Predikční metody "in silico" a softwarové nástroje pro REACH a CLP Ing. Tomáš Novotný (novotny@techemcz.cz), Ing. Zuzana Heřmánková (hermankova@techemcz.cz), TECHEM CZ, s.r.o., Ondříčkova 48, 130 05, Praha 3, Česká Republika Souhrn Rozsáhlé legislativní požadavky vyvolané Nařízením REACH a Nařízením CLP významně zvýšily nároky na provádění testů toxicity a ekotoxicity v Evropě. Vzhledem k časové náročnosti, finanční nákladnosti a především s ohledem na potřebu značného množství laboratorních zvířat k provádění těchto testů jsou vyvíjeny alternativní metody k určování toxicity a ekotoxicity chemických látek. Významnou perspektivní skupinu těchto metod tvoří výpočetní metody, označované jako metody in silico. Výpočetní metody jsou založené na vztahu mezi strukturními vlastnostmi chemických látek a jejich biologickými, potažmo toxikologickými účinky. Tento článek je přehledem metod a přístupů in silico a jejich možností použití pro plnění povinností legislativy REACH a CLP a uvádí praktické příklady v jejich aplikaci. 1. Úvod Dne 1. 6. 2007 vstoupilo v platnost významné evropské chemické nařízení, obecně známé pod akronymem REACH (Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006). Jedním z cílů a důvodů přijetí Nařízení REACH je prohloubit znalosti o nebezpečných vlastnostech jednotlivých chemických látek používaných v rámci Evropské unie. V konečném důsledku by se na evropském trhu neměly vyskytovat látky, jejichž nebezpečné vlastnosti (toxikologické, ekotoxikologické a fyzikálně-chemické) nebyly dostatečně prostudovány, popsány, zhodnoceny a experimentálně prokázány. Experimentální testování toxikologických a ekotoxikologických vlastností všech látek uváděných na trh evropské unie vyžaduje značné množství laboratorních zvířat. V souladu s principy ochrany zvířat je Nařízení REACH koncipováno tak, aby potřebné množství testovacích organismů bylo minimální. Jeden z klíčových principů REACH stanovuje provádění nových studií na obratlovcích pouze jako poslední možnost, nejsou-li ke spolehlivému popisu toxicity a ekotoxicity látek dostatečně průkazné výsledky jiných alternativních metod. Mechanismy vyplývající z Nařízení REACH současně také omezují zdvojování již provedených studií [1]. Z důvodů ochrany laboratorních zvířat je důležité omezit množství prováděných testů tam, kde to není nezbytné a kde je to zdůvodnitelné [2]. Legislativa REACH vyžaduje po průmyslu vyhodnocení toxicity nejen u nových chemických látek, ale i u desítek tisíc existujících chemických látek, které jsou již vyráběny, ale nikdy nebyly předmětem důkladného testování. Dosažení tohoto cíle tradičním experimentálním testováním na zvířatech by trvalo desetiletí, bylo by velice nákladné a bylo by použito mnoho milionů obratlovců. Je proto důležité, že právní předpisy výslovně podporují inovace v hodnocení toxicity a vyžadují využívání existujících dat. V této souvislosti jsou metody in silico potenciálně neocenitelné, protože využívají výpočetních metod k rozšíření stávajících experimentálních dat a mohou být použity pro rychlejší posouzení tisíců chemikálií [3].
2. In silico metody In silico toxikologii lze v širším slova smyslu považovat za "něco, co je možné v toxikologii realizovat s využitím počítače". Existuje mnoho různých typů in silico metod, které byly vyvinuty pro charakterizaci a predikci výsledků testů toxicity chemických látek pro člověka a pro životní prostředí. V současné době se tyto metody již používají i pro regulační účely a lze předpokládat, že v blízké budoucnosti bude jejich role ještě mnohem významnější [4]. Účelem in silico toxikologie je poskytnout techniky pro získání relevantních dat nebo dat pro predikci osudu a účinku chemických látek. V tomto smyslu má výraz in silico shodné použití jako termíny in vitro a in vivo. Existuje samozřejmě mnoho výhod technik in silico, včetně jejich nákladové efektivity, rychlosti ve srovnání s tradičním testováním a snížení počtu potřebných testovacích zvířat [5]. In silico nebo výpočetní toxikologie jsou oblastí s velmi aktivním rozvojem a značným potenciálem [6]. Průmysl v Evropě nyní čelí naléhavé potřebě poskytovat toxikologické údaje o svých stávajících a nových látkách s cílem udržet trh pro své výrobky a podpořit svůj ekonomický zájem. V konečném důsledku by díky legislativě REACH mohlo dojít k situaci, kdy nedostatek údajů o chemických látkách by mohl znemožnit jejich uplatnění na trhu. Pro mnoho osob v chemickém průmyslu je tedy velmi atraktivní možnost využít levnější a rychlejší způsoby hodnocení toxicity [7]. Existuje nejméně sedm důvodů, proč používat in silico metody v rámci REACH [7]: 1. Inovace hodnocení toxicity je podporována právními předpisy REACH, přičemž vývoj alternativních metod je zde uveden jako jeden z hlavních účelů REACH. 2. Čas potřebný pro získání údajů požadovaných dle REACH pro desítky tisíc existujících chemikálií by byl velmi dlouhý. Pokud by byly použity in vivo přístupy, zřejmě by testování trvalo desetiletí. Avšak tam, kde jsou již k dispozici dostatečná experimentální data z in vivo nebo in vitro testů podobných látek, mohou být in silico metody použity pro posouzení tisíců chemikálií, a to v časovém horizontu dnů. 3. V Evropě je v současnosti nedostatek laboratoří schopných provádět in vivo testy u tak velkého počtu látek. Naopak metody in silico mohou být prováděny na běžných kancelářských počítačích, bez nutnosti investic do drahého laboratorního vybavení. 4. Hodnocení pomocí in vivo metod by vyžadovalo náklady v řádech miliard eur. Alternativní metody, zejména metody in silico, jsou řádově levnější variantou. 5. Pokud by byly využívány výhradně metody in vivo, bylo by při hodnocení použito mnoho milionů obratlovců. Alternativní metody mohou snížit nebo v určitých specifických případech i zcela nahradit používání laboratorních zvířat pro testování. 6. In silico metody nabízejí nástroje pro stanovení priorit chemických látek podle jejich předpokládané toxicity. To znamená, že potřebný čas, ekonomické náklady a použití obratlovců mohou být sníženy jednoduše použitím tradičních in vivo testů u těch látek, u kterých je největší pravděpodobnost vysoké toxicity a vyšší riziko nebezpečnosti.
7. Prediktivní schopnost in silico metod umožňuje proaktivní přístup v rámci vývoje produktů a regulační toxikologie. Hodnocení toxicity by mohlo přinést významný růst v oblasti vývoje produktů a rozhodovacích procesech.
3. Typy in silico metod 3.1 SAR a QSAR SAR (Structure-Activity Relationship) je obecným označením metod a modelů pro rozbor a popis kvalitativních vztahů strukturálních vlastností látek a jejich vlivu na fyzikální, chemické či biologické vlastnosti. Ke kvantifikaci těchto vztahů pak slouží metody a modely QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). V obecné rovině jsou SAR a QSAR statistickými modely popisující vztah typicky mezi strukturálními či fyzikálně-chemickými vlastnostmi látky a jejich chemickými vlastnostmi či biologicky účinky. K vytvoření modelů (Q)SAR je využíváno standardních postupů a metod statistiky, vytěžování dat (data mining) a strojového učení. Vytvoření modelu obvykle vyžaduje použití rozsáhlého množství dat a informací o značném počtu chemických látek chemických struktur. Tyto informace pak tvoří trénovací, testovací a validační množinu pro sestavení modelu. Po důkladné validaci a ověření spolehlivosti modelu jsou následně vytvořená pravidla uplatňována na chemickou strukturu, jejíž vlastnosti chceme odhadnout. Nařízení REACH zvlášť označuje přístup read-across (analogický přístup), který je podmnožinou metod (Q)SAR. Jedná se o odvozování vlastností látek na základě vlastností látek strukturně podobných (analogických). Hlavní rozdíl mezi (Q)SAR v obecném slova smyslu a přístupem read-across je to, že modely (Q)SAR jsou často založeny na větším množství chemických látek a jsou obvykle více formalizovány ve svém popisu [8]. 3.2 Read-across (analogický přístup) Přístupem read-across (do češtiny překládaném jako analogický přístup ) je označováno využití dat/informací o určité chemické struktuře a posouzení významu a relevance těchto informací vzhledem k jiné chemické struktuře. Jedná se o postup, při kterém je jedna nebo více vlastností chemické látky odvozena na základě srovnání s chemickou látkou s podobnou strukturou či fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Tento přístup lze aplikovat k posouzení fyzikálně-chemických vlastností, toxicity, osudu látky v životním prostředí či ekotoxicity. Read-across může být provedeno kvalitativně nebo kvantitativně. Kvalitativní přístup read-acrosss je použitím principu SAR (Structure-Activity Relationship), kvantitativní přístup pak za podmnožinu metod QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). Predikce toxicity metodou read-across se opírá o dva klíčové kroky: a) identifikaci strukturně podobné (analogické) látky, či identifikaci chemické substruktury, která je společná pro obě látky (jak pro látku výchozí se známými vlastnostmi, tak pro látku cílovou s neznámými vlastnostmi) b) využití předpokladu, že přítomnost (nebo absence) vlastnosti/účinku pro látky lze odvodit z přítomnosti (nebo absence) vlastnosti/účinku látky strukturně podobné. Tento předpoklad vychází ze základní teorie, že toxikologické, biologické a fyzikálně-chemické vlastnosti látky jsou určeny její strukturou. Na základě tohoto předpokladu lze usoudit, že strukturně
podobné (analogické) látky budou (do určité míry) vykazovat podobné vlastnosti. Klíčovou otázkou pak je zhodnocení vzájemné strukturní podobnosti látek. Výsledkem kvalitativního přístupu read-across je určení pozitivního/negativního (respektive přítomnosti či absence) účinku či vlastnosti (například zda má daná látka senzibilizační účinky, či nemá). Kvantitativní přístup read-across pak tento účinek kvantifikuje (například zjištění hodnoty EC50).
Varianty použití přístupu read-across Přístup read-across může být uplatněn jakýmkoliv ze čtyř následujících způsobů z hlediska počtu výchozích a cílových látek: Jedna na jednu (jedna výchozí látka k odhadu vlastností jedné cílové látky) Více na jednu (dvě nebo více výchozích látek k odhadu vlastností jedné cílové látky) Jedna na více (jedna výchozí látka k odhadu vlastností více cílových látek) Více na více (dvě nebo více výchozích látek k odhadu vlastností více cílových látek) [8] 3.3 Sdružování látek Příloha XI k nařízení REACH umožňuje hodnotit vlastnosti chemických látek pomocí sdružování (např. do chemických kategorií ). Chemickou kategorii představuje skupina chemických látek, jejichž fyzikálně-chemické, toxikologické a ekotoxikologické vlastnosti jsou s největší pravděpodobností velmi podobné nebo sledují určitý pravidelný vzor v důsledku strukturální podobnosti. Na základě tohoto pravidelného předvídatelného vzoru lze u látek sdružených v dané kategorii určit jejich fyzikálně-chemické vlastnosti, osud v životním prostředí, účinky na životní prostředí a účinky na lidské zdraví. Podobnosti chemických látek mohou být založeny na: společné funkční skupině (např. aldehydová, epoxidová, esterová, atd.) vztahující se ke specifické aktivitě společných prekurzorech nebo společných rozkladných produktech při fyzikálních, biologických či chemických procesech, které vedou ke strukturně podobným chemikáliím (např. přístup společné metabolické dráhy při zkoumání příbuzných látek jako například kyselin/esterů/solí) inkrementální a stálé změně v celé kategorii (např. kategorie látek s rostoucí změnou v délce řetězce a výslednou změnou ve vlastnostech těchto látek) Pokud stávající dostupné experimentální výsledky potvrzují, že chemické látky v dané kategorii vykazují shodné nebo předvídatelné vlastnosti, pak lze pro posouzení vlastností chemikálií využít interpolace (nebo v odůvodněných případech i extrapolace) namísto provádění dodatečných laboratorních zkoušek [8]. 3.4 Analýza trendu Analýza trendu může být použita, pokud jednotlivé látky v dané kategorii vykazují pravidelné předvídatelné zvýšení nebo snížení účinku (například konstantní pokles hodnoty LD50 s rostoucí změnou v délce řetězce). Interpolací či extrapolací lze pak predikovat vlastnosti látek v dané kategorii, jež jsou seřazeny podle hodnoty parametru, která determinuje daný účinek (například rozdělovací koeficient oktanol-voda v případě ekotoxicity). Ve statistické terminologii je metoda analýzy trendu lineární regresní analýzou (respektive obvykle spíše multilineární regresní analýzou) a následnou interpolací či extrapolací. Obecně platí, že interpolace je vždy preferována před extrapolací, kterou lze využít jen ve velmi důsledně odůvodněných případech, neboť u extrapolace je vyšší riziko náhlé změny ve sledovaném trendu a tudíž riziko významné odchylky predikce. Interpolace může být
prováděna s vysokou mírou spolehlivosti, zejména pokud je řada známých experimentálních hodnot monotónní (všechny vykazují zvýšení nebo snížení). Důsledná interpretace a zdůvodnění a patřičná obezřetnost při predikci je zapotřebí v případě, že jedna nebo více hodnot jsou vyloučeny z trendu [8].
Na obr. 1 je znázorněno schéma jednotlivých způsobů doplňování chybějících dat pro chemické látky. Chemikálie 1 Chemikálie 2 Chemikálie 3 Chemikálie 4 Vlastnost 1 Vlastnost 2 Vlastnost 3 Vlastnost 4 Aktivita 1 SAR/Read- Across Interpolace Extrapolace QSAR známý datový bod neznámý datový bod Obr. 1: Grafické znázornění způsobů vyplňování chybějících dat (http://ihcp.jrc.ec.europa.eu/our_labs/predictive_toxicology/background/chemicalcategories-and-read-across) 4. Dostupné softwarové nástroje pro praktické využití metod in silico 4.1 OECD (Q)SAR Application TOOLBOX Jedná se o softwarový nástroj vyvinutý pod záštitou OECD distribuovaný jako freeware. QSAR Toolbox je samostatná softwarová aplikace určená pro použití vládními organizacemi a orgány státní správy, chemickým průmyslem a dalšími zúčastněnými stranami k určení chybějících (eko)toxikologických údajů nezbytných pro posouzení nebezpečnosti chemických látek. Jedná se o rozsáhlý databázový systém umožňující analýzu vzájemných vztahů mezi biologickou aktivitou hodnocené látky a stejnou vlastností u jiných příbuzných látek. QSAR Toolbox zahrnuje data z řady databází obsahujících výsledky experimentálních studií. Tento software je vhodný především pro vytváření kategorií strukturně a fyzikálně-chemicky podobných látek. Nejnovější verzí je (Q)SAR Application Toolbox 3.0, která byla vydána v říjnu 2012 [9]. 4.2 EPI SUITE
Tento software je vyvinutý jako freeware agenturou US EPA (US Environmental Protection Agency) a je ve velké míře používaný vládními a průmyslovými organizacemi zejména pro posouzení vlastností nových a stávajících průmyslových chemikálií. Tento software umožňuje predikci zejména fyzikálně-chemických vlastností, ale rovněž i některých ekotoxikologických vlastností chemických látek [9]. 4.3 TOXTREE Toxtree je flexibilní a uživatelsky příjemná open-source aplikace, která rozděluje chemické látky do kategorií a umožňuje predikci různých druhů toxických účinků látek pomocí rozhodovacích stromů. Nejnovější verze (2.5.0) je ze srpna 2011, která zahrnuje mimo jiné i implementace těchto rozhodovacích stromů: Cramerovo klasifikační schéma, Verhaarovo schéma pro určení toxicity pro vodní organismy, rozhodovací strom BfR pro predikci kožní dráždivosti a leptavých účinků na kůži, rozhodovací strom Benigni-Bossa pro predikci mutagenity a karcinogenity, rozhodovací strom START pro predikci persistence/biodegradačního potenciálu [9]. 5. Praktické příklady využití in silico metod Predikce ekotoxicity LC50/96h pro Pimephales promelas (analýza trendu) Nejjednodušším typem predikce vlastnosti chemické látky je analýza trendu. Tato metoda je velmi dobře aplikovatelná na řadu látek, které vykazují určitý pravidelný trend v dané vlastnosti. Nejlepším příkladem, pro který je tato metoda dobře použitelná, jsou homologické řady chemických látek (např. alkoholy, acetáty). Naopak jako nevhodné se jeví skupiny látek obsahující isomery (např. m-xylen, o-xylen, p-xylen). Níže uvedený praktický příklad je ukázkou predikce ekotoxické hodnoty LC50/96h pro Pimephales promelas (Střevle potoční) interpolací (pro acetáty). Na obr. 2 je graficky znázorněna závislost hodnot ekotoxicity LC50/96h pro Pimaphelas promelas na molekulové hmotnosti jednotlivých látek (acetátů), která má exponenciálně klesající charakter. V tabulce a v grafu jsou tučně zvýrazněny známé hodnoty a netučně hodnoty neznámé, tedy predikované. Pro pentyl acetát je výsledná hodnota predikce LC50/96h pro Pimephales promelas 11 mg/l. Data pro všechny látky (acetáty) byla získána z jednoho informačního zdroje z důvodu spolehlivějšího výpočtu. Pro pentyl acetát, heptyl acetát a oktyl acetát nebyly hodnoty z tohoto zdroje dostupné. V jiném informačním však byla nalezena experimentální hodnota LC50/96h pro Pimephales promelas pro pentyl acetát 18 mg/l. V porovnání s tímto zdrojem se predikovaná hodnota příliš neliší [10]. Látka Hodnota LC 50 /96h (mg/l) M (g/mol) Methyl acetát 320 74,08 Ethyl acetát 230 88,11 Propy acetát 60 102,13 Butyl acetát 18 116,16 Pentyl acetát 11 130,19 Hexyl acetát 4 144,21 Heptyl acetát 1,4 158,24 Oktyl acetát 0,5 172,27
Tab. 1: Predikce ekotoxicity LC50/96h pro Pimephales promelas Obr. 2: Analýza trendu pro endpoint ekotoxicita LC50/96h pro Pimaphelas promelas Predikce ekotoxicity LC50/96h pro Pimephales promelas (software EPI SUITE) Analýzou trendu uvedenou v předchozím příkladu byla predikována hodnota ekotoxicity LC50/96h pro Pimephales promelas pro pentyl acetát s výsledkem 11 mg/l. Pro tuto stejnou látku (pentyl acetát) byla provedena predikce ekotoxicity pro ryby pomocí softwarového nástroje EPI SUITE. Jak je patrné z obr. 3 (ve vyznačeném rámečku), výsledná predikovaná hodnota pro pentyl acetát za použití této aplikace činila 11,351 mg/l. Porovnáním obou výsledných predikovaných hodnot ekotoxicity metodou analýzy trendu a pomocí softwarového nástroje EPI SUITE lze dojít k závěru, že obě hodnoty jsou srovnatelné [10].
Obr. 3: Predikce ekotoxicity LC50/96h (Pimephales promelas) pro pentyl acetát pomocí aplikace EPI SUITE Predikce kožní dráždivosti či leptavých účinků pomocí rozhodovacího stromu s využitím aplikace Toxtree Dalším názorným příkladem je klasifikace dráždivosti/žíravosti na kůži pro ethyl akrylát pomocí algoritmu rozhodovacího stromu BfR (vyvinutý speciálně pro potřeby určení kožní dráždivosti dle Nařízení REACH a Nařízení CLP), který je implementován v softwarovém nástroji Toxtree. Aby mohla být určena výsledná klasifikace, je nutné zadat některé parametry dané látky (identifikátor SMILES, bod tání, rozpustnost v tucích, povrchové napětí a tenzi par). Rozhodovací strom na obr. 4 klasifikuje ethyl akrylát jako látku s dráždivými účinky na kůži [10].
Obr. 4: Klasifikace dráždivosti/leptavých účinků na kůži pro ethylacetát metodou rozhodovacího stromu Predikce kožní dráždivosti či leptavých účinků pomocí OECD (Q)SAR Application Toolbox (metoda read-across) Pro predikci kožní dráždivosti či leptavých účinků ethyl akrylátu přístupem read-across na základě analogických látek byl použit software OECD (Q)SAR Application Toolbox. Výpočet nám dává výslednou hodnotu, která odpovídá klasifikaci látky jako dráždivé pro kůži. Výsledná klasifikace pomocí rozhodovacího BfR stromu a read-across metodou je pro ethyl akrylát shodná a shoduje se také s harmonizovanou klasifikací ethyl akrylátu dle Nařízení CLP [10].
Obr. 5: Klasifikace dráždivosti/leptavých účinků na kůži pro ethylacetát metodou read-across 6. Závěr Chemie je důležitou součástí každodenního života. Aby byly interakce s chemickými látkami bezpečné, je nutné znát jejich vlastnosti. Tradiční metody pro určení bezpečnosti chemických látek jsou založeny na laboratorním testování s použitím experimentálních zvířat. Je nicméně velký zájem a značná potřeba rozvoje metod alternativních k tradičnímu testování. Velkou pozornost mezi in silico metodami vyvolal zejména přístup read-across, u něhož se předpokládá, že bude důležitou alternativou k tradičnímu testování na zvířatech pro plnění povinností vyplývajících z Nařízení REACH [11, 12]. Praktické zkušenosti s uplatňováním přístupu read-across byly získány (mimo jiné) v roce 2010 v souvislosti s registrací prvních látek podle Nařízení REACH (látky vyráběné nebo dovážené v množství přesahujícím 1000 t/rok). Možnost využít levnější a rychlejší způsoby hodnocení toxicity je velmi atraktivní zejména pro zástupce průmyslu. Postoj průmyslu k těmto alternativním metodám bezprostředně souvisí s jejich přijetím regulačními orgány [13]. Dne 30. června 2011 Evropská chemická agentura zveřejnila zprávu o používání alternativních metod k testování vlastností látek v souladu s REACH. Pro predikci toxicity látek v první registrační vlně (2010) byl přístup read-across druhým nejčastěji používaným způsobem při vážení důkazů pro určení toxických či ekotoxických vlastností látek. Celkově vzato byla hlášena úspěšná aplikace metod in silico v registračním procesu REACH [14], přičemž je očekáván další prudký rozvoj těchto metod, které mají při implementaci Nařízení REACH sehrát klíčovou roli.
Literatura [1] A. Poth and M. Jaeger: Alternative testing The intelligent way to REACH compliance, AATEX 14, Special Issue, 799-803, Proc. 6th World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences, August 21-25, 2007, Tokyo, Japan. [2] Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006), článek 25, odstavec 1. [3] ECHA: Guidance in a nutshell: Registration data and dossier handling. 2009, 14 & 19. [4] H. Raunio: In Silico Toxicology Non Testing Methods, Front Pharmacol. 2011; 2: 33. [5] M. T. D. Cronin and J. C. Madden: In silico Toxicology An Introduction, School of Pharmacy and Chemistry, Liverpool John Moores University, Byrom Street, Liverpool L3 3AF, UK. [6] R. J. Kavlock, G. Ankley, J. Blancato, M. Breen, R. Conolly, D. Dix, K. Houck, E. Hubal, R. Judson, J. Rabinowitz, A. Richard, R. Setzer R., I. Shah, D. Villeneuve, E. Weber: Computational toxicology-a state of the science mini review. Toxicol. Sci. 103, 14 27, (2008). [7] E. Benfenati, R. G. Diaza, A. Cassano, S. Pardoe, G. Gini, C. Mays, R. Knauf and L. Benighaus: The acceptance of in silico models for REACH: Requirements, barriers, and perspectives, Chemistry Central Journal 2011, 5:58. [8] G. Patlewicz: Chemical Categories and Read Across, EUROPEAN COMMISSION DIRECTORATE GENERAL JOINT RESEARCH CENTRE, Institute for Health and Consumer Protection Toxicology and Chemical Substances Unit European Chemicals Bureau, I- 21020 Ispra (VA) Italy, 2005 EUR 21898 EN [9] M. F. Gatnik and A. Worth: Review of Software Tools for Toxicity Prediction, JRC Scientific and Technical Report, EUR 24489 EN 2010 [10] TECHEM CZ: Závěrečná zpráva o řešení programového projektu programu výzkumu a vývoj MPO: Výzkum predikčních metod hodnocení nebezpečných vlastností chemických látek (2012) [11] G. Schaafsma, E. D. Kroese, E. L. P. J. Tielemans, J. J. M. Van de Sandt, C. J. Van Leeuwen: REACH, non-testing approaches and the urgent need for a change in mind set. Regul. Toxicol. Pharmacol. 53 (1), 70 80, 2009. [12] EC, 2006. Regulation (EC) No. 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No. 793/93 and Commission Regulation (EC) No. 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. Off. J. Eur. Union, L396/1 of 30.12.2006. Commission of the European Communities. [13] L. Bassan, A. Worth, qsar Comb Sci., 27, pp. 6-20 (2008).
[14] H. Spielmann, U. G. Sauer and O. Mekenyan: A Critical Evaluation of the 2011 ECHA Reports on Compliance with the REACH and CLP Regulations and on the Use of Alternatives to Testing on Animals for Compliance with the REACH Regulation, ATLA 39, 481 493, 2011.