Zdroj rozmanitosti mikrorganismů ZÁKLADY BAKTERIÁLNÍ GENETIKY Různé sekvence nukleotidů v DNA kódují různé proteiny Různé proteiny vedou k různým organismům s různými vlastnostmi Exprese genetické informace je regulována, takže jednotlivé geny jsou funkční v závislosti na podmínkách prostředí Uložení genetické informace Chromozomy Plasmidy Plasmidy Množí se nezávisle na chromozomech Pouze intracelulární forma Obvykle kruhové, ale i lineární Většina bakterií obsahuje jeden nebo dva stejné plasmidy(lowcopy plasmid), některé více než 100 (high-copy plasmid) Velikost od několika genů až po několik set Obvykle méně než 5% velikosti chromozomu Některé bakterie mohou obsahovat několik různých plasmidů Geneticky různé Nekompatibilní skupiny Episomy Plasmidy, které se mohou integrovat do chromozomu Plasmidy Plasmidy nesou geny nutné k vlastní replikaci Vlastnosti kódované plasmidyjsou pro bakterie užitečné, ale ne nezbytné (rezistence k antibiotikům, tvorba antibiotik, tvorba tumorů u rostlin, metabolické schopnosti, fixace dusíku atd.) Většina plasmidůse množí pouze v jednom druhu Konjugativní plasmid Nese všechny informace nutné k přenosu konjugací Nekonjugativní plasmid Nemá tyto informace, ale může být přenesen konjugací, pokud stejná buňka obsahuje také konjugativní plasmid Základní pojmy Genotyp Celková genetická konstituce organismu Kompletní sekvence chromosomu(ů) a plasmidu(ů) Genom Genetická informace obsažená v DNA genotypu Fenotyp Charakteristiky projevované organismem v daném prostředí Změna genotypu může vést ke změně fenotypu Změny genotypu jsou vzácné, zahrnují změnu v sekvenci nukleotidů DNA, stabilní Změny fenotypu jsou běžné a snadno reverzibilní 1
Modifikace genů - mutace Dědičná změna nukleotidové sekvence v genomu organismu Mutace může nastat Záměnou jednoho nukleotidu druhým (bodová) Změna pozice vodíkového atomu v bázi (tautomerní posun) způsobí změnu vazebných vlastností Odstraněním nebo přidáním nukleotidu Posun čtecího rámce Změna kodónů a aminokyselin Možné i delece a inzerce stovek a tisíců párů bazí Translokací (přesun sekvence) Inverzí (obrácení sekvence) Mutant Učebnice Madigan a kol., obr. 11.6, str. 288 Důsledky bodové mutace Mutageneze Učebnice Madigan a kol., obr. 11.7, str. 289 Delece a inserce Proces vytváření mutací Frekvence 10-4 -10-12 Mutageny Činidla zvyšující frekvenci mutací 10 až 1000x Chemická činidla Transpozony(mobilní elementy) Radiace Mutace Spontánní Vliv záření, kyslíkových radikálů Chyby při replikaci Indukované Chemické mutageny Změna tvorby vodíkových vazeb HNO 2 (deaminace A ac) Alkylační činidla Přidávají alkylovou skupinu k bázi a mění tím její schopnost tvořit vodíkové vazby Analoga bazí Podobají se chemickou strukturou přirozeným bazím a mohou být začleněny do DNA Tvoří jinak vodíkové vazby a zvyšuje se tak možnost nesprávného párování při následné syntéze komplementárního řetězce Interkalační činidla Molekuly s třemi benzenovými jádry, které se vloží mezi báze obou vláken a oddálí tak přilehlé báze Při replikaci pak dojde k vložení dalších bazído volného místa vedoucího k přidání bazí Mobilní elementy Speciální segmenty DNA, které se mohou přemisťovat z jednoho místa na druhé ve stejné nebo jiné molekule DNA Vkládají se do genů a narušují jejich funkci Inzerční sekvence Obrácená repetice (palindrom) Pouze gen nutný pro přemístění Transposasa Transpozony Obsahuje další geny Transpozice (přemístění) Místně specifická rekombinace Transposasa rozpoznává palindromové sekvence a cílovou sekvenci 2
Ultrafialové záření Způsobuje dimerizaci sousedních pyrimidinových bazí na stejném vláknu DNA DNA vlákno je zdeformováno, nemůže se přizpůsobit dvoušroubovici a DNA je poškozena Zvyšuje se pravděpodobnost, že polymerasa udělá chybu Hlavní mutagenní účinek však plyne ze snahy o opravu poškození SOS systémem Oprava poškozené DNA SOS systém Indukovatelnýenzymový systém DNA replikace, který obejde poškozené místo Řada chyb a proto další mutace Fotoreaktivace Viditelné světlo indukuje enzym, který přeruší kovalentní vazbu thyminů Obnova vyříznutím Vyříznutí poškozené DNA z jednoho řetězce a syntéza komplementárního řetězce Další mechanismy opravy Frekvence mutací Pravděpodobnost, že při dělení buňky v daném genu nastane mutace 10-4 až 10-12 na jedno dělení buňky Jednotlivé geny mutují nezávisle na sobě Mutace jsou stabilní Příležitostně se nukleotid může změnit zpět Reverze U prokaryotníchbuněk jsou mutace pozorovány rychle, protože obsahují pouze jeden nebo dva identické chromosomy Detekce a izolace mutantů Přímá selekce Izolace tzv. selektovatelných mutantů Přímá metoda Třídění (screening) Izolace tzv. neselektovatelných mutantů Nepřímá metoda Detekce a izolace mutantů Selektovatelná mutace Mutace uděluje organismu výhodnou vlastnost, kterou lze využít pro jeho izolaci Mutant roste na pevném médiu, na kterém mateřský organismus neroste Mutant přeroste mateřský organismus Např. organismy rezistentní k antibiotikům Izolace na médiu obsahujícím antibiotikum Selekce umožňuje izolaci jediného mutanta z populace mateřského organismu Neselektovatelná mutace Detekce zkoumáním rozdílných vlastností kolonií Mohou být viditelné na první pohled Např. ztráta pigmentace, tvorba zvrásněných kolonií, ztráta schopnosti růst bez růstového faktoru, citlivost na teplotu, ztráta motility Třídění a nepřímá selekce Využitelné pro izolaci nutričně defektivních mutantů Auxotrof Mutant s požadavky na výživu, neschopen syntézy sloučeniny nutné pro růst Prototrof Mateřský organismus od kterého byl odvozen auxotrof, syntetizuje všechny sloučeniny nutné pro růst Mutant neroste na médiu, na kterém roste mateřský organismus, vyžaduje určitý růstový faktor Neexistuje přímá metoda pro izolaci Mutant musí být identifikován pomocí screeningu Zdlouhavé Replica plating (metoda razítka) Nepřímá selekce pomocí penicilinu Obohacení kultury o mutantní organismus 3
Izolace nutričních auxotrofůmetodou replica plating Učebnice Madigan a kol., obr. 11.15, str. 287 (vysvětluje postup metody třídění otiskem misky) Izolace auxotrofůpomocí penicilinové selekce Základní předpoklad: penicilin zabíjí pouze množící se buňky Předběžná inkubace směsné kultury na minimálním médiu s penicilinem Mutant neroste na minimálním médiu Mateřský organismus by rostl, ale je usmrcen penicilinem Následuje odstranění penicilinu a přenos na médium obsahující růstový faktor (kompletní médium) Vykultivované kolonie reprezentují mutantní organismus a mateřské buňky, které přežily kontakt s penicilinem Negativní selekce Selekce proti mateřskému organismu nikoli selekce mutantního Testování mutagenní aktivity látek Mutagenní látka je potenciálně karcinogenní Amesův test Stanovení frekvence reverze His - buněk na His + buňky Salmonellyv přítomnosti i nepřítomnosti testované chemické látky na médiu neobsahujícím vyžadovanou živinu (His) Mutagenní látka zvyšuje počet reverzí Pozorujeme růst kolonií na minimálním médiu Médium obsahuje enzymy z krysích jater Některé látky nejsou karcinogenní samy o sobě, ale až po metabolizaci v živočišném organismu, primárně v játrech Amesův test Přenos genů Genetická informace buňky může být změněna přenosem skupiny genů z jiné buňky Přenos genů mezi bakteriemi Transformace DNA je přenesena jako prostá DNA Transdukce Bakteriální DNA je přenesena bakteriálním virem Konjugace DNA je přenesena mezi bakteriemi, které jsou ve vzájemném kontaktu Je přenesen pouze krátký úsek DNA Homologní rekombinace Fyzická výměna genů mezi genetickými elementy, která nastává v důsledku homologie DNA sekvencí ze dvou různých zdrojů 4
Transformace Obecný mechanismus integrace donorové DNA do genomu příjemce Pokud je bakteriální buněčná stěna narušena, chromozomální DNA se rozpadne Tato DNA může projít skrze buněčnou stěnu a cytoplasmatickou membránu recipientníbuňky a být integrována do jejího chromozomu Přirozená kompetence DNA vstoupí do recipientníbuňky za určitých růstových podmínek Kompetentní buňka Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae Umělá kompetence Otvory v buněčné stěně jsou vytvořeny uměle (např. elektroporací, pomocí chemických sloučenin) E.coli Transdukce Přenos bakteriální DNA pomocí bakteriofága Obecná transdukce Defektní virové částice náhodnězabudují fragmenty chromosomální DNA Virulentní i temperovaný fág (při lytickém cyklu) Specializovaná transdukce DNA temperovaného fága se nesprávně vyřízne z chromozomu hostitele a přenese do další buňky i sousedící geny hostitele E.coli, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella, Staphylococcus Učebnice Madigan a kol., obr. 11.17, 11,18, str. 300, 301 Konjugace Přenos plasmidu(f plasmid) z buňky do buňky Donorová a recipientní buňka Přenos pouze v jednom směru z donoru na recipienta Vyžaduje fyzický kontakt buněk E. coli, řada G - bakterií, známo i u G + (Streptococcus, Enterococcus, Staphylococcus) Donor obsahuje F plasmid F + buňka Nese genetickou informaci pro přenos DNA a syntézu pohlavního vlákna Není přítomen v recipientní buňce (F - buňka) Vznikají dvě F + buňky Konjugace Příležitostně se F plasmidintegruje do chromozomu (vznik Hfr buňky) Integrované F faktory jsou příležitostně vyříznuty z bakteriálního chromozomu Při správném vyříznutí vzniká znovu F + buňka Někdy plasmid nese i kus chromozomální DNA (F buňka) Hfri F buňky mohou konjugovat s F - buňkou 5
Přenos genů v jedné bakterii F + buňka přenáší F plasmid do F - buňky Transpozony (mobilní elementy) Transpozony se mohou přemístit z místa na chromozomu do plasmidu, který může být přenesen konjugací do jiných buněk Integrace F plasmidu do chromozomu Hfr buňka interaguje s F - buňkou, dochází k přenosu části DNA Hfr buňky, ale ne F faktoru F buňka interaguje s F - buňkou, dochází k přenosu části DNA původní F + buňky Restrikce a modifikace DNA Recipientníbuňky přijmou obecně DNA pouze ze stejného druhu bakterií Pokud do buňky vstoupí cizorodá DNA, je degradována pomocí restrikčních endonukleas Reaguje se specifickými krátkými sekvencemi v cizí DNA a štěpí ji na těchto místech Enzymy v různých organismech rozeznávají a štěpí různé sekvence Zamezení destrukce vlastní DNA Modifikační enzymy (např. metylace určitých bazív rozpoznávané sekvenci zabrání štěpení endonukleasou) Význam přenosu genů pro bakterie Konjugace a transformace nastává pouze u několika druhů bakterií Nejrozšířenější mechanismus přenosu genů je transdukce Přenos genů poskytuje mikroorganismu nové genetické informace, které mu umožní přežít v měnícím se prostředí Význam přenosu genů pro mikrobiální genetiku Umožňuje mapování genů na bakteriálním chromozomu analýzou jejich přenosu z jedné buňky do druhé Čím blíže jsou geny na chromozomu, tím vyšší je pravděpodobnost jejich společného přenosu Důležitá součást technologie genového inženýrství Využití pro zavedení genů do bakterií 6