Mikrosatelity (STR, SSR, VNTR)

Transkript

1 Mikrosatelity (STR, SSR, VNTR)

2 Repeats Více než polovina našeho genomu Interspersed (transposony) Tandem (mini- a mikrosatelity) Minisatellites (longer motifs nucleotides)

3 mikrosatelity Tandemová opakování krátkých motivů (1 až 6 nukleotidů) Např. (CTTT) n nebo (CA) n CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT Někdy i složitější (CTTT) n (CA) n CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT Velmi časté v jaderném genomu, plastidech, někdy i mtdna Člověk asi 700 tisíc mikrosatelitů, 3 % genomu

4 Treska a zej Jiang et al Mořské organismy Větší genom více mikrosatelitů Ale i značné rozdíly mezi taxony (ptáci méně než savci a ryby)

5 Klasifikace

6 Neutralita? Některé mají známou funkci cis regulace v lidském genomu Často i v exonech (transcriptome) Genetic disorders Vasopressin gene expression Microtus ochrogaster

7

8 Vznik 2 teorie 1) De novo (Spontánně) Např. GACGCACG GACACACG Indels nebo mutací 2) Pomocí mobilních elementů (TE) Přenesení celého lokusu na jiné místo Vznik asi z PolyA tails Víc jak polovina lidských msats Možná důvod málo msats u ptáků (málo TE) AAAAAAAAAAA AAACAAAAAAA AAACACAAAAA AAACACACAAA

9 V kódujících oblastech častěji tri- a hexa- V nekódujících di- a tetra-nukleotidová opakování Nejběžnější u obratlovců je (AC) n

10 Mutace Mutační rychlost 10-3(2) 10-7 Značné rozdíly mezi druhy, lokusy Male germline > female germline Především slippage (chyba při replikaci), málo asi i rekombinace

11 Většinou posun o jednotku opakování? (single step) SMM stepwise mutation model (Mutace způsobeny pouze ztrátou nebo získáním jediného opakování motivu. Mutací může vzniknout alela, která je již v populaci přítomna) Pro msat se často předpokládá v modelech CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTT Empirická data až polovina i více - multistep

12

13 Mutace Dinukleotidové msats > tri-, tetra Více u complex Závislost na místě v genomu (místa s efektivním MMR) (MMR sníží rychlost mutací 100 až 1000krát) MMR = mismatch repair

14

15

16 Dinukleotidové mikrosatelity v exonech Haasl & Payseur 2014

17

18

19 flanking regions

20

21 Constraints life cycle? threshold required for high rates of strand slippage Jen vzácně víc než 50 opakování větší délka větší šance pro mutace větší délka interruptions (chyby v motivu) Degenarace až smrt? znovuvzkříšení (jen teorie)

22

23 Některé msats vydrží na stejném místě stovky miliónů let

24 Využití: analýza paternity, identity, populační struktury Jednoduchá mendelovská dědičnost Vysoce polymorfní

25

26 Pro řadu otázek je (či brzo bude) lepší alternativa NGS Msats zatím dominují u neinvazivních vzorků (ale objevují se alternativy) Stále skvělé pro identitu, paternitu a příbuznost

27 PCR Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. Co se bude množit? To určí primery. Primery krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA DNA templátu primer primer tento úsek se bude množit

28 Mikrosatelity Vyhledání primerů pro nové lokusy: náročné na čas i finance genomové knihovny, hybridizace se sondou, sekvenování pozitivních klonů

29 Alternativa next-gen seq pyrosekvenování Illumina

30 Lze i detekovat polymorfní lokusy

31 Stejné primery často fungují pro více příbuzných druhů (ale ne vždy, mutace v místě nasedání primerů) Primery na základě srovnání genomu slepice a zebřičky Dawson et al.

32 Elektroforéza gel

33 Alely se liší délkou CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTC + CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT

34 kapilára musím mít fluorescenčně značené fragmenty (např. označím primery) rozdělení fragmentů dle velikosti při průchodu kapilárou detekce pomocí laserového paprsku detektor laserový paprsek

35

36 primer CTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTT GAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAAGAAA primer Fluorescenční značení primer CTTTCTTTCTTTCTTT GAAAGAAAGAAAGAAA primer

37 Multiplex Více dvojic primerů v jedné reakci Různé značení Analýza se standardem standard

38

39

40 allelic dropout allelic dropout allelic dropout and false allele. allelic dropout allelic dropout

41

42

43 Medvědi v Pyrenejích Taberlet et al Trus a chlupy 24 mikrosatelitových lokusů 4 samci a jedna samice (o jednoho víc než podle stop a fotografií) U nás podobně studovány vydry (trus) Molecular scatology

44

45

46 Jak ta struktura vznikla? ABC (Approximate Bayesian Computation) Program DIYABC Různé scénáře Mikrosatelitová data

47 Balaena mysticetus velryba grónská

48 Kromě analýzy neinvazivních vzorků se dají využít i vhodnější aletrnativy (NGS, SNPs) Jsou však i výjimky

49 645 microsatellite loci, 5795 individuals from 267 worldwide populations

50 Určení paternity Matka Otec Mládě 1 Mládě 2

51 Fragmentační analýza

52 Kachny (Kreisinger et al. 2010) Neinvazivně Genotyp matky z peří v hnízdě Genotypy mláďat z blan z vylíhlých vajec Zjištění vnitrodruhového hnízdního parazitismu Dohledání hnízd parazitických samic Opakované hnízdění Rekonstrukce genotypů otců Zjištění extrapárových paternit Dohledání dalších mláďat extrapárových otců

53 Populační genetika populační genomika 3rd-gen sequencing