UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE RIGORÓZNÍ PRÁCE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE RIGORÓZNÍ PRÁCE Alkaloidy rodu Narcissus (Amalyllidaceae) a jejich biologická aktivita The alkaloids of the genus Narcissus (Amaryllidaceae) and its biological activity Vedoucí katedry: Doc. Ing. Lucie Cahlíková, Ph.D. Vedoucí diplomové práce: Doc. Ing. Lucie Cahlíková, Ph.D. Hradec Králové, 2015 Mgr. Václav Hrstka

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že tato práce je mým autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem čerpal při zpracování, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a řádně citovány. V Hradci Králové 2015 Podpis

Děkuji grantům SVV UK 265 002, FRVŠ 664/2011 a FRVŠ 190/2012 za finanční podporu, bez které by tato práce nemohla vzniknout. Rád bych na tomto místě velice poděkoval Doc. Ing. Lucii Cahlíkové, Ph.D. za podporu, odbornou pomoc při interpretaci MS spekter a tvorbě této diplomové práce, poskytnuté materiály a cenné rady a připomínky při praktických úkolech. Dále tímto děkuji Prof. RNDr. Lubomíru Opletalovi, CSc. za změření biologických aktivit alkaloidních extraktů. V neposlední řadě také děkuji celé katedře farmaceutické botaniky a ekologie za příjemné pracovní prostředí a kolegialitu.

1 ÚVOD... 6 2 CÍL PRÁCE... 9 3 TEORETICKÁ ČÁST...11 3.1 Čeleď Amarylidaceae a její alkaloidy... 12 3.2 Rod Narcissus... 18 3.2.1 Alkaloidy rodu Narcissus... 19 3.3 Biologická aktivita Amaryllidaceae alkaloidů (AA)... 20 3.3.1 Prolyloligopeptidáza... 22 3.3.2 Protinádorová aktivita AA... 24 3.3.2.1 Alkaloidy lykorinového strukturního typu... 24 3.3.2.2 Alkaloidy homolykorinového strukturního typu... 25 3.3.2.3 Alkaloidy haemanthaminového strukturního typu... 25 3.3.2.4 Alkaloidy tazettinového strukturního typu... 26 3.3.2.5 Alkaloidy pankratistatinového strukturního typu... 26 3.3.3 Antimikrobiální aktivita AA... 26 3.3.4 Neuroprotektivní aktivita AA... 30 3.3.5 Antivirotická aktivita... 30 3.3.6 Další účinky AA... 31 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST...32 4.1 Všeobecné postupy... 33 4.1.1 Destilace a odpařování... 33 4.1.2 Materiál a vybavení... 33 4.1.2.1 Rozpouštědla... 33 4.1.2.2 Chemikálie... 33 4.2 Příprava sumárních extraktů a GC/MS analýza... 33 4.2.1 Biologický materiál... 33 4.2.2 Příprava ethanolového a alkaloidního extraktu... 34 4.2.3 GC/MS analýza a identifikace alkaloidů... 34 4.3 Stanovení inhibiční aktivity alkaloidních extraktů a čistých alkaloidů vůči erytrocytární AChE a sérové BuChE... 35 4.3.1 Chemikálie a materiál použité pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity 35 4.3.1.1 Chemikálie... 35 4.3.1.2 Pufry... 35 4.3.1.3 Biologický materiál... 36 4

4.3.2 Přístroj použitý pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity... 36 4.3.3 Podmínky měření... 36 4.3.4 Příprava hemolyzátu lidských erytrocytů... 36 4.3.5 Stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity (hodnoty IC 50 )... 37 5 VÝSLEDKY A DISKUZE...38 5.1 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus bulbocodium var. conspicus a jeho GC/MS analýza... 39 5.2 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Fortissimo a jeho GC/MS analýza... 43 5.3 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Delnashaugh a jeho GC/MS analýza... 46 5.4 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Sealing a jeho GC/MS analýza... 49 5.5 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Ice Follies a jeho GC/MS analýza... 52 5.6 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus canaliculatus a jeho GC/MS analýza... 55 6 ZÁVĚR...58 7 LITERATURA...61 8 SEZNAM ZKRATEK...71 5

1 ÚVOD 6

Rostliny jsou nedílnou součástí lidského života již od nepaměti. Na počátku byly zdrojem obživy, s postupem času a získáváním dalších zkušeností a vědomostí se začaly objevovat jejich toxické účinky, které se postupně dařilo převádět k léčebnému využití. Jak se společnost vyvíjela odkrývaly se nové poznatky léčivého charakteru rostlin. Části rostlin, tedy jejich orgány, se upravovaly a konzervovaly jednoduchými metodami. Po nějaké době bylo zjištěno, že účinek je vázán na látky v těchto orgánech obsažených a vyvstala potřeba podrobnějšího poznávání těchto léčivých bylin a jejich složek, jejich vývoje, účinku, způsobu pěstování a uchovávání. To bylo úrodnou půdou pro vznik nového, důležitého oboru, farmakognozie. Farmakognozie šla od počátku ruku v ruce s další vědní disciplínou, farmaceutickou chemií. 1,2 Jejich společným cílem je hledání nových potenciálních látek využitelných jako stabilní bezpečná léčiva. V 18. století se cesty těchto oborů rozešly a zatímco farmaceutická chemie se zaměřila na syntézu a chemickou úpravu různých látek, farmakognozie se soustředila na poznávání látek přírodních, jejich zdrojů, standardizaci a využití v léčitelství. V současné době se tyto obory opět prolínají pří hledání účelně využitelných léčiv. Semisyntetická příprava aktivních molekul z přírodních zdrojů nebo zvýšení účinnosti přírodních látek přípravou jejich derivátů jsou příklady efektivní aplikace znalostí z obou oborů. Společné využití těchto disciplín je dobrým předpokladem k hledání nových cest k léčbě nejdůležitějších civilizačních chorob dnešní doby. Vývoj společnosti a zvýšení životní úrovně je důsledkem prodloužení průměrné délky života a s ní četnější projevy chorob s tím spojených. Tzv. neurodegenerativní onemocnění se stávají velkým problémem dnešní vyspělé společnosti. V současné době je z těchto onemocnění nejčastější Alzheimerova choroba (AD). Této nemoci je také na poli vědy věnována velká pozornost, především za účelem nalezení účinnějších látek využitelných v terapii tohoto závažného onemocnění. Lidé postižení touto nemocí ztrácí schopnosti samostatného života a s postupně se rozvíjející demencí je konečným stádiem smrt. Kauzální léčba pro stále neznámou přesnou patogenezi choroby není možná, a hlavní terapií tedy zůstává léčba symptomatická. Ve všech stádiích onemocnění hrají největší roli inhibitory lidských cholinesteráz; acetylcholinestrázy (HuAChE) a butyrylcholinesterázy (HuBuChE). Jejich inhibicí dochází k větší dostupnosti acetylcholinu v neurosynapsích a snížení tvorby a toxicity β-amyloidu, což je zatím 7

nejuznávanější teorie patogeneze AD. 3 Z přírodních látek spadajících do této skupiny je registrován alkaloid galantamin izolovaný původně z cibulí sněženky Galanthus woronowii 4. Tento inhibitor poukázal na velký potenciál alkaloidů čeledi Amaryllidaceae, a proto se věnuje velká pozornost zkoumání těchto látek jakožto inhibitorů esteráz i dalších enzymů využitelných v léčbě AD. Na katedře farmaceutické botaniky a ekologie se v roce 2005 začala věnovat této problematice pracovní skupina ADINACO Research Group 5 pod vedením Prof. RNDr. Lubomíra Opletala, CSc. Tato práce, která vznikla v rámci zmíněné pracovní skupiny, je zaměřena na hledání účinných látek, konkrétně alkaloidů z rodu Narcissus. Po extrakci alkaloidních látek z cibulí jednotlivých druhů rostlin následovala jejich identifikace a měření inhibice vůči HuAChE a HuBuChE za účelem vytipování vhodných druhů k podrobnější studii, případně k izolaci perspektivních alkaloidů. 8

2 CÍL PRÁCE 9

Cíle rigorozní práce: 1. Příprava alkaloidních extraktů vybraných zástupců rostlin rodu Narcissus. 2. Příprava vzorků pro biologické testování. 3. GC/MS analýza alkaloidních extraktů. 4. Stanovení inhibiční aktivity alkaloidního extraktu vůči lidské erytrocytární acetylcholinesteráze a sérové butyrylcholinesteráze. 5. Vyhodnocení a vybrání vhodných zástupců rodu Narcissus k dalším fytochemickým studiím na základě jejich inhibičních aktivit a alkaloidního profilu. 10

3 TEORETICKÁ ČÁST 11

3.1 Čeleď Amarylidaceae a její alkaloidy Čeleď amarylkovitých rostlin sestává z jednoděložných, víceletých rostlin s cibulovitými kořeny převážně se vyskytujících v oblastech tropů a subtropů. Na území České republiky se nachází 3 známé původní rody této čeledi, rod Narcissus (narcis), rod Galanthus (sněženka) a rod Leucojum (bledule). V přírodě se můžeme setkat s druhy N. poeticus a N. pseudonarcissus původem z jihozápadní Evropy, které u nás zdomácněly. 6, 7 Mnoho dalších druhů se u nás pěstuje jako okrasné rostliny, jsou to například N. tazetta a jeho kultivary, dále rod Amaryllis, Eucharis aj. Po celém světě je známo více než 1100 druhů, které se řadí do 85 rodů 8. Na Obr. 1. jsou zobrazeny příklady některých druhů této rozsáhlé čeledi. A B C Obr. 1. Rostliny čeledi Amaryllidaceae A Narcissus cyclamineus (Narcis bramboříkový) 9 B Eucharis amazonica (Libenka velkokvětá) 10 C Hippeastrum reticulatum ( Hvězdník sp.) 11 Tyto rostliny se hojně využívaly v lidovém léčitelství. První zmínky použití těchto rostlin jako léčiv sahají až do 4. století př. Kristem. 12 Od této doby našla celá řada těchto rostlin široké uplatnění v terapii různých onemocnění. V období starého Říma se jednalo především o léčbu nádorových onemocnění. Postupem času se přišlo na další možnosti jejich uplatnění, například některé druhy rodu Crinum se ukázaly jako dávidla (Crinum amabile Donn), jiné se osvědčily při léčbě malarie (Crinum bulbispermum Milne-Redh & Schweick). 13 Dnes jsou různé druhy rostlin této čeledi cílem rozličných výzkumů jejich potenciálního účinku u nádorových onemocnění nebo jako antimikrobních látek, léčiv potlačujících progresi neurodegenerativních chorob (AD) jako inhibitory lidských cholinesteráz, antifungálního působení, analgetického účinku a 12

jako potenciální antimalarika. 8 Do popředí se také dostává významný účinek některých druhů jako inhibitorů enzymu propyloligopeptidázy (POP), dalšího mechanismu případně použitelného jako podpůrná léčba AD. 14 vlastnosti jsou tzv. Amarylidaceae alkaloidy. Látkami zodpovědnými za tyto Pro svou velmi širokou biologickou aktivitu patří k nejdůležitějším obsahovým látkám těchto rostlin. Kromě výše uvedených biologických účinků jsou to látky jedovaté, což může být chápáno jako obranný mechanismus rostliny. Tyto heterocyklické sloučeniny obsahující ve své struktuře atom dusíku se dělí na základě své biosyntetické cesty a strukturní podobnosti do několika skupin. Základní tzv. norbelladinová cesta biosyntézy AA z L-fenylalaninu a L-tryptofanu je podrobně popsána v mé diplomové práci. 15 Touto cestou vzniká převážná většina strukturních skupin. Některé méně často se vyskytující typy a montaninový strukturní typ jsou syntetizovány nejspíše jinou biosyntetickou cestou, která nebyla dosud uspokojivě objasněna. Dosud známé strukturní typy včetně jejich zástupců a výskytu jsou shrnuty v následující tabulce (Tab. I.) Tabulka I Rozdělení Amaryllidaceae alkaloidů do jednotlivých strukturních skupin včetně jejich zástupců a příkladů rostlin, ze kterých byly izolovány. Strukturní typ vzorec zástupce izolace galanthaminový galanthamin Narcissus tortifolius 16 Galanthus 17, 18 elwesii Leucojum vernum 19 haemanthaminový haemanthamin Narcissus triandruss cv. Thalia 20 Narcissus confusus 21 13

Tabulka I Pokračování Strukturní typ vzorec zástupce výskyt krininový krinin Narcissus poeticus var. recurvus 22 Narcissus filifolia 22 Nerine bowdenii 23 tazettinový tazettin Narcissus 24, 25 tazetta Zephyranthes robusta 26 Narcissus tazetta var. chinensis 27 lykorinový lykorin Narcissus. 28, 29 poeticus Ammocharis coranica 30 Lycoris radiata 31, 32 Brunsvigia radulosa 33 montaninový montanin Lycoris Squamigera 34 belladinový belladin Nerine filifolia 35 Chlidanthus 36, 37 fragrans 14

Tabulka I Pokračování Strukturní typ vzorec zástupce výskyt homolykorinový homolykorin Narcissus broussoneti 38 Narcissus pseudonarcissus cv. Carlton 39 Hippeastrum morelianum 40 augustaminový augustamin Crinum kirkii 41 pankratistatinový pankratistatin Haemanthus kalbreyeri 42 Pancratium littorale 43 gracilinový gracilin Galanthus 44, 45 gracilis galanthindolový galanthindol Galanthus plicatus 46 gracilaminový gracilamin Galanthus 44, 45 gracilis 15

Tabulka I Pokračování Strukturní typ vzorec zástupce výskyt cheryllinový cheryllin Narcissus angustifolius subsp. transcarpaticus 47 buflavinový buflavin Boophane flava 48 galasinový galasin Galanthus elwesii 18 plikaminový plikamin Galanthus plicatus 49 kripowellinový kripowellin A R 1, R 2 = -CH 2 OCH 2 - kripowellin B R 1, R 2 = -CH 3 Crinum powelii 50 16

Tabulka I Pokračování Strukturní typ vzorec zástupce výskyt mesembrin mesembranový joubertiamin Narcissus triandrus 51 Narcissus 52, 53 pallidus Skeletin A4 17

3.2 Rod Narcissus Vzhledem k zaměření této práce bude na tomto místě podrobněji popsán rod Narcissus. Rozdělení alkaloidů s jejich zástupci je součástí mé diplomové práce z roku 2013 15. Následující přehled bude soustředěn především na botanické zařazení druhů s uvedením nových poznatků získaných v posledních letech. Narcisy mají rychlý vývoj, proto potřebují dostatek živin, které jsou uloženy v cibulích. Na obrázku dole je zachycen vegetační vývoj narcisu (Obr. 2.). Cibule jednotlivých druhů se od sebe liší tvarem i barvou slupky, obecně však jsou tvarem kulaté, případně zploštělé s tenkou papírovitou slupkou žluté až hnědé barvy. Dceřiné cibule se tvoří po stranách mateřské a dorůstají 1 a 3 roky, pak se samy oddělí. 54 Obr. 2. Vegetační vývoj narcisu 54 18

Listy narcisů jsou řemenovité nebo čárkovité. Stonek je bezlistý, kulatý až zploštělý. Květy jsou složeny z 6 okvětních lístků rozverných tvarů a barev. Pakorunka uprostřed květu je utvářena rozmanitě. 54 Většina narcisů je domácích v Evropě, ale najdeme je také na severu Afriky podél středozemního moře. Původ narcisů náleží Řecku, kde také tyto okrasné rostliny získaly svůj název - Narcissus z řec. narkos (omamující) podle opojné vůně N. poeticus. Historicky najdeme narcisy také ve staré Číně, kde byly uctívány jako symbol čistoty. 54 Na rozšíření narcisů v evropských zahradách se podíleli především Holanďané a Angličané. Od 19. století bylo započato šlechtění narcisů, a v současnosti tak máme k dispozici tisíce různých odrůd a kultivarů, které jsou průběžně obměňovány. 54 Rod Narcissus obsahuje přibližně 40 druhů. Vzhledem k početnému zastoupení odrůd došlo postupně k redukci a botanicky byly narcisy rozděleny do několika skupin. Dalším, používanějším typem rozdělení je zahradnické třídění, podle kterého jsou narcisy rozděleny do 12 skupin a jejich podskupin, v nichž jsou jednotlivé odrůdy. 54 3.2.1 Alkaloidy rodu Narcissus Biosyntéza a popis alkaloidů v tomto rodu jsou detailně shrnuty v mé diplomové práci. 15 Zde budou uvedeny poznatky o vývoji biosyntézy alkaloidních skupin v těchto rostlinách. V cibulích různých druhů narcisů se nachází široké spektrum alkaloidů lišící se koncentrací, strukturním typem i množstvím jednotlivých typů alkaloidů. Podrobným rozborem alkaloidních extraktů mnoha druhů rodu Narcissus bylo zjištěno, že původními strukturními typy jsou alkaloidy lykorinového a homolykorinového typu, přičemž lykorinový typ se zdá být i nejpůvodnějším v celé čeledi Amarylliadaceae. Dokazuje to nejen jejich nejširší zastoupení napříč celou čeledí, ale také jejich dominantní zastoupení ve starších rodech Clivia a Lapiedra. Později se vyvinula syntéza haemanthaminového, tazettinového a galanthaminového typu. 53 Výzkum také poukázal na 2 odlišné cesty vývoje druhů spočívající v syntéze alkaloidů korespondující s jejich růstem. Zatímco první cesta směřovala k rozmanité syntéze strukturních skupin alkaloidů různě ukládaných v jednotlivých částech rostlin zároveň s větším růstem, která dávala rostlině větší možnost obrany a přizpůsobení se různým podmínkám prostředí (př. skupina Pseudonarcissus), druhá naopak vedla k 19

významnému omezení syntézy i vzrůstu rostliny (př. skupina Bulbocodium) či až k úplnému útlumu biosyntézy alkaloidů (př. skupina Apodanthi). 53 Na našem pracovišti byly od vydání mé předchozí práce provedeny analýzy dalších druhů a odrůd narcisů, ve kterých se podařilo identifikovat řadů známých alkaloidů i několik dalších látek, jejichž strukturu se zatím nepodařilo identifikovat. Kromě měření inhibiční aktivity vůči HuAChE a HuBuChE byla dále měřena inhibiční aktivita vůči enzymu propyloligopeptidáze (POP) u dvou izolovaných alkaloidů narwedinu a inkartinu (Obr. 5.), jež se ukázala jako zajímavá. 55 O významu inhibice POP bude pojednáno dále. 3.3 Biologická aktivita Amaryllidaceae alkaloidů (AA) O využití AA jako inhibitorů lidské acetycholinesterázy (HuAChE) a lidské butyrylcholinestarázy (HuBuChE) při léčbě AD a její patofyziologii je blíže pojednáno v mé diplomové práci 15 u rodu Narcissus, proto budou v následujících odstavcích shrnuty nové poznatky spojené s touto aktivitou u jiných druhů a dále bude věnováno více pozornosti jiným zajímavým aktivitám těchto alkaloidů. Do dnešní doby bylo testováno široké množství rodů z čeledi Amaryllidaceae, zajímavou aktivitu vůči HuBuChE vykázal sumární alkaloidní extrakt rostliny Nerine bowdenii (IC 50 = 14.8 ± 1.1 μg/ml), u které bylo detekováno 22 alkaloidů, z nichž se podařilo 19 identifikovat. 23 Dalším analyzovaným druhem z rodu Nerine byla N. undulata, která prokázala zajímavou hodnotou inhibice HuAChE (IC 50 = 14.3 ± 1.2 μg/ml). Zde se podařilo identifikovat 11 různých alkaloidů. 56 Velmi zajímavá inhibice vůči HuBuChE byla zjištěna u cibulí rostliny Sternbergia lutea (Obr. 3.). Získaná hodnota byla IC 50 = 3.7 ± 0.1 μg/ml. Přestože u této rostliny byl identifikován pouze lykorin a haemantamin, samy o sobě tyto alkaloidy významnou aktivitu neprokázaly. Není tedy zatím uspokojivě vysvětleno, co je příčinou této zajímavé hodnoty. Nabízí se možnost synergického působení více látek nebo významné působení minoritních či neidentifikovaných látek. 22 Extrakt z cibulí Chlidanthus fragrans (Obr. 4.) také prokázal dobrou míru inhibice HuAChE, konkrétně IC 50 = 20.1 ± 2.9 μg/ml. Převažovaly u něj alkaloidy tazettinového a galantaminového typu. 57 20

Podrobné fytochemické studii byl podroben druh Zephyranthes robusta, ze kterého bylo izolováno 13 alkaloidů následně testovaných na inhibiční aktivitu lidských cholinesteráz. Z izolovaných látek prokázal největší aktivitu galanthamin, dále se také zajímavou hodnotou inhibice HuAChE projevil 8-O-demethylmaritidin, alkaloid krininového strukturního typu (Obr. 5). Tato rostlina se ukázala jako zajímavý zdroj alkaloidů pro izolaci a přípravu možných derivátů. 26 Obr. 3. Sternbergia lutea 58 Obr. 4. Chlidanthus fragrans 59 21

3.3.1 Prolyloligopeptidáza Prolyloligopeptidáza (POP), také známa jako prolyl endopeptidáza spadá do skupiny serinových oligopeptidáz. Tento enzym se nachází jak v solubilní tak částicové formě v cytosolu a membránách buněk různých tkání, obzvlášť významně pak v centrální nervové soustavě. Bylo zjištěno, že v různých částech mozku se jeho koncentrace liší. 60 Funkcí POP je hydrolýza karboxylového konce prolinových částí peptidů. Mezi tyto peptidy patří například vasopresin, thyreotropní hormon (TRH), substance P, neurotensin aj. Tyto látky hrají důležitou roli v procesu učení a paměti, jsou důležitými modulátory v kognitivních procesech a jejich degradace POP může být jednou z příčin urychlení procesu stárnutí a rozvoje neurodegenerativních onemocnění jako bipolární afektivní porucha, schizofrenie, či Alzheimerova choroba. U těchto onemocnění je důležitá role neuronální komunikace pomocí různých neuropeptidů, jejíž součástí je inositol- 1,4,5- trifosfát. Metabolismus této molekuly ovlivňuje právě také POP, což může mít také svou roli při patogenezi těchto chorob. 55 Z mechanismu účinků POP vyplývá potenciální užitek z inhibice tohoto enzymu. Bylo zjištěno, že v neuroprotektivním procesu inhibitorů POP hrají svou roli i receptory mediátorů substrátů degradovaných POP (receptory pro vasopresin, TRH). Při podání antagonistů těchto receptorů se vyrušil neuroprotektivní účinek neuromediátorů indukovaných inhibitory POP. 14 V současné době probíhá výzkum potenciálních inhibitorů POP. Na našem pracovišti probíhá ve spolupráci s centrem pokročilých studií, Univerzity obrany testování inhibičních aktivit doposud izolovaných alkaloidů. U dvou alkaloidů izolovaných z rostliny Zephyranthes robusta (Obr. 6.) neaktivních vůči AChE a BuChE byla naměřena zajímavá aktivita právě vůči POP. Jednalo se o galanthin a 9-Odemethylgalanthin (Obr. 5.), přičemž právě derivát galanthinu byl přibližně 10krát aktivnější inhibitor. 62 Z rodu Narcissus byly testovány aktivity některých získaných alkaloidů. Slibné hodnoty byly zjištěny u alkaloidů inkartinu a narwedinu, které se blížily inhibici baikalinu použitého jako standardu. Je zajímavé, že i tyto dva alkaloidy se zajímavou aktivitou vůči POP byly proti AChE a BuChE neaktivní. 55 22

inkartin R = CH 3 galantin R = H 9-O-demethylgalantin 8-O-demethylmaritidin narwedin Obr. 5. Struktury vybraných alkaloidů Obr. 6. Zephyranthes robusta 61 23

Kromě přírodních látek jsou hledány inhibitory také na poli chemických látek. Vědecký tým z finské univerzity v Helsinkách zkoumal možný efekt některých psychofarmak jako anxiolytika, antidepresiva, modulátory nálady, antipsychotika aj. na inhibici POP. Některé látky se jevily jako kompetitivní, nekompetitivní i jako smíšené inhibitory. Vzhledem k vyšší lipofilitě se tyto látky snadněji dostávají přes hematoencefalickou barieru do mozku, proto se předpokládal i větší efekt působení. Bohužel určitou zajímavou inhibiční aktivitu vykázaly pouze některé testované látky. Z tohoto důvodu se tyto látky do budoucna nejeví jako potenciálně použitelné POP inhibitory. 63 Z jiného směru byla POP zkoumána na svou možnou participaci v kancerogenních procesech různých tkání. Na základě předpokladů, že se POP těchto procesů přímo účastní, byl proveden výzkum, měřící aktivitu POP v několika lidských tkáních jak zdravých tak neoplastických. Zjistilo se, že aktivita POP byla u většiny tkání postižených rakovinou znatelně vyšší, než ve zdravých tkáních stejného druhu. 64 Z uvedeného lze soudit, že POP může mít podíl při patogenezi nádorových onemocnění a bude třeba dalších studií, které by zhodnotily, zda by inhibitory POP mohly být i přínosnými léčivy v oblasti antineoplastik. 3.3.2 Protinádorová aktivita AA Některé Amaryllidaceae alkaloidy prokázaly cytotoxickou aktivitu a účinnost při regresi tumorových onemocnění. Vybrané alkaloidy jsou uvedeny blíže. 3.3.2.1 Alkaloidy lykorinového strukturního typu Lykorin inhibuje u zvířat různé rakovinné buňky. Byla prokázána účinnost proti buňkám BL6 myšího melanomu a HeLa buňkám. Zjistilo se snížení buněčné aktivity v kostní dřeni stehenní kosti, což zapříčinilo granulocytickou leukopenii a snížení produkce erytrocytů. Mechanismus účinku zřejmě spočívá v inhibici syntézy proteinů v ribozomech. Lykorin také inhibuje produkci tumor nekrotizujícího faktoru α (TNF-α) a oxidu dusného. Místem působení u suprese lidské leukémie je G2/M fáze buněčného cyklu a indukce apoptózy rakovinných buněk. 65 24

Ze skupiny lykorinových alkaloidů jsou ještě aktivní vůči některým rakovinným buňkám například karanin, pseudolykorin, galanthin a 2-O-acetylpseudolykorin. 65 Ungeremin (Obr. 7.) jakožto přírodní metabolit lykorinu je částečně zodpovědný za 66, 67 inhibiční účinek lykorinu u leukemie. 3.3.2.2 Alkaloidy homolykorinového strukturního typu Aktivní alkaloidy této skupiny jsou například homolykorin, dubiusin (Obr. 7.), hippeastrin nebo lykorenin. Prokázaly účinnost in vitro i in vivo u některých nádorových buněk. Byly to především buňky lidského jaterního karcinomu HepG2, leukemické buňky MOLT-4 a lidské buňky karcinomu prostaty. Kromě pozitivních supresivních účinků vůči těmto nádorům vykázaly tyto látky také cytotoxickou aktivitu proti nenádorovým buňkám myších fibroblastů LMTK. 3.3.2.3 Alkaloidy haemanthaminového strukturního typu Mezi antitumorálně aktivní alkaloidy této řady patří například haemanthamin, haemanthidin, krinamin a maritidin. Zmíněné látky vykazují aktivitu proti Rauscherově virové leukemii, MOLT-4 leukemii, HeLa buňkám, lidskému hepatokanceromu a dalším. Krinamin a haemanthamin mají schopnost selektivní aktivace apoptozy nádorových buňek potkaního hepatocelulárního karcinomu 5123tc bez cytotoxického působení na lidské embryonální buňky ledvin HEK 293T při stejných koncentracích. Mechanismus inhibice proteosyntézy haemanthaminem zřejmě spočívá v blokaci tvorby peptidových vazeb na 60S ribozomální podjednotce. 65 Haemanthamin a haemanthidin také prokázaly inhibici růstu buněk myšího lymfomu L5178 podobným mechanismem jako u lykorinu, tedy navázáním na trna za tvorby blokujícího komplexu. Dalším zjištěním byl popis inhibičního účinku na p53- negativní T-lymfoblastovou leukemii Jurkat. 65 Další alkaloid této řady, distichamin (Obr. 7.), vykázal cytotoxické působení k nádorovým buňkám MCF-7, HeLa, G361, K562, BJ, a CEM. U lidských buněk T- lymfoblastické leukémie v závislosti na aplikované dávce vedl k akumulaci buněk v G2 fázi buněčného cyklu a indukoval tvorbu proteinu p53. 68 25

3.3.2.4 Alkaloidy tazettinového strukturního typu U tazettinu byla zjištěna jen mírná cytotoxická aktivita proti některým rakovinným buňkám, ovšem jeho biologický prekurzor pretazettin vykázal v biologických testech silnou účinnost proti buňkám Rauscher leukemie, Lewisova karcinomu a spontánní AKR lymfocytární leukemie. Velmi vysokou aktivitu projevuje vůči T-lymfoidním buňkám MOLT-4. Působením pretazettinu docházelo k inhibici růstu HeLa buňek. 65 3.3.2.5 Alkaloidy pankratistatinového strukturního typu Důležitým alkaloidem této skupiny je narciclasin. Jeho dlouho známým účinkem je antimitotické působení na eukaryotní buňky. Mechanismus účinku spočívá v inhibici peptidyltransferázy navázáním na 60S ribozomální podjednotku, důsledkem tohoto působení je zastavení tvorby nových proteinů. Pankratistatin (Obr. 7.) zpomaluje růst HeLa buněk, působí proti leukemii a je aktivní například vůči rakovině hrtanu nebo buňkám Ehrlischova tumoru. 65 3.3.3 Antimikrobiální aktivita AA Z egyptské rostliny Amaryllis belladonna byl izolován nový alkaloid lykorinové řady amarbellisin (Obr. 7.). Spolu s dalšími izolovanými alkaloidy lykorinem, pankracinem, hippeastrinem, vittatinem a 11-hydroxyvittatinem (Obr. 7.) byla proměřena jejich antimikrobiální a antifungální aktivita. S výjimkou lykorinu a hippeastrinu, měly všechny testované alklaoidy antibakteriální efekt. Byla zjišťována aktivita vůči Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli a Staphylococcus aureus. Vůči E. coli byly alktivní pouze amarbellisin a vittatin. Vůči P. aeruginosa byl aktivní pouze vittatin, zatímco vůči S. aureus prokázaly aktivitu všechny 4 alkaloidy. Antifungální účinek (vůči Candida albicans) vykázaly však všechny testované alkaloidy, přičemž nejaktivnější se ukázal lykorin, amarbellisin a hippeastrin. 69 26

Další antimikrobiální studii byl podroben extrakt (CH 2 Cl 2 /MeOH) z listů rostliny Crinum purpurascens z čeledi Amaryllidaceae. Ten byl testován vůči 6 agens a to E. coli, P. aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, Salmonella typhi a Salmonella paratyphi B. Extrakt ukázal zajímavou inhibiční aktivitu vůči všem použitým mikrobům. Následně byly z extraktu izolovány 2 alkaloidy, hippadin a pratorimin, a jedna steroidní látka. Pratorimin nejevil žádné antibakteriální účinky. Hippadin byl aktivní vůči všem patogenům kromě P. aeruginosa a K. pneumoniae. Přestože účinek hippadinu byl označen za baktericidní, byl až o 150krát méně účinný než standard ciprofloxacin. 70 Hymenocallis littoralis (Obr. 8.) je dalším druhem podrobeným testování aktivity vůči mikrobům. Petroletherový extrakt této rostliny byl studován v účinnosti proti Gram-pozitivní bakterii S. aureus a Gram-negativní P. aeruginosa a E. coli. Vůči E. coli. a kvasince C. albicans nebyla zjištěna žádná aktivita. Zbylé 2 bakteriální kmeny byly ektraktem inhibovány v růstu, ale jen v poloviční efektivitě oproti standardům ciprofloxacinu a cefalosporinu. 71 Další dva druhy rostlin z rodu Crinum byly podrobeny vyhodnocení antimikrobní aktivity. Alkaloidní extrakty z rostlin Crinum latifolium (Obr. 9.) a Crinum asiaticum rostoucí ve Vietnamu, které obsahovaly identifikované alkaloidy lykorin, pratorinin, krinin, crinamidin, 1-O-acetyllykorin, 1,2-di-O-acetyllykorin a lykorin-1,2-di-o-β-dglukosid, prokázaly silnou aktivitu vůči Gram-pozitivní bakterii Sarcina lutea. Izolovaný alkaloid pratorinin byl pak aktivní vůči Gram-pozitivnímu koku S. aureus. 72 Alkaloidní extrakt z cibulí Crinum angustum, který obsahoval alkaloidy patřící do 6 strukturních typů, byl testován na aktivitu vůči vybraným kmenům bakterií včetně dvou rezistentních forem bakterií, methicillin rezistentní S. aureus a carbapenemázu produkující K. pneumoniae. Extrakt vykázal zajímavou účinnost vůči 6 z 9 testovaným kmenům, přičemž převládal efekt proti Gram-pozitivním bakteriím než Gramnegativním. Byla také potvrzena aktivita vůči kvasince C. albicans a slibnou aktivitu prokázal extrakt také u rezistentních testovaných kmenů. 73 Alkaloid narciklasin sám o sobě disponoval aktivitou vůči hned několika patogením organismům. Inhiboval růst Corynebacterium fascians a kvasinky Cryptococcus neoformans. Jeho deriváty, jako 2,3,4,7-tetra-O-acetylnarciklasin inhibovaly patogenní bakterii Neisseria gonorrhoeae. 27

ungeremin dubiusin distichamin pankratistatin amarbellisin R = H vittatin R = OH 11-hydroxyvittatin Obr. 7. Struktury vybraných alkaloidů s protinádorovou a antimikrobiální aktivitou. 28

Obr. 8. Hymenocallis littoralis 74 Obr. 9. Crinum latifolium 75 29

3.3.4 Neuroprotektivní aktivita AA Kromě inhibiční aktivity AA vůči AChE vyvstávají otázky na jejich neuroprotektivní účinky a případnou souvislost s inhibicí AChE. Byla provedena srovnávací studie, ve které byly zkoumány alkaloidní extrakty 5 druhů rostlin čeledi Amaryllidaceae: Crinum jagus, C. bulbispermum, Hippeastrum barbatum, H. puniceum a Zephyranthes carinata. Alkaloidní extrakt z druhu C. jagus obsahující převážně lykorin a vittatin, tedy alkaloidy lykorinové a krininové řady, prokázal určité neuroprotektivní působení u kortikálních neuronů vystavených oxidačnímu stresu z působení glutamátu. Byla tedy vyhodnocována protekce neurotoxického působení glutamátu na tyto neurony. Zároveň byla zjištěna znatelná inhibice AChE extraktem Z. carinata, u které převažovaly alkaloidy galanthaminového a lykorinového typu. Na základě těchto výsledků a vyhodnocení dalších studií se autoři domnívají, že neuroprotektivní účinek může být vázán na lykorinové a krininové alkaloidy, zatímco inhibiční účinek na AChE je vázán na alkaloidy galanthaminového typu. Případné synergické působení těchto alkaloidů stejně jako potvrzení či vyvrácení, zda nositelem účinnosti nejsou také minoritně zastoupené alkaloidy, je třeba prokázat dalšími studiemi. 76 3.3.5 Antivirotická aktivita Lykorin a pseudolykorin vykázali široké spektrum antivirotického působení. Bylo provedeno několik studií, ve kterých byla prokázána účinnost vůči flaviviru, Punta Toro a Rift Valley chřipkovému viru. Lykorin dále působil proti koronavirem zprostředkovanému akutnímu těžkému respiračnímu syndromu (SARS-CoV). Slibný efekt projevil také u herpes virů typu 1. Studie působení alkaloidů proti virům poukázala na možnou strukturální souvislost antivirotického účinku s výskytem hexahydroindolového kruhu se dvěma funkčními hydroxylovými skupinami. Mechanismem účinku je zřejmě snížení aktivity virové DNA-polymerázy, a tudíž inhibice multiplikace virových jednotek uvnitř buňky, spíše než inaktivace extracelulárně se vyskytujícího viru. 65 30

Zajímavá biologická aktivita byla zjištěna u dalšího AA pretazettinu (Obr. 10.). Účinně se projevil proti některým RNA flavivirům a bunyavirům. Slibnou aktivitu prokázal také proti herpes simplex viru. Mechanismus účinku zřejmě tkví v inhibici proteinové syntézy během replikace viru. Mezi některé další alkaloidy s antivirotickou aktivitou můžeme dále zařadit narciklasin (Obr. 10.) s účinností proti RNA flavivirům a bunyavirům, haemanthamin a hippeastrin účinný proti herpes simplex virům typu 1 nebo homolykorin s vysokou aktivitou, ale nízkým terapeutickým indexem. 65 3.3.6 Další účinky AA Jak bylo výše uvedeno, Amaryllidaceae alkaloidy vykazují rozmanitou paletu biologických aktivit. Z výše neuvedených lze jmenovat například hypotenzní účinek dubiusinu, lykoreninu, 8-O-demethylhomolykorinu a homolykorinu, prokázaný u normotenzních krys nebo vasodilatační efekt lykorinu, jehož příčinou je blokáda α- adrenergních receptorů. 65 Haemanthamin, hemanthidin (Obr. 10.) a krinamin disponují také antimalarickou aktivitou vůči Plasmodium falciparum. 65 Lykorenin a hemanthidin mají silnou analgetickou a antiflogistickou účinnost, dokonce vyšší než aspirin. Vitattin se projevil jako účinné koanalgetikum morfinu. Tento efekt prokázal také narwedin. 65 pretazettin narciklasin haemanthamin haemanthidin Obr. 10. Struktury vybraných alkaloidů s antivirotickými a antimalarickými účinky 31

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 32

4.1 Všeobecné postupy 4.1.1 Destilace a odpařování Rozpouštědla byla před použitím destilována, nejprve byl zachycen předek (asi 5 %, většinou s vodným azeotropem), poté bylo destilováno zbylých cca 90 % rozpouštědla. Rozpouštědla byla uchovávána v hnědých nádobách. Odpařování extraktů bylo prováděno na vakuové odparce Bűchi Rotavapor R 114 vybavené vodní lázní Bűchi Waterpath B-480 při 40 C za sníženého tlaku. 4.1.2 Materiál a vybavení 4.1.2.1 Rozpouštědla Diethylamin, p.a. (Lachner) Diethyleter, p.a. (Penta) Ethanol 95%, denaturovaný methanolem, p.a. Ethylacetát, p.a. (Penta) Methanol LC-MS CHROMASOLV (Sigma-Aldrich) Toluen, p.a. (Penta) 4.1.2.2 Chemikálie Amoniak, 25% vodný roztok, p.a. (Lachema) Kyselina chlorovodíková 35%, p. a. (Lachema) 4.2 Příprava sumárních extraktů a GC/MS analýza 4.2.1 Biologický materiál Čerstvé cibule rostlin Narcissus bulbocodium var. conspicus, N. cv. Fortissimo, N. cv. Delnashaugh, N. cv. Sealing, N. cv. Ice Follies a N. canaliculatus byly získány od komerčního prodejce Lukon Glands (Sadská, Česká republika). Verifikace vzorků byla provedena Prof. RNDr. Lubomírem Opletalem CSc. Dokladné vzorky rostlin jsou uloženy v herbáři na Katedře farmaceutické botaniky a ekologie Farmaceutické fakulty v Hradci Králové pod následujícími čísly: 33

CUFPH-16130/AL-437 (N. cv. Fortissimo) CUFPH-16130/AL-438 (N. cv. Sealing) CUFPH-16130/AL-439 (N. bulbocodium var. conspicus) CUFPH-16130/AL-440 (N. canaliculatus) CUFPH-16130/AL-445 (N. cv. Ice Follies) CUFPH-16130/AL-451 (N. cv. Delnashaugh) 4.2.2 Příprava ethanolového a alkaloidního extraktu Čerstvé cibule narcisů byly rozdrobeny a extrahovány ethanolem (3 krát po 125 ml) při teplotě varu ethanolu 30 minut. Po následné filtraci přes křemelinu bylo rozpouštědlo odpařováno na vakuové odparce. Po odpaření do sucha byl zbytek rozpuštěn v 10 ml 2% HCl a vytřepán diethyletherem (3 15 ml) pro odstranění neutrálních sloučenin. Dalším krokem byla úprava ph na cca 9-10 přidáním 25% amoniaku k vodné fázi. Vodná fáze byla vytřepána ethylacetátem (3 15 ml) a organická odpařena do sucha. Ke konečnému vysušení došlo v exsikátoru. Z každého odparku bylo odebráno 2 krát 10 mg extraktu na biologické testy, dále byl připraven vzorek pro GC/MS analýzu o koncentraci 1 mg/ml. Zbývající extrakty byly uloženy pro případné využití. 4.2.3 GC/MS analýza a identifikace alkaloidů Alkaloidy jednotlivých alkaloidních extraktů byly identifikovány pomocí plynového chromatografu Agilent 7890A GC 5975 inert pracující s hmotnostním detektorem při elektronové ionizaci 70 ev (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Separace byla prováděna na koloně DP-5 MS (30 m 0.25 mm 0.25 μm, Agilent Technologies Santa Clara, CA, USA). Teplotní program: z 100 C na 150 C 15 C/min, 1 min stabilizováno na 180 C a z 180 C na 300 C po 5 C/min a 35 min udržována na hodnotě 300 C. Teplota nástřiku 280 C. Průtoková rychlost nosného plynu (helium) byla 0.8 ml/min. Detekční rozmezí bylo m/z 35-600, a teplota detektoru 200 C. Nástřik 1 µl alkaloidního roztoku (1 mg/ml) byl prováděn ve split módu (split poměr 1:10). Jednotlivé alkaloidy byly identifikovány porovnáním jejich hmotnostních spekter s daty v knihovně NIST, s publikovanými spektry v literatuře a také se spektry referenčních sloučenin dříve izolovaných v naší laboratoři. 34

4.3 Stanovení inhibiční aktivity alkaloidních extraktů a čistých alkaloidů vůči erytrocytární AChE a sérové BuChE 4.3.1 Chemikálie a materiál použité pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity 4.3.1.1 Chemikálie Acetylthiocholin jodid (Sigma-Adrich) (použit 10mM roztok) Butyrylthiocholin jodid (Sigma-Adrich) (použit 10mM roztok) Dimethylsulfoxid p. a. (Sigma-Adrich) 5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina 98% (Sigma-Aldrich) (použit 5mM roztok) Galanthamin hydrobromid (Changsha Organic Haerb Inc., China) Huperzin A (TAZHONGHUI Tai an zhonghui Plant Biochemical Co., Ltd., China) 4.3.1.2 Pufry 5mM Fosfátový pufr ph 7,4 Zásobní roztok A 10 mm roztok NaH 2 PO 4 (v 1 litru roztoku je obsaženo 1,20 g NaH 2 PO 4, nebo 1,38 g NaH 2 PO 4.H 2 O, nebo 1,56 g NaH 2 PO 4.2 H 2 O). Zásobní roztok B 10 mm roztok Na 2 HPO 4 (v 1 litru roztoku je obsaženo 1,42 g Na 2 HPO 4, nebo 1,78 g Na 2 HPO 4.2 H 2 O, nebo 3,58 g Na 2 HPO 4.12 H 2 O). Smíchá se 57 ml roztoku A a 283 ml roztoku B a 300 ml vody. 5mM Fosfátový pufr ph 7,4 obsahující 150 mm chloridu sodného 8,766 g chloridu sodného p. a. se rozpustí v 5mM fosfátovém pufru ph 7,4 a doplní se jím do 1000 ml. 100mM Fosfátový pufr, ph 7,4 Zásobní roztok A 200 mm roztok NaH 2 PO 4 (v 1 litru roztoku je obsaženo 24,0 g NaH 2 PO 4, nebo 27,6 g NaH 2 PO 4.H 2 O, nebo 31,2 g NaH 2 PO 4. 2 H 2 O). 35

Zásobní roztok B 200 mm roztok Na 2 HPO 4 (v 1 litru roztoku je obsaženo 28,4 g Na 2 HPO 4, nebo 35,6 g Na 2 HPO 4.2 H 2 O, nebo 71,63 g Na 2 HPO 4.12 H 2 O). Smíchá se 57 ml roztoku A a 243 ml roztoku B a 300 ml vody. 4.3.1.3 Biologický materiál Jako zdroj acetylcholinesterasy (HuAChE) byl použit hemolyzát lidských erytrocytů. Zdrojem butyrylcholinesterasy (HuBuChE) byla lidská plazma. Měření bylo prováděno v mikrotitračních destičkách. 4.3.2 Přístroj použitý pro stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity Reader Synergy TM HT Multi-Detection Microplate Reader (BioTek, USA) 4.3.3 Podmínky měření Experimenty byly prováděny za těchto podmínek: při teplotě 37 C v prostředí fosfátového pufru (ph 7,4) při vlnové délce spektrofotometru 436 nm v mikrotitračních destičkách 4.3.4 Příprava hemolyzátu lidských erytrocytů Erytrocyty se získají z čerstvě odebrané citrátované krve zdravých dobrovolníků (18 ml krve + 2 ml 3,4% roztoku citrátu). Bezprostředně po odběru se krev rozdělí stejnoměrně po 5 ml do šroubovacích zkumavek a provede se centrifugace při rychlosti 4000 rpm při 4 C po dobu 10 minut. Po této první centrifugaci se plazma odsaje tak, aby v ní nebyly erytrocyty, a uchovává se do doby stanovení aktivity BuChE v chladničce při 4 C (nejdéle však 6 hodin). Zbytek plazmy z erytrocytárního sedimentu se opatrně odsaje bezpopelovým filtračním papírem s hlazeným povrchem, jehož špička je sestřižena (při naklonění zkumavek), odečte se objem erytrocytární masy a tento sediment se zředí takovým množstvím 5 mm fosfátového pufru ph 7,4 obsahujícím 150 mm chloridu sodného a suspense se rozdělí do zkumavek o objemu 13 ml, aby těchto zkumavek bylo 8 a objem v každé z nich byl 10-12 ml, obsah se dobře promíchá a provede se centrifugace 36

stejným způsobem, jak je uvedeno výše při oddělování plazmy. Promytí tímto způsobem se provede celkem 3x a promývací kapalina se dokonale odstraní. Po tomto promytí se přidá takové množství 5 mm fosfátového pufru ph 7,4 bez obsahu chloridu sodného, aby byl objemový poměr erytrocyty : pufr 1 : 9, směs se opět homogenizuje, přelije do Erlenmayerovy baňky a erytrocyty se ponechají spontánně hemolyzovat za míchání teflonovým míchadlem při 300 rpm. Ihned po skončení této řízené hemolýzy se u suspenze stanoví aktivita, případně se 5mM fosfátovým pufrem upraví absorbance (hodnota absorbance musí být 0,08 0,15) a naředěný hemolyzát se uchovává do doby použití při -22 C. Cholinesetrasová aktivita plazmy se stanoví stejným způsobem (hodnota absorbance musí být 0,15 0,20), uchovává se stejným způsobem jako hemolyzát. 4.3.5 Stanovení cholinesterázové inhibiční aktivity (hodnoty IC 50 ) Pro stanovení hodnoty IC 50 byla použita Ellmanova spektrofotometrická metoda s použitím 5,5 -dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB) 77. Jako substráty se používají estery thiocholinu, které jsou cholinesterázami štěpeny na thiocholin a příslušnou kyselinu. Stanovuje se SH- skupina thiocholinu, která se naváže na DTNB za vzniku žlutě zbarveného produktu, který se stanovuje spektrofotometricky při vlnové délce 436 nm. Sleduje se nárůst absorbance za 1 minutu. Hodnoty IC 50 byly vypočítány z naměřených hodnot poklesu aktivity acetylcholinesterázy nebo butyrylcholinesterázy nelineární regresí v programu GraphPaD Prism (verze 3.02 pro Windows; výrobce Graph PaD Software, San Diego, CA, USA). Výsledky byly porovnány s hodnotami IC 50 známých inhibitorů cholinesteráz: galataminem (IC 50 HuAChE = 0,63 ± 0,025 μg/ml, HuBuChE = 15,58 ± 0,48 μg/ml) a huperzinem A (IC 50 HuAChE = 7,99 ± 0,24 x 10-3 μg/ml, HuBuChE >500 μg/ml). % I (inhibice) byla počítána dle vzorce: kde ΔA BL je nárůst absorbance slepého vzorku za 1 minutu a ΔA SA je nárůst absorbance měřeného vzorku. 37

5 VÝSLEDKY A DISKUZE 38

5.1 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus bulbocodium var. conspicus a jeho GC/MS analýza Při fytochemické GC/MS analýze tohoto botanického druhu narcisu (Obr. 11.), bylo detekováno 10 alkaloidních látek, z nichž 4 se podařilo identifikovat na základě porovnání jejich spekter s databází NIST a literaturou. Plný výčet změřených látek shrnuje tabulka na následující straně (Tab. II). Nejvyšší zastoupení měl identifikovaný alkaloid tazettin jak je zachyceno na chromatografickém záznamu (Obr. 12). Vedle tazettinu se podařilo identifikovat dvě látky lykorinového strukturního typu lykorin a didehydroassoanin. Ostatní látky se bohužel na základě hmotnostního spektra nepodařilo identifikovat. S velkou pravděpodobností se může jednat o látky nové doposud nepopsané. Je vysoká šance, že tyto relativně nezajímavé alkaloidy jsou spojeny s biologickou aktivitou jak identifikovaných tak látek, které se identifikovat nepodařilo. Zajímavou látkou je látka označená A6 a to vzhledem k vysokému zastoupení v extraktu (32% TIC). Šance na izolaci a strukturní identifikaci je ve srovnání s ostatními neidentifikovanými látkami vysoká. Inhibiční aktivita alkaloidního extraktu byla vůči AChE (IC 50 = 52,05 ± 6,19 µg/ml) nevýrazná, ale vůči BuChE Obr. 11. Narcissus bulbocodium var. conspicus 78 39

(IC 50 = 22,37 ± 3,14 µg/ml) byla průměrná. Nízké zastoupení alkaloidů lykorinového typu, které jsou známy svou nízkou inhibiční aktivitou 79, spolu s vysoce zastoupeným neidentifikovaným alkaloidem může být příčinou nízké aktivity vůči HuAChE. Navíc alkaloidy tazettinového typu jak známo nejsou nositeli silného inhibičního efektu vůči AChE. Pro srovnání strukturních odlišností obou skupin identifikovaných alkaloidů jsou vyobrazeny 2 z popsaných látek na Obr. 13. Inhibice HuBuChE byla oproti tomu zajímavější, zatím však stále nejsme schopni říct, které alkaloidní struktury jsou za tyto účinky zodpovědné, proto může být tato hodnota výsledkem působení majoritně zastoupené neidentifikované látky, či silně aktivní látkou minoritně obsaženou, stejně jako synergické působení více látek v extraktu. 6 látek se nám identifikovat nepodařilo a právě pro zajímavou hodnotu inhibice HuBuChE a velkým portfoliem neznámých látek včetně majoritně zastoupené neznámé látky skýtá tato rostlina potenciál pro další analýzu a izolaci neznámých alkaloidů. 40

Tabulka II Sloučenina GC/MS analýza alkaloidního extraktu N. bulbocodium var. conspicus. RT a (min) RI 1 A1 16,94 2264 2 6- Epimesembrenol 17,54 2301 3 Tazettin 22,75 2645 4 Didehydroassoanin 23,19 2676 5 A2 c 23,43 2692 6 A3 c 23,65 2707 7 A4 c 23,80 2718 8 Lykorin 24,06 2734 9 A5 c 24,72 2784 10 A6 c 26,82 2939 [M + ] a charakterisktické ionty, m/z (% relativní intenzita) 287(5), 272(5), 257(5)203(40), 115(5), 70(100) 301(4), 288(4), 273(4), 219(42), 70(100) 331(20), 316(20), 298(25), 247(100), 230(10) 265(84), 264(100), 248(15), 220(14), 191(14), 178(16), 133(10) 316(12), 259(25), 258(32), 257(75), 256(35), 247(20), 229(40), 226(75), 225(100), 199(27), 197(20), 139(32) 341(18), 317(25), 247(100), 242(25), 230(26), 221(24), 200(20), 199(28), 173(20), 152(17), 115(20), 96(27) 389(100), 388(32), 387(30), 358(60), 325(35), 265(31), 241(60), 210(25), 191(30), 148(30), 135(30), 116(30) 287(35), 286(30), 268(20), 250(15), 227(70), 226(100) 315(42), 266(33), 242(25), 241(98), 240(100), 226(12), 196(10) 315(8), 296(18), 295(98), 294(100), 284(20), 288(12), 266(11), 250(10), 178(9), 148(11) % TIC b 11 Reference pro MS 4 51 34 NIST 3 80 3 2 1 7 NIST a podmínky GC/MS analýzy viz experimentální část, b celkový iontový proud, c nebylo identifikováno 3 32 41

100 3 10 50 1 5 6 7 8 2 4 9 18 20 22 24 26 28 Obr. 12. Chromatografický záznam alkaloidního extraktu z cibulí N. bulbocodium var. conspicus 3 tazettin 8 lykorin Obr. 13. Vybrané struktury identifikovaných látek v rostlině N.bulbocodium var. conspicus 42

5.2 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Fortissimo a jeho GC/MS analýza V alkaloidním extraktu z cibulí Narcissus cv. Fortissimo (Obr. 14.) bylo určeno 9 látek alkaloidní povahy, z nichž se 6 podařilo identifikovat. Tyto alkaloidy se řadí do galantaminového, krininového, lykorinového a homolykorinového strukturního typu (Tab. III; Obr. 16.). 3 látky se nám na základě jejich MS spekter nepodařilo identifikovat. Zbylých 6 bylo určeno na základě porovnání dat s databází NIST a literatury. Výrazně zastoupený galantamin společně s dalšími alkaloidy galantaminového a lykorinového strukturního typu (Obr. 16.) je s velkou pravděpodobností zodpovědný za zajímavou inhibiční aktivitu vůči AChE IC 50 = 11,8 ± 0,66 µg/ml. Zbylé identifikované alkaloidy krininové a homolykorinové řady dle literatury nejeví významné inhibiční účinky na cholinové esterázy. 79 Aktivita extraktu vůči HuBuChE IC 50 = 37,90 ± 3,41 µg/ml je spíše nezajímavá. Minoritní zastoupení neidentifikovaných alkaloidů společně s nízkou aktivitou vůči HuBuChE a aktivitou vůči HuAChE vysvětlenou přítomností galantaminu činí tuto rostlinu dále spíše neperspektivní pro budoucí fytochemické práce. Obr. 14. Narcissus cv. Fortissimo 81 43

Tabulka III GC/MS analýza alkaloidního extraktu N. cv. Fortissimo Sloučenina RT a [M + ] a charakterisktické ionty, Reference RI %TIC b (min) m/z (% relativní intenzita) pro MS 1 Galanthamin 19,09 2400 287(90), 286(100), 270(20), 244(30), 230(5), 216(45) 30 NIST 2 Lykoramin 19,34 2417 289(65), 288(100), 274(10), 232(10), 202(30) 2 NIST 4 Krinin 20,08 2465 271(100), 254(8), 242(8), 228(25), 216(14), 199(48), 14 NIST 187(43) 5 B1 c 22,24 2476 285(33), 284(33), 274(13), 273(62), 272(63), 252(13), 216(18), 188(30), 187(33), 174(19), 115(19), 109(100) 2 6 O- Methyllykorenin 20,53 2494 7 B3 c 20,62 2499 8 Galantin 23,64 2706 9 Homolykorin 24,34 2757 331(1), 300(3), 207(5), 191(10), 147(5), 110(9), 109(100), 94(3), 82(2) 1 82 273(100), 230(25), 203(21), 202(25), 201(95), 189(58), 175(24), 174(21), 157(20), 2 128(22), 115(23) 317(30), 298(15), 284(15), 268(15), 243(100), 242(95) 44 NIST 301(-), 207(1), 178(3), 110(8), NIST + 109(100), 108(20), 94(3), 2 standard 82(3) a podmínky GC/MS analýzy viz experimentální část, b celkový iontový proud, c nebylo identifikováno 44

1 8 50 4 7 2 3 5 6 9 19 20 21 22 23 24 25 Obr. 15. Chromatografický záznam alkaloidního extraktu z cibulí N. cv. Fortissimo 1 galanthamin 4 krinin Obr. 16. Vybrané struktury identifikovaných látek v rostlině N. cv. Fortissimo 45

5.3 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Delnashaugh a jeho GC/MS analýza Celkem 9 alkaloidů bylo nalezeno při fytochemické analýze kultivaru Narcissus cv. Delnashaugh (Obr. 17.). Identifikované alkaloidy patří do dvou strukturních skupin lykorinových a galantaminových alkaloidů s výjimkou haemanthaminu, který je zástupcem své vlastní skupiny. Níže uvedená tabulka předkládá úplný výčet určených alkaloidů a jejich hmotnostních spekter (Tab IV). Graf na Obr. 18 poté vyobrazuje zastoupení jednotlivých látek, z něhož je čitelné, že nejvíce je v extraktu obsažen galantamin a galantin. Právě příslušnost valné většiny alkaloidů v extraktu k lykorinovým a galantaminovým strukturním skupinám je zřejmě také příčinou velmi zajímavé inhibiční aktivity vůči HuAChE (IC 50 = 8,43 ± 0,71 µg/ml). Ve vysokém zastoupení byl také zjištěn alkaloid haemanthamin spadající do vlastní skupiny haemanthaminových alkaloidů, podobných skupině krininových, od kterých se liší pouze izomerií ethylenového můstku v pozici 5,10. Ani jeden z těchto strukturních typů ovšem neukázal zajímavou aktivitu vůči lidským cholinesterázám jak je dosud známo z literatury. 84 Zatím jedinou výjimkou se jeví alkaloidy undulatin a Obr. 17. Narcissus cv. Delnashaugh 83 46

8-O-demethylmaritidin, které určitou aktivitu prokázaly. Zvláště undulatin, alkaloid krininového strukturního typu, prokázal zajímavou inhibiční aktivitu vůči AChE a také pasivní permeabilitu přes hematoencefalickou bariéru. 85 Oproti slibnému výsledku inhibice HuAChE byla míra inhibičního působení na HuBuChE nezajímavá (IC 50 = 46,09 ± 6,41 µg/ml). Na následujícím obrázku (Obr. 19.) jsou uvedeny struktury některých alkaloidů identifikovaných v alkaloidním profilu studované rostliny. Z výše zmíněných důvodů se tato rostlina jeví spíše jako nezajímavá pro podrobnou fytochemickou studii. Tabulka IV GC/MS analýza alkaloidního extraktu N. cv. Delnashaugh. RT a [M + ] a charakterisktické ionty, % Reference Sloučenina RI (min) m/z (% relativní intenzita) TIC b pro MS 287(90), 286(100), 270(20), 1 Galanthamin 19,09 2400 35 NIST 244(30), 230(5), 216(45) 2 N- demethylgalantamin 19,34 2436 3 Elwesin 21,14 2535 4 Pluviin 21,59 2566 5 Assoanin 21,74 2576 6 Haemanthamin 22,50 2627 7 Didehydroassoanin 23,17 2674 8 Galanthin 23,61 2705 9 9-Omethylpseudolykorin 24,62 2777 273(80), 272(100), 230(33), 202(27), 174(12) 2 86 273(100), 256(14), 244(16), 230(25), 203(25), 201(100), 189(55), 175(25), 157(30), 2 NIST 131(17), 115(25) 287(81), 286(48), 268(52), 254(15), 243(66), 242(100), 17 NIST 228(23) 267(60), 266(100), 250(27), 222(10), 193(7), 180(10) 2 87 301(15), 272(100), 240(15), 225(5), 211(15) 14 NIST 265(82), 264(100), 248(17), 220(14), 191(14), 178(18) 1 80 317(30), 298(15), 284(15), 268(15), 243(100), 242(95) 25 NIST 303(28), 302(20), 284(20), 244(19), 243(96), 242(100), 2 NIST 228(17), 162(24) a podmínky GC/MS analýzy viz experimentální část, b celkový iontový proud, c nebylo identifikováno 47

100 1 8 50 4 6 2 3 5 7 9 19 20 21 22 23 24 25 Obr. 18. Chromatografický záznam alkaloidního extraktu z cibulí N. cv. Delnashaugh 2 N-demethylgalanthamin 4 pluviin 9 9-O-demethypseudolykorin Obr. 19. Vybrané struktury identifikovaných látek v rostlině N. cv. Delnashaugh 48

5.4 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Sealing a jeho GC/MS analýza V alkaloidním profilu cibulí okrasného kultivaru Narcissus cv. Sealing (Obr. 20.) bylo identifikováno nejširší spektrum látek ze všech studovaných rostlin. Celkem se podařilo určit 13 látek alkaloidní povahy, z nichž bylo 10 identifikováno. Identifikované alkaloidy lze zařadit do 4 různých strukturních skupin, z nichž největší podíl náleží alkaloidu haemanthaminu. Dalšími významně zastoupenými alkaloidy jsou galantamin a galantin, tedy skupiny galantaminové a lykorinové (Tab. V). Ostatní určené látky patří do řady homolykorinové, především pak homolykorin sám. Tento alkaloid byl v mé předchozí práci izolován z rostliny Narcissus cv. Sir W. Churchilli a podroben analýze inhibiční aktivity vůči esterázám, bohužel nebyly zjištěny zajímavé hodnoty biologické aktivity. 15 Jak je známo, alkaloidy lykorinové řady s výjimkou lykorinu samotného jsou dobrými inhibitory AChE. 79, 88 Alkaloid inkartin v tomto extraktu tuto aktivitu spíše postrádá. 89 Majoritní zastoupení haemanthaminu, které můžeme také vidět na chromatografickém záznamu (Obr. 21.), a spíše menší obsah alkaloidů galantaminové a lykorinové řady je zřejmě příčinou ne příliš významného inhibičního působení na HuAChE (IC 50 = 27,79 ± 2,30 µg/ml). Také IC 50 HuBuChE nedosahovala vysokých hodnot (IC 50 = 38,66 ± 4,64 µg/ml). Na Obr. 22. je kromě struktury hippeastrinu zaznamenána struktura alkaloidu assoaninu, který patří mezi nejaktivnější inhibitory lykorinového typu. 90 Další podrobnější zkoumání této rostliny je vzhledem k výše zmíněným důvodům spíše nepravděpodobné. Obr. 20. Narcissus cv. Sealing 90 49

Tabulka V GC/MS analýza alkaloidního extraktu N. cv. Sealing. [M + ] a charakterisktické RT a Sloučenina RI ionty, m/z (% relativní (min) intenzita) 1 Galanthamin 19,09 2400 2 Lykoramin 19,35 2417 3 D1 c 21,09 2532 4 D2 c 21,48 2558 5 Assoanin 21,76 2575 6 Haemanthamin 22,54 2630 7 11,12- Didehydroassoanin 23,18 2677 8 Galantin 23,61 2705 9 Lykorin 24,07 2738 10 Inkartin 24,07 2752 11 Homolykorin 24,36 2758 12 Hippeastrin 26,04 2880 13 D3 c 26,83 2940 287(90), 286(100), 270(20), 244(30), 230(5), 216(45) 289(65), 288(100), 274(10), 232(10), 202(30) 329(70), 328(84), 270(33), 269(48), 267(22), 266(46), 254(22), 242(34), 240(30) 287(75), 286(100), 270(22), 266(19), 258(25), 243(15), 242(45), 230(11) 267(60), 266(100), 250(27), 222(10), 193(7), 180(10) 301(15), 272(100), 240(15), 225(5), 211(15) 265(82), 264(100), 248(17), 220(14), 191(14), 178(18) 317(30), 298(15), 284(15), 268(15), 243(100), 242(95) 287(35), 286(30), 268(20), 250(15), 227(70), 226(100) 333(45), 332(100), 296(30), 259(70), 258(85), 250(30) 301(-), 207(1), 178(3), 110(8), 109(100), 108(20), 94(3), 82(3) 315(-), 162((4), 134(4), 125(100), 96(36), 82(3) 295(93), 294(100), 278(11), 250(7), 237(5), 221(6), 208(5), 194(6), 178(7), 148(14) % TIC b Reference pro MS 16 NIST 2 NIST 3 1 3 87 43 NIST 2 80 16 NIST 3 NIST 2 NIST 4 NIST 2 NIST a podmínky GC/MS analýzy viz experimentální část, b celkový iontový proud, c nebylo identifikováno 2 50

100 6 8 1 50 10 11 2 3 4 5 7 9 12 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Obr. 21. Chromatografický záznam alkaloidního extraktu z cibulí N. cv. Sealing 5 assoanin 12 hippeastrin Obr. 22. Vybrané struktury identifikovaných látek v rostlině N. cv. Sealing 51

5.5 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus cv. Ice Follies a jeho GC/MS analýza Tento zahradní druh narcisu na první pohled zaujme ledově bílými okvětními listy (Obr. 23.). Cibule této rostliny byly podrobeny fytochemické práci se ziskem širokého spektra alkaloidů. Chromatografický záznam z GC-MS analýzy je na obrázku dále (Obr. 24.). Celkem bylo určeno 10 alkaloidů patřících do 5 různých strukturních skupin. Jedna látka zůstala neznámá. Největší podíl z obsahu alkaloidů zastupoval galantamin, který spolu s narwedinem patří do skupiny galantaminových alkaloidů (Tab. VI). Dalšími hojně zastoupenými strukturními typy byly alkaloidy homolykorinové řady zde zastoupené massoninem, hippeastrinem, odulinem a jeho derivátem O- methylodulinem a haemanthaminové prezentující se samotným haemanthaminem, jenž zaujímá pětinu z naměřeného obsahu. Lykorin a krinín, kteří jsou zástupci vlastních strukturních řad, byli zastoupeni minoritně. Naměřená aktivita u tohoto extraktu byla velmi zajímavá a ve srovnání s ostatními rostlinami v této práci dosáhla nejlepších výsledků. Hodnota pro HuAChE byla IC 50 = 7,28 ± 0,66 µg/ml a pro HuBuChE dokonce IC 50 = 14,95 ± 2,01 µg/ml. Inhibice acetylcholinesterázy se blíží inhibici galantaminu a s vysokou pravděpodobností bude způsobena právě jeho vysokým zastoupením, neboť ostatní zde nalezené skupiny aktivitu vůči HuAChE spíše postrádají. 79, 88, 91 Zajímavou inhibiční aktivitu, kterou extrakt projevil proti HuBuChE však zatím přesně vysvětlit nedokážeme. Nabízí se možnost synergického působení homolykorinových alkaloidů, byť homolykorin sám takovou aktivitu nemá. 15 Také Obr. 23. Narcissus cv. Ice Follies 92 52

neidentifikované látky mohou být vysoce aktivní i v malém množství. Pro potvrzení či vyvrácení bude potřeba dalších studií v tomto směru. Pro zajímavý výsledek extraktu při tlumení HuBuChE skýtá Narcissus cv. Ice Follies potenciál k dalšímu zkoumání, zda některé z jeho alkaloidů jsou nositeli tohoto účinku. Na Obr. 25. jsou 2 zástupci alkaloidů z homolykorinové řady nalezené v této rostlině. Tabulka VI GC/MS analýza alkaloidního extraktu N. cv. Ice Follies. Sloučenina RT a [M + ] a charakterisktické ionty, RI (min) m/z (% relativní intenzita) 1 Galanthamin 19,10 2401 287(90), 286(100), 270(20), 244(30), 230(5), 216(45) 2 Lykorin 19,36 2418 287(35), 286(30), 268(20), 250(15), 227(70), 226(100) 287(65), 286(100), 258(5), 3 E1 c 19,68 2440 244(5), 230(6), 218(15), 216(10), 202(22), 187(17) 4 O- 315(<1), 284(2), 250(1), 19,72 2442 Methylodulin 175(10), 109(10) 271(100), 254(8), 242(8), 5 Krinin 20,08 2465 228(25), 216(14), 199(48), 187(43) 285(90), 284(100), 242(25), 6 Narwedin 20,27 2477 228(20), 216(43), 199(35), 174(50), 128(30), 115(32) 301(<1), 283(14), 209(7), 7 Odulin 23,32 2546 165(16, 133(7, 109(100), 108(29, 89(13) 8 301(15), 272(100), 240(15), 22,52 2629 Haemanthamin 225(5), 211(15) 9 Massonin 23,38 2688 299(<1), 190(2),164(4), 134(1), 109(100), 108(23), 94(4), 82(2) 10 Hippeastrin 26,05 2881 315(-), 162((4), 134(4), 125(100), 96(36), 82(3) % TIC b Reference pro MS 44 NIST 7 NIST 4 5 93 2 NIST 1 NIST 3 93 21 NIST 7 NIST 6 38 a podmínky GC/MS analýzy viz experimentální část, b celkový iontový proud, c nebylo identifikováno 53

100 1 50 8 2 3,4 9 10 5 6 7 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Obr. 24. Chromatografický záznam alkaloidního extraktu z cibulí N. cv. Ice Follies 6 odulin 8 massonin Obr. 25. Vybrané struktury identifikovaných látek v rostlině N. cv. Ice Follies 54

5.6 Biologická aktivita alkaloidního extraktu z cibulí rostliny Narcissus canaliculatus a jeho GC/MS analýza Posledním zkoumaným druhem je ozdobný Narcissus canaliculatus zobrazený na následujícím obrázku (Obr. 26.). V naší laboratoři byl podroben fytochemickému rozboru s následujícími výsledky. Identifikováno bylo celkem 5 alkaloidů galantaminového a lykorinového typu a tazettin spadající do vlastní strukturní řady. Všechny látky se nám podařilo popsat dle záznamů z literatury a porovnání jejich MS spekter s knihovnou spekter NIST (Tab. VII). Prakticky celý extrakt tvoří tři alkaloidy: lykorin zastoupený z 80% v celém extraktu a dále galantamin a tazetin s vyrovnaným zastoupením blížícím se 10%. V nepatrných množstvích byl zachycen lykorinový derivát 11,12-didehydroanhydrolykorin a lykoramin, který náleží alkaloidům galantaminového strukturního typu. Obě struktury jsou zobrazeny na Obr. 28. Extrakt z cibulí tohoto narcisu inhiboval HuAChE nejvíce ze všech testovaných (IC 50 = 6,39 ± 0,68 µg/ml). Vyvstává otázka, které alkaloidy jsou za tuto aktivitu zodpovědné, neboť drtivě 79, 84, 88 převažující lykorin jak známo takovou aktivitu nemá. Nabízí se teorie 79, že zvýšení inhibičního účinku může být spojeno s planární konformací C kruhu, který má 11,12-didehydroanhydrolykorin aromatizovaný podobně jako nejaktivnější lykorinový Obr. 26. Narcissus canaliculatus 94 55