FORMULACE SUBMIKROSKOPICKÝCH ČÁSTIC Z VĚTVENÝCH OLIGOESTERŮ

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie FORMULACE SUBMIKROSKOPICKÝCH ČÁSTIC Z VĚTVENÝCH OLIGOESTERŮ Autor: Mgr. Marie Seidlová Konzultant rigorózní práce: Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Zlín, 5.5. 2011

Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány. Poděkování patří vedoucímu diplomové práce Doc. RNDr. Milanu Dittrichovi, CSc. za pomoc při zpracování této práce a paní Romaně Nobilisové za vytvoření nadstandardních pracovních podmínek při realizaci této práce. 2

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmaceutické technologie Kandidát Konzultant Název rigorózní práce Mgr. Marie Seidlová Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Formulace submikroskopických částic z větvených oligoesterů Cílem práce bylo přispět k optimalizaci postupu přípravy nanočástic z oligoesterů a polyesterů alifatických alfa hydroxykyselin s větvenou konstitucí řetězce. Byla zvolena metoda emulgace roztoků nosičů polyesterového typu ve vodné fázi za rozdělování a odpařování rozpouštědla. Postup dispergace olejové fáze ve vodné fázi byl modifikován z hlediska rychlosti přidávání této fáze a z hlediska kontinuity celého procesu. Byla vyzkoušena různá rozpouštědla nosičů. Jako emulgátory byly vyzkoušeny nativní a hydrogenovaný lecithin a čistý fosfatidylcholin s alternativním umístěním těchto emulgátorů do vnější fáze nebo do obou nemísitelných fází zároveň. Byla vyzkoušena možnost změny aktuální acidity vnější fáze její alkalizací. Byl prokázán vliv molekulárních parametrů nosiče, kvality rozpouštědla, typu emulgátoru a jeho alokace v heterogenním systému a vliv modifikace postupu dispergace na velikostní parametry a na zeta potenciál nanočástic. Velikostní parametry a jeho povrchový náboj byly měřeny pomocí DLS za využití měření koeficientu difúze, povrchový náboj pomocí laserového Dopplerova rychloměru. 3

ABSTRACT Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of farmaceutical technology Candidate Consultant Title of Thesis Mgr. Marie Seidlová Doc. RNDr. Milan Dittrich, CSc. Formulation of submicroscopical particles from branched oligoesters The aim of the thesis was directed to the nanoparticles preparation and optimization method. As the carriers were used oligoesters and polyesters of aliphatic alpha hydroxyacids with branched constutution of chain. Emulsion method solvent distribution and evaporation was used as preparation procedure. The process of oil phase dispersion in the aqueous one was modified in the aspect of velocity of the pouring of this phase into water and in the aspect of continuity of the process. Various solvents of carriers were tested, as emulsifiers were used lecithins and pure phophatidylcholine with the possibility of localisation of these emulsifiers into outer phase or into both the immiscible phases at the same time. The actual acidity change of outer phase by alcalisation was evaluated also. It was demonstrated effect of molecular parameters of carrier, effect of solvent quality and the type of emulsifier and its situation in the heterogeneous system, and effect of modification of the dispersion process on size parameters and on zeta potential of nanoparticles. The size characteristics was measured and interpreted by PCS method by the using od diffusion coefficient measurements, the surface charge was evaluated by the method based on Doppler effect measurements. 4

Obsah Seznam zkratek.8 Zadání práce...9 I Teoretická část..10 1 Úvod 10 2 Příprava nanočástic.12 2.1 Dispergace polymerů...12 2.1.1 Metoda odpaření rozpouštědla...13 2.1.2 Spontánní emulgace a rozdělování rozpouštědla...13 2.2 Polymerizační metoda.13 2.3 Koacervace a iontová gelace..14 2.4 Tvorba nanočástic použitím superkritické fluidní technologie...14 2.4.1 SAS.15 2.4.2 RESS..15 3 Charakteristika nanočástic...15 3.1 Fyzikální vlastnosti 15 3.1.1 Molekulová hmotnost 15 3.1.2 Stupeň krystalinity.16 3.1.3 Hydrofobicita..16 3.1.4 Poměr komonomerů.17 3.1.5 Biodegradabilita a biokompatibilita.17 3.1.6 Rozpustnost...17 3.1.7 Interakce léčivo polymer...17 4 Vliv vlastností nanočástic na distribuci léčiva..18 4.1 Velikost částic 18 4.2 Povrchové vlastnosti částic.19 5

5 Polymerní nosiče využité k přípravě nanočástic.20 5.1 Biodegradabilní polymery 21 5.1.1 Přírodní biodegradabilní polymery.21 5.1.2 Syntetické biodegradabilní polymery.21 5.2 Biologicky neodbouratelné polymery.22 6 Principy měření zkoumaných charakteristik nanočástic.22 6.1 Měření velikosti nanočástic.22 6.2 Měření zeta potenciálu nanočástic 22 II Experimentální část..24 1 Použité přístroje 24 2 Chemikálie.24 3 Nosiče a jejich charakterizace 25 4 Použitá metoda přípravy nanočástic.26 4.1 Příprava vnější fáze..26 4.2 Příprava vnitřní fáze.27 4.3 Příprava nanočástic..27 4.4 Měření velikosti a zeta potenciálu částic..28 5 Výsledky.28 III Diskuze..70 1 K zaměření práce.70 2 Vliv nosiče a postupu přípravy na parametry nanočástic..71 3 Vliv dichlormethanu a methylacetátu jako rozpouštědla nosiče a postupu přípravy na parametry nanočástic.71 4 Vliv methylethylketonu a methylformiátu jako rozpouštědla nosiče a postupu přípravy na parametry nanočástic..72 5 Vliv emulgátoru a jeho lokalizace na parametry nanočástic z methylacetátového roztoku..72 6

6 Vliv emulgátoru a jeho lokalizace a úpravy ph na parametry nanočástic z methylethylketonového roztoku..73 7 Vliv úpravy ph na parametry nanočástic z methylethylketonového roztoku 73 8 Vliv způsobu dispergace a úpravy ph na parametry nanočástic z acetonového roztoku a roztoku směsi acetonu s methylethylketonem74 9 Vliv způsobu dispergace, úpravy ph a lokalizace emulgátoru na parametry nanočástic z acetonového roztoku a roztoku směsi acetonu s methylethylketonem..74 IV Závěry.76 Seznam použité literatury 77 7

Seznam zkratek DLS SAS RESS PEG PDLLA PLG PLGA PCA o/v SEM TEM MPS dynamický rozptyl světla (dynamic light scattering) superkritické antirozpouštědlo (supercritical anti-solvent) prudká expanze kritického roztoku (rapid expansion of critical solution) polyethylenglykol polymer kyseliny DL-mléčné polyglykolid poly-d,l-laktid-ko-glykolid poly-kyanoakrylát emulze typu olej ve vodě skenovací elektronová mikroskopie transmisní elektronová mikroskopie mononukleární fagocytový systém 8

Zadání práce Zadání rigorózní práce bylo vytyčeno v návaznosti na vyřešení problematiky diplomové práce. Je součástí snah o získání informací využitelných při přípravě polymerních nanočástic emulzní metodou za rozdělování rozpouštědla. Cílovou vlastností byl minimální rozměr nanočástic připravených vysokoobrátkovým dispergátorem. Kromě nosičů různých molekulových hmotností a různých stupňů větvení byla testována různá rozpouštědla a jejich směsi a různé emulgátory a jejich lokalizace ve fázích. Vnější fáze byla upravována na různé hodnoty aktuální acidity, postup dispergace byl modifikován. Výsledky dosažené v experimentech bylo zadáno vyhodnotit a zobecnit do závěrů a doporučení pro další postup. 9

I Teoretická část 1 Úvod Za posledních několik dekád byly zkoumány oblasti distribuce léčiv za použití částicových systémů jako nosičů malých a velkých molekul. Částicové systémy (např. nanočástice) byly použity jako faktor pro změnu a zlepšování farmakokinetiky a farmakodynamiky různých typů molekul léčiv. Použity byly in vivo tak, aby chránily strukturu léčiva v systémové cirkulaci, omezovaly rozplynutí léčiva v k tomu neurčených místech a doručily tak léčivo v kontrolovaném a požadovaném poměru na místo účinku. Pro formulaci nanočástic byly použity nejrůznější polymery pro možnost výzkumu ke zlepšení terapeutického výnosu za minimalizace vedlejších účinků. Nanočástice jsou definovány jako pevné částice s rozměry v rozmezí 10 až 1000 nm. Léčivo je pak na takové částici adsorbováno, v ní zabudováno, v ní rozpuštěno či enkapsulováno. V závislosti na metodě mohou být přípravou získány nanočástice, nanosféry nebo nanokapsuly. Nanokapsuly jsou systémy, kdy je léčivo zavedeno do dutiny obklopené jedinečnou polymerní membránou, zatímco nanosféry jsou matricové systémy, ve kterých je léčivo fyzikálně a uniformně dispergováno. V posledních letech byly využity jako potenciální nosiče léčiv biodegradabilní polymerní nanočástice, zvláště ty pokryté adsorbovaným hydrofilním polymerem, jako např. polyethylenglykolem (PEG), známé jako dlouhocirkulující částice právě pro jejich schopnost cirkulovat po prodlouženou dobu a schopnost zacílit požadovaný orgán a nést a doručit proteiny, peptidy a geny (1-4). Hlavní úspěchy při formulaci nanočástic jako doručovacích systémů jsou v oblasti kontroly velikosti částic, povrchových vlastností a uvolňování farmakologicky aktivních látek, v pořadí dosahování účinku v žádaných místech v terapeuticky optimálním množství a dávkování. Ačkoli byly využívány liposomy jako potenciální nosiče s unikátními vlastnostmi zahrnujíce ochranu 10

léčiva před degradací, zacílení na místo účinku a snížení toxicity nebo vedlejších účinků, jejich využití je limitováno nízkou efektivitou enkapsulace, rychlým propouštěním ve vodě rozpustných léčiv v přítomnosti krevních součástí anebo nízká skladovací stabilita. Na druhé straně polymerní nanočástice nabízejí některé specifické výhody nad liposomy. Navíc pomáhají zvyšovat stabilitu léčiv, proteinů a poskytují využitelnou kontrolu vlastností uvolňování (5, 6). Výhody používání nanočástic jako léčivo doručujících systémů jsou následující: velikost částic a povrchové charakteristiky mohou být jednoduše měněny, aby dosáhly jak pasivního tak aktivního targetingu po parenterálním podání umožňují a kontrolují uvolňování léčiva během cesty a v místě lokalizace, obměňují orgánovou distribuci léčiva a clearance léčiva, aby dosáhly zvýšení terapeutického využití léčiva a redukce vedlejších účinků kontrola uvolňování a charakteristiky degradace mohou být znatelně modulovány výběrem matricových komponentů, výběr léčiv je relativně velký a léčiva mohou být inkorporovány do systémů bez jediné chemické reakce, to je důležitý faktor pro uchování aktivity léčiva targetingu může být dosaženo zavedením targetujících ligandů na povrch částic nebo magnetické navádění systém může být použit pro různé cesty podání zahrnující perorální, nasální, parenterální nebo intraokulární Na druhé straně nanočástice mají omezení, např. jejich malá velikost a velký povrch může vést k agregaci částic, která způsobuje náročné zacházení s nanočásticemi v tekutých i tuhých formách. Navíc malé rozměry částic a velká plocha povrchu snadno vedou k obtížnému vázání léčiva a jeho uvolňování. Tyto praktické problémy mohou být překonány před klinickým použitím nebo jejich konečným použitím. 11

2 Příprava nanočástic Nanočástice mohou být připraveny z množství materiálů, jako jsou proteiny, polysacharidy, syntetické polymery. Výběr materiálu pro matrici závisí na mnoha faktorech (7): požadovaná velikost nanočástic základní vlastnosti léčiva (rozpustnost ve vodě, stabilita) povrchové charakteristiky (náboj, permeabilita) stupeň biodegradability, biokompatibilita a toxicita požadovaný profil uvolňování léčiva antigenita finálního produktu Nanočástice jsou připravovány nejčastěji jednou ze tří metod dispergace polymerů, polymerizace monomerů, iontová gelace nebo koacervace hydrofilních polymerů. Nicméně byly popsány další metody v literatuře pro přípravu nanočástic jako superkritická fluidní technologie (8) a replikace částic v nevlhkých vzorcích (9). Druhý z uvedených postupů se uplatňuje pro absolutní kontrolu velikosti částic, jejich tvaru a složení. 2.1 Dispergace polymerů Dispergace polymerů je běžná technika používaná k přípravě biodegradabilních nanočástic z polymerů kyseliny DL-mléčné (PDLLA), polyglykolidu (PLG), poly-d,l-laktid-ko-glykolidu (PLGA) a poly-kyanoakrylátu (PCA) (10-12). K dispergaci polymerů je používáno několika metod. 12

2.1.1 Metoda odpaření rozpouštědla Při této metodě dochází k rozpuštění polymeru v organickém rozpouštědle, jako je např. dichlormethan, chloroform a ethylacetát, které je taktéž použito pro rozpuštění hydrofobního léčiva. Směs polymeru a roztoku léčiva je následně emulgována do vodného roztoku obsahující emulgátor, který pomůže k vytvoření emulze olej ve vodě (o/v). Po vytvoření stabilní emulze je organické rozpouštědlo odpařeno buď za pomocí snížení tlaku, nebo dlouhotrvajícím kontinuálním mícháním. Bylo zjištěno, že velikost částic je ovlivněna typem a koncentrací stabilizátoru, rychlostí homogenizace a koncentrací polymeru (13). Aby byly vytvářeny částice malých velikostí, je dobré využít vysokorychlostní homogenizaci nebo ultrazvukovou stabilizaci (14). 2.1.2 Spontánní emulgace a rozdělování rozpouštědla Je to modifikovaná verze metody odpařování rozpouštědla (15). Při této metodě je použito jako olejová s vodou mísitelné rozpouštědlo spolu s malým množstvím s vodou nemísitelného organického rozpouštědla. Spontánním rozdělováním rozpouštědla dochází k turbulencím na rozhraní fází vedoucí k tvorbě malých částic. S vzrůstající koncentrací s vodou mísitelného rozpouštědla se dosáhne snížení velikosti vznikajících částic. Obě metody mohou být použity jak pro hydrofilní tak pro hydrofobní léčivo. Složené emulze v/o/v musí být tvořeny tak, aby léčivo bylo rozpuštěno ve vnitřní vodné fázi. 2.2 Polymerizační metoda Při této metodě jsou monomery skládány do polymerních nanočástic ve vodném prostředí. Léčivo je inkorporováno buď rozpuštěním v polymeračním médiu nebo adsorpcí na povrch nanočástic poté, co je polymerizace dokončena. Nanočásticová suspenze je následně přečištěna za použití centrifugace a re-suspendování částic, aby byly odstraněny stabilizátory 13

a emulgátory použité při polymerizaci. Tato metoda bývá použita při přípravě polybutylkyanoakrylátových nanočástic (16, 17). Stavba nanočástice a její velikost závisí na koncentraci použitých emulgátorů a stabilizátorů (18). 2.3 Koacervace a iontová gelace Velký podíl výzkumu byl zaměřen na přípravu nanočástic z biodegradabilních hydrofilních polymerů, např. chitosanu, želatiny a sodné soli alginátu. Byla tak objevena metoda přípravy nanočástic z chitosanu pomocí iontové gelace (19, 20). Metoda zpracovává směs dvou vodných fází, ze kterých jedna je polymer chitosanu a druhá je polyanion tripolyfosfát sodný. Při této metodě interaguje pozitivně nabitá aminoskupina chitosanu s negativně nabitým tripolyfosfátem za tvorby koacervátu ve velikosti nanometrů. Koacerváty jsou tvořeny jako výsledek elektrostatické interakce mezi dvěma vodnými fázemi, kde je iontovou gelací měněn materiál z tekutiny na gel v závislosti na podmínkách iontových interakcí za pokojové teploty. 2.4 Tvorba nanočástic použitím superkritické fluidní technologie Konvenční metody jako extrakce za odpaření rozpouštědla, rozdělování rozpouštědla a fázová separace vyžadují použití organická rozpouštědla, která mohou poškodit životní prostředí stejně tak jako fyziologické systémy. Proto byla vyvinuta superkritická fluidní technologie pro přípravu biodegradabilních mikro- a nanočástic, protože superkritické tekutiny jsou bezpečné pro okolí (21). Superkritická tekutina může být obecně definována jako rozpouštědlo za teploty nad jeho vlastní kritickou teplotou, kdy tekutina zůstává jednofázová bez ohledu na tlak (21). Superkritický CO 2 (SC CO 2 ) je nejšíře používanou superkritickou tekutinou díky jeho mírným kritickým podmínkám (T C = 31,1 C, P C = 73,8 b), není toxický, výbušný a je levný. Nejpoužívanějšími technikami využívající superkritické tekutiny jsou metody superkritického antirozpouštědla (supercritical anti-solvent = SAS) a prudké expanze kritického roztoku (rapid expansion of critical solution = RESS). 14

2.4.1 SAS Methanol, který je snadno mísitelný se superkritickým CO2, je používán jako tekuté rozpouštědlo v procesu SAS. Rozpouští používanou látku pro následující mikronizaci, protože sama je v superkritické tekutině nerozpustná. Extrakce tekutého rozpouštědla pomocí superkritické tekutiny vede k okamžité precipitaci rozpuštěné látky a následně k tvorbě nanočástic (8). Již bylo uveřejněno použití modifikované metody pro přípravu hydrofilních nanočástic s enkapsulovaným dexamethasonfosfátem (22). 2.4.2 RESS RESS se liší od SAS tím, že používaná látka pro vznik vlastní nanočástice je rozpustná v superkritické tekutině a tak je následně vzniklý roztok velmi rychle tlačen skrz malou trysku do prostředí s nižším tlakem (21). Tak rozpouštěcí schopnost superkritické tekutiny klesá a původně rozpuštěná látka precipituje. Touto technikou vznikají nanočástice velmi čisté, v podstatě prosté rozpouštědla. RESS a jeho modifikované způsoby použití jsou často využívány pro přípravu polymerních nanočástic (23). Přestože je technika superkritické fluidní technologie přátelská k životnímu prostředí a velmi výhodná pro vysokou produkci, vyžaduje speciálně navržené přístroje a vybavení a je velmi drahá. 3 Charakteristika nanočástic 3.1 Fyzikální vlastnosti polymerů 3.1.1 Molekulová hmotnost Molekulová hmotnost ovlivňuje takové vlastnosti polymerů jako je teplota skelného přechodu, viskozita v roztocích, rozpustnost, krystalinita, míra 15

degradace a mechanická pevnost. Obecně polymery s nízkou molekulovou hmotností vykazují nižší viskozitu a pevnost v tahu a rozpadají se rychleji. Je proto důležité vybrat vždy takový polymer, aby jeho vlastnosti, opírající se o jeho molekulovou hmotnost, umožňovaly podání zamýšlenou cestou. 3.1.2 Stupeň krystalinity Mechanické vlastnosti polymerů mohou být měněny v závislosti na stupni krystalinity. Polymery s uniformním uspořádáním řetězců bez síťování struktury se budou rozpadat rychleji než amorfní formy. Nicméně čistě krystalické polymery jsou křehké a proto méně vhodné pro doručování léčiv na místo určení. Amorfní polymery mají velmi malou mechanickou pevnost. Proto se pro přípravu nanočástic, které jsou určené pro doručování léčiv, používají směsi krystalických a amorfních forem. 3.1.3 Hydrofobicita Faktory, které ovlivňují hydrofobicitu polymerů zahrnují molekulovou hmotnost, rozpustnost monomerů ve vodě a stupeň větvení. Ačkoli vzrůstající molekulová hmotnost zvyšuje hydrofobicitu, zvýšení míry větvení ústí ve ve vodě více rozpustné polymery. Nanočástice připravené použitím hydrofobních polymerů vykazují snižující se penetraci vody a botnání, což vede k relativně pomalejšímu uvolňování neseného léčiva. Je také zpomalena degradace polymeru než u jednoduchých hydrofilních polymerů. Nicméně inkorporací hydrofilních polymerů nebo aditiv do nanočástic připravených z hydrofobních polymerů budou ve vodném prostředí tvořeny na nanočásticích póry a zvýší se tak degradace, eroze a stejně tak uvolňování nesené látky. Je důležité si proto uvědomit, že metoda přípravy nanočástice bude ovlivněna relativní hydrofobicitou i hydrofilitou jak polymeru, tak léčiva. 16

3.1.4 Poměr komonomerů Výběr polymeru a metoda polymerizace přímo dopadá na typ kopolymeru stejně tak jako molekulová hmotnost, krystalinita a hydrofobicita. Obecně lze říci, že kopolymery použité k přípravě nanočástic typicky obsahují jak hydrofobní, tak hydrofilní úseky, které umožňují větší flexibilitu při přípravě a větší předvídatelnost fyzikálních vlastností. 3.1.5 Biodegradabilita a biokompatibilita Biologicky odbouratelný polymer se musí degradovat na fyziologicky inertní produkty, které jsou následně eliminovány tělem. PLGA polymery hydrolyzují na mléčnou a glykolovou kyselinu, které jsou dále štěpeny na běžné složky těla. Biokompatibilní polymery jsou definovány jako ty, které nevyvolávají imunitní nebo zánětlivou reakci, jsou stabilní v průběhu trvání účinku a kompletně metabolizovány tělem. Většina biodegradabilních polymerů používaných v doručování léčiv jsou specificky využity pro parenterální podání. 3.1.6 Rozpustnost Rozpouštěcí spektrum polymerů ovlivňuje metodu přípravy a in vivo chování nanočástic. Obecně je jak polymer, tak látka potřebná k doručení, rozpustné v organických rozpouštědlech, může tak být pro přípravu použita jednoduchá o/v emulzní metoda nebo fázová separace. 3.1.7 Interakce léčivo polymer Jedná se o chemické a fyzikální interakce, které se vyskytují v závislosti na chemických vlastnostech obou činitelů. Většinou jde o interakce nábojů, rozpustnosti a hydrofobicity a mohou pozměňovat vlastnosti polymeru, jako je teplota skelného přechodu a stupeň krystalinity, stejně tak jako vlastnosti nanočástic, zde nejčastěji míru uvolňování. 17

4 Vliv vlastností nanočástic na doručení léčiva 4.1 Velikost částic Velikost částic a distribuce velikosti jsou nejdůležitější charakteristiky nanočásticových systémů. Předurčují distribuci in vivo, biologický osud, toxicitu a schopnost zacílení nanočásticových systémů. Navíc mohou také ovlivňovat množství vázaného léčiva, jeho uvolňování a stabilitu nanočástic. Mnoho studií demonstrovaly jak nanočástice jako léčivo doručující systém velikosti sub-mikronu mají řadu výhod nad mikročásticemi (24). Obecně mají nanočástice oproti mikročásticím relativně větší intracelulární uptake a jsou schopné dosáhnout většího množství biologických cílů pro jejich malou velikost a vyšší pohyblivost. Bylo uveřejněno, že částice velikosti 100 nm mají 2,5krát vyšší uptake než částice velikosti 1 µm a šestkrát větší uptake než mikročástice o velikosti 10 µm (25). V jiné studii (26) nanočástice penetrovaly přes submukózní vrstvy krys v in situ modelu intestinálních kliček, zatímco mikročástice byly převážně v linii epitelu. Také bylo zjištěno, že nanočástice jsou schopny proniknout hematoencefalickou bariérou přes těsné spoje za pomocí hypertonického roztoku mannitolu, který může podporovat doručení terapeutických činitelů při obtížně léčitelných chorobách, jako jsou např. mozkové tumory (27). Nanočástice potažené Tweenem 80 má podobnou schopnost umožnit přestup přes hematoencefalickou bariéru (28). V některých typech buněk mohou přestupovat pouze sub-mikronové nanočástice, zatímco větší částice ne. Uvolňování léčiva je také ovlivněno velikostí částice, která jej nese. Menší částice mají větší povrch, proto tedy většina neseného léčiva se nachází na povrchu nebo v jeho těsné blízkosti a to vede k rychlejšímu uvolňování. Kdežto 18

větší částice mají větší jádro a léčivo je tak enkapsulováno a tedy i pomaleji propouštěno ven (30). Menší částice nesou větší riziko agregace v průběhu skladování a distribuce nanočásticové disperze. Je to vždy problém formulovat nanočástice s co nejmenší velikostí ale maximální stabilitou. Degradace polymeru může být také ovlivněna velikostí částic. Například míra degradace PLGA polymeru se zvyšuje se vzrůstající velikostí částice in vitro (31). Bylo uvažováno, že v menších částicích degradační produkt PLGA může difundovat z částice snadněji, zatímco ve větších částicích spíše degradační produkty zůstávají v polymerové matrix po delší dobu, aby způsobily autokatalytickou degradaci polymeru. Proto tedy bylo hypotézou, že větší částice přispívají k rychlejší polymerové degradaci stejně tak jako k rychlejšímu uvolnění léčiva. Nicméně byly připraveny PLGA částice s odlišnými velikostmi a bylo zjištěno, že míra rozpadu polymeru in vitro nejsou tak úplně odlišné s odlišnou velikostí částice (32). Nejrychlejší a nejběžnější metodou stanovení velikosti částice je foton-korelační spektroskopie neboli dynamický rozptyl světla. Metoda vyžaduje, aby byla známa viskozita prostředí, udává velikost částice na základě Brownova pohybu a vlastností rozptýleného světelného paprsku (33). Výsledky získané touto metodou jsou ověřovány skenovací nebo transmisní elektronovou mikroskopií (SEM nebo TEM). 4.2 Povrchové vlastnosti nanočástic Pokud jsou nanočástice podány intravenózně, jsou velmi snadno rozpoznány imunitním systémem a jsou odstraněny z oběhu fagocyty (34). Vedle velikosti částice, jejich hydrofobní povrch předurčuje množství adsorbovaných krevních komponentů, zvláště proteinů (opsoninů). A tyto ovlivňují osud nanočástic in vivo (34, 35). Vázání opsoninů na povrch nanočástic nazýváme opsonizací, což vytváří mosty mezi nanočásticemi a fagocyty. Vazba léčiva na konvenční nosič vede k modifikaci profilu biodistribuce léčiva a to je tak doručeno hlavně do mononukleárního fagocytového systému (MPS) jako jsou játra, slezina, plíce a 19

kostní dřeň. Ovšem povrchově neupravené nanočástice (konvenční nanočástice) jsou velmi rychle opsonizovány a masivně odstraněny makrofágy z MPS bohatých orgánů (36). V zásadě jsou to IgG, složky C 3 komplementu které jsou používány imunitním systémem pro rozpoznání cizích částic, zvláště cizích makromolekul. Proto ke zvýšení pravděpodobnosti úspěchu při doručení léčiva je nezbytné, aby byla minimalizována opsonizace a prodloužena cirkulace nanočástic in vivo. Toho může být docíleno: povlečením povrchu nanočástice hydrofilními polymery příprava nanočástic z biodegradabilním kopolymerů s hydrofilními částmi jako např. polyethylenglykol (PEG), polyethylenoxid, poloxamer nebo polysorbát 80 Studie ukázaly, že konformace PEG na povrchu nanočástice je z nejdůležitějších pro odrazení opsoninů. PEG redukuje fagocytózu a aktivaci komplementu (2, 37). Zeta potenciál se běžně používá pro charakterizaci povrchu jako vlastní náboj nanočástice (38). Zobrazuje elektrický potenciál částice a je ovlivněn skladbou částice a médiem, ve kterém jsou částice rozptýleny. Nanočástice se zeta potenciálem (+/-) 30 mv jsou dostatečně stabilní v suspenzi, protože náboj povrchu působí proti agregaci částic. Zeta potenciál může být také využit pro určení, zda je nabitý materiál enkapsulován do jádra částice nebo je adsorbován na povrchu. 5 Polymerní nosiče využité k přípravě nanočástic Ideálně mohou být biologicky aktivní látky enkapsulovány do polymerních nanočástic s velmi dobře popsanými fyzikálními a chemickými vlastnostmi. Tyto polymery chrání aktivní složku a při lokálním nebo systémovém podání, 20

podmiňují targeting a kontrolují přesné množství uvolněného léčiva. Využití polymerních nanočástic pro doručování léčiv je strategií k optimalizaci terapeutických efektů při současné minimalizaci vedlejších účinků (39-41). Polymery používané v kontrolovaném doručování (targeting) léčiva, zahrnujíce nanočástice, můžeme rozlišit na biodegradabilní, které jsou pro využití ve farmakoterapii daleko výhodnější, a na biologicky neodbouratelné. 5.1 Biodegradabilní polymery Biologicky odbouratelné polymery jsou klasifikovány jako přírodní nebo syntetické. 5.1.1 Přírodní biodegradabilní polymery Příklady v přírodě se vyskytujících biodegradabilních a biokompatibilních polymerů využitých k přípravě nanočástic zahrnují celulózu, želatinu, chitosan, algináty a další. Vlastnosti a chování, zvláště in vivo, nanočástic připravených použitím přírodních polymerů mohou být méně předvidatelné stejně tak jako se mohou tyto polymery široce lišit v chemické stavbě a také ve fyzikálních vlastnostech. Navíc jsou přírodní polymery často lehce imunogenní. 5.1.2 Syntetické biodegradabilní polymery Naproti výskytu přírodních polymerů je možné syntetizovat polymery s přesnou chemickou strukturou ústící ve vysokou možnost předvídat fyzikální vlastnosti jako je rozpustnost, propustnost a míra biodegradace. Tím jsou syntetické polymery daleko přesněji určeny pro specifickou cestu podání vlastnostmi, jako je kontrolovatelná míra disoluce, propustnosti, degradace a eroze, stejně tak jako zacílení na místo účinku. Příklady syntetických biodegradabilních polymerů používaných k přípravě nanočástic jsou polylaktidy (PLA), poly(laktid-koglykolidy) (PLGA), polyanhydridy a poly-ε-kaprolaktony. Biologická degradabilita 21

a kompatibilita jsou důležitými prvky polymerních materiálů, které jsou určeny k aplikaci injekcí nebo k implantování do těla. 5.2 Biologicky neodbouratelné polymery Nebiodegradabilní polymerní nanočástice mohou být také určeny ke kontrolované distribuci a v příbuzné oblasti též k diagnostice. Příklady nebiodegradabilních syntetických polymerů používaných jako nosiče jsou polymethylmetakryláty, zatímco polystyrénové nanočástice se používají jako diagnostické látky. 6 Principy měření zkoumaných charakteristik nanočástic 6.1 Měření velikosti nanočástic Velikost nanočástic je měřena na základě Brownova pohybu, jehož rychlost je úměrná velikosti částic. Částice při svém pohybu pohlcuje a rozptyluje laserový paprsek, který se rozptýlí mnoha směry. Tomuto procesu se říká dynamický rozptyl světla (DLS - dynamic light scattering). Detektor vyhodnotí dopadající záření, zaznamená rychlost pohybu skvrn (tedy projekce částic na stínítku) a přes korelační funkci a Stokes-Einsteinovu rovnici přepočítá rychlost pohybu částic na jejich velikost. 6.2 Měření zeta potenciálu nanočástic Technikou používanou v Zetasizeru ZS 90 k měření zeta poteniálu je laserový Dopplerův rychloměr. Během měření je používán paprsek měrný a paprsek srovnávací. Zeta potenciál je měřen pomocí vytvoření elektrického pole v disperzi. Částice v disperzi s určitým zeta potenciálem putují k opačně nabité elektrodě rychlostí, která je úměrná velikosti zeta potenciálu. Po aplikaci 22

elektrického pole dochází ke kolísání detekovaného světla, které je odráženo z dráhy zdroje pohybujícími se částicemi. Frekvence kolísání je měřena jako pohyblivost částic a tato pohyblivost je konvertována na zeta potenciál. 23

II Experimentální část 1 Použité přístroje Analytické váhy Kern ABS, max 220g, d=0,1mg Váhy Kern 440-47, max 1 200g, d=0,1g Homogenizátor Diax 900 Heildolph, 8000-26 000 otáček/min., 6 pásem Magnetická míchačka Heildolph MR 3001, 100-1 250 otáček/min. Ultrazvuková lázeň Malvern Instruments, UK Zetasizer ZS 90 2 Chemikálie P3, KFT FaF UK Hradec Králové T3, KFT FaF UK Hradec Králové D3, KFT FaF UK Hradec Králové dichlormethan LachNer s. r. o. Neratovice methylacetát - Penta Chrudim methylformiát - Aldrich ethyl-methyl-keton aceton - lecitin, Míča & Harašta Blansko polysorbát 20, Biesterfeld Silcom Praha fosfatidylcholin 24

destilovaná voda hydroxid sodný, LachNer s. r. o. Neratovice 3 Nosiče a jejich charakterizace Tabulka 1: větvené oligoestery složení reakční směsi označení větvící monomer název konc. (% hmot.) GA (% mol) DLLA (% mol) P3 pentaerytritol 3,0 (100-D)/2 (100-D)/2 D3 dipentaerytritol 3,0 (100-D)/2 (100-D)/2 T3 tripentaerytritol 3,0 (100-D)/2 (100-D)/2 Tabulka 2: molekulární a termické charakteristiky nosičů nosič Mn Mw MP Mz Mz+1 Mw/Mn g' Tg 1 Cp P3 2440 5231 4659 8342 11778 2,14 0,33 22,2 0,416 D3 3600 5300 N N N 1,5 1,19 27,3 N T3 3355 13334 9074 27152 43224 3,97 0,31 21,7 0,508 Vysv.: hodnoty naměřeny v Synpo Pardubice, a. s. Mn číselně střední molekulová hmotnost Mw hmotnostně střední molekulová hmotnost MP charakteristika v místě píku Mz molekulová hmotnost velkých molekul Mz+1 molekulová hmotnost extrémně velkých molekul Mw/Mn stupeň polydisperzity Tg teplota skelného přechodu Cp specifická tepelná kapacita N nebylo měřeno 25

4 Použitá metoda přípravy nanočástic Pro přípravu nanočástic v rámci této práce byla použita metoda typu topdown. Byl připraven roztok polymeru v organickém rozpouštědle (olejová vnitřní fáze), který byl následně emulgován do roztoku emulgátorů ve vodné fázi. Proces emulgace se odehrával za účasti homogenizátoru při nejvyšším stupni otáček a to v různých schématech přidávání vnitřní fáze do vnější. Při míchání dochází v soustavě k tomu, že organické rozpouštědlo přechází do vnější fáze a odpařuje se a polymer přechází z roztoku do pevné fáze. Vnější fáze byla připraveny jako 1% roztok lecitinu (práškového nebo tekutého) anebo fosfatidylcholinu a polysorbátu 20 (3:1) ve vodě. Ve vnitřní fázi byly obsaženy ať už samotné, tak směsi polymerů P3, D3 a T3 rozpuštěné jako 1% roztok v acetonu, methylacetátu, methylformiátu, dichlormetanu, ethyl-methylketonu a směsích ethyl-methylketonu a acetonu v poměru 80:20, 65:35, 50:50 a 25:75 směsi methylacetátu a ethyl-methylketonu v poměru 1:1. U některých vzorků byl zkoumán vliv ph vnější fáze na velikost nanočástic. 4.1 Příprava vnější fáze Na analytických vahách jsme navážili potřebné množství směsi emulgátorů a rozpustili ve vodě. Protože se lecitin ve vodě při laboratorní teplotě rozpouští pomalu, umístili jsme směs do mikrovlnné trouby a zahřívali po dobu 10 vteřin. Tabulka 3: Vnější fáze (1% roztok lecitinu a polysorbátu 20) látka Množství lecithin 0,375g polysorbát 0,125g destilovaná voda 49,50g 26

4.2 Příprava vnitřní fáze Na analytických vahách jsme navážili potřebné množství polymerů, případně směsi polymerů o různých poměrech a rozpustili v organickém rozpouštědle, případně směsi rozpouštědel. Jelikož jsou použitá rozpouštědla těkavé kapaliny, překryli jsme kádinku víčkem z alobalu pro snížení odpařování. 4.3 Příprava nanočástic Kádinku s vodnou fází jsme umístili na homogenizátor a postupně zvyšovali otáčky až na maximum. Při maximálních otáčkách jsme přidali organickou fázi ve třech schématech. Buď byla organická fáze přidávána po dobu 30 vteřin a další 1 minutu míchána (postup A), nebo byla organická fáze přidána najednou, míchána 30 vteřin, poté následovala přestávka v míchání asi 20 vteřin a příprava emulze byla ukončena 30 vteřinami míchání (postup B), anebo byla organická fáze přidána najednou, míchána po dobu jedné minuty, následovala přestávka v míchání 1 minuta a nakonec jsme míchali po dobu další minuty (postup C). Postupným snižováním otáček na homogenizátoru bylo ukončeno míchání a emulze byla vlita do velké kádinky umístěné na magnetické míchačce, ve které bylo obsaženo 200 ml destilované vody. Směs byla většinou stabilizována po dobu 2 hodin. Odebírali jsme vzorky a měřili velikost částic a jejich zeta potenciál na Zetasizeru ZS. U některých vzorků byly zkoumané vlastnosti měřeny opakovaně s odstupem času několika hodin až několika dní. Zkoumali jsme vliv použitého rozpouštědla, polymeru, jejich směsí a vliv alkalizování vnější fáze. Výjimkou je příprava vzorku 43, který byl po rychlém smíchání fází ihned umístěn na magnetickou míchačku, a vzorků 44 a 45, které byly homogenizovány v ultrazvukové lázni. 27

4.4 Měření velikosti a zeta potenciálu částic Pro měření byl použit Zetasizer ZS 90. Přístroj vyžaduje pro měření speciální polystyrénové kyvety dvojího typu, jeden pro měření velikosti částic a druhý pro měření vlastního potenciálu. Kapátkem jsme naplnili kyvety do požadované výšky, kyvety na měření zeta potenciálu jsme uzavřeli k tomu určenými zátkami a umístili do přístroje. 5 Výsledky Výsledky jsou předloženy v tabulkách 4 až 12 a obrázcích 1 až 30. 28

Tabulka 4: Přehled všech vzorků Vz. Polym. Rozpouštědlo Mích. Emulg. Int. ph pík 1 Int. % pík 2 Int. % pík 3 % Obj. pík 1 Obj. % pík 2 Obj. % pík 3 % Zeta 1 T3 dichlormetan A HL 284 100 313 100-61,4 2 T3 dichlormetan B HL 311 100 86 28 389 72-63,6 3 P3 dichlormetan A HL 282 100 173 58 486 42-68,1 4 P3 dichlormetan B HL 333 100 11 29 30,6 24 263 34-72,3 5 D3 dichlormetan A HL 263 100 276 100-70,9 6 D3 dichlormetan B HL 328 100 46 18 375 82-69,6 7 T3 dichlormetan C HL 282 100 172 58 487 42-62,5 8 T3 methylacetát A HL 246 84 72,5 16 248 52 67,7 48-85 9 T3 methylacetát B HL 400 100 88 31 228 27 690 42-74 10 T3 E-M-keton A HL 243 100 84 57 353 43-67,3 11 T3 E-M-keton B HL 370 100 114 34 235 24 686 42-73,6 12 T3 methylformiát A HL 342 82 96,9 18 369 64 81,3 36-53,9 13 T3 methylformiát B HL 476 79 122 21 541 78 108 22-60,8 14 T3 MA + EMK 1:1 A HL 262 100 100 45 225 24 491 31-79,3 15 T3 methylacetát A HL obě fáze 249 69 1866 28 53,7 3 254 52 1880 18 50,1 31-65,7 16 T3 methylacetát A SL 194 59 810 41 75 38 222 19 737 42-59,6 17 T3 methylacetát A SL obě fáze 517 62 128 38 578 64 114 36-67,1 18 T3 methylacetát A FCH 346 67 108 33 370 51 91,9 49-75,9 19 T3 methylacetát A FCH obě fáze 362 86 76,1 14 373 62 71,5 38-72,7 20 T3 E-M-keton A HL obě fáze 180 94 52,9 6 172 59 48 41-56,7 21 T3 E-M-keton A SL obě fáze 145 57 741 43 119 55 719 45-58,3 22 T3 E-M-keton A FCH obě fáze 261 100 92 36 215 32 455 32-70,8 23 T3 E-M-keton A HL 8 127 100 115 100-89 24 T3 E-M-keton A SL 8 246 44 1119 34 71,6 22 260 44 918 23 61,8 62-78,1

Vz. Polym. Rozpouštědlo Mích. Emulg. ph Int. pík 1 % Int. pík 2 % Int. pík 3 % Obj. pík 1 % Obj. pík 2 % Obj. pík 3 % Zeta 25 T3 E-M-keton A FCH 8 163 100 35 22 122 78-86,9 26 T3 E-M-keton A HL 6,9 226 100 76 45 261 55-75,9 27 T3 E-M-keton A HL 7,5 172 92 1838 8 152 94 948 1 2004 5-77,9 28 T3 E-M-keton A HL 8,0 339 83 85,9 17 390 60 74,7 40-64,5 29 T3 E-M-keton A HL 8,5 266 100 80 45 336 55-62,5 30 T3 E-M-keton A HL 9,1 256 99 29,7 1 28 29 88,7 29 337 41-69,7 31 T3 E-M-keton A HL 10,1 270 92 60,5 8 293 55 58 45 79,1 32 T3 EMK+AC 80:20 A HL 283 98 40 2 38 30 102 21 378 49-70,5 33 T3 EMK+AC 65:35 A HL 278 100 67 20 192 43 458 37-66,7 34 T3 EMK+AC 50:50 A HL 253 100 102 35 328 65-72,5 35 T3 EMK+AC 25:75 A HL 238 99 39,2 1 35 18 100 31 395 51-62,5 36 T3 EMK+AC 0:100 A HL 314 100 88 47 479 53-64,8 37 T3 E-M-keton A HL 10 250 97 2327 3 83 46 338 53 2390 1-74,8 38 T3 E-M-keton A HL 10 207 97 2077 3 162 95 851 4 2265 1-77 39 T3 E-M-keton A HL 8,5 237 100 105 52 361 48-76,8 40 T3 EMK+AC 50:50 A HL obě fáze 265 100 101 45 387 55-71,3 41 T3 EMK+AC 25:75 A HL obě fáze 324 100 107 42 257 28 690 30-63,9 42 T3 EMK+AC 25:75 A HL+PS vnitřní 242 100 87 46 309 54-60,5 43 T3 aceton magn. HL 188 61 1326 39 156 57 827 33 2045 10-63,9 44 T3 aceton ultrazv. HL 185 100 108 62 247 38-58 45 T3 EMK+AC 25:75 ultrazv. HL 205 100 109 55 273 45-61,2

Tabulka 5: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3 (vzorek 1, 2), P3 (vzorek 3, 4), D3 (vzorek 5, 6), rozpouštědlo dichlormetan, emulgátor hydrogenovaný lecitin, ph bez úpravy. Vz. Mích. Int. pík 1 % Int. pík 2 % Int. pík 3 % Obj. pík 1 % Obj. pík 2 % Obj. pík 3 % Zeta 1 A 283,5 100 312,5 100-61 2 B 310,5 100 86,4 28 389,3 72-64 3 A 282,3 100 172,8 58 486,1 42-68 4 B 333,3 100 11,3 29 30,6 24 262,5 34-72 5 A 263 100 276 100-71 6 B 328 100 46,1 18 374,8 82-70 Obrázek 1A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 1. 31

Obrázek 1B: Objemový průměr nanočástic vzorku č. 1. Obrázek 1C: Zeta potenciál nanočástic vzorku č. 1. 32

Obrázek 2A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 2. Obrázek 2B: Objemový průměr nanočástic vzorku č. 2. 33

Obrázek 2C: Zeta potenciál nanočástic vzorku č. 2. Obrázek 3A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 3. 34

Obrázek 6C: Zeta potenciál nanočástic vzorku č. 6. 40

Tabulka 6: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem dichlormetan (vzorek 1, 2, 7) a metylacetát (vzorek 8, 9), emulgátor hydrogenovaný lecithin, ph bez úpravy. Vz. Mích. Int. pík 1 % Int. pík 2 % Int. pík 3 % Obj. pík 1 % Obj. pík 2 % Obj. pík 3 % Zeta 1 A 283,5 100 312,5 100-61 2 B 310,5 100 86,4 28 389,3 72-64 7 C 282 100 171,8 58 486,8 42-63 8 A 246,3 84 72,5 16 247,8 52 67,7 48-85 9 B 399,5 100 88,2 31 227,7 27 690 42-74 Obrázek 7A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 7. 41

Obrázek 8: Zeta potenciál vzorku č. 8. Obrázek 9: Zeta potenciál vzorku č. 9. 43

Tabulka 7: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem methylethylketon (vzorek 10, 11), methylformiát (vzorek 12, 13) a jejich směs 1:1 (vzorek 14), emulgátor hydrogenovaný lecitin, ph bez úpravy. Int. Int. Int. Obj. Obj. Obj. Vz. Mích. pík 1 % pík 2 % pík 3 % pík 1 % pík 2 % pík 3 % Zeta 10 A 242,8 100 84 57 352,5 43-67 11 B 370,3 100 113,9 34 235,2 24 686,3 42-74 12 A 341,8 82 96,9 18 369,3 64 81,3 36-54 13 B 476,2 79 122,4 21 541,4 78 108 22-61 14 A 261,6 100 99,6 45 225 24 491 31-79 Obrázek 10A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 10. 44

Obrázek 10B: Objemový průměr nanočástic vzorku č. 10. Obrázek 11A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 11. 45

Tabulka 8: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem methylacetát, emulgátorem hydrogenovaný lecitin v obou fázích (vzorek 15), lecitin nativní v hydrofilní fázi (vzorek 16) a v obou fázích (vzorek 17) a fosfatidylcholin v hydrofilní fázi (vzorek 18) a v obou fázích (vzorek 19). Int. Int. Int. Obj. Obj. Obj. Vz. Mích. pík 1 % pík 2 % pík 3 % pík 1 % pík 2 % pík 3 % Zeta 15 A 249,4 69 1866 28 53,7 3 253,8 52 1880 18 50,1 31-66 16 A 193,7 59 810,4 41 74,7 38 222,4 19 737,4 42-60 17 A 516,8 62 127,7 38 577,6 64 114,2 36-67 18 A 346 67 108,3 33 370 51 91,9 49-76 19 A 362,3 86 76,1 14 373,2 62 71,5 38-73 Obrázek 13A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 18. 48

Tabulka 9: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem ethylmethylketon, emulgátorem hydrogenovaný lecitin v obou fázích (vzorek 20) a jen v hydrofilní fázi s úpravou ph na 8,0 (vzorek 23), nativní lecithin v obou fázích (vzorek 21) a jen v hydrofilní fázi s úpravou ph na 8,0 (vzorek 24) a fosfatidylcholin v obou fázích (vzorek 22) a jen v hydrofilní fázi s úpravou ph na 8,0 (vzorek 25). Int. Int. Int. Obj. Obj. Obj. Vz. Mích. pík 1 % pík 2 % pík 3 % pík 1 % pík 2 % pík 3 % Zeta 20 A 179,6 94 52,9 6 172,4 59 48 41-57 21 A 144,9 57 741,4 43 119,1 55 719,2 45-58 22 A 260,9 100 92,2 36 215 32 455,2 32-71 23 A 126,7 100 114,5 100-89 24 A 246 44 1119 34 71,6 22 260,4 44 917,7 23 61,8 62-78 25 A 163,1 100 35,1 22 121,9 78-87 Obrázek 15A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 10. 51

Obrázek 16B: Objemový průměr nanočástic vzorku č. 20. Obrázek 17: Zeta potenciál vzorku č. 20. 53

Obrázek 18: Zeta potenciál vzorku č. 21. Obrázek 19: Zeta potenciál vzorku č. 22. 54

Tabulka 10: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem ethylmethylketon, emulgátorem hydrogenovaný lecitin v hydrofilní fázi a ph bylo upraveno na hodnotu 6,9 (vzorek 26), 7,5 (vzorek 27), 8,0 (vzorek 28), 8,5 (vzorek 29), 9,1 (vzorek 30) a 10,1 (vzorek 31). Int. Int. Int. Obj. Obj. Obj. Vz. Mích. pík 1 % pík 2 % pík 3 % pík 1 % pík 2 % pík 3 % Zeta 26 A 225,8 100 75,8 45 260,8 55-76 27 A 172,2 92 1838 8 151,5 94 948,1 1 2004 5-78 28 A 338,9 83 85,9 17 390,2 60 74,7 40-65 29 A 266,1 100 79,7 45 336,3 55-63 30 A 255,8 99 29,7 1 28,1 29 88,7 29 337,2 41-70 31 A 269,8 92 60,5 8 293,2 55 58 45 79 Obrázek 22A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 26. 58

Obrázek 22B: Objemový průměr nanočástic vzorku č. 26. Obrázek 23: Zeta potenciál nanočástic vzorku č. 28. 59

Obrázek 24: Zeta potenciál nanočástic vzorku č. 29. 60

Tabulka 11: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem byl roztok ethylmethylketonu a acetonu v poměrech 80:20 (vzorek 32), 65:35 (vzorek 33), 50:50 (vzorek 34), 25:75 (vzorek 35), čistý aceton (vzorek 36), bez úpravy ph. Úprava ph byla provedena u vzorků 37 (ph=10), 38 (ph=10) a 39 (ph=8,5), kde byl rozpouštědlem ethylmethylketon. Int. Int. Int. Obj. Obj. Obj. Vz. Mích. pík 1 % pík 2 % pík 3 % pík 1 % pík 2 % pík 3 % Zeta 32 A 282,6 98 40 2 37,8 30 101,8 21 377,7 49-71 33 A 278 100 67 20 191,9 43 458 37-67 34 A 252,7 100 102,3 35 327,6 65-73 35 A 237,6 99 39,2 1 35,4 18 100 31 395,2 51-63 36 A 314,3 100 87,9 47 478,9 53-65 37 A 250,4 97 2327 3 82,5 46 338,1 53 2390 1-75 38 A 206,7 97 2077 3 161,7 95 850,5 4 2265 1-77 39 A 237,1 100 105,4 52 360,5 48-77 Obrázek 25A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 34. 61

Obrázek 26C: Zeta potenciál nanočástic vzorku č. 35. 64

Tabulka 12: Intenzitní a objemový průměr a zeta potenciál nanočástic. Použitým polymerem byl T3, rozpouštědlem roztok ethylmethylketonu a acetonu v poměrech 50:50 (vzorek 40 - hydrogenovaný lecitin v obou fázích), 25:75 (vzorek 41 - hydrogenovaný lecitin v obou fázích, vzorek 42 hydrogenovaný lecitin i polysorbát ve vnitřní fázi, vzorek 45 hydrogenovaný lecitin ve vnější fázi) a čistý aceton (vzorek 43 a 44). Int. Int. Int. Obj. Obj. Obj. Vz. Mích. pík 1 % pík 2 % pík 3 % pík 1 % pík 2 % pík 3 % Zeta 40 A 265,4 100 101,3 45 387,4 55-71 41 A 323,5 100 106,6 42 256,5 28 689,6 30-64 42 A 241,7 100 87,2 46 308,8 54-61 43 M 187,8 61 1326 39 156 57 827,1 33 2045 10-64 44 U 184,9 100 107,7 62 247,4 38-58 45 U 205,4 100 109 55 272,5 45-61 Obrázek 27A: Intenzitní průměr nanočástic vzorku č. 40. 65

Obrázek 30B: Objemový průměr nanočástic vzorku č. 45. 69

III Diskuze 1 K zaměření práce Cílem rigorózní práce bylo pokračovat v hledání možností přípravy koloidních částic z polyesterů a oligoesterů alifatických hydroxykyselin s lineární a větvenou konstitucí řetězce. Téma navazuje na řadu prací, v nichž je prezentována snaha připravit co nejmenší nanočástice s dostatečně úzkou distribucí velikosti. Společnými rysy je emulzní metoda za rozdělování rozpouštědla s využitím dispergátoru založeného na principu turbíny s vysokou frekvencí otáček rotoru. Kromě studia vlivu parametrů nosiče je důležitým faktorem kvalita rozpouštědla jednak ve smyslu termodynamické interakce jednak ve smyslu vyhovující biokompatibility. Mnohá rozpouštědla nejsou pro daný účel vhodná vůbec, u mnohých jsou velmi náročné a obtížně splnitelné požadavky na obsah reziduí. Totéž se týká formulace vnější fáze emulze jako prostředí pro dispergaci roztoků nosiče. Z praktického technologického hlediska je výhodné, když není nutno k separaci vnější fáze využívat postupy, které jsou náročné na energii a čas. V tomto případě akceptovatelnost přítomnosti emulgátorů v produktech v nezanedbatelné koncentraci je nespornou výhodou. Účinnost emulgátorů ionického typu je možno modifikovat nejen jejich zvýšenou koncentrací, ale i změnami aktuální acidity nebo ionické síly jejich roztoků. Také jeho situování do obou fází může mít pozitivní efekt z hlediska účinnosti dispergace. Účinnosti různých způsobů dispergace je při vývoji metod přípravy nanočástic věnována značná pozornost. Obecné závěry z nich je velmi obtížné vyvozovat, protože jsou ovlivněny mnoha dalšími obtížně definovatelnými komplexy proměnných a jejich vzájemnými interakcemi hydrodynamického charakteru. Velikost částic je parametr, který souvisí s jejich využitelností. V případě medikovaných nanočástic může být velikostí ovlivněna jejich distribuce, včetně možností přestupu do buněk či transfekce genetického materiálu při vektorizaci. 70

Distribuce velikosti nanočástic v případě jejich tuhé konzistence je méně důležitá než u kapalných, u nichž je nebezpečí koalescence. Agregace je jev, který je možno napravit prostým mícháním. Ve světle výše uvedeného platí, že zeta potenciál je parametr, který není klíčový pro stabilitu nanočástic. Emulgátory, které jsou nutné při dispergaci roztoku nosičů, zpravidla plní v dostatečné míře funkci stabilizátorů suspenze. I neionické tenzidy a neionické tenzioaktivní polymery jsou v této oblasti použitelné. 2 Vliv nosiče a postupu přípravy na parametry nanočástic V rámci 6 vzorků byly testovány vlivy 3 různých nosičů a dvě odlišné procedury dispergace jejich roztoků v dichlormethanu. Byl použit hydrogenovaný lecithin v koncentraci 0,75%. Parametry nosičů jsou v tabulce 1 a 2, parametry nanočástic jsou v tabulce 5, výsledky měření jsou na obr. 1 až 6. Mezi nosiči byly značné rozdíly z hlediska molekulových hmotností, jejich distribuce i stupně větvení. Jak je patrné z tabulky 5, v parametrech velikosti nebyly zjištěny významné rozdíly, z hlediska objemového průměru byla zaznamenána větší polydisperzita u nanočástic z P3, který měl nejnižší molekulovou hmotnost. Zeta potenciál byl nejnižší u nanočástic z T3 s nejvyšší molekulovou hmotností. Z omezeného počtu vzorků je možno usoudit, že nejvhodnější je postup dispergace založený na pomalém přidávání roztoku nosiče za intenzivního míchání. 3 Vliv dichlormethanu a methylacetátu jako rozpouštědla nosiče a postupu přípravy na parametry nanočástic Byl použit nosič T3 a hydrogenovaný lecitin jako emulgátor, jako rozpouštědla byly použity dichlormethan a methylacetát, byly vyzkoušeny 3 varianty postupu při dispergaci. Z výsledků uvedených v tabulce 6 vidíme, že použití 71

methylacetátu bylo méně vhodné jednak z hlediska většího středního rozměru nanočástic, jednak z hlediska větší polydisperzity velikostí. Pokud jde o postup přípravy, jako nejvhodnější se jeví takový, který je založený na pomalém přidávání dispergovaného roztoku a maximální intenzity dispergace při použití dichlormethanu jako rozpouštědla nosiče. Zajímavé jsou vyšší hodnoty zeta potenciálu u částic připravených z methylacetátu. Příčinou může být větší povrchová aktivita lecitinu daná menší mísitelností polárních částí lecitinu v methylacetátovém roztoku. 4 Vliv methylethylketonu a methylformiátu jako rozpouštědla nosiče a postupu přípravy na parametry nanočástic Jak je z tabulky 7 patrné, z ethylmethylketonových roztoků byly připraveny menší nanočástice než z methylformiátových. Vysvětlením může být pomalejší přestup ethylmethylketonu jako rozpouštědla do vnější fáze. Z tabulky je zřetelný rozdíl ve velikosti nanočástic připravených různým způsobem dispergace. Stejně jako v předešlém případě jiných rozpouštědel se více osvědčil postup pomalého přidávání dispergované fáze. Jako nevhodná se projevila kombinace methylethylketonu a methylacetátu ve stejném poměru složek. Z hlediska objemového průměru byly nanočástice značně polydisperzní. Distribuce velikosti byla charakterizována trimodalitou kvantitativně významných frakcí s polohou píků 100 nm, 225 nm a 490 nm. Zajímavá je vysoká hodnota zeta potenciálu (79 mv). Hypotetické vysvětlení může vycházet z předpokládaného prodloužení doby pro orientaci molekul lecithinu na mezifázi emulze o/v. 5 Vliv emulgátoru a jeho lokalizace na parametry nanočástic z methylacetátového roztoku Společným jmenovatelem nanočástic prezentovaných v tabulce 8 byl nosič T3, methylacetát jako jeho rozpouštědlo a postup založený na pomalém přidávání 72