Buňka V Jádro. Buněčný cyklus a buněčné dělení (mitosa). Ústav histologie a embryologie 1. LF UK Autor: doc. MUDr. Tomáš Kučera, Ph.D. Předmět: Obecná histologie a obecná embryologie, kód B02241 Datum: 14.10.2013
JÁDRO NUCLEUS Membránou ohraničený kompartment - obsahuje genetickou informaci Různý počet, velikost a nukleo-plasmový poměr Syncytia
Jádro v interfázi - chromatin (komplex DNA a proteiny), jadérko (nucleolus), jaderný obal jaderná matrix (nukleoplasma) nukleoskelet Jaderný obal -dvě membrány, perinukleární cisterna, jaderné póry, fibrózní lamina (laminy, k fibrózní lamině připojené chromosomy) Jadérko - místo syntézy rrna a tvorby ribosomových podjednotek nukleolární organizátor (sekvence bazí DNA kódujících rrna), pars fibrosa (iniciální ribonukleoproteinová vlákna), pars granulosa (dozrávající ribosomy),
BUNĚČNÉ JÁDRO (schema) jádro jadérko lamina fibrosa HC jaderný obal F ribosomy EC G jadérko heterochromatin (HC), euchromatin (EC), pars fibrosa (F), pars granulosa (G) Schéma: Junqueira, Carneiro, Basic Histol, 2003
BUNĚČNÉ JÁDRO (elektronogram) euchromatin (EC) heterochromatin (HC) NUKLEOLUS marginální heterochromatin (připojený k lamina fibrosa) zevní jaderná membrána (perinukleární prostor) EC ribosomy připojené k zevní jaderné membráně Elektronogram: Basic Histology, Junqueira, Carneiro, 2003
JADERNÝ OBAL Světelný mikroskop tenká linie ohraničující jádro Elektronový mikroskop - obal tvořený dvěma membránami - perinukleární prostor (cisterna) mezi oběma membránami k zevní membráně mohou být připojeny polyribosomy místy je membrána napojena na ger k vnitřní membráně -připojena lamina fibrosa (LF) - - Je tvořená sítí intermediárních filament (IMF) složených z laminů (proteiny), navázaných na laminové receptory vnitřní jaderné membrány. Na počátku mitosy vymizí LF a laminy se uvolňují, na konci anafáze se laminy opět uspořádají do intermediárních filament a LF plní důležitou funkci při rekonstrukci jaderného obalu v telofázi. - jaderné póry
JADERNÝ OBAL (šipky - jaderné póry) Hitsology, Ross and Pawlina,, 2006 JADERNÉ PÓRY - elektronogram, metoda mrazového lomu
JADERNÉ PÓRY Okrouhlé až osmihranné (oktagonální) otvory v jaderném obalu o průměru 70 až 80 nm Jaderné póry - proteinové komplexy (složené z 50 různých proteinů - - nukleoporinů), které protínají jaderný obal a vytvářejí nukleární pórový komplex Selektivní obousměrný transport látek mezi jádrem a cytoplasmou Transport iontů a malých hydrofilních molekul - prostou difusí Transport velkých molekul (velké proteiny a makromolekulární komplexy) - - založen na rozpoznání specifických signálních sekvencí uvnitř jádra (nukleární lokalizační signál a nukleární exportní sekvence) receptorovými molekulami (importiny, exportiny), které realizují transport pórovým kanálem za přítomnosti GTP, který zajišťuje pro transport energii Import do jádra - histony, laminy, ribosomové proteiny, transkripční faktory, hormony (steroidy) Export z jádra - ribosomové podjednotky, mrna, trna, transkripční faktory
SCHEMA JADERNÉHO PÓROVÉHO KOMPLEXU proteinové fibrily subjednotka cytoplasmatického prstence centrální kostra subjednotka nukleoplasmového prstence jaderný koš CYTOPLASMA zevní jaderná membrána Obvod póru 8 proteinových podjednotek - osmiboká centrální kostra - vložena mezi cytoplasmatický a nukleoplasmový prstenec Do cytoplasmy vstupuje z cytoplasmatického prstence 8 krátkých proteinových fibril lamina fibrosa (nukleární lamina) luminální podjednotka centrální pór vnitřní jaderná membrána terminální prstenec Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2011 JÁDRO Nukleoplasmový prstenec - zakotven - do koše z osmi tenkých filament připojených k terminálnímu prstenci.
Vnitřní a zevní jaderná membrána perinukleární prostor (cisterna) granulární ER (GER) LAMINA FIBROSA (jaderná lamina) jaderný pór jádro nukleární lamina fibrosa - síť intermediárních filament DNA vlákna chromatinu Histology, Ross, Pawlina, 2006 Obraz sítě (metoda mrazového lomu)
JADERNÁ MATRIX (nukleoplasma) Vysoce dynamická struktura - vytváří otevřený kompartment pro volnou difusi látek v jádře
DNA (genetická informace) - replikace v S fázi buněčného cyklu Počet chromosomů - somatické buňky - 46 chromosomů - 23 párů = diploidní počet - 2n (jedna sada otcovských a jedna sada mateřských chromosomů); 22 párů homologických chromosomů + 1 pár heterochromosomů (pohlavní chromosomy XY nebo XX). V buňkách ženského pohlaví zůstává trvale jeden X kondensován sex chromatin (Barrovo tělísko) - zralé pohlavní buňky (gamety) - 23 chromosomů = haploidní počet -1n Polyploidní počet chromosomů RNA - realizace genetické informace, vzniká transkripcí z DNA -tvořena jedním polynukleotidovým řetězcem -tři druhy- mrna, trna a rrna - tvorba specifických bílkovin (enzymů) dlouhé raménko krátké raménko chromatidy (sesterské) Schema stavby chromosomu v metafázi obr. Google centromera
Chromosomy pozorované v transmisním EM (spermatogonie 1denního laboratorního potkana) Karyotyp (sada chromosomů) somatické buňky. Mužské chromosomy isolované z buňky v mitose. (použití speciálních fluorescenčních barviv - - FISH technika) Elektronogram Z. Jirsová 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 XY Histology, Ross, Pawlina, 2011 XX chromosom z normálního karyotypu ženy
Molekula DNA se skládá ze dvou polynukleotidových řetězců uspořádaných do dvoušroubovice Stavební jednotkou chromatinu je nukleosom složený z oktamerního histonového jádra (8 histonů -H2A, H2B, H3 a H4 každý typ ze dvou molekul), okolo kterého je dvakrát ovinutá molekula DNA. Další segment DNA s připojeným histonem H1 tvoří spojnici s následujícím nukleosomem. Šňůra nukleosomů se dále stáčí a vytváří chromatinovou fibrilu o průměru 30 nm, která se skládá v kličky. Kličky chromatinové fibrily zakotvené do chromosomové kostry (složené z nehistonových proteinů) tvoří chromatinové vlákno interfázového jádra. Podle stupně kondensace se jeví jako heterochromatin nebo euchromatin. Heterochromatin tvoří úseky silně kondensovaných chromatinových vláken. Barví se hematoxylinem a dalšími basickými barvivy, dá se prokázat Feulgenovou reakcí. H1 H1 Euchromatin je složen z volně uspořádaných chromatinových vláken, kde je uložena převážná část transkribovaných genů EUCHROMATIN HETEROCHROMATIN V profázi buněčného dělení dochází k vystupňované kondenzaci chromatinových vláken do formy chromosomů Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006 metafázový chromosom
SCHEMA NUKLEOSOMU Střední část - 8 histonových molekul (H2A, H2B, H3 a H4) Nukleosomy - dynamické struktury, uvolnění H1 a despiralisace DNA umožní přístup dalších proteinů (transkripční faktory, enzymy) k DNA H1 histon centrální DNA dvakrát obtočená (obsahuje kolem 150 bazí) vázající (připojovací) DNA Schéma: Junqueira s Basic Histology, Mescher, 2010
JADÉRKO (NUKLEOLUS) - není ohraničeno membránou, je místem syntézy rrna a tvorby ribosomových podjednotek - na koncových úsecích pouze pěti chromosomů - geny pro rrna - v interfázi probíhá transkripce (syntéza rrna) - počet jadérek a jejich velikost závisí na metabolické aktivitě buňky Nukleolární organizátor (NO) - DNA kódující rrna Pars fibrosa (PF) - ribonukleoproteinová vlákénka (5-10 nm) - obsahují primární transkripty rrna Pars granulosa (PG) -granulární materiál ze zrajících ribosomových podjednotek. Ribosomové proteiny - syntetizovány v cytoplasmě a transportovány do jádra, ribosomové podjednotky jsou exportovány nukleárními póry do cytoplasmy. Perinukleolární heterochromatin (NAC) - chromatin asociovaný s nukleolem NE jaderný obal, C - cytoplasma Schéma: Junqueira s Basic Histology, Mescher, 2010
Jadérko (nucleolus) Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006 Pars granulosa Pars fibrosa Molecular Biology of the Cell, Alberts et al., 2002 Fibrilární centrum (nukleolární organizátor DNA kódující rrna)
Jadérko v jádru nervové buňky Transmisní EM fibrilární centra (FC, organizátor nukleolu) a nukleolonemata SM - barvení hematoxylin-eosin jadérko (šipka) FC Nukleolonemata (síť z fibrilárního a granulárního materiálu) Elektronogram: Histology, Ross, Pawlina, 2006 Wheater s Functional Histology, 2011
SCHEMA BUNĚČNÉHO CYKLU G2 - post DNA duplikace syntéza tubulinu příprava na na vznik mitotického vznik mitotického vřeténka vřeténka oddělování oddělování chromosomů (vznik (vznik chromatid) NBP (neproliferující buněčná populace) bod kontroly úplnosti replikace DNA G1 - presyntéza DNA DNA S - replikace DNA restrikční bod bod PBP (proliferující buněčná populace) Schéma: Histology, Ross, Pawlina, 2006
BUNĚČNÝ CYKLUS U většiny buněk vyzrálých tkání neprobíhá buněčný cyklus, protože se nacházejí v klidové fázi (G0). Tyto buňky jsou plně diferencovány a každá plní specifické funkce. Mitotické figury jsou proto ve vyzrálých tkáních poměrně vzácné. I diferencované buňky mohou pod vlivem mitogenních faktorů (růstových faktorů) opět vstoupit do buněčného cyklu a znovu se množit. V jiných tkáních jsou přítomny kmenové buňky a populace nezralých mitoticky aktivních buněk, které zajišťují náhradu za odumřelé diferencované buňky.
BUNĚČNÝ CYKLUS Klíčovou událostí mezi děleními buněk je S-fáze. Slouží ke zdvojení (replikaci) DNA, stejně jako histonů a regulačních proteinů v každém chromosomu. Proteinový komplex (kohesin) slouží tomu, aby sesterské chromatidy držely až do příští mitosy pohromadě. M- a S-fáze jsou odděleny dvěma časovými mezerami (gaps), G1-fází a G2-fází. V obou G-fázích je na genetickém materiálu provedena kontrola chyb a ty jsou vpřípadě potřeby opraveny, aby byl v následujícím dělení jako bezchybný předán do dceřinných buněk. Před přechodem z jedné fáze do další je zařazen kontrolní bod, vněmž je cyklus v případě poškození DNA zastaven. Tak je získán čas pro případnou opravu poškození, nebo je buňka apoptosou stažena z oběhu. V G1-fázi se rozhoduje také o tom, zda buňka vůbec překoná hranici (restrikční bod) dalšího běhu cyklu; to se stane pouze vlivem mitogenních faktorů. Jinak je buňka vyřazena z cyklu a vstupuje do G0-fáze, v níž buď pod vlivem diferenciačních faktorů vyzrává, nebo apoptosou zaniká.
REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU Průběh buněčného cyklu je přísně regulován a jištěn. Pro postup jsou důležité enzymy specifické pro řízení cyklu proteinkinasy, cyklindependentní kinasy, CDK), které se aktivují díky tvorbě komplexů surčitými proteiny, cykliny. CDK jsou trvale přítomné, cykliny jsou (vzhledem k jejich přesně programované tvorbě a odbourávání vždy k disposici jen krátký čas). Pokračování dané fáze cyklu a postup do další je možný pouze, když pro fázi specifický cyklin/cdkkomplex dosáhne efektivní úrovně a aktivita komplexu není inhibitory snížena.
REGULACE BUNĚČNÉHO CYKLU
BUNĚČNÝ CYKLUS V G1-fázi proběhne: (a) zvětšení na velikost mateřské buňky (synthesa ribosomů, proteinů, biomembrán, atd.); doplnění stavu buněčných organel, (b) prověření DNA na možné chyby po předchozí mitose a jejich oprava (c) přírodní proliferativní brzda je např. retinoblastomový protein, který znemožňuje překročení prahu (restrikčního bodu) do S-fáze. Tento práh může být překonán pouze tehdy, když se tato brzda uvolní stimulačním působením mitogenních faktorů (inaktivace Rbproteinu). Za restrikčním bodem nejsou již takové stimuly pro pokračování cyklu zapotřebí. V G2-fázi jsou DNA zkontrolovány a opraveny případné chyby vzniklé při jejich zdvojování. Kontrolní body. V každé fázi cyklu jsou připraveny nouzové mechanismy, jimiž může být cyklus zpomalen nebo zastaven, pokud dílčí kroky nejsou řádně dokončeny; G1/S-kontrolní bod před vstupem do S-fáze; v průběhu S-fáze; G2/Mkontrolní bod před vstupem do M-fáze; kontrolní bod dělícího vřeténka před vstupem do anafáze.
MITOSA PROFÁZE již během S-fáze jsou centrioly zdvojeny a leží jako dva centriolové páry v jednom centrosomovém komplexu. Buňka se zakulacuje. Centrosomový komplex se rozděluje ve dva sesterské centrosomy, které se od sebe vzdalují a organizují vznik mitotického vřeténka. To se skládá z bipolárně seskupených mikrotubulů a proteinů molekulárního motoru. Mikrotubuly jsou svými (-) konci zakotveny k centrosomům a tvoří tak póly dělícího vřeténka. Chromosomy začínají být viditelné díky postupné kondenzaci. Jaderný obal se rozpadá v drobné vesikuly. Tak získávají (+) konce mikrotubulů vřeténka přístup k chromosomům a mohou se připojit ke kinetochorám (kinetochorové mikrotubuly). Toto období je někdy označováno jako PROMETAFÁZE. METAFÁZE všechny chromosomy se svými kinetochorami sestaví do jedné (ekvatoriální), roviny jež je ve středu vřeténka a kolmá k jeho ose (metafázová ploténka). Zůstane-li i jen jediná nepřipojena, mitosa se zastaví (kontrolní bod vřeténka).
jaderná membrána centrioly MTOC centroméra PROFÁZE mikrotubuly vřeténka pól mitotického vřeténka mikrotubuly kinetochory PROMETAFÁZE zbytky jaderného obalu - vesikuly polární mikrotubuly ekvatoriální rovina METAFÁZE Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993 Kerr, Functional Histol, 2010
MITOSA ANAFÁZE oddělování sesterských chromatid. Rozštěpí se poslední kohesinová propojení enzymem separasou. Kinetochorové mikrotubuly se začínají díky depolymeraci na (+) koncích zkracovat. Tak jsou chromatidy od sebe odtahovány a svými kinetochorami se přibližují k pólům dělícího vřeténka. Buňka se protahuje. TELOFÁZE - rozpad dělícího vřeténka, začínající dekondensace rozdělených chromatid a nově se tvoří jaderný obal. Začíná se zaškrcovat buněčné tělo (dělící rýha) jako důsledek působení kontrakčního prstence z aktinových filament a myosinu II. Cytokinese ukončuje dělení a znamená úplné rozdělení buněčného těla.
vesikuly jaderného obalu migrují k pólům prodloužení polárních mikrotubulů ANAFÁZE chromatidy směřují k pólům zkrácení mikrotubulů kinetochor dekondenzace chromosomů TELOFÁZE obnova jaderného obalu centrioly CYTOKINEZE akto-myosinové zaškrcení Schéma: Stevens and Lowe, Histology, 1993 Kerr, Functional Histol, 2010