Regulace translace 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech ITAF = initiation trans acting factor chaperone aktivity konformace domény pro IRES mnohočetné RNA vazebné domény Vagner S. et al. 2001, EMBO Report 2, 893-898 2. translace- iniciace v jakých situacích je využíván IRES Virové napadení IRES fialová= virová partikule, růžová= eif3, eif3 tvoří komplex 40S/IRES napadení viry, apoptoza, stres, cell cycle G2/M 1
Apoptoza - IRES Stres -IRES Homeostáze buňky udržována (mimo jiné) rovnováhou mezi : Inhibiory apoptozy (Bcl2) blokace inhibitorů = uvolňování cytochromu C z mitochondrií Receptory apoptozy (IAP) Apoptotické proteázy aktivační faktor Apaf1-interakce s prokaspázou 9 IRES se podílí na syntéze jednotlivých fází apoptozy stresor: teplota, hladovění, zasychání, osmotické nerovnováhy, těžké kovy, napadení patogenem stres buňka se brání vzniku proteinových agregací stres - okamžitá represe translace konstitutivních typů mrna, mrna jsou z translačního aparátu odstraněny do stres granulí stres okamžitá exprese specifických stresových proteinů HSP + shsp HSP: 60, 70, 90, 110, 120 kda shsp: 23, 25, 28kDa v živočišných buňkách, jejich aktivita spojena s fosforylací 15 35 kda, široká škála až 20 typů bílkovin v rostlinných buňkách Stres - IRES 1. translační aparát trna strukturní modifikace Nepříznivé vnější podmínky stresory: Aktivace stresové odpovědi Změna programu bunky: metabolická energetická translační translační aparát: modifikace TF přeskupení mrna (přesun konstitutivních typů mrna do stresových granulí) fosforylace IF2alfa F4E S6 proteinu modifikace inosinové trna 2
2.translace stres (př. interakce bílkovina DNA, bílkovina-bílkovina a úloha fosforylace bílkoviny) 2. translace- modifikace iniciace, stres Okamžitá exprese stresových bílkovin??? 1. mrna kódující stresové bílkoviny nemá čepičku - využívá systém IRES 2. Stresové bílkoviny přímo ovlivňují iniciaci, iniciační faktory Hsp27 indukovaný stresem v savčích buňkách interakuje přímo s faktorem 4G a tak brání translaci konstitutivních proteinů overexprese Hsp70 udržuje 4G funkční a umožňuje jeho zabudování do4f, podílí se na nastartování translace po stresu tyto nálezy zatím jen v živočišných buňkách u rostlin působí Hsp101 jako translační enhancer, je funkčně obdobou TMV vazba Hs101 na mrna vrací funkci 4G a eif3 a tím konfigurují 40S komplex pro expresi konstitutivních bílkovin Buněčný cyklus - IRES PITSLRE kinázy rodina cyklin dependentních regulovány cis-trans elementy specifické pro G2/M fázi spolu s vysokou hladinou fosfoylace IF2 = aktivace IRES 2. Translace modifikace iniciace RIP = ribosome inactivating proteins = inhibitory = stop proteosyntézy = cytotoxické proteiny, ribosomální jedy mají N-glykosidázovou aktivitu, štěpí glykosidickou vazbu 28S rrna v 60S podjednotce = neschopnost vazby ribosomu na eef2 Přirozená obrana rostlinné buňky proti virovým infekcím Celosia cristatae) Ricinus communis 3
2. translace- iniciace Regulace translace Iniciace je mnohostupňovým procesem Aktivace aminokyselin Aktivace 40S ribosomální podjednotky Vytvoření ternárního komplexu Vytvoření preiniciačního komplexu Aktivace mrna Vazba preiniciačního komplexu na čepičku mrna Scanování mrna reiniciačním komplexem až po AUG kodón Vazba PABP na čepičku Recyklace eif2.gdpnapojení PABP na čepičku Iniciace čepička na 5 UTR = scanovací model platí vždy??? 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech 2. Translace Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci Iniciace je klíčovým procesem REGULACE TRANSLACE ELONGACE + TERMINACE 4
2.Translace - elongace Elongace začíná nalezením prvního AUG a zformováním ribosomu preiniciační komplex navázán na AUG LSU připojen po odvázání eif6 pomocí eif5.gtp hydrolýza GTP = finální selekce AUG dovršena iniciátorová-met trna v P místě zformovaného ribosomu Volné A místo pro první vnitřní kodón syntetizovaného proteinu 2.Translace - elongace Elongace = postupné přidávání aminokyselin k rostoucímu řetězci bílkovin Ribosom obsahuje 4 vazebná místa pro RNA: 1 místo pro mrna (při iniciaci) 3 místa pro trna (při elongaci) A = aminoacyl-trna P= peptidyl- trna E = exit trna Molekuly trna jsou pevně drženy v místech P a A pouze při dokonalém párování kodón-antikodón Vazebná místa A, P a E: tvořena ve vnitřním prostoru, na interfázi obou podjednotek Zahájení elongační fáze 2.Translace - elongace Ternus termophilus a)cryoelectron mikroskopická podoba E.coli ribosomů b) Počítačový model 70S ribosomu místa: A (růžová), P (zelená) a E(žlutá) nascentní polypeptidový řetězec zanořen do tunelu v 50S poblíž akceptorového ramínka trna v P místě, proti místu kde se velká podjednotka váže na malou podjednotku translačně funkční místa ribosomu viditelná na interfázi podjednotek A= modrá, P= žlutá, E= zelená, 5
2.translation - elongation Elongace = růst nascentní bílkoviny : 3 stupně 2. Translace elongace = aminoacyl t-rna se pevně váže na ribosom = dekodující stádium pre-state uspořádání ribosomu 1. vazba aminoacyl t-rna na ribosom 2. transpeptidace 3. translokace 2.Translace - elongace První fáze = vstup 2. aminoacyl t-rna do ribosomu vždy v podobě ternárního komplexu s navázaným elongačním faktorem aktivované formě EF1 alfa.gtp vždy na místo A přesně na odpovídající kodón mrna a antikodón trna Elongační faktor EF1 ( Prokaryota: EF-Tu) EF1A + (EF1B) EF1A: nalézá správnou adresu pro aa-trna na A místě ribosomu (EF1B): recyklační faktor EF1A: alfa, beta, gama podjednotky eef1 alfa : kódována mnohočetnou genovou rodinou exprese regulována vývojově, hormonálně a stresem na hladině transkripce a stability mrna v rámci rostlinných druhů vysoká sekvenční homologie výjímečnost eef1 alfa podjednotky: katalyzuje vazbu aminoacyl-t-rna k ribosomům reguluje přesnost + rychlost elongace přítomna v buňce až do 1-5% celkových bílkovin její exprese koreluje s rychlostí růstu bez ohledu na vysokou konstitutivní hladinu snižuje aktivační energetickou barieru mezi konformačními stavy ribosomů váže se na mikrofilamenta a mikrotubuly zvyšuje podíl F aktinu vazba na cytoskelet: kompartmentace translace na cytoskeletu regulace transportu translokace aktivace mrna i mrnp zajišťuje prostorovou orientaci i organizaci translačního aparátu 6
elongační faktor eef1b recyklace eef1a eef1b: alfa, beta, gama podjednotky recyklace eef alfa.gdp - eef alfa.gtp eef alfa.gdp + eef1b = --- eef alfa.gtp míra recyklace = míra účinnosti translace fosforylace eef1b alfa = inhibice recyklace = inhibice elongatce, inhibice translace EF1A + EF1B obdoba eif2a + eif2b Vstup aminoacyl-trna do ribosomů na místo A, úloha elongačního faktoru EF-TU 2.Translace elongace Nobelova cena za chemii 2009 Struktura a funkce ribosomů Venkatraman Ramakrishnan Thomas A. Steitz Ada E. Jonath 7
2.Translace elongace Funkčnost ribosomů : labilní napojování podjednotek + konfigurační proměnlivost obou podjednotek STRUKTURA A FUNKCE RIBOSOMU 1. Problém přesnosti elongace Jak je zajištěna:? aminoacyl-trna rozpozná kodon-antikodon selektivita přijímání aminoacyl-trna na místo A - jak je zabráněno substituci Aa (změna aktivity syntetizované bílkoviny) - jak je zabráněno předčasné terminaci translace (ribozom s redukovanou schopností produkovat kompletní bílkoviny) Jak se otázka řešila: ultraskturální analýzy mutace rrna, RP aplikace antibiotik Ternární komplex se navazuje do A místa Indukuje pohyb basí A1492, A1493, G530 a tím: nastavena pozice kodón-antikodón změna konformace 30S z otevřeno na zavřeno signalizace pro hydrolýzu GTP uvolnění EF.Tu-GDP poloha aminoacylovaného 3 konce t-rna v místě A blízko 3 konce imet-trna v místě P = Test správného ternárního komplexu v místě A + Konečné usazení komplexu v místě A How the ribosome increases the intrinsic selectivity, d, of codon recognition. (A) The geometry of base pairing between U1 in first codon position and A36 in the anticodon is monitored by A1493. (B) The geometry of base pairing between U2 in second codon position and A35 in aminoacyl-trna is monitored by A1492 and G530, while the geometry of the base pairing in third codon position (U3:G34) is less stringently monitored, explaining the wobble hypothesis (From (Ogle and Ramakrishnan, 2005)). Přijetí odpovídajícího ternárního komplexu: větší rychlost hydrolýzy GTP než pro neodpovídající x Disociační rychlost v opačném uspořádání Closing and opening of the 30S subunit. The subunit opens and closes by intra-subunit rotations (red arrows) around the A site The open conformation is stabilized by ribosomal proteins S4 and S5, while the closed conformation is stabilized by ribosomal protein S12. Cognate aminoacyl-trnas and some error inducing drugs (e.g. paromomycin) stabilize the closed conformation. Mutations in S12 tend to stabilize the open conformation (increased accuracy) and mutations in S4 and S5 tend to stabilize the closed conformation (decreased accuracy) (From (Ogle and Ramakrishnan, 2005)). 8
2.Translace - elongace 2.translation - elongation STRUKTURA A FUNKCE RIBOSOMU 1. Problém přesnosti elongace Usazení aminoacyl-trna do A: závisí na hodnotě rozdílu volné energie mezi odpovídající a neodpovídající trna odpovídající trna: preference hydrolýzy GTP = pevné zakotvení neodpovídající : prefernce disociace = odmítnutí rozpoznání nejen Watson-Crick párováním, ale i geometrií kodon-antikodon rotací uvnitř SSU kolem A místa: otevřená-závřená konformace Elongace = růst nascentní bílkoviny : 3 stupně 1. vazba aminoacyl t-rna na ribosom 2. transpeptidace 3. translokace 2.Translace elongace STRUKTURA A FUNKCE RIBOSOMU 2. Problém tvorby peptidové vazby reakce aminoskupiny acylované trna v místě A s carboxyl- terminál C peptidyltrna v místě P? ribozom katalyzuje tento proces Úloha peptidyl transferázového centrum (PTC) Mechanismus reakce Jak se otázka řešila: kinetické analýzy krystalografie mutace rrna v oblasti PTC Binding of EF-Tu and trnas to the ribosome seen by cryo-em. (A) Aminoacyl-tRNA in A/T site in ternary complex, peptidyl-trna in P site and deacylated trna in E site. (B) Pre-translocation ribosome with peptidyl-trna in A site, deacylated trnas in P and E site (From Valle et al., 2003). 9
The peptidyl-transferase center in the 50S ribosomal subunit is attacked by a large number of existing antibiotics, now revealed at high resolution in 50S subunit crystal structures (Figure 8) (Franceschi and Duffy, 2006). 2.Translace elongace Peptidyltransferázová reakce: je katalyzovaná velkou podjednotkou ribosomu? E.coli 50S: zbavena téměř všech bílkovin a přesto peptidylová reakce in vitro bez omezení proběhla = zřejmá úloha rrna (ribozymu) rrna LSU = přesná orientace atomů, jež spolu musí reagovat = modulace elektrostatického prostředí pro přenos protonů Pro studium reakce - nutnost fixace stavu: Kinetika rekce - rychlost vazby: aminoacyl-trna do místa A = 10 vazeb/sec vytvoření peptidové vazby = 300 vazeb/sec před reakcí v průběhu reakce po reakci Ribosom váže 2 trna substráty: 1. Peptidyl-tRNA v místě P je napojena na rostoucí polypeptidový řetězec 2. Aminoacyl-tRNA v místě A s jedinou nově přivedenou aa 3. Oba substráty uspořádány tak, že dojde k interakci: - mezi CCA konci obou substrárů - nukleofilní alfa amino skupinou A substrátu a 23S rrna v aktivním centru = přesné uspořádání na ribosomu před vlastní reakcí Řešení: použít v místě A analogy (např. puromycin) = rychlost vazby snížena na 50 vazeb/sec Rychlost tanspeptidační reakce na ribosomu je 10 7 oproti reakci s analogy in vitro 10
2 OH skupina A76 peptidyl-trna má klíčovou roli; její substituce vždy znamenala snížení aktivity 10 6 The mechanism of peptide bond formation on the ribosome. The α-amino group of aminoacyl-trna in the A site (blue) attacks (black arrow right to left) the ester bond of the peptidyl-trna in the P site (red). A proton is shuttled via the OH group of A76 in peptidyl-trna in the P site (black arrows left to right), aided by an H-bond network (Trobro and Åqvist, 2005) established with the help of 23S rrna bases and water molecules (not shown). Mechanismus katalýzy: shuttling protonů z OH skupiny A76 P místa trna 2 OH skupina předává proton Nukleofilní atak aminoskupiny A místa na esterovou vazbu P místa = Modulace konformačních změn PTC = Tvorba vazeb a bourání vazeb Peptidové vazby mezi rostoucím polypeptidovým řetězcem a novou aa nascentní bílkovina přenesena z trna v P místě, nová aa připojena na trna v A místě Peptidyl t-rna v A místě trna v P místě bez aa, připravena pro odplavení z ribosomu Transpeptidázová reakce ribosomu = Substrátem katalyzovaná reakce 11
2.translation - elongation Úloha elongačních faktorů Elongace = růst nascentní bílkoviny : 3 stupně 1. vazba aminoacyl t-rna na ribosom 2. transpeptidace 3. translokace eef2 = elongační faktor pro translokaci katalyzuje GTP-dependentní translokaci peptidyl-trna na ribosomu z místa A na P = posun mrna o 3 nukleotidy = uvolnění deacylované trna z místa P člen velké rodiny GTPáz nepotřebuje recyklační faktor pro výměnu GDP na GTP pre-translokační ribosom upřednostňuje vazbu eef2 post-translokační ribosom vazbu na eef1 alfa Třetí fáze = translokace ribosom se posune (translokuje) podél vlákna mrna přesně o 1 kodón trna Met bez aktivovaného methioninu se pohybuje k místu E další trna kovalentně vázaná na dipeptid se pohybuje na místo P V tomto okamžiku je konformace ribosomu s volným místem A = post state = připravenost přijmout další komplex aminoacylt-rna.ef1 alfa.gtp další aminokyselina se přidá na C-konec rostoucího polypeptidu dle posloupnosti kodódů tento proces se opakuje až po stop kodón 12
2.Translace - elongace 2. Translace Translace má 3 fáze: iniciaci, elongaci a terminaci vysoká flexibilita molekuly ribosomální bílkoviny L1 její funkčnost zajišťuje účinnou translaci terciární struktura L1 ribosomálního bílkoviny L1 se váže na: V. domenu 23S rrna (zodpovídá za odstraňování deacylované trna z ribosomu) ribosomální bílkoviny S9, S2 S10 mrna 2. translace - terminace 2. Translace - terminace Terminace = ukončení translace, uvolnění polypeptidového řetězce z ribosomu konečný stupeň translace nezbytné molekulární signály pro rozhodnutí o osudu komplexu: mrna-ribosom-trna-peptidyl stop kodóny: UAA UAG UGA nezbytná přítomnost uvolňovacích faktorů RF (release factors) 13
2. translace - terminace 2. translace terminace, stop triplety Terminační faktory RF: erf1 tvarově podobný trna, váže se na místo A rozezná stop kodóny erf3 funguje jako komplex erf3.gtp oba faktory katalyzují štěpení peptidyl-trna a tím uvolňují kompletní bílkovinný řetězec Bacterie: RF1, RF2 = obdoba erf1 RF3 = obdoba erf3 triplety UAA, UGA a UAG =terminační signály RF = release faktor dekodovací mechanismus pro AMI kodony je triplet :triplet mezi mrna a trna (kodon:antikodon) terminační signál není dekodován trna, ale proteinem RF1(+RF3) část RF musí rozeznat STOP sekvenci v mrna terminační signál je větší než UAA, UGA a UAG, +1 base za terminačním signálem rozhodující u všech organismů u rostlin je využíván UGA ve 46%, UAA ve 28% (u dvouděložných) base za 4. nukleotidem ovlivňují účinnost terminace RF výjimečnými faktory, mají současně kontakt s : mrna, s ribosomem, trna existuje alternativní translace, kdy není stop kodon rozeznán a je využit jiný 2. translace - terminace 2. Translace elongace ribosom se setká s terminačním kodonem UAA, UGA, UAG v místě A RF1 dekoduje příslušný terminační signál na mrna terminační faktor se naváže na ribozom peptidyl-trna je hydrolyzována RF3 asistuje, (vytváří se uvolňovací komplex RF1.RF3.GTP) uvolnění polypeptidu recyklace ribosomů, mrna, trna a všech translačních faktorů Elongace umožní postupné navazování dalších ribosomů Vznikají polysomální struktury přepis genetické informace z mrna do sekvence aminokyselin syntéza bílkoviny dovršena 14
2. Translace - terminace Disociace ribosomálních podjednotek a možnost okamžité reasociace na téže molekule mrna s využitím bílkovinných faktorů: PABP, eif4e a EIF4G Syntéza bílkovin na polysomech Polysomální komplexy ribosomy polysomy 15
Poly(A)-vazebné bílkoviny, eif4e a eif4g vytváří kruhovou strukturu mrna 2. translace terminace 2. translace Disociace ribosomálních podjednotek a jejich stabilizace navázáním stabilizačních faktorů: 60S (eif6), 40S (eif3) každá mrna svou specifickou elongační rychlost, průměrná rychlost = 5 AMI /sec doba vytváření bílkoviny = transit time = elongace + terminace (stanovení = poměr frakcí polysomální : cytosolické frakci) zpomalení pohybu ribosomů podél mrna = zvýšení počtu (density) ribosomů na mrna stimulace proteosyntézy při konstantním profilu polysomů zvýšením elongační rychlosti 16
Regulace translace rozdílná elongační rychlost u různých mrna za stejných podmínek: struktura 5 a 3 UTR oblasti neuniformní, specifická distribuce mrna a iniciačních faktorů ve specifických kompartmentech vytvářených cytoskeletální sítí struktura vytvářeného nascentního polypeptidu počet ko-translačních modifikací ( N-glykosylací ) rozdílná afinita iniciačních faktorů k určitým mrna volba preferovaných nebo vzácných kodonů volených trna inhibitor elongace a tím i inhibitor translace: CH = cykloheximid 1. Translační aparát 2. Translace 3. Bílkoviny a jejich posttranslační modifikace 4. Lokalizace bílkovin v buňce a jejich degradace 5. Translace v mitochondriích a chloroplastech Děkuji za pozornost Přijďte zase příště na kus řeči o translaci 17