STABILITA GENOMU. III. Opravné mechanismy DNA

STABILITA GENOMU III. Opravné mechanismy DNA

Sources, Damage and Repair

Responses to DNA damage Transient blockage of: Cell cycle Transcription Replication Chromosome segregation End result: Damage Repair Damage Tolerance Cell cycle arrest Cell death Low dose of damage incorrect repair > mutations damage tolerance > mutations + persistence of damage High dose of damage genomic instability apoptosis(p53 dependent)

DNA damage and cell status Block transcription decreased transcription of damaged genes transcription up-regulation of specific genes (p53, XPC, XPE) Block replication polymerase switch (translesion DNA synthesis) template switch (recombination-dependent daughter-strand gap repair) (Ubc13/Mms2) Checkpoint activation and cell cycle arrest G1, S, G2, and M to allow repair

Inability to proper repair DNA damage Low dose of damage incorrect repair > mutations damage tolerance > mutations + persistence of damage High dose of damage genomic instability apoptosis (p53 dependent)

Následky vrozených defektů reparace DNA Nádorová predispozice (či maligní transformace) Nádory kůže (Nucleotide Excision Repair) Nádory prsu (Homologous Recombination) Hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Mismatch Repair) a jiné Vývojové abnormality Neurologické poruchy Předčasné stárnutí (Homologous Recombination) Selhání kostní dřeně (DSB repair and cell cycle checkpoint)

Vrozené mutace genů účastnících se oprav vedou ke vzniku specifických syndromů... Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer Syndrom dědičné rakoviny prsu a ovaria Fanconiho syndrom Li Fraumeniho syndrom Xeroderma pigmentosum Cockaynův syndrom Bloomův syndrom Wernerův syndrom Rothmundův Thomsonův syndrom Nijmegen syndrom (NBS) Ataxia telangiectasia ATLD (Ataxia telangiectasia like disease) Seckelův syndrom MSH2, MLH1,... BRCA1 FANC, BRCA2 TP53 XPA XPG CSA, CSB BLM WRN RecQL NBS1 ATM MRE11 ATR

1) HIERARCHY OF DNA DAMAGE RESPONSE DNA damage Damage sensing DNA repair Cellular senescence DNA damage checkpoints Cell cycle arrest Transcription response Cell death

Kategorie faktorů účastnících se DDR Sensors PCNA/RFC clamp loader homologues Mediators Ser-Thr kinases Transducers Effectors cdk inhibition

2 ) REPARAČNÍ MECHANISMY globální reparace genomu (nespřažené s transkripcí) reparace spřažené s transkripcí (transcription coupled repair)

Reparační systémy: specializace a zástupnost Specializace: specifické reparační mechanismy pro různé typy lézí Zástupnost: jeden opravný systém pro několik typů lézí

Přehled opravných mechanismů DNA 1. Mismatch repair MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomůřetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair homologous recombination HR nonhomologous end joining NHEJ

1. Mismatch repair MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair homologous recombination HR nonhomologous end joining NHEJ

MISMATCH REPAIR MMR opravuje špatně inkorporované báze (ne tedy poškozenou DNA) avšak léze způsobené alkylačními a interkalačními činidly mohou zmást MMR aspustit chybnou nebo neúčinnou MMR typ NER vázaný na probíhající replikaci zahrnuje rozpoznání léze, incizi, odstranění krátkého úseku nukleotidů, resyntézu a ligaci, vstupním místem jsou pravděpodobně existující jednovláknový zlom (SSB)

MISMATCH REPAIR (MMR) repairs mismatched bases (not DNA damage) however, lesions caused by alkylating agents and intercalators, may fool MMR and trigger erroneous or futile MMR typ NER vázaný na probíhající replikaci, zahrnuje rozpoznání léze, incizi, odstranění krátkého úseku nukleotidů, resyntézu a ligaci, vstupním místem jsou pravděpodobně existující SSBs

MISMATCH REPAIR (MMR) Záměny během replikace a rekombinace hmsh2/6 záměny a jednobázové vlásenky hmsh2/3 inserce/delece (1>10 nt) Nově syntetizované vlákno je zdegradováno za záměnou a resyntetizováno: Polδ/ε, RPA, PCNA, RFC, exonukleáza 1, FEN1 Hoeijmakers, Nature 411:366 374, 2001

Vrozené poruchy MMR Vrozená nepolypózní rakovina tlustého střeva a konečníku HNPCC (Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer) Dominantně autosomálnídědičnost mutace několika odlišných genů: MSH2, MLH1, PMS2, MSH6, PMS1, MBD4, MYH pozorována nestabilita mikrosatelitů (variace počtu jednotek opakujících se krátkých sekvencí DNA) Klinické příznaky: predispozice k určitým typům zhoubných nádorů, především tlustého střeva a rekta s nástupem v časném věku nádory endometria, žaludku, vaječníků, hepatobiliárního systému u tumorů sporadicky rezistence vůči alkylačním a interkalačním činidlům

Přímá oprava metylačního poškození pomocí proteinu AlkB AlkB nalezen u všech žijících organismů patřímezi α ketoglutarát a Fe dependentní oxygenázy α ketoglutarát je konvertován na sukcinát a CO2 a metylová skupina báze je hydroxylována hydroxymetylová skupina se pak spontánně uvolňuje ve formě formaldehydu a dochází tak k obnovení původní báze

Přímá oprava fotodimerů fotoreaktivací první objevený mechanismus reparace DNA (1949) CPD fotolyáza obsahuje dva chromofory, FADH a buď metenyltetrahydrofolát (MTHF) nebo 8 hydroxy 5 deazaflavin (8 HDF) MTHF či 8 HDF absorbují viditelné světlo, přenášejí takto získanou energii na FADH, tato energie je potom použita na rozštěpení dimeru není přítomen u placentálních savců

3. Extenze 3ʹ OH konce DNA polymerázou (β), doprovázená excizí AP místa deoxyribózofosfatázovou (drpáza) aktivitou Polβ; DNA ligáza IV plus XRCC1 BASE EXCISION REPAIR BER hlavní cesta (mnoho variant) opravy oxidačního poškození DNA, metylací, deaminací a jednovláknových zlomů 1. Odstranění nesprávné báze danou DNA N glykoslyázou (specifickou pro daný typ modifikované báze) za vzniku AP místa 2. Přetnutí poškozeného DNA řetězce AP endonukleázou po směru od AP místa za vzniku 3ʹ OH konce přilehlého k AP místu

BER in steps P P S Base glycosylase S P Base S P P Base S P BASE DAMAGE AP SITE - apurinic - apyrimidinic

BER in steps P P S AP endonuclease Base S Base S AP SITE strand break

BER in steps P Base S polymerase ligase P S Base Base S P P strand break

DEFECTS IN BER MUTYH / (DNA glycosylase excises adenine from 8 oxog:a base pairs) MUTYH interacts with MSH2/MSH6 heterodimer the first BER gene associated with a human cancer syndrome (multiple colorectal tumors, Al Tassan et al, 2002) Mouse models knockout: individual glycosylases no overt phenotype, but double mutants have increased mutagenesis and cancer susceptibility core proteins embryonic lethality

nonhomologous end joining NHEJ 1. Mismatch repair MMR (oprava záměn bází) 2. Direct repair of a) chemical adducts b) photodamage (oprava fotopoškození) 3. Base excision repair BER (excize bází) 4. Nucleotide excision repair NER (excize nukleotidů) 5. Strand break repair (oprava zlomů řetězců) a) single strand break repair b) double strand break repair homologous recombination HR

NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR NER hlavní cesta opravy poškození způsobeného UV, tabákem a ostatními karcinogeny podílí se také na opravě oxidačního poškození, odstranění velkých aduktů, fotoproduktů a jiných lézí distortujících DNA či blokujících RNA Pol

NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR NER účast 6 korových faktorů zahrnujících 15 až 18 polypeptidových řetězců pro excizi, opravnou resyntézu a ligaci slow fast Sensors Endonucleases Helicases 18 24 nt Pol δ/ε, ligase I

Vrozené poruchy NER Cockaynův syndrom (porucha NER spřažená s transkripcí TCR NER) dominantně recesivní onemocnění mutace genů CSA či CSB Trichothiodystrofie specifické mutace genů XPB či XPD, někdy TTD A Pro oba syndromy jsou společné růstové defekty, progredující mentální retardace Pro trichothiodystrofii jsou charakteristické kožní problémy šupinatákůže (ichthyosis), lámavé vlasy a nehty Symptomy předčasného stárnutí, není výrazně vyšší incidence zhoubných nádorů

Biochemický nález: citlivost buněk k UV záření hořčičnému plynu psoralenům cisplatině defekty reparace DNA Xeroderma pigmentosum (porucha globálního NER GG NER) Autosomálně recesivní dědičné onemocnění 7 komplementačních skupin, mutace genů XPA XPG Klinické příznaky: citlivost ke slunečnímu záření dermatózy hyperpigmentace degenerace sítnic mentální retardace (skupiny A, B, D, G) nádorová onemocnění kůže a vnitřních orgánů 2000 násobná incidence

Funkce genů postižených u Xeroderma pigmentosum a trichothiodystrofie

Oprava složitých jednovláknových zlomů SSBR 1) vazba polyadpribózapolymerázy do místa zlomu, syntéza polya 2) vazba XRCC1 a DNA ligázy 3 do místa zlomu 3) vazba polynukleotidkinázy a polymerázy beta, vyplnění mezery 4) ligace řetězce DNA (DNA ligáza 3)

DNA DOUBLE STRAND BREAK REPAIR HR (sister chromatid) NHEJ (no template) Hoeijmakers, Nature 411:366 374, 2001

DNA DOUBLE STRAND BREAK REPAIR DNA double strand break Nonhomologous end joining (NHEJ) Homologous recombination (HR) no homology error prone G1 phase Ku/DNA PK homologous template error free S/G2 phase Rad52/51 complex

HOMOLOGOUS RECOMBINATION HR

NON HOMOLOGOUS END JOINING NHEJ

Překlenutí poškození (Damage Bypass; Translesion Synthesis)

vážná překážka transkripci a replikaci DNA, oprava je často možná obětí fragmentu DNA Oprava příčných vazeb mezi vlákny DNA hypotetický model G1 fáze G2 fáze

Klinické příznaky: malý vzrůst, malformace různých orgánových systémů (nejčastěji rádia a palce, GUT, GIT, srdce a CNS) výskyt café au lait skvrn na kůži nejproblematičtější je snížená funkce hematopoietického systému (pancytopenie) vznikající od raného dětství krvácení, anémie, náchylnost k infekcím predispozice k určitým typům zhoubných nádorů (tzv. preneoplastický myelodysplastický syndrom, především leukémiím AML) přecitlivělost na crosslinkery (mitomycin A, cisplatinu a diepoxybutan), vyvolávají G2 blok buněčného cyklu Fanconiho anémie recesivně autosomální dědičné onemocnění mutace více než 7 genů kódujících FANC proteiny (včetně BRCA2=FANCD1) zhoršená reparace zlomů DNA