ANTIFUNGÁLNÍ PROTEINY ROSTLIN KLASIFIKACE, CHARAKTERISTIKA,

ANTIFUNGÁLNÍ PROTEINY ROSTLIN KLASIFIKACE, CHARAKTERISTIKA, MOŽNOSTI VYUŽITÍ VERONIKA HEŘMANOVÁ a,b, JAN BÁRTA a a VLADISLAV ČURN b a Katedra rostlinné výroby, b Biotechnologické centrum, Zemědělská fakulta, Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích, Studentská 13, 370 05 České Budějovice vhermanova@centrum.cz Došlo 26.5.05, přijato 30.6.05. Klíčová slova: antifungální proteiny, stresové proteiny rostlin, rostlinné β-glukanasy, rostlinné chitinasy Obsah 1. Úvod 2. Reakce rostliny na infekční agens 3. Klasifikace antifungálních proteinů 3.1. Proteiny PR-1 3.2. Proteiny PR-2 (β-glukanasy) 3.3. Proteiny PR-3 (chitinasy) 3.4. Proteiny PR-4 (proteiny vázající se na chitin) 3.5. Proteiny PR-5 (proteiny podobné thaumatinu) 3.6. Defensiny, thioniny 3.7. Proteiny podobné cyklofilinu 3.8. Proteiny inaktivující ribosomy 3.9. Proteiny přenosu lipidů 3.10. Inhibitory proteas 3.11. Ostatní 4. Možnosti využití antifungálních proteinů 5. Závěr 1. Úvod Antifungální proteiny jsou specifické stresové obranné proteiny, které mají schopnost omezovat až inhibovat růst hub. U vyšších organismů jsou tyto proteiny přirozenou součástí sekundárního obranného systému vrozené imunity. Výskyt těchto proteinů není ovšem omezen pouze na vyšší organismy, ale obdobné proteiny byly nalezeny i u hmyzu, rostlin a mikroorganismů 1,2. Studium antifungálních proteinů nabývá v posledních letech na významu. Vzhledem k tomu, že tyto proteiny jsou součástí přirozených obranných systémů člověka, ale i živočichů a rostlin, existuje možnost jejich využití proti houbovým patogenům. Zájem o antifungální proteiny projevily jak obory humánní a veterinární medicíny, tak i obory zemědělské či potravinářské 1. 2. Reakce rostliny na patogenní organismy Mezi rostlinami a fytopatogeny se vytvořily v průběhu koevoluce velmi spletité vzájemné vztahy. U patogenů se vyvinuly systémy, pomocí kterých napadají rostliny; rostliny získaly schopnost se účinně bránit infekčním agens. Průnik patogenů do buněk je ztížen řadou mechanických bariér (krycí pletiva, vosky, kutikula, buněčná stěna), avšak ani tyto struktury nejsou pro specializované patogeny nepřekonatelnou překážkou 3. Z pohledu metabolismu a genové exprese dochází při kontaktu buňky s patogenem k řadě změn, jejichž cílem je omezit působení infekčního organismu v rostlině. Látka spouštějící tuto obranou reakci na buněčné úrovni je tzv. elicitor 3,4, kterým bývá specifický metabolit identifikovatelný receptorem hostitelské rostliny. Většina obranných reakcí rostlin je závislá na aktivaci vhodných genů. Elicitory obvykle neovlivňují genovou aktivitu přímo, ale zprostředkovaně pomocí přenašečů signálu. Přenos od aktivovaných receptorů k DNA je možný více systémy. Jedná se především o fosfoinositidový systém, při kterém jsou hydrolýzou lipidů plasmatické membrány rostlinné buňky generovány dvě signální sloučeniny (inositol-1,4,5-trisfosfát a diacylglycerol), které za účasti iontů vápníku aktivují proteinkinasy a posléze i expresi genů 4. Následná obranná reakce zahrnuje tvorbu nekróz (hypersenzitivní reakce), syntézu sloučenin s antibiotickým účinkem (fytoncidů) a syntézu specifických stresových proteinů 2,5. Hypersenzitivní reakce patří mezi nejúčinnější obranné mechanismy 6. V napadené buňce během krátké doby naroste koncentrace vysoce reaktivních volných radikálů a peroxidu vodíku, což vede k rychlé zkáze napadené buňky 4. Hypersenzitivní reakce je pro okolní buňky často spouštěcím mechanismem pro syntézu fytoncidů a stresových proteinů PR (zkratka pochází z anglického označení pathogenesis related proteins ), nebo-li proteinů souvisejících s patogenezí 6,7. Mezi fytocidy se řadí nejrůznější flavonoidy, terpenoidy, fenolické látky a alkaloidy 3,4. Proteiny PR jsou definovány jako stresové proteiny, jejichž syntéza je indukovaná přítomností specifického infekčního organismu 2,4,6,8. PR proteiny tvoří velmi početnou a různorodou skupinu. V současnosti jsou rostlinné proteiny PR klasifikovány do 14 skupin 6. 3. Klasifikace antifungálních proteinů rostlin Antifungální proteiny tvoří rozsáhlou a různorodou skupinu. Do současnosti bylo izolováno několik set těchto 495

proteinů a lze říci, že nové jsou objevovány téměř denně 2. Velký počet antifungálních proteinů, jejich různorodost i fakt, že jsou stále objevovány nové, ztěžuje jejich klasifikaci. Antifungální proteiny mohou být klasifikovány na základě struktury, enzymových vlastností, podobnosti s dříve popsanou skupinou proteinů, molekulové hmotnosti, sérologických vlastností 2,6 nebo mechanismu účinku 1. Přehlednou klasifikaci antifungálních proteinů uvádějí ve své práci Selitrennikoff (2001), nebo Theis a Stahl (2004). Většina autorů 1 3 se shoduje na rozdělení nejvýznamnějších antifungálních proteinů rostlin do pěti skupin. Toto členění odpovídá pěti základním třídám proteinů PR (PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5), u nichž byla prokázána antifungální aktivita. Každá z těchto pěti skupin je dělena na základě odlišného isoelektrického bodu na další dvě podtřídy. Kyselé antifungální proteiny se nacházejí v extracelulárním prostoru, zatímco bazické proteiny jsou přítomny v buněčných vakuolách 6. Obdobné antifungální proteiny byly izolovány i z jiných než rostlinných zdrojů. Takové proteiny se označují jako proteiny podobné rostlinným PR proteinům, nebo-li PR-1/5-like proteiny 1. K základním pěti skupinám rostlinných antifungálních proteinů jsou dnes řazeny další skupiny defensiny, thioniny, proteiny podobné cyklofilinu (angl. cyklophilin-like proteins, CLPs), proteiny inaktivující ribosomy (angl. ribosome-inactivating proteins, RIPs), proteiny přenosu lipidů (angl. lipid-transfer proteins, LTPs) a inhibitory proteas 1,2,6. Z doposud známých skupin antifungálních proteinů byl mechanismus účinku zcela popsán pouze u skupiny PR-2 a PR-3 proteinů 2, které narušují základní stavební struktury buněčné stěny hub (viz obr 1). PR-2 proteiny (β-glukanasy) hydrolyzují strukturu β-glukanů, PR-3 (chitinasy) narušují chitinové polymery buněčné stěny. plasmatická membrána GPI - kotvený protein chitin β-1,3-glukan mannoproteiny β-1,6-glukan Obr. 1. Schéma stavby buněčné stěny hub (GPI glykofosfatidylinositol); převzato a upraveno z lit. 2 3.1. Proteiny PR-1 Proteiny PR-1 vykazují podobnost vůči skupině proteinů bohatých na cystein. Jedná se o významnou skupinu PR proteinů, které se často využívají jako markery pro studium indukované rezistence rostlin 6. Jejich molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 15 17 kda (cit. 2 ). Proteiny PR-1 byly poprvé izolovány z tabáku (Nicotiana tabacum L.) 9, později byly nalezeny u mnoha dalších rostlin (např. Oryza sativa L., Triticum aestivum L., Arabidopsis thaliana L.) 6,10,11. Antifungální aktivita byla u těchto protienů prokázána proti řadě houbových patogenů Uromyces fabae, Phytophtora infestans, Erysiphe graminis Phytophtora parasitica a Perenospora tabaci 11. Stabilní struktura většiny proteinů PR-1, odolná proteasové degradaci, je zajištěna přítomností šesti cysteinových zbytků, které zajišťují tvorbu sulfidických můstků 6. Mechanismus účinku proteinů PR-1 není znám. Předpokládá se, že mechanismus antifungální aktivity rostlinných proteinů PR-1 je obdobný jako v případě proteinu označovaného helothermin 2. Helothermin je živočišný antifungální protein (PR-1-like protein), který u cílových buněk interaguje s proteiny membránových kanálků a inhibuje tak propouštění vápenatých iontů, následkem čehož dochází k lyzi buněk 12. 3.2. Proteiny PR-2 (β-glukanasy) Společným znakem proteinů této skupiny je β-1,3- -endoglukanasová aktivita. Vzhledem k enzymové aktivitě PR-2, spočívá jejich mechanismus účinku v hydrolýze struktury β-1,3-glukanů přítomných v buněčných stěnách hub. Postupné oslabování buněčných stěn vede následně k lyzi buněk. V primární struktuře β-glukanas je vždy přítomná oblast dvou reziduí kyseliny glutamové. Tato oblast je považována za aktivní místo, umožňující navázání na strukturu β-glukanu a štěpení β-glykosidických vazeb 1. Na základě analýzy aminokyselinové sekvence jsou PR-2 proteiny děleny do tří skupin 2,13,14. První skupina představuje bazické, intracelulární proteiny s velikostí přibližně 33 kda, druhá a třetí skupina zahrnuje kyselé extracelulární proteiny o velikosti 36 kda. Basické PR-2 proteiny jsou produkovány ve formě prekurzorů, jejichž enzymová aktivita je dána posttranslačními úpravami 15. Bazické isoformy vykazují 50 až 250 krát vyšší aktivitu než kyselé isoformy PR-2 proteinů 16. Antifungální aktivita byla zjištěna již na mikromolární úrovni (50 µg ml 1 ) proti celé řadě organismů např. Rhizoctonia solani, Candida albicans nebo Aspergillus fumigatus 2. Proteiny PR-2 byly nalezeny u řady rostlin 15 18. Exprese proteinů PR-2 je u rostlin tabáku indukována jak přítomností viru mozaiky tabáku 16, tak i na základě infekce inkompatibilními rasami patogenních druhů Pseudomonas tabaci nebo Phytophtora parasitica var. nicotianae 19. U rostlin bramboru (Solanum tuberosum L.) byla zjištěna β-1,3-glukanasová aktivita u zásobního proteinu hlíz, patatinu 15. Následně byla dokázána antifungální aktivita tohoto proteinu vůči patogenu Phytophtora infestans 13. 496

3.3. Proteiny PR-3 (chitinasy) Jedná se o skupinu proteinů PR, které vykazují endochitinasovou aktivitu. Tato aktivita je u bazických chitinas pětkrát vyšší než u kyselých 16. Hmotnost většiny proteinů PR-3 se pohybuje v rozmezí 26 43 kda. Rostlinné chitinasy jsou na základě struktury děleny do čtyř skupin 1. Chitinasy I třídy obsahují N-terminální doménu bohatou na cystein, která se skládá ze 40 aminokyselin (aglutininová doména obilného klíčku), a heveinu podobnou doménu (tzv. hevein-like doménu), která má schopnost vazby na chitin. Proteiny PR-3 třídy II jsou podobné chitinasam první skupiny, ale postrádají N-terminální doménu a jejich hmotnost je 27 28 kda. Třída III nevykazuje podobnost vůči žádné ze skupin chitinas. Velikost je 28 30 kda. Třída IV je podobná proteinům první třídy, ale proteiny jsou z důvodu čtyřnásobné delece prokazatelně menší 1,2. Proteiny PR-3 byly izolovány z celé řady rostlin tabáku, okurky, fazolu, hrachu, obilovin, ale i z mnoha dalších 20 22. Antifungální aktivitu vykazují proti řadě houbových organismů Alternaria solani, A. radicina, Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, F. graminearum, Botrytis cinerea 21,23,24. Mechanismus účinku proteinů PR-3 je dán jejich enzymovou aktivitou. Jedná se o endochitinasy, které narušují chitin přítomný v buněčné stěně hub 25. Antifungální aktivita rostlinných endochitinas je in vitro synergisticky zvyšována přítomnosti proteinů PR-2 (cit. 26 ). 3.4. Proteiny PR-4 (proteiny vázající se na chitin) Jedná se o významnou skupinu proteinů PR majících schopnost vazby na chitin buněčných stěn hub. Molekulová hmotnost je od 3,1 do 20 kda (cit. 1 ). Pro kyselé proteiny PR-4 je nejčastěji uváděno 13 14,5 kda (cit. 2,3 ). Proteiny PR-4 vykazují vysokou odolnost vůči extrémnímu ph a degradaci proteasami 27. Skupina proteinů PR-4 je na základě struktury klasifikována do dvou tříd 1. Proteiny PR-4 třídy I mají N-terminální doménu vázající se na chitin, která je podobná doméně přítomné u heveinu 28. Z tohoto důvodu se tato třída řadí do nadtřídy lektinů vázajících se na chitin. Do této skupiny patří např. proteiny Win 1 a Win 2, které byly izolovány z brambor (Solanum tuberosum L.) 29. Proteiny PR-4 třídy II na chitin se vázající doménu neobsahují. PR-4 proteiny byly opět izolovány z celé řady rostlin 14,30,32. Spektrum houbových organismů, vůči kterým vykazují antifugální aktivitu, je velmi široké např. Trichoderma harzianum, Fusarium culomorum, F. graminearum, Botrytis cinerea 2. Mechanismus účinku proteinů PR-4 není zcela objasněn. Proteiny PR-4 třídy I mají schopnost vázat se na β-chitin vznikající buněčné stěny 27, a tím narušovat polaritu a růst buněk 14. Mechanismus účinku proteinů PR-4 třídy II, které postrádají vazebnou doménu, je nejasný 2. 3.5. Proteiny PR-5 (proteiny podobné thaumatinu) Tyto antifungální proteiny o velikosti 24 25 kda (cit. 2,3,33 ) vykazují vysokou podobnost primární struktury s thaumatinem (angl. thaumatin-like protein, TLPs). Thaumatin je sladce chutnající protein izolovaný z jihoafrické rostliny Thaumatococcus danielli Benth 2. Proteiny PR-5 byly nalezeny u celé řady rostlin např. Hordeum vulgare L. 34, Zea mays L. 35, Nicotiana tabacum L. 36, ale i mnoha dalších. Přítomnost 16 cysteinových zbytků, které tvoří 8 disulfidických můstků, poskytuje proteinům PR-5 vysokou stabilitu vůči změnám teploty, ph a degradaci proteasami 8. Struktura byla doposud determinována pouze u thaumatinu (T. danielli) 37, zeamatinu (Zea mays) 35 a PR-5d proteinu (N. tabacum) 36. Mechanismus účinku těchto antifungálních proteinů není doposud znám. Různá pozorování více či méně objasňují působení proteinů PR-5. Některé proteiny PR-5 způsobují změny v permeabilitě buněčných membrán zeamatin způsobuje rychlou lyzi buněk houby Neurospora crassa, a to i při 4 C (cit. 38 ). U ostatních proteinů PR-5 byla zjištěna β-1,3-glukanasová aktivita a schopnost vázat se na β-glukan buněčných stěn 34. Osmotin (zdroj N. tabacum) způsobuje chaos při stavbě buněčné stěny hub 39. Proteiny PR-5 jsou účinné proti širokému spektru houbových patogenů. Nejznámějším proteinem PR-5 je zeamatin, o jehož využití se vážně uvažuje i v lékařství, a to z důvodu jeho účinnosti proti kvasinkám Candida albicans a C. vaginitis 40. 3.6. Defensiny a thioniny Defensiny a thioniny jsou variabilní skupina malých (5 kda; 45 54 aminokyselinových zbytků), proteinů bohatých na cystein 2,3. Antimikrobiální aktivita rostlinných thioninů je známa již od začátku 40. let, kdy byly získány pšeničné thioniny 41. Rostlinné defensiny byly poprvé získány z pšenice (Triticum aestivum L.). Vzhledem k strukturální podobnosti s thioniny byly zpočátku defensiny označeny jako γ-thioniny a staly se podskupinou thioninů 42. Později byla skupina γ-thioninů přejmenována na rostlinné defensiny 43. Rostlinné thioniny a defensiny byly do současnosti izolovány z mnoha rostlin 3,44,45. Inhibiční aktivita byla prokázána proti řadě houbových patogenů Botrytis cinerea, Alternaria brassicola, Fusarium culmorum, F. oxysporum, F. solani, Candida albicans 2. Stabilní strukturu těmto proteinům poskytuje přítomnost sulfidických můstků. Nejčastěji se jedná o čtyři až pět sulfidických můstků 43,45. Thioniny jsou syntetizovány ve formě větších prekurzorů (15 kda), které jsou uvnitř vlastních buněk neaktivní. Odštěpením terminální sekvence se stávají toxickými 3. Mechanismus účinku této skupiny proteinů není zcela znám. Při ošetření houby N. crassa defensiny Rs-AFP2 (Raphanus sativus L.) a DM-AMP1 (Dahlia merckii L.) byla zjištěna schopnost vazby na specifické 497

membránové receptory, následkem čehož docházelo k ztrátě iontů K + a lyzi buněk 44. 3.7. Proteiny podobné cyklofilinu Tyto rostlinné antifungální proteiny (nejčastěji 18 kda) 46,47 jsou strukturálně podobné cyklofilinům (angl. cyklophilin-like proteins, CLPs), tedy proteinům, které představují intracelulární receptory pro cyklosporin 2,48. Poprvé byly tyto proteiny z rostlin izolovány v roce 1990, kdy byla nalezena cdna těchto proteinů v rostlinách Lycopersicon esculentum Mill., Zea mays L., a Brassica napus L. 48. Zástupcem této skupiny jsou proteiny mungin (Phaseolus mungo L.) a CLAP (Cicer arietinum L.) 47. Proteiny CL jsou aktivní proti řadě houbových patogenů R. solani, F. oxysporum, B. cinerea, Coprinus comatus. Mechanismus účinku těchto proteinů nebyl dostatečně objasněn, mungin in vitro inhibuje α-amylasu a vykazuje β-glukosidasovou aktivitu 46. 3.8. Proteiny inaktivující ribosomy fosfatasová aktivita guanin adenin RNA N-glykosidasová aktivita Obr. 2. Působení proteinů inaktivujících ribosomy; proteiny inaktivující ribosomy vykazují fosfatasovou aktivitu narušující fosfodiesterové vazby a RNA N-glykosidasovou aktivitu, která deadenyluje rrna. Převzato a upraveno z lit. 1 Proteiny inaktivující ribosomy (angl. ribosomeinactivating proteins, RIPs) jsou N-glykosidasy, které odbourávají purin z rrna, což způsobuje rozpad ribosomů a zastavení syntézy proteinů (viz. obr. 2) 1,2. Jedná se o skupinu proteinů, které se nacházejí v podstatě u všech organismů. Rostlinné RIPs byly nalezeny např. u druhů Mirabilis expansa Ruiz & Pavon 49, Pisum sativum L. 50, Zea mays L., Ricinus communis L. 51. Proteiny inaktivující ribosomy jsou rozděleny do tří skupin. Třída I zahrnuje jednořetězové N-glykosidasy s hmotností 11 30 kda. Proteiny třídy II obsahují dva řetězce, a to lektin (B řetězec), který se váže na buňky a N-glykosidasu (A řetězec). Molekulová hmotnost je přibližně 60 kda (cit. 1,2 ). Do této třídy patří např. ricin, ebulin a nigrin. Proteiny třídy III jsou složeny ze čtyř řetězců, které jsou organizovány jako dva dimery shodné s typem třídy II. Antifungální aktivita byla doposud popsána pouze u malého počtu zástupců proteinů RI (cit. 2 ). Řetězec B (lektin) se váže na buňky hub a vytváří v buněčné stěně kanálky, pomocí kterých N-glykosidasový řetězec A proniká do buněk, kde poškozuje ribosomy 52. Není známo, jakým způsobem do buněk pronikají proteiny třídy I, které neobsahují řetězec B (cit. 2 ). Kromě antifungálního účinku vykazují tyto proteiny i silnou toxicitu vůči živočišným buňkám 52. 3.9. Proteiny př enosu lipidů Proteiny této skupiny (8 9 kda) zajišťují přenos fosfolipidů mezi membránami (angl. lipid-transfer proteins, LTPs) 53. Struktura těchto proteinů je zcela specifická. Jsou stabilizovány čtyřmi disulfidickými můstky a vytvářejí centrální dutinu v podobě jakéhosi tunelu. Tyto proteiny jsou aktivní vůči řadě bakterií a hub, ale mechanismus účinku není znám 51. Existují hypotézy, které tvrdí, že tyto proteiny mají schopnost začlenit se do buněčné membrány hub tak, že centrální hydrofóbní dutina vytvoří póry, které umožní odliv intracelulárních iontů a v konečném důsledku způsobí smrt buňky. Jaký je vztah mezi tímto účinkem a funkcí přenosu lipidů není jasné 2. 3.10. Inhibitory proteas Inhibitory proteas patří k nejčastěji se vyskytujícím antifungálním proteinům rostlin 1. Cysteinové inhibitory proteas byly izolovány z velkého počtu rostlin 2,54,55 a vytvářejí čtvrtou skupinu cystatinů, tzv. fytocystatiny. Fytocystatiny jsou jednoduché polypeptidy o velikosti 10 až 12 kda (cit. 2 ), které vykazují antifungální aktivitu vůči řadě zástupců fytopatogeních hub Claviceps, Helminthosporium, Curvularia, Alternaria a Fusarium 56. Princip antifungální aktivity inhibitorů proteas není znám 2. Z hlediska ochrany rostlin je významná i schopnost těchto proteinů inhibovat trávicí enzymy hmyzích škůdců především trypsin a α-amylasu. U inhibitorů proteas byla popsána bifunkčnost inhibice trávících enzymů i antifungální aktivita. Nejpodrobněji byla antifungální aktivita bifunkčních proteinů popsána u proteinu zeamatinu (Z. mays L.) 38. Inhibitory proteas, izolované např. z ječmene nebo pšenice, nebyly z hlediska antifungální aktivity studovány. 3.11. Ostatní Existuje celá řada rostlinných antifungálních proteinů, které nelze zařadit do žádné z výše uvedených skupin. Snakin-1 byl izolován z brambor (Solanum tuberosum L.), má velikost 6,9 kda a je účinný již při koncentraci 10 µm (cit. 57 ). Antifungální účinky vykazuje i 30 kda velký glykoprotein izolovaný z rostliny Engelmannia pinnatifida 498

Nutt. 58. Ani u jednoho z těchto proteinů není znám mechanismus účinku. 4. Možnosti využití antifungálních proteinů Možností využít antifungální proteiny jako zajímavou alternativu chemických fungicidních látek se zabývá mnoho oborů. Podle údajů 1 z roku 2004 bylo v osmi evropských zemích povoleno používání nisinu ke konzervaci potravin. Nisin je antimikrobiální protein produkovaný kmeny bakterie Lactococcus lactis 59. Další oblast využití antifungálních proteinů je farmacie. Ve fázi klinických testů se v současnosti nachází živočišný antifungální protein heliomycin izolovaný z organismu Heliothis virescens 60 a uvažuje se o využití kukuřičného proteinu zeamatinu při léčbě kandidózy způsobené kvasinkou Candida albicans 33,40. U skupiny proteinů inaktivující ribosomy (RIPs) byla zjištěna rozdílná toxicita vůči nádorovým a normálním buňkám člověka. Existuje teoretická možnost využití těchto proteinů jako selektivních protinádorových léků a imunotoxinů 61,52. Vzhledem k tomu, že rostliny vytvářejí antifungální proteiny jako vlastní obranný systém, nabízí se využití těchto proteinů při ochraně zemědělských plodin. Detekce změn v přítomnosti a množství specifických PR proteinů (zejména PR-1 proteinů, β-glukanas, chitinas) se využívá při studiu indukované rezistence rostlin proteiny PR se v tomto případě označují jako tzv. ISR ( induced systemic resistance ) markery 5. Možností zvýšit rezistenci rostlin expresí genů antifungálních proteinů v transgenních rostlinách se zabývá mnoho prací. Zvýšené rezistenci bylo dosaženo např. u rostlin tabáku vůči patogenu Alternaria alternata po vnesení tlp genů rýže 62, vůči padlí (Sphaerotheca panosa) u rostlin růží po vnesení genu Ace-AMP1 (syntéza proteinů podobných thaumatinu) 63, nebo u transgenních linií pšenice vůči fytopatogenní houbě Fusarium graminearum po vnesení genů kódujících chitinasy, β-glukanasy a TL proteiny 64. Zvyšování rezistence rostlin vůči rostlinným patogenům s využitím specifických rostlinných proteinů je v současnosti nejvýznamnější oblastí využití antifungálních proteinů. 5. Závěr Antifungální proteiny rostlin jsou v současné době řazeny do 11 tříd. Tyto specifické proteiny jsou významnou součástí obranného systému všech rostlin. Antifungální vlastnosti těchto proteinů mohou být v budoucnosti významným nástrojem v boji proti patogenním organismům v mnoha oborech. Přestože jsou nové rostlinné antifungální proteiny objevovány téměř denně, víme o těchto výjimečných proteinech velmi málo. Budoucí využití antifungálních proteinů je podmíněno znalostí jejich specifických vlastností. Jedná se především o významné vlastnosti jako jsou selektivita, synergismus, imunologické vlastnosti, možné křížové reakce s receptory hostitele (člověka), nebo vznik rezistence u cílového patogenu. U většiny antifungálních proteinů je také nutné doplnit chybějící informace o mechanismu účinku jejich působení. vznikl v rámci řešení projektu GA ČR č. 521/03/P036. Autoři děkují za finanční podporu. LITERATURA 1. Theis T., Stahl U.: Cell. Mol. Life Sci. 6, 437 (2004). 2. Selitrennikoff C. P.: Appl. Environ. Microbiol. 67, 2883 (2001). 3. Terras F. R: Dissertation. K. U. Leuven, Belgium 1994. 4. Gloser J., Prášil I. v knize: Fyziologie stresu (Procházka S., ed.) kap. 15. Academia, Praha 1998. 5. Heil M., Bostock R. M.: Ann. Bot. 89, 503 (2002). 6. van Loon L. C., van Strien E. A.: Physiol. Mol. Plant Pathol. 55, 85 (1999). 7. Kombrink E., Schmelzer E.: Eur. J. Plant Pathol. 107, 69 (2001). 8. Breiteneder H.: Allergy 59, 479 (2004). 9. van Loon L. C., Kammen A.: Virology 40, 1 (1970). 10. Agrawal G. K., Jwa N. S. Rakwal R.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 274, 157 (2000). 11. Niederman T., Genetet I., Bruyere T., Gees R., Stintzi A., Legrand M., Fritig B., Mosinger E.: Plant Physiol. 108, 17 (1995). 12. Morrisette J., Kratzschmar J., Haendler B., El-Hayek R., Mochca-Morales J., Martin B. M., Patel J. R., Moss R. L., Schleuning W. D., Coronado R., Possani L. D.: Biophys. J. 68, 2280 (1995). 13. Tonon C., Guevara C., Daleo G., Oliva C.: J. Phytopathology 150, 189 (2002). 14. Nielsen K. K., Nielsen J. E., Madrid S. M., Mikkelsen J. D.: Plant Physiol. 113, 83 (1997). 15. Tonon C., Daleo G., Oliva C.: Plant Physiol. Bioch. 39, 849 (2001). 16. Linthorst H. J. M.: Crit. Rev. Plant Sci. 10, 123 (1991). 17. Zemanek A. B., Ko T-S., Thimmapuram J., Hammerschlag F. A., Korban S. S.: J. Plant Physiol. 8, 887 (2002). 18. Kim, Y. J., Hwang B. K.: Physiol. Mol. Plant Pathol. 50, 103 (1997). 19. Meins F. Jr., Ahl P.: Plant Sci. 61,155 (1989). 20. Graham L. S., Sticklen M. B.: Can. J. Bot. 72, 1057 (1994). 21. Zavareh A. H., Tehrani A. S., Mohammadi M.: Commun. Agric Appl. Biol. Sci. 69, 555 (2004). 22. Lee S. C., Hwang B. K.: Planta, v tisku (2005). 23. Taira T., Yamagami T., Aso Y., Ishigura M., Ishihara M. 2001: Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 2710 (2001). 24. Kong L., Anderson J. M., Ohm H. W.: Genome 48, 29 (2005). 499

25. Sela-Burlage M. B., Ponstein A. S., Vlomans S. A., Melchers L. S., van den Elzen P. J. M., Cornelissen B. J. C. : Plant Physiol. 88, 936 (1993). 26. Jach G., Gornhardt B, Mundy J, Logemann J, Pinsdorf E, Leah R, Schell J, Maas C.: Plant J. 8, 97 (1995). 27. Bormann C., Baier D., Horr I., Raps C., Berger J., Jung G., Schwartz H.: J. Bacteriol. 181, 7421 (1999). 28. van Damme E. J., Charels D., Roy S., Tierens K., Barre A., Martins J. C., Rouge P., van Leuven F., Does M., Peumans W. J.: Plant Physiol. 119, 1547 (1999). 29. Friedrich L., Moyer M., Ward E., Ryals J.: Mol. Gen. Genet. 230, 113 (1991). 30. Caporale C., Facchiano A., Bertini L., Leonardi L., Chilosi G., Buonocore V., Caruso C.: J. Mol. Model. 9, 9 (2003). 31. Nielsen K. K., Nielsen J. E., Madrid S. M., J. D. Mikkelsen S. M.: Plant Physiol. 113, 83 (1997). 32. Koo J. C., Lee S. Y., Chun H. J., Cheong Y. H., Choi J. S. Kawabata S. I.: Biochim. Biophys. Acta 1382, 80 (1998). 33. Gavrović-Jankulović M., Ćirković T., Vučković O., Atanasković-Marković M., Petersen A., Golgić G.: J. Allergy Clin. Immunol. 110, 805 (2002). 34. Osmond R. I. W., Hrmova M., Fontaine F., Imberty A., Fincher G. B.: Eur. J. Biochem. 268, 4190 (2001). 35. Batalia M. A., Monzingo A. F., Ernst S., Roberts W., Robertus J. D.: Nat. Struct. Biol. 3, 19 (1996). 36. Koiwa H., Kato H., Nakatsu T., Oda J., Yamada Y., Sato F.: J. Mol. Biol. 286, 1137 (1999). 37. Ogata C. M., Gordon P. F., De Vos A. M., Kim S. H.: J. Mol. Biol. 228, 893 (1992). 38. Roberts W. K., Selitrennikoff C. P.: J. Gen. Microbiol. 136, 1771 (1990). 39. Yun D. J., Ibeas J. I., Lee H., Coca M. A., Narasimhan M. L., Uesono Y., Hasegawa P. M., Pardo J. M., Bressan R. A.: Mol. Cell 1, 807 (1998). 40. Stevens D. A., Calderon L., Martinez M., Clemons K. V., Wilson S. J., Selitrennikoff C. P.: J. Antimicrob. Chemother. 50, 361 (2002). 41. Balls A. K., Hale W. S.: Cereal Chem. 17, 243 (1940). 42. Colilla F. J., Rocher R., Mendez E.: FEBS Lett. 270, 191 (1990). 43. Broekaert W. F., Terras F. R., Cammue B. P., Osborn R. W.: Plant Physiol. 108, 1353 (1995). 44. Thevissen K., Francois I. E., Takemoto J. Y., Ferket K. K., Meert E. M., Cammue B. P.: FEMS Microbiol. Lett. 226, 169 (2003). 45. Lay F. T., Brugliera F., Anderson M. A.: Plant Physiol. 131, 1283 (2003). 46. Ye X. Y., Ng T. B.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 273, 1111 (2000). 47. Ye X. Y., Ng T. B.: Life Sci. 70, 1129 (2002). 48. Gasser C. S., Gunning D. A., Budelier K. A., Brown S. M.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 9519 (1990). 49. Vivanco J. M., Savary B. J., Flores H. E.: Plant Physiol. 119, 1447 (1999). 50. Nielson K., Payne G. A., Boston R. S.: Plant Physiol. 119, 1447 (2001). 51. Park S. W., Lawrence C. B., Linden J. C., Vivanco J. M.: Plant Physiol. 130, 164 (2002). 52. Peumas W. J., Hao Q., Van Damme J. M.: FASEB J. 15, 1493 (2001). 53. Kader J. C.: Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 627 (1996). 54. Park K. S., Cheong J. J., Lee S. J., Suh M. C., Choi D.: Biochim. Biophys. Acta 1492, 509 (2000). 55. Soares-Costa A., Beltramini L. M., Thiemann O. H., Henrique-Silva F.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 296, 1194 (2002). 56. Joshi B. N., Sainani M. N., Bastawade K. B., Gupta V. S., Ranjekar P. K.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 246, 382 (1998). 57. Segura A., Moreno M., Madueno F., Molina A., Garcia-Olmedo F.: Mol. Plant-Microbe Interact. 12, 16 (1999). 58. Huynh Q. K., Borgmeyer J. R., Smith C. E., Bell L. D., Shah D. M.: Biochem. J. 15, 723 (1996). 59. Breukink E., De Kruijff B.: Biochem. Biophys. Acta 1462, 223 (1999). 60. Zasloff M.: Nature 415, 389 (2002). 61. Sandvig K., van Deurs B.: EMBO J. 19, 5943 (2000). 62. Velazhahan R., Muthukrishnan S.: Bilogia Plantarum 47, 347 (2003). 63. Li X., Gasic K., Cammue B., Broekaert W., Korban S. S.: Planta 218, 226 (2003). 64. Ahnand A., Zhou T., Trick H. N., Gill B. S., Bockus W. W., Muthukrishnan S.: J. Exp. Bot. 38, 1101 (2003). V. Heřmanová a,b, J. Bárta a, and V. Čurn b ( a Department of Plant Production, b Biotechnological Centre, Faculty of Agriculture, University of South Bohemia, České Budějovice): Antifungal Plant Proteins Classification, Characterization and Potential Applications This short review is focused on antifungal plant proteins, their classification and characterization. There are 11 groups of the proteins: PR-1, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5 proteins, defensins, thionins, CLPs, RIPs, LTPs, and protease inhibitors. The mechanisms of action of these proteins are as different as their sources and include degradation of fungal cell wall polymers, formation of membrane channels or damage of cellular ribosomes. The mode of action of many proteins remains unknown. The range of fungi that are inhibited by these proteins is very broad, including pathogens of many plants. The genes encoding antifungal proteins can be used to create transgenic plants with increased fungal field resistance. Some antifungal proteins (e.g. zeamatin) are tested for therapeutical use. 500