Využití průtokové cytometrie v analýze savčích chromozomů Jan Fröhlich frohlich@vri.cz Brno 17.-18.5.2015
Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - Historie Užívána od pol. 70. let 20.stol (Gray et al., 1975, Wray and Stubblefield, 1970). První experimenty na chromozomech křečka barvené jen ethidium bromidem (Jednokanálové experimenty). Konec 70.let - zaveden systém dvou laseru => možnost užití 2 barev vedlo ke zlepšení rozlišovací schopnosti (Dean and Pinkel, 1978, Langlois and Jensen 1979). Na počátku 90. let sortované chromozomy sloužily pro konstrukci DNA knihoven pro počáteční fáze Human Genome Project (Van Dilla and Deaven 1990). Navzdory všem vylepšením za posledních 20 let se stále nedaří rozeznat celou řadu chromozomu u různých druhů zvířat => využití FISHIS (Fluorescence in situ hybridization in suspension). 2
Flowcytometrické karyotypování a sorting chromozomů - aplikace Detekce delecí, aneuploidii, translokací, markerových chromozomů nebo jiných chromozomových abnormalit (Gray et al., 1988). Využití v genomových evolučních studiích (tvorba FISH sond) (Carter et al., 1992). Flow-sortování chromozomu je jednoduchou a levnou metodikou pro získání velkých množství určitého chromozomu v karyotypu o vysoké čistotě (více jak 90 %) => užití k vytvoření DNA knihoven. Sexation pohlaví potomstva založeno na oplodnění spermiemi, které byly rozděleny dle přítomnosti chromozomů X a Y. 3
Aplikace I - Identifikace derivovaných nebo markerových chromozomů A) B) Figure. Pictures shows flow karyotypes of two patients with derivated chromosomes. The peaks representing the normal chromosomes and additionally in case A) chromosomes X, 8, and 7, and the derivative chromosome 8 are indicated. In B) the peaks representing the normal and derivative chromosomes 21 (Carter et al., 1992). 4
Aplikace II - Chromosome painting and genomové evoluční studie Chromosome painting je metoda využívající principy FISH (fluorescence in situ hybridization). Malovací sondy vytvořené z chromozomu jednoho druhu jsou hybridizovány na chromozomy příbuzného druhu. Reciproký chromozomový painting umožňuje zobrazení chromozomových homologií, translokací, delecí a popřípadě inverzí, ke kterým došlo během evoluce (Wienberg et al., 1990, 1992; Jauch et al., 1992, Korstanje 1999). Figure. Color-banded chromosomes of human and the great apes arranged according to the numbering system of the human idiogram. Chromosomes in each cases colorbanded using multicolor gibbon probe set (Harlequin FISH, Cambio) (Ferguson-Smith et al.,2000). 5
Komparativní FISH a malovací sondy průtoková cytometrie laserová mikrodisekce + efektivní, velice rychlé + možnost subchromosomálních - omezena na Flowcytometricky sond (specifické pro ramena, oblasti rozlišitelné chromosomy chromosomu) - sondy pouze pro celé - pomalé, zisk málo chromozomů chromosomy - nutná znalost karyotypu 6
7
Výsledky I - Flow karyotyp člověka Figure. Human bivariate flow karyotype from a normal male individual. Different peaks represent chromosomes of varying size and base pair content. Using modern high-end machines, quality preparations have made it possible to resolve two parental alleles for certain chromosomes (NG and Carter, 2006). Figure. Human bivariate flow karyotype of the normal male Lymphocyte cells. 8
Výsledky I - Flow karyotyp krávy (Bos Taurus)? 28 Figure. Buňky z linie MDBK (Madine-Darby Bovine Kidney) Figure.Bivariate flow karyotype of the bovine cell culture. (Schmitz et al.,1995) 9
Kráva (Bos Taurus) FISH sondy BTA6 BTA25 BTA8 10
Flow karyotyp - Prase (Sus Scrofa) Figure. Pig bivariate flow karyotype from a normal male (Yerle et al., 1993) Figure. Izolace prasečích chromosomů z linie IPEC (Intestinal Porcine Epitelial Cells ) 11
Prase (Sus Scrofa) FISH sondy SUS 3 SUS 12 SUS 3(pter-qdist) 2(pter-qprox) 12
Zpětná Hybridizace a Karyotyp IPEC linie SUS IPEC 2n= 73-77 13
Flow analýza karyotypu Liška (Vulpes Vulpes) 14 Figure. Flow karyotype of the red fox with chromosomal assignments. Cell line derivated from Red Fox skin fibroblasts. Figure. Flow karyotype of the red fox with chromosomal assignments. (Yang et. al, 1999)
Další cíle = Pes (Canis lupus familiaris) Figure. Flow karyotype of the canine kidney cell line MDCK ( Madin-Darby Canine Kidney) with chromosomal assignments. Note that peaks a, b, and c contain derivative chromosomes (Yang et al., 1999). A další významná hospodářská zvířata (kůň, ovce, koza,...) 15
Shrnutí Flow-sorting chromozomů je silnou metodou pro identifikaci a rozlišení chromozomů u celé řady druhů organismů. Dobré využití techniky v oblasti detekce chromozomových abnormalit (delecí, translokací, inserce). Metoda je schopna poskytnou vysoká množství specifického chromozomu o vysoké čistotě za relativně krátký čas vhodné pro FISH sondy. Děkuji za pozornost :o) 16