nachází na povrchu krevních buněk, kde se podílí na neuroendokrinní regulaci některých procesů. Význam butyrylcholinesterasy není tak snadno definovatelný, jako je tomu v případě acetylcholinesterasy. V minulosti se nazývala plazmatická cholinesterasa díky faktu, že AChE je na povrchu krevních buněk a po centrifugaci krve zůstává v plazmě pouze BChE. Zatímco acetylcholinesterasa je pojmenována po nativním substrátu, přirozený substrát butyrylcholinesterasy se nepodařilo dosud nalézt a butyrylcholin je jen alternativní substrát. Možné vysvětlení fyziologické funkce BChE v organismu je v detoxikaci některých přírodních toxinů. Butyrylcholinesterasa se dříve využívala z důvodu snadnější izolace z krve. Má však nižší číslo přeměny substrátu a pro analytické účely se dnes využívá acetylcholinesterasa. Jak AChE, tak i BChE jsou tzv. serinové hydrolázy. V aktivním centru obsahují hydrolyticky aktivní serin, který je zároveň selektivně a ireverzibilně esterifikován nervově paralytickými látkami a organofosfátovými pesticidy, především v tzv. oxoformě (4). Dostupné detektory založené na acetylcholinesterase Pro sledování aktivity acetylcholinesterasy bylo v minulosti navrženo několik metod. Dvě z nich se zdají být nejperspektivnější a nalezly širší uplatnění. V Armádě České republiky jsou především 2 typy detekčních instrumentů založených na AChE

10 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 a sledování její aktivity Ellmanovou metodou. Prvním detektorem je Chemický průkazník (ChP) 71 (obr. 1), resp. jeho modifikace vzor 05. Obě verze ChP jsou schopny semikvantitativního hodnocení přítomnosti nervově paralytických látek (a jiných látek podle typu trubičky) v okolním prostředí za pomoci detekčních trubiček s vázanou AChE. Druhým dostupným instrumentem je průkazníkový papírek Detehit. V minulosti byly zařazeny i různé poloautomatické systémy. V současné době je používán například plně automatický signalizátor GSA. Další alternativou je použití indoxylacetátu či jeho derivátů. Výhodou této metody je ostřejší barevný přechod, nevýhodou je pak pomalejší konverze indoxylacetátu acetylcholinesterasou. Jednoduchý průkazník založený na tomto principu dodává např. Neogen Corporation (Lansing, Michigan, USA). Pro úplnost lze zmínit, že v dnešní době jsou převažujícími zařízeními pro rychlé stanovení nervově paralytických látek přenosné hmotnostní spektrometry. Komerčně dostupným zařízením jsou např. hmotnostní spektrometry RAID-1, RAID-M, RAID-S a RAID-E od společnosti Bruker Daltonics. Tyto přístroje porovnávají spektra získaná měřením neznámých vzorků se spektry z uložených standardů. Výhodou hmotnostních spektrometrů je lepší reprodukovatelnost měření, protože jsou méně ovlivňovány skladovacími podmínkami ve srovnání s detektory obsahujícími biorekogniční makromolekuly. V neprospěch hmotnostní spektrometrie však hovoří vyšší pořizovací cena a problematické stanovení méně známých toxických derivátů, jejichž spektrum není uloženo v databázi. Obr. 1: Fotografie Chemického průkazníku 71. V levé části je balení trubiček pro stanovení nervově paralytických látek a dále detail vlastní trubičky. a b c d Obr. 2: Průkazník nervově paralytických látek Detehit. Význam symbolů: a tuba obsahující balené průkazníky a návod, b detekční tkanina průkazníku s vázanou AChE, c žlutý etalon, d indikační papír Možnosti kolorimetrického stanovení aktivity acetylcholinesterasy Princip stanovení nervově paralytických látek jak ChP, tak i přípravkem Detehit je totožné. Jedná se o modifikovanou Ellmanovu metodu vyobrazenou v obr. 3. Tato reakce byla v minulosti zavedena především pro stanovení aktivity AChE v krvi a díky tomu byla klinicky diagnostikována intoxikace NPL či OP, následně byla tato metoda shledána vhodnou i pro rychlé stanovení přítomnosti nervově paralytických látek. Mechanismus reakce je popsán následovně: substrát acetylthiocholin (alter-

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 11 O N + S AChE N + SH CH 3 COOH HOOC COOH O 2 N S S NO 2 HOOC COOH O 2 N S S N + - S NO 2 H + Obr. 3: Sledování aktivity acetylcholinesterasy (AChE) Ellmanovou metodou. nativní substrát fyziologickému acetylcholinu) je hydrolyzován na octovou kyselinu a thiocholin. Thiocholin reaguje s 5,5 - dithiobis-(2-nitrobenzoovou) kyselinou za vzniku 2-nitro-5-thiobenzoové kyseliny. Reakce se projevuje vznikem žlutého zbarvení spektrofotometricky měřitelného při 412 nm bez jakékoli další časové prodlevy nebo dalších fyzikálních zásahů. Tato reakce je blokována v přítomnosti nervově paralytické látky inhibicí AChE. Pro sledování aktivity AChE lze použít i jiný chromogen než Ellmanovo činidlo. V literatuře jsou často zmiňovány indofenol acetát, 2,6-dichloroindofenyl acetát, β-naftyl acetát a N-methylindoxyl acetát (8). Praktického rozšíření došlo činidlo indoxyl acetát. Tato uvedená činidla na rozdíl od Ellmanova činidla poskytují modré zbarvení. V případě indoxyl acetátu dochází k hydrolýze indoxyl acetátu na indoxyl a octovou kyselinu. Indoxyl pak spontánně přechází na indigo dávající roztoku modré zbarvení. Vlastní reakce je vyobrazena jako obr. 4. Pro úplnost lze uvést možnost sledování aktivity cholinesteras pomocí ph indikačního činidla a nativního substrátu acetylcholinu. Uvolněná octová kyselina způsobuje acidifikaci média. Tuto acidifikaci lze kolorimetricky sledovat přidáním vhodného indikačního činidla. Nevýhodou sledování aktivity AChE ph indikačními činidly za účelem stanovení přítomnosti NPL a OP je možná interference kyselých výparů. Zároveň nadměrné množství NPL, respektive OP, může díky spontánní hydrolýze s následnou acidifikací vytvářet falešně pozitivní indikaci aktivní cholinesterasy. Další nevýhodou pak je nemožnost indikace aktivity AChE v silně pufrujících roztocích. O N H O AChE Obr. 4: Sledování aktivity AChE za použití indoxyl acetátu. Dá se říci, že použití jak Ellmanovy metody, tak indoxyl acetátu je vhodné pro reálné stanovení aktivity cholinesteras. Každá z těchto metod má své přednosti a nevýhody. Hlavní předností Ellmanovy metody je rychlá konverze acetylthiocholinu. Stejné množství AChE způsobuje přibližně desetkrát pomalejší konverzi indoxyl acetátu ve srovnání s acetylthiocholinem. Na druhou stranu i Ellmanova metoda má značná úskalí. Především N H OH N H 2x HO OH HN HO O

12 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 se jedná o značnou interferenci některých látek. Falešně pozitivní reakce může být způsobena thiol obsahujícími molekulami. Například v lidské krvi přítomný glutathion reaguje taktéž s Ellmanovým činidlem. Při vlnové délce 412 nm se rovněž uplatňuje interference hemoglobinu. V literatuře je také popsána interference léků (antidot) NPL a OP oximů. V reakční směsi způsobují tzv. oximolýzu substrátu poskytující rovněž falešně pozitivní indikaci aktivity AChE. Obecně je předností Ellmanovy metody ve srovnání s indoxyl acetátem větší podobnost acetylthiocholinu s nativním substrátem acetylcholinem. Proto je obecně dávána přednost Ellmanově metodě před indoxyl acetátem při klinických stanoveních aktivit AChE v krvi. Výhodou použití indoxyl acetátu je vizuálně lépe pozorovatelná barevná změna s možnou jak fluorimetrickou, tak i spektrofotometrickou indikací. Pro stanovení NPL a OP byla v minulosti upřednostňována Ellmanova metoda z důvodu menší spotřeby AChE, resp. BChE. V současné době není tato výhoda rozhodující díky levným a čistým komerčně dostupným preparátům AChE. Z výše uvedených faktů vyplývá, že Ellmanova metoda i použití indoxyl acetátu má své přednosti a použití příslušných činidel musí být zváženo pro konkrétní situaci na základě experimentální optimalizace. Nosné matrice používané v detektorech založených na acetylcholinesterase Pro konstrukci kolorimetrických průkazníků se využívá široká škála nosných matricí a tomu odpovídá i množství různých imobilizačních technologií. Obecnými požadavky na nosnou matrici jsou zejména: kompatibilita se vzorkem, tj. vzorek nesmí matrici rozpouštět, extrahovat složky atd. Dalšími požadavky jsou dostatečně velká plocha pro styk se vzorkem, rychlý přístup analytu k rekogničním komponentám díky dostatečné propustnosti, hydrofilní charakter, chemická a tepelná stabilita, mechanická pevnost, odolnost vůči mikrobiálnímu rozkladu, nízká cena apod. V zásadě lze nosné matrice rozdělit do tří velkých skupin: přírodní polymery (polysacharidy, proteiny), syntetické polymery (polystyren, polyakryláty, hydroxylalkyl methakryláty, apod.), anorganické nosiče (minerály, aktivní uhlí, skelná vlákna, porézní oxidy kovů). Přírodní polymery jsou získávány z poměrně pestré škály přírodních zdrojů (dřevní vlákna, odpad z jatek či mikroorganismy), typickými zástupci této skupiny jsou celulóza, příp. papír (6), dextran nebo želatina. Určitou nevýhodou těchto látek je možnost ztráty AChE vymýváním. Ze syntetických polymerů, resp. anorganických nosičů, se nejčastěji využívájí PVC (1), polykarbonáty (11), polyester (2), polyuretan (5), keramika (12), popř. skleněná vlákna či buničinové tkaniny, do nichž se pak AChE zachycuje. Z méně běžných syntetických materiálů můžeme zmínit ve vodě rozpustný polymer AQ 55 (polyester sulfonát od fy Kodak), jehož směs s enzymem je po nakápnutí a zaschnutí na povrchu nosné matrice, možno používat i v přítomnosti organických rozpouštědel. Zajímavou novinkou jsou i tzv. biocers (biologically modified ceramics, biologicky modifikovaná keramika (3), případně uhlíková matrice), založené na modifikovaných nanovláknech, nebo naopak nanopórech (13). Biocers jsou třída nanokompozitů kombinující keramické biokomponenty jako matrici. Mohou být připravovány jako sypký materiál nebo jako povlaky při zamezení kritických podmínek (vysoká teplota, organická rozpouštědla apod.), což by vedlo k denaturaci bílkovin. Detektory založené na těchto nosných matricích často vykazují pozoruhodně nízké limity detekce, nevýhodou těchto matricí je však stále vysoká cena jednotlivých reagencií. Z hlediska výrobní ceny je bezesporu nejzajímavější poslední skupina nosných matricí založených na jednoduché fyzikální sorpci, případně mechanickém zachycení pod tenkou vrstvou matrice. Lze zmínit roztokem enzymu sycený porézní vesměs anorganický nosič, jako je skelná tkanina, sol-gel a skleněná membrána. Vzhledem k předpokládanému jednorázovému použití průkazníku založeného na AChE se zde jedná o optimum poměru cena/výkon. Zachycení acetylcholinesterasy AChE může být imobilizována obdobným způsobem jako většina molekul biologického původu. Při zachycení jakékoli biomolekuly musí být imobilizační procedura korespondující s účelem této imobilizace. Acetylcholinesterasa imobilizovaná za účelem detekce NPL a OP nemusí být zachycena s vysokou afinitou. Tato stanovení jsou jednorázová a v případě pozitivního stanovení obvykle nelze detektor založený na AChE použít opakovaně.

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 13 Pro konstrukci komerčních detektorů jsou ideální především jednokrokové imobilizace, sorpce na povrch nosných matricí a zachycení do stabilních membrán. Z dostupné literatury lze zmínit mechanické zachycení AChE do želatinových (14) nebo celulózových (16) membrán. Známé jsou i složitější imobilizační procedury jako sol-gel techniky a zachycení na nanočástice a magnetické mikročástice (10). Tyto procedury jsou na jednu stranu efektivní, na druhou stranu však zvyšují náklady přípravy jednorázových detektorů. Pro imobilizaci AChE lze využít dobře zdokumentované zachycení na aktivovanou celulózu či stabilizaci fyzikálně sorbované AChE glutaraldehydem. Při těchto imobilizačních procedurách jsou využívány aminoskupiny volně dostupné na povrchu molekuly cholinesterasy. Glutaraldehyd je homo- -bifunkční činidlo kovalentně propojující dvě molekuly cholinesterasy nebo molekulu cholinesterasy s molekulou stabilizujícího proteinu (nejčastěji albuminu) nebo i jiného enzymu, jako je například cholinoxidasa (7). Takto provázané cholinesterasy jsou značně odolné proti vymývání do roztoku. Vazba na celulózu je možná rovněž díky volným aminům. Obecný mechanismus zachycení biomolekuly je uveden v obrázku 5 adaptovaný podle Wang a kol. (15). Před vlastní imobilizací je nutné provést částečnou oxidaci celulózy roztokem jodistanu nebo jiného oxidačního činidla. Vlastní zachycení AChE je chemicky obdobné precipitaci glutaraldehydem. O CH 2 OH OH OH n NaIO 4 Obr. 5: Oxidace celulózy jodistanem sodným a následné navázání biomolekuly. Molekula vody odstupující při kondenzační reakci není znázorněna. O O CH 2 OH O O CH 2 OH NR RNH 2 NR n n Závěr Kolorimetrické průkazníky založené na AChE jsou vhodným a často užívaným nástrojem pro rychlé, levné a vysoce citlivé stanovení přítomnosti nervově paralytických látek a některých, především organofosfátových, pesticidů. Zároveň je možné použít tyto průkazníky i pro stanovení vybraných toxinů přírodního původu. Současné metody konstrukce průkazníků umožňují připravit dostatečně pevně vázaný komplex AChE nosná matrice. Zároveň jsou známy i biochemické metody sledování aktivity AChE pomocí chromogenních substrátů, které jsou cholinesterasou konvertovány s dostatečnou rychlostí. Tato studie popisující základní metody a možnosti konstrukce průkazníků založených na AChE uvádí přehledovou formou znalosti nutné k pochopení problematiky. Literatura 1. ANDREESCU, S. BARTHELMEBS, L. MARTY, JL. Immobilization of acetylcholinesterase on screen-printed electrodes: comparative study between three immobilization methods and applications to the detection of organophosphorus insecticides. Anal. Chim. Acta, 2002, vol. 464, no. 2, p. 171 180. 2. ARDUINI, F. RICCI, F. TUTA, CS., et al. Detection of carbamic and organophosphorous pesticides in water samples using a cholinesterase biosensor based on Prussian Blue-modified screen-printed electrode. Anal. Chim. Acta, 2006 vol. 580, no. 2, p. 155 162. 3. BOTTCHER, H. SOLTMANN, U. MERTIG, M., et al. Biocers: ceramics with incorporated microorganisms for biocatalytic, biosorptive and functional materials development. J. Materials Chemistry, 2004, vol. 14, no. 14, p. 2176 2188. 4. CASIDA, JE. QUISTAD, GB. Serine hydrolase targets of organophosphorus toxicants. Chem. Biol. Interact., 2005, vol. 157, no. 158, p. 277 283. 5. CHO, YA. LEE, HS. CHA, GS., et al. Fabrication of butyrylcholinesterase sensor using polyuretane-based ion- -selective membranes. Biosensors & Bioelectronics, 1999, vol. 14, p. 435 438. 6. CUI, G. KIM, SJ. CHOI, SH., et al. A disposable amperometric sensor screen printed on a nitrocellulose strip: a glucose biosensor employing lead oxide as an interference- -removing agent. Anal. Chem., 2000, vol. 72, no. 8, p. 1925 1929. 7. GUERRIERI, A. MONACI, L. QUINTO, M., et al. A disposable amperometric biosensor for rapid screening of antichoinesterase aktivity in soil extracts. Analyst, 2002, vol. 127, no. 1, p. 5 7. 8. NO, HY. KIM, YA. LEE, YT., et al. Cholinesterasebased dipstick assai for the detection of organophosphate and carbamate pesticides. Anal. Chim. Acta, 2007, vol. 594, no. 1, p. 37 43.

14 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 9. PATOČKA, J. KUČA, K. JUN, D. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase important enzymes of human body. Acta Medica, 2004, vol. 47, no. 4, p. 215 228. 10. POHANKA, M. MUSILEK, K. KUČA, K. Progres sof biosensors based on cholinesterase inhibition. Curr. Med. Chem., 2009, vol. 16, no. 14, p. 1790 1798. 11. SANCHEZ, S. PUMERA, M. CABRUJA, E., et al. Carbon nanotube/polysulfone composite screen-printed electrochemical enzyme biosensors. Analyst, 2007, vol. 132, no. 2, p. 142 147. 12. SANTHA, H. DOBAY, R. HARSANYI, G. Amperometric uric acid biosensors fabricated of various types of uricase enzymes. IEEE Sensors J., 2003 vol. 3, no. 3, p. 282 287. 13. SOTIROPOULOU, S. CHANIOTAKIS, NA. Lowering the detection limit of the acetylcholinesterase biosensor using a nanoporous carbon matrix. Anal. Chim. Acta, 2005, vol. 530, no. 2, p. 199 204. 14. TIMUR, S. TELEFONCU, A. Acetylcholinesterase (AChE) electrodes based on gelatin and chitosan matrices for the pesticide detection. Artif. Cell Blood Substit. Immobil. Biotechnol., 2004, vol. 32, no. 3, p. 427 442. 15. WANG, S. LI, S. YU, Y. Immobilization of cholesterol oxidase on celulose acetate membráně for free cholesterol biosensor development. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol., 2004, vol. 32, no. 3, p. 413 425. 16. ZHANG, J. LUO, A. LIU, P., et al. Detection of organophosphorus pesticides using potentiometric enzymatic membráně biosensor based on methylcellulose immobilization. Anal. Sci., 2009, vol. 25, no. 4, p. 511 515. Korespondence: Kpt. RNDr. Miroslav Pohanka, Ph.D. Univerzita obrany Fakulta vojenského zdravotnictví Centrum pokročilých studií Třebešská 1575 500 01 Hradec Králové e-mail: rau@atlas.cz pohanka@pmfhk.cz Do redakce došlo 5. 11. 2009

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 15 BETA-AMINOKYSELINY A JEJICH PŘÍRODNÍ BIOLOGICKY AKTIVNÍ DERIVÁTY I. DERIVÁTY ΒETA-ALANINU A ΒETA-LEUCINU Jiří PATOČKA Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Zdravotně sociální fakulta, katedra radiologie a toxikologie, České Budějovice Souhrn Na rozdíl od proteinogenních α-aminokyselin, které jsou základem všech proteinů a enzymů kontrolujících metabolismus v živé materii, většina β-aminokyselin se vyskytuje pouze jako součást omezeného počtu přírodních látek. Jak se zdá, zejména bakterie, cyanobakterie, houby a rostliny často imkorporují β-aminokyseliny do svých sekundárních metabolitů. Nejvýznamnějšími β-aminokyselinami jsou β-alanin, β-leucin, β-lysin, β-arginin, β-glutamát, β-phenylalanin a β-tyrosin. Beta-alanin je přírodní aminokyselina, která však není využívána při biosyntéze žádných důležitých proteinů a enzymů. Přesto je β-alanin nejrozšířenější β-aminokyselinou. Byl nalezen u živočichů, rostlin, hub i bakterií, neboť je zabudován do látek jejich primárního i sekundárního metabolismu. U savců je β-alanin součástí přirozeně se vyskytujících dipeptidů karnosinu a anserinu, které jsou důležitými molekulami jejich primárního metabolismu, a také kyseliny pantotenové (vitamin B5), která sama je součástí koenzymu A. Některé sekundární metabolity β-alaninu jsou biologicky velmi aktivní sloučeniny, které byly nejprve nalezeny v rostlinách a suchozemských bakteriích a později, počínaje rokem 1980, v mořských houbách a cyanobakteriích (sinicích), které se staly významným předmětem výzkumu. Tyto organismy velmi často obsahují cyklické a acyklické peptidy a depsipeptidy s neobvyklými aminokyselinani. Přírodní látky se zabudovaným β-alaninem představují substance zajímající jak akademické, tak průmyslové chemiky, farmakology a toxikology. Neobyčejně významné jsou tyto látky pro všechny, kteří se zajímají o bioorganickou a biologickou chemii. Přírodní deriváty β-leucinu jsou méně početné, ale četné nálezy B12-dependentní 2,3-aminomutáz u bakterií, rostlin i savců podporují myšlenku většího rozšíření přírodních látek s β-leucinovým motivem. Klíčová slova: Beta-alanin; Přírodní látky; Anserin; Karnosin; Barangamid; Destruxin; Kryptofycin; Leualacin; Leucinostatin; Theonellamid; Theonellapeptolid; Yanucamid. Beta-Amino Acids and Their Natural Biologically Active Derivatives. I. Derivatives of Beta-Alanine and Beta-Leucine Summary Contrary to proteinogenic α-amino acids that are constituents of all proteins and enzymes which control the metabolism in living matter, most β-amino acids only occur as constituents of distinct natural compounds. Apparently, bacteria, cyanobacteria, fungi, and plants often incorporate β-amino acids into secondary metabolites. The most important β-amino acids are β-alanine, β-leucine, β-lysine, β-arginine, β-glutamate, β-phenylalanine and β-tyrosine. Beta-alanine is a naturally occurring amino acid which is not used in the biosynthesis of any major proteins or enzymes. Beta-Alanine is the most widespread of all β-amino acids. It has been found in animals, plants, fungi, and bacteria because it is incorporated in compounds of the primary and secondary metabolism. In mammals, β-alanine is a component of the naturally occurring dipeptides carnosine and anserine which are important molecules of their primary metabolism and also of pantothenic acid (vitamin B5) which itself is a component of coenzyme A. Multiple secondary metabolites of β-alanine are biologically very active compounds which were primarily found in plants and terrestrial bacteria and later, starting with the 1980s, in marine sponges and cyanobacteria which became important subjects of investigation. These organisms often contain cyclic and acyclic peptides and depsipeptides with unusual amino acid moieties. Natural compounds with incorporated β-alanine represent substances of interest to both academic and industrial chemists, pharmacologists, and toxicologists. Exceedingly important are these compounds for all who are interested in bioorganic and biological chemistry. Beta-Leucine natural derivatives are less numerous but finding of B12-dependent 2,3-aminomutase in bacteria, plants, and mammals provides an idea of better spread compounds with β-leucine moiety in nature. Key words: Beta-Alanine; Beta-Leucine; Natural compounds; Anserine; Carnosine; Barangamide; Destruxin; Cryptophycine; Leualacine; Leucinostatin; Theonellamide; Theonellapeptolide; Yanucamide.

16 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 Úvod Jako β-aminokyseliny jsou označovány organické karboxylové kyseliny, jejichž aminoskupina je vázána na druhém atomu uhlíku počítáno od karboxylové (COOH) skupiny. Na rozdíl od α-aminokyselin, které jsou pravidelnou součástí všech proteinů, β-aminokyseliny se v těchto biomakromolekulách objevují jen zcela mimořádně. Jsou však poměrně časté v některých dalších přírodních látkách, jako např. v peptidech, cyklopeptidech, depsipeptidech, glykopeptidech, alkaloidech a terpenoidech. Zejména bakterie, cyanobakterie (sinice), houby a rostliny často inkorporují β-aminokyseliny do svých sekundárních metabolitů, které slouží jako ochranné faktory v konkurenčním boji s ostatními organismy. Proto tyto látky obvykle vykazují vysokou biologickou a fyziologickou aktivitu, jež je často založena právě na substruktuře přítomné β-aminokyseliny. Mnohé tyto molekuly představují potenciální léky nebo mohou být modelovými strukturami pro vývoj léků nových. Biosyntéza β-aminokyselin probíhá tak, že aminoskupina proteinogenní L-α-aminokyseliny je účinkem specifické 2,3-aminomutázy přesunuta z pozice 2 do pozice 3 a vznikne odpovídající β-aminokyselina. 2,3-aminomutázy náleží do velké skupiny tzv. SAM-enzymů, v nichž figuruje jako koenzym S-adenosylmethionin (SAM) (7). Časté jsou také případy, kdy zabudováním β-aminokyseliny za přirozenou α-aminokyselinu do molekuly peptidu při jeho syntéze v laboratoři se dosáhne zvýšení jeho stability snížením degradace savčími peptidázami. Použití β-aminokyselin v peptidové syntéze je proto významnou metodou jak připravit biologicky aktivní produkty odolné biodegradaci (48) či s poněkud jinými vlastnostmi (37, 38). Inkorporace β-aminokyseliny do molekuly antibiotika zvyšuje jeho odolnost vůči bakteriálním peptidázám. Nejčastěji se vyskytujícími β-aminokyselinami v přírodních produktech jsou β-alanin, β-leucin, β-lysin, β-arginin, β-glutamová kyselina, β-glutamin, β-fenylalanin a β-tyrosin. Tento přehled je věnován derivátům β-alaninu a β-leucinu. Deriváty β-alaninu Beta-alanin (I) (obr. 1) je v přírodě vůbec nejrozšířenější β-aminokyselinou (3-aminopropionová kyselina). Byl nalezen u živočichů, rostlin, hub i bakterií a často je inkorporován do látek jejich primárního metabolismu. Například koenzym A, esenciální kofaktor všech organismů a jedna z nejdůležitějších molekul živé hmoty, obsahuje ve své molekule β-alanin. U savců byl β-alanin objeven i ve volné formě jako výsledek katabolismu uracilu. U některých rostlin (Plumbaginaceae, čeleď olověncovité) zase betain β-alaninu (N,N,N--trimethyl-β-alanin) funguje jako osmoprotektant, který chrání rostlinu před osmotickým stresem, stabilizuje terciární strukturu bílkovin a podílí se rovněž na odstraňování reaktivních forem kyslíku (39). Obr. 1: Chemické strukturní vzorce β-alaninu (I), β-n--methylaminoalaninu (II), dvou β-alaninových dipeptidů anserinu (III) a karnosinu (IV) a cyklických undekapeptidů barangamidů (V): Barangamid A (R 1 = R 2 = R 3 = Et), barangamid B (R 1 = R 2 = Et, R 3 = Me), barangamid C (R 1 = R 3 = Et, R 2 = Me), barangamid D (R 1 = Me, R 2 = R 3 = Et). Důležitými přírodními deriváty β-alaninu jsou zejména β-methylamino-alanin, anserin a karnosin, barangamidy, destruxiny, některé kryptofyciny, leualacin, leucinostatiny, theonellamidy a theonellapeptolidy. Mezi přírodní deriváty β-alaninu můžeme zařadit také physariginy, žluté pigmenty izolované z myxomycety Physarum rigidum (31).

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 17 Beta-N-methylamino-alanin (BMAA) BMAA (II) (obr. 1) je neurotoxin nalezený v semenech cykasů (Cycas circinalis), který je produkován cyanobakteriemi rodu Nostoc žijícími na jejich kořenech (3). Toxin je zřejmě zodpovědný za vznik amyotrofní laterální sklerózy (ALS), jejíž vysoká incidence byla zaznamenána zejména na ostrově Guam mezi domorodci kmene Chamorro (47), pro něž je cykas zdrojem potravy. Ze škrobovitého středu kmene (tzv. ságo), případně semen, připravují placky. Otrava BMAA je spojena se vznikem demence podobné Parkinsonově nemoci (amyotrophic lateral sclerosis associated with a Parkinson s disease-like dementia complex ALS-PDC) (21). Jedovaté jdou všechny části cykasů a otrava může být i smrtelná. Cyanobakterie v kořenech cykasů produkují vedle neurotoxicky účinného BMAA, který se ukládá zejména v semenech, ještě další jed, který produkují všechny cykasy, a tím je cykasin. Jedná se o glykosid methylazoxymethanolu, který je hepatotoxický, neurotoxický a karcinogenní pro člověka i zvířata. Před konzumací potravy z cykasů je zapotřebí tyto jedy odstranit propíráním či fermentací. BMAA poškozuje neurony a způsobuje jejich smrt (43) tím, že indukuje oxidativní stres (28). Selektivně pak ničí motorické neurony tím, že aktivuje AMPA/kainátové receptory (40). Anserin a karnosin Dipeptidy anserin (III) (β-alanyl-3-n-methyl-lhistidin) a karnosin (IV) (β-alanyl-l-histidin) (obr. 1), spolu s homokarnosinem (γ-aminobutyryl-l-histidin) jsou u savců mimo jiné významnými scavengery volných radikálů. Tyto strukturně blízké histidinové dipeptidy se nacházejí ve vysokých koncentracích ve svalech, ale také v mozku (20). Inhibují velmi účinně vznik hydroxylových radikálů generovaných superoxid-dismutázovým systémem (18) jakož i ostatních volných radikálů (1), a zpomalují tak procesy stárnutí (13). Významnou úlohu pravděpodobně hrají také v přenosu nervového vzruchu v některých částech mozku (35), např. v neuronech bulbus olfactorius (44). Tyto peptidy vykazují afinitu k histaminovým receptorům a také k receptorům γ-aminomáselné kyseliny (GABA) a mohly by mít vztah k panické poruše vyvolané nedostatkem GABA v okcipitální kůře mozku (8). Anserin je ve vysoké koncentraci obsažen zejména ve svalových buňkách ptáků (lat. anser = husa) a ryb, karnosin zejména ve svalech savců. Podáváním karnosinu a anserinu či ještě lépe perorálním podáváním kombinace β-alaninu a L-histidinu lze dosáhnout nárůstu svalové hmoty a u sportovců zlepšení jejich výkonu (14, 49). Tyto látky tvoří podstatnou část různých potravinových doplňků a přípravků pro výživu sportovců. Barangamidy Barangamidy (V) jsou cyklické peptidy o 11 aminokyselinách. Tři z těchto aminokyselin tvoří β-alanin a další tři jsou N-methylované aminokyseliny. Barangamid A byl izolován z mořské houby Theonela swinhoei nalezené v Indonésii u ostrova Baranglompo, který dal substanci jméno (42). Na rozdíl od imunosupresivně účinných theonellapeptolidů, které jsou v houbě také přítomny, je barangamid A v tomto směru inaktivní (41). Další izosterní barangamidy (B až D) byly izolovány ze stejného biologického zdroje. Jejich cyklický polypeptidový skelet je stejný a jednotlivé látky se liší jen v podrobnostech (obr. 1). Obr. 2: Chemické strukturní vzorce destruxinů (VI), cyklohexadepsipeptidů z entomopatogenní houby Metarrhizium anisopliae (Destruxin A: R 1 = CH2CH=CH2, R 2 = H, R 3 = Et; destruxin B: R 1 = CH2CH(CH3)CH2OH, R 2 = H, R 3 = Et; destruxin E: R 1 = CH2-CH2(O)CH2, R 2 = H, R 3 = Et; roseotoxin B: R 1 = = CH2CH=CH2, R 2 = Me, R 3 = ipr; roseokardin: R 1 = CH2- -CH(CH3)2, R 2 = Me, R 3 = ipr), kryptofycinů (VII), cyklopentadepsidů cyanobakteri (Kryptofycin-1: R 1 = Me, R 2 = H, R 3 = Cl; kryptofycin-24: R 1 = R 2 = R 3 = H; kryptofycin-52: R 1 = = R 2 = Me, R 3 = Cl) a leualacinu (VIII), cyklického depsipeptidu z askomycety Hapsidospora irregularis Destruxiny Destruxiny (VI) (A, B a E) (obr. 2) byly poprvé izolovány z entomopatogenní houby Metarrhizium anisopliae (dřívější jméno Oospora destructor) roku

18 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 1961 (24) jako látky toxické pro hmyz. Destruxiny jsou cyklické hexadepsipeptidy, které se chovají jako antagonisté napěťově řízených kalciových kanálů a aktivují influx kalcia v hmyzím skeletárním svalstvu (2). Podobných cyklohexadepsipetidů byla z různých entomopatogenních hub izolována celá řada a v poslední době jsou tyto látky intenzivně studovány jako potenciální ekologicky přívětivé biopesticidy (17, 27). Do stejné skupiny cyklohexapeptidů s motivem β-alaninu v molekule patří dále např. roseokardin B nebo roseokardin (51), jejichž chemická struktura i biologická aktivita je destruxinům velmi podobná (56). Kryptofyciny Kryptofyciny (VII) tvoří početnou skupinu strukturně podobných látek (obr. 2) produkovaných cyanobakteriemi (55). Jedná se o 16-členné makrocyklické depsipeptidy, pro něž je charakteristická přítom- nost oxiranového cyklu v molekule (obr. 4). Mají schopnost interagovat s tubulinem (6) a vykazují protinádorovou aktivitu in vitro i in vivo (26). Kryptofyciny zasahují do dynamiky buněčného cytoskeletu a patří do velké skupiny inhibitorů mikrotubulů (36), které již delší dobu mají své pevné místo v terapii rakoviny. Leualacin Leualacin (VIII) je cyklický depsipentapeptid (obr. 2), který byl izolován z askomycety Hapsidospora irregularis (12). Látka se chová jako blokátor kalciových kanálů (11) a má silný vazodilatační účinek. Jeho synteticky připravený amid je vazodilatačně ještě účinnější a navíc silně inhibuje agregaci krevních destiček vyvolanou kolagenem (IC 50 = 0,6 µm) nebo kyselinou arachidonovou (IC 50 = 2,0 µm) (16). Obr. 3: Chemické strukturní vzorce peptidických antibiotik leucinostatinů (IX) (Leucinostatin A: R 1 = CH(OH)CH2COCH2CH3, R 2 = Me; R 1 = = CH(OH)CH2COCH2CH3, R 2 = H; leucinostatin C: R 1 = R 2 = H; leucinostatin D: R 1 = H, R 2 = Me) a bicyklických peptidů z rodiny theonellamidů (X) (Theopalauamid: R = H; theonellamid A: R = OH).

ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY 19 Obr. 4: Chemická struktura theonellapeptolidu-id, zástupce depsipeptidů z rodiny theonellapeptolidů a dvou malých cyklických depsipeptidů z rodiny yanucamidů (yanucamid A: R = H; yanucamid B: R = Me). Leucinostatiny Leucinostatiny (IX) tvoří skupinu peptidických antibiotik produkovanou saprofytickými houbami Paecilomyces lilacinus a P. marquandii (32). Tyto lineární hydrofobní nonapeptidy (obr. 3) fungují jako ionofory pro mono- a divalentní ionty (4) a vykazují antimikrobiální a antitumorovou aktivitu (19). Jsou účinné proti některým penicilin-rezistentním kmenům gram-pozitivních bakterií (např. Staphylococcus aureus), ale jsou bohužel příliš toxické pro savce. Letální dávka LD 50 pro myš při intraperitoneálním podání je 1,8 mg/kg a při perorálním podání 5,4 mg/kg (29). Theonellamidy Theonellamidy (X) jsou bicyklické peptidy, které mají ve své molekule amidickou skupinu (obr. 3). Theonellamid A je hydroxyderivátem jiného bicyklického peptidu, theopalauamidu. Oba jsou představiteli nové skupiny látek vážících steroly (15). Theonellamid F, pro který je charakteristická přítomnost neobvyklé aminokyseliny, (2S,4R)-2-amino-4-hydroxyadipové, byl izolován (53) z mořské houby Theonella sp. jako bicyklický peptid s antifungicidní a cytotoxickou aktivitou. Toxický účinek theonellamidů je vysvětlován jejich schopností způsobovat vakuolizaci buněk (53). V těchto vakuolách se zvyšuje koncentrace vodíkových iontů, což vede k zániku buňky (52). Theonellapeptolidy Mořské houby rodu Theonella jsou nevyčerpatelným zdrojem nových biologicky aktivních látek. Jejich produktem jsou i theonellapeptolidy izolované z houby T. swihoei, která obývá korálové útesy ostrova Okinawy. Název peptolid je méně častým označením pro depsipeptid či peptidový lakton (34). Jsou to obvykle cyklické peptidy, v nichž alespoň jedna z peptidických vazeb je nahrazena vazbou esterovou. Ta je realizována mezi karboxylem aminokyseliny a hydroxylovou skupinou hydroxyaminokyseliny.

20 VOJENSKÉ ZDRAVOTNICKÉ LISTY ROČNÍK LXXIX, 2010, č. 1 Theonellapeptolidy (XI) jsou vysoce hydrofobní cyklické tridekadepsipeptidy (23). Jejich chemická struktura je po mnoha stránkách zajímavá (obr. 4). Nejenže obsahují hned tři molekuly β-alaninu, ale část aminokyselin je ve formě D-enantiomerů (D- -Leu, D-Ileu, D-Val), na aminovou skupinu koncové aminokyseliny (L-Val) je navázán methoxyacetyl a většina peptidových vazeb je methylována. V současné době je známo již více než tucet těchto látek, které byly nalezeny i v některých dalších druzích mořských hub (50), např. v Lamellomorpha strongylata, která je hojná v okolí Nového Zélandu (25), nebo v Kaliapsis sp. z Indonésie (45). Theonellapeptolidy mají imunosupresivní aktivitu (5) a theonellapeptolidy Ib, Ic, Id a Ie vykazují in vitro silný cytostatický účinek u buněčné linie myší leukémie L1210 (IC 50 = 1,6; 1,3; 2,4, resp. 1,4 µg/ml). Theonellapeptolid Ie inhibuje transport Na + a K + iontů přes membránu a u nezralých oocytů mořské hvězdice Asterina pectinifera vyvolává nevídané morfologické změny díky tomu, že narušuje cytoskeletární F-aktin a vytváří shluky a jakési prstence (33). Theonellapeptolid IId v koncentracích 25 mg/ml a vyšších brání fertilizaci vajíček mořského ježka Hemicentrotus pulcherrimus, ale nemá žádný vliv na časný embryonální vývoj až do stadia gastruly (22, 23). Deriváty β-leucinu Beta-leucin je v malých množstvích syntetizován i u vyšších organismů (9) z L-α-leucinu účinkem specifické leucin-2,3-aminomutasy, ale jeho úloha není známa. V přírodních derivátech byl β-leucin nalezen v depsipeptidech zvaných yanucamidy. Yanucamidy Yanucamidy A a B (XII) jsou cyklické depsipeptidy izolované z cyanobakterie Lyngbya majuscula a také z cyanobakterií rodu Schizothrix sp. (46). Charakteristická je pro ně přítomnost koncové trojné vazby, která je součástí unikátní 2,2-dimethyl-3- -hydroxy-7-oktynové kyseliny (obr. 4), která byla až dosud v přírodě nalezena pouze jako součást kulolidu-1 a kulokainalidu-1, metabolitů mořského měkkýše Philinopsis speciosa (30). Oba yanucamidy jsou velmi toxické pro krevety (LD 50 = 5 ppm) a pravděpodobně i pro další korýše. Závěr Zdrojem přírodních chemických látek byly po dlouhou dobu zejména rostliny a v menší míře houby a živočichové. Rozvoj lékařské a biologické chemie je velmi úzce spjat s izolováním mnoha přírodních chemických látek a poznáním jejich chemické struktury a jejich biologického účinku. Pomocí moderních separačních metod a metod chemické strukturní analýzy jsou poznávány stále nové a nové substance. Jejich nevyčerpatelným zdrojem se staly bakterie, sinice, řasy, mikromycety i makromycety a zejména pak nejrůznější organismy žijící v moři. Moře a oceány poskytují prostor obrovskému množství rozmanitých organismů, často ještě nepoznaných, a ty jsou zdrojem obrovského množství chemických substancí rozmanitých struktur (10). Chemikům se tak dostávají do rukou zcela nové látky s dosud nepoznanou strukturou a po jejím dešifrování provokují organické syntetiky k jejich přípravě v laboratoři. Farmakologům a toxikologům se dostávají do rukou látky s novými biologickými účinky, od nichž si slibují možnost využití v medicíně. Dochází k nebývalému spojení biologie a chemie, což prospívá oběma vědám. Zpracované téma derivátů β-alaninu představuje jen nepatrný zlomek stále narůstajícího objemu nově objevovaných molekul. V současné době je každoročně popsáno asi jeden milion nových látek, z nichž velká část má svůj původ v přírodě (54). Teprve jejich další výzkum ukáže, zda obohatí jen naše znalosti, či zda také najdou praktické uplatnění v našem životě. Literatura 1. BOLDYREV, AA. STVOLINSKY, SL. TYULINA, OV., et al. Biochemical and physiological evidence that carnosine is an endogenous neuroprotector against free radicals. Cell. Mol. Neurobiol., 1997, vol. 17, no. 2, p. 259 271. 2. BRADFISCH, GA. HARMER, SL. Omega-Conotoxin GVIA and nifedipine inhibit the depolarizing action of the fungi metabolite, destruxin B on muscle from the tobacco budworm (Heliothis virescens). Toxicon, 1990, vol. 28, no. 11, p. 1249 1254. 3. COX, PA. BANACK, SA. MURCH, SJ., et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-n-methylamino-l- -alanine, a neurotoxic amino acid. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 2005, vol. 102, no. 27, p. 5074 5078. 4. CSERMELY, P. RADICS, L. ROSSI, C., et al. The nonapeptide leucinostatin A acts as a weak ionophore and as immunosuppressant on T lymphocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1994, vol. 1221, no. 2, p. 125 132. 5. DEWI, AS. Biologically active secondary metabolites from