Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové. Katedra biofyziky a fyzikální chemie. Interakce tenzidů a barviv v roztocích II

Transkript

1 Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biofyziky a fyzikální chemie Interakce tenzidů a barviv v roztocích II (diplomová práce) Hradec Králové 2008 Soňa Menšíková 1

2 Čestné prohlášení Prohlašuji, že jsem diplomovou práci zpracovala samostatně a uvedla veškeré použité prameny a literaturu. 2

3 Poděkování Chtěla bych poděkovat ing. V. Kubíčkovi za cenné rady a připomínky při zpracování mé diplomové práce. 3

4 OBSAH Abstrakt ÚVOD TEORETICKÁ ČÁST Roztoky Třídění kapalných roztoků Voda a její charakteristika jako rozpouštědla Zprostředkované rozpouštění solubilizace Tenzidy Definice a základní charakteristika tenzidů Vlastnosti tenzidů kritická micelární koncentrace Systematika tenzidů Cetyltrimethylamoniumbromid Benzethoniumchlorid Interakce organických barviv s tenzidy Faktory ovlivňující tvorbu agregátů Závěrečné shrnutí Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti Elektromagnetické záření a jeho vlastnosti Absorpce elektromagnetického záření Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti Extrakční spektrofotometrie Fluorimetrie Fluorescenční měření a jeho omezení Fluorimetr a jeho konstrukce EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST Použité chemikálie Použité přístroje Příprava zásobních roztoků

5 Příprava základních vodných roztoků KČ Příprava vodných roztoků tenzidů Příprava univerzálního pufru podle H.T.S. Brittona a R.A. Robinsona Pracovní postup Extrakční spektrofotometrie Spektrofotometrie vodných roztoků Fluorimetrie vodných roztoků VÝSLEDKY Výsledky studia interakcí KČ s CTAB Extrakční spektrofotometrie Spektrofotometrie vodných roztoků Fluorimetrie vodných roztoků Výsledky studia interakcí KČ s BCl Extrakční spektrofotometrie Spektrofotometrie vodných roztoků Fluorimetrie vodných roztoků DISKUSE Interakce KČ s CTAB Interakce KČ s BCl ZÁVĚR LITERATURA

6 Interakce tenzidů a barviv v roztocích II Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá studiem interakcí organického barviva (kresolové červeně) a tenzidů (cetyltrimethylamoniumbromidu a benzethoniumchloridu) s využitím extrakční spektrofotometrie, UV-VIS absorpční spektrofotometrie a fluorimetrie. Za použití uvedených metod byly získány výsledky, které potvrzují existenci významných interakcí mezi kresolovou červení a tenzidy ve vodných roztocích. 6

7 Interaction of Tensides and Dyes in Solutions II Abstract This diploma thesis deals with interactions of organic dye (cresol red) and tensides (cetyltrimethylamonium bromide and benzethonium chloride) utilizing extraction spectrophotometry, UV-VIS absorption spectrophotometry and fluorimetry. Using these methods, results were obtained confirming significant interactions of cresol red with the tensides in aqueous solutions. 7

8 1. ÚVOD 8

9 Již dříve bylo pozorováno, že tenzid přidaný do roztoku barviva způsobuje změny v absorpčním spektru barviva. Předpokládá se, že mezi organickým barvivem a povrchově aktivní látkou dochází k interakcím za vzniku agregátů barvivo-tenzid. Tato diplomová práce se zabývá interakcemi tenzidů a organických barviv v roztocích. Pracovala jsem s kationickými tenzidy, cetyltrimethylamoniumbromidem a s benzethoniumchoridem a s organickým barvivem kresolovou červení. Vliv těchto interakcí jsem zkoumala pomocí extrakční spektrofotometrie, UV- VIS absorpční spektrofotometrie a fluorimetrie. První dvě metody již byly v minulosti použity ke zkoumání interakcí v jiných soustavách barvivo-tenzid, využití fluorimetrie je však doposud jen řídkým jevem. Práce navazuje na výzkumnou činnost katedry biofyziky a fyzikální chemie, kde jsou v posledních letech interakce tenzidů a barviv systematicky zkoumány. 9

10 2.TEORETICKÁ ČÁST 10

11 2.1. Roztoky Definice roztoků Roztoky jsou dvou a vícesložkové homogenní a disperzní systémy, nejčastěji kapalného skupenství. Převládající kapalná složka roztoku se zpravidla označuje jako rozpouštědlo, další složky jsou pak rozpuštěné látky a zastoupení složek se vyjadřuje jejich koncentrací. (1) Rozpouštědlo je kapalná látka, která je zpravidla v přebytku nad rozpouštěnou látkou. Pro rozpouštědlo je důležitá polarita jeho molekul, podle toho rozlišujeme rozpouštědla polární a nepolární. Typickým polárním rozpouštědlem je voda a nepolárním například benzen. (2) Rozpouštěné látky můžeme rozdělit a charakterizovat podle formy v jaké se vyskytují v roztoku, rozeznáváme tak neelektrolyty a elektrolyty. Neelektrolyt je látka, která se rozpouští ve formě elektroneutrálních molekul, například kyslík ve vodě. Naproti tomu elektrolyt je látkou, která se při interakci s molekulami polárního rozpouštědla rozpadá na ionty. Rozlišujeme elektrolyty pravé, které již v pevném stavu existují ve formě iontů a elektrolyty potenciální, které ve své molekule obsahují silně polární kovalentní vazbu a na ionty se štěpí až působením polárního rozpouštědla. Tento rozpad původní struktury elektrolytů na volně rozptýlené ionty v rozpouštědle nazýváme elektrolytická disociace. Důležitou vlastností roztoků je homogennost ( stejnorodost ) chemických a fyzikálních vlastností a je důsledkem toho, že rozpuštěné složky jsou vzájemně dispergované až na molekuly nebo ionty. Roztok se tak fyzikálními vlastnostmi charakterizuje jako celek a mizí některé individuální vlastnosti jednotlivých složek. (1) Třídění kapalných roztoků (1) Podle skupenství rozpouštěné látky rozlišujeme roztoky plynů v kapalinách, roztoky kapalných látek a roztoky tuhých látek v kapalinách. V případě vzájemných 11

12 roztoků kapalných látek většinou nerozlišujeme mezi rozpuštěnou látkou a rozpouštědlem a tyto roztoky označujeme jako kapalné směsi. Roztoky dále můžeme rozdělit podle použitého rozpouštědla. Pokud je rozpouštědlem voda, mluvíme o vodných roztocích, v ostatních případech se jedná o roztoky nevodné. Podle charakteru dispergovaných částic rozpouštěné látky dělíme roztoky na molekulové nebo-li roztoky neelektrolytů a roztoky iontové neboli roztoky elektrolytů. Dalším hlediskem rozdělení roztoků je i velikost dispergovaných částic. Na základě toho rozeznáváme roztoky pravé, kdy velikost dispergovaných částic nepřesahuje 1 nm, a roztoky koloidní, ve kterých rozptýlené částice dosahují rozměrů od 1 nm až do 500 nm. Neposledním v řadě třídění roztoků je i hledisko termodynamické. Vznik roztoku totiž charakterizujeme změnami entalpie H, Gibbsovy energie G a entropie S, mezi nimiž za stalé teploty T platí obecný vztah: H = G + T S. Jestliže se H rovná nule, pak se jednotlivé složky mísí na takzvaný ideální roztok. Oproti tomu neideální tj. reálné roztoky se při svém vzniku vyznačují nenulovou změnou entalpie. Rozpouštění je v takovém případě doprovázeno uvolňováním tepla ( H < 0 ), nebo je teplo naopak pohlcováno ( H > 0 ). Teoreticky mohou být ideální pouze molekulové roztoky (neelektrolytů), zatímco roztoky všech elektrolytů se díky iontovým interakcím od ideality více nebo méně odchylují Voda a její charakteristika jako rozpouštědla (2) Voda patří mezi nejčastěji používaná rozpouštědla. Ve vodě se rozpouští četné anorganické a organické látky, které jsou v plynném, kapalném i pevném skupenství. Rozpouštěcí schopnost vody úzce souvisí s polárním charakterem molekul vody. Iontové sloučeniny a molekuly s polárními vazbami se rozpouštějí za vzniku hydratovaných iontů (elektrolyty), molekuly látky s málo polárními nebo nepolárními vazbami voda obklopuje, ale neštěpí (neelektrolyty). K elektrolytické disociaci dochází i v samotné čisté vodě. Vodu totiž řadíme mezi amfiprotní rozpouštědla, tzn. že molekuly vody mohou protony jak přijímat, tak i poskytovat. Měřením elektrické vodivosti bylo zjištěno, že i čistá voda vede elektrický 12

13 proud. Z toho vyplývá, že ve vodě dochází k ionizaci a část molekul se chová jako kyselina a část jako zásada. Tento disociační děj se nazývá autoprotolýza. H 2 O + H 2 O H 3 O + + OH - Protože se jedná o reakci rovnovážnou, platí pro ni Gulgbergův-Waageův zákon s příslušnou rovnovážnou konstantou K c. [H 3 O + ].[OH - ] K c = [H 2 O] 2 Disociace vody je velmi malá, proto koncentraci nedisociovaných molekul vody lze považovat za konstantní. Na základě tohoto předpokladu můžeme definovat novou konstantu K V, kterou nazýváme iontový součin vody. K V je konstantou, která závisí pouze na teplotě a vztah pro iontový součin vody vystihuje rovnováhu mezi ionty H 3 O + a OH - a nedisociovanými molekulami vody nejen v čisté vodě, ale i ve všech vodných roztocích. K V = [H 3 O + ].[OH - ] = (25 ºC) Koncentrace oxoniových iontů H 3 O + určuje kyselost vodných roztoků. S ohledem na důležitost této veličiny byla zavedena logaritmická stupnice kyselosti zvaná stupnice ph. ph = - log [H 3 O + ] Zprostředkované rozpouštění solubilizace (1) Pod pojmem zprostředkované rozpouštění neboli solubilizace se rozumí výrazné zlepšení rozpustnosti málo nebo prakticky nerozpustné látky a to přidáním další látky, tzv. solubilizátoru, do roztoku. Zprostředkované rozpouštění nejčastěji využíváme při přípravě vodných roztoků látek, které jsou ve vodě těžce rozpustné. 13

14 Jedním z mechanismů solubilizace je vytvoření komplexu málo rozpustné látky a solubilizátoru. Komplex vzniklý reakcí obou složek ve stechiometrickém poměru se pak vyznačuje výrazně lepší rozpustností. Další mechanismus zprostředkovaného rozpouštění využívá tzv. hydrotropního efektu. Hydrotropně účinné soli a polární látky zlepšují schopnost vody rozpouštět málo polární látky tím, že částečně rozrušují její asociovanou strukturu. Hydrotropní solubilizace je nespecifický a nestechiometrický děj, protože se jedná o působení na rozpouštědlo. Jedním z typů zprostředkovaného rozpouštění je i tzv. micelární solubilizace. Principem je vstup solubilizované látky do koloidních micel tenzidů. Hydrofilnější tenzidy se rozpouštějí ve vodě a po překročení kritické micelární koncentrace zde vytvářejí shluky ( micely ), které mají lipofilní jádro a hydrofilní obal. Lipofilní látky se zabudovávají do nitra micel, nebo vytváří s tenzidem smíšené micely. Velmi účinným prostředkem solubilizace je přidání kosolventu do roztoku. Kosolvent je nevodné rozpouštědlo, které se mísí s vodou. Tato směs se pak vyznačuje zvýšenou rozpouštěcí schopností, která je důsledkem nižšího povrchového napětí, než má samotná čistá voda. 14

15 2.2. Tenzidy Definice a základní charakteristika tenzidů Tenzidy neboli povrchově aktivní látky jsou látky, které snižují povrchovou nebo mezifázovou energii a samovolně se koncentrují ve fázovém rozhraní. Tím, že snižují povrchové napětí, usnadňují rozpouštění. Pojem tenzid pochází z latinského slova tendo, tendere napínat. Zde je vyjádřena nejdůležitější vlastnost tenzidů a tou je jejich vliv na povrchové napětí. Někdy se tenzidy také označují jako surfaktanty. Tento termín je odvozen z anglického sousloví surface active agens, což v překladu znamená povrchově aktivní látky. Podstatou této povrchové aktivity je asymetrická molekula tenzidů, která je složená ze dvou částí. A to z části hydrofilní, která obsahuje polární skupinu, a z nepolární, lipofilní části. Látky s touto strukturou nazýváme amfifilní neboli amfipatické. Přítomná hydrofilní i hydrofobní část musí mít dostatečnou velikost a musí být v dostačující vzdálenosti od sebe. Ve vodě se nepolární lipofilní části molekul tenzidů, s nimi popřípadě i další hydrofobní složky vodného systému, orientují k sobě prostřednictvím nevazbových interakcí. Molekuly vody jsou z této oblasti vytlačovány. Hydrofobní části tenzidů jsou nejčastěji tvořeny uhlovodíkovými řetězci alkanů, alkenů a fenylovými zbytky aromatických sloučenin. (3) Hydrofilní polární části tenzidů se na rozdíl od lipofilní složky vyznačují afinitou k vodě a jsou tedy ve vodném prostředí v různé míře hydratovány. To znamená, že se kolem vytvoří solvatační obal z molekul vody, který vzniká díky existenci vodíkových můstků mezi hydratovanou polární částí tenzidu a molekulami vody, přičemž míra hydratace hydrofilní složky tenzidu je přímo úměrná její polaritě. (3) Vlastnosti tenzidů kritická micelární koncentrace (1) Důsledkem amfipatického charakteru tenzidů je, že po dosažení tzv. kritické micelární koncentrace molekuly nebo ionty tenzidu spontánně agregují do větších útvarů micel. Neasociované molekuly nebo ionty tvoří monomolekulární vrstvu na 15

16 fázovém rozhraní. I když se micely přímo neúčastní tvorby této vrstvy, jejich funkce spočívá v ovlivňování povrchového napětí na rozhranní fází díky dynamické rovnováze mezi koncentrací micel a neasociovaných molekul tenzidu Systematika tenzidů Tenzidy můžeme klasifikovat podle různých hledisek. Například podle struktury hydrofobní části tenzidů rozeznáváme tenzidy alifatické, alicyklické, aromatické, heterocyklické atp., nebo je můžeme rozdělit podle způsobu využití na detergenty, solubilizátory, emulgátory nebo smáčedla, ale nejpraktičtějším kritériem jejich klasifikace se jeví rozdělení podle schopnosti tenzidů disociovat ve vodě. Podle tohoto hlediska rozlišujeme dvě základní skupiny tenzidů a to tenzidy neionogenní, které ve vodě nedisociují a jejich rozpustnost ve vodě je dána přítomností hydrofilních skupin, například hydroxylových, aminových atd., a tenzidy ionogení, které ve vodě disociují a jejich molekuly nesou kladný nebo záporný náboj. Podle charakteru náboje je dále rozdělujeme na anionické neboli anionaktivní, kationické neboli kationaktivní a amfoterní. Anionické tenzidy jsou látky, jejichž povrchově aktivní části nesou po disociaci ve vodném roztoku záporný náboj. Jsou to například karboxylové kyseliny, deriváty sulfonových kyselin, deriváty kyseliny sírové nebo fosforečné atd. Patří mezi nejúčinnější tenzidy a jsou nejvíce využívané. Příkladem anionaktivního tenzidu může být laurylsíran sodný. Kationické tenzidy naopak nesou po disociaci ve vodném prostředí na povrchově aktivní části molekuly kladný náboj. Využívají se nejčastěji jako invertní mýdla a konzervanty. Příkladem katonického tenzidu je cetylpyridiniumchlorid. Amfoterní tenzidy obsahují aniontové i kationtové funkční skupiny. Jejich náboj závisí ve vodném prostředí na koncentraci vodíkových iontů, tj. na ph. Při vysokém ph se chovají jako anionické tenzidy a naopak při nízkých hodnotách ph jako kationické. Hodnotu ph, při které je koncentrace kladných i záporných nábojů stejná, nazýváme isoelektrický bod. Tenzidy v tomto bodě existují jako amfiony a vyznačují se nízkou rozpustností ve vodě. 16

17 Cetyltrimethylamoniumbromid N + Br - Cetyltrimethylamoniumbromid patří do skupiny kationických tenzidů. Jeho molární hmotnost je 364,46 mol.l -1. Jedná se o bílý nebo téměř bílý objemný sypký prášek, který je snadno rozpustný ve vodě a v 96% lihu a prakticky nerozpustný v etheru.(4) Vykazuje dobré antibakteriální vlastnosti, proto se často využívá jako antiseptikum a jako konzervační přísada Benzethoniumchlorid CH 3 CH 3 H 3 C O O H 3 C CH 3 N + Cl - H 3 C CH 3 Je to bílý nebo nažloutlý prášek, který je velmi snadno rozpustný ve vodě a v lihu 96%, snadno rozpustný v dichlormethanu. Jeho vodné roztoky při třepání silně pění.(4) Benzethoniumchlorid je kationický tenzid, který ve své molekule obsahuje N- benzyl-n,n, dimethylamoniovou skupinu, která je nositelkou jeho kladného elektrického náboje. Jeho molární hmotnost je 448,10 mol.l -1. Podobně jako cetyltrimethylamoniumbromid má i benzethoniumchlorid bakteriostatické vlastnosti. 17

18 2.3. Interakce organických barviv s tenzidy Interakce organických barviv a tenzidů v roztocích jsou předmětem mnoha studií. Holandští vědci se zabývali pozorováním interakcí tenzidů a azobarviv a vyhodnocováním vlivu těchto interakcí na absorpční spektra azobarviv. Zjistili, že největší změny v absorpčních spektrech jsou při koncentraci povrchově aktivních látek, která je nižší než kritická micelární koncentrace. Změna v absorpčním spektru azobarviva ( methyloranže ) spočívala ve snížení absorbance v absorpčním maximu methyloranže (463 nm). Při zvyšování koncetrace povrchově aktivní látky (cetyltrimethylamoniumbromidu) došlo k vytvoření absorpčního pásu při vlnové délce 380 nm, který je připisován vzniku iontového páru organické barvivo tenzid. Při dalším přidávání tenzidu k roztoku došlo ke vzniku absorpčního pásu při vlnové délce 430 nm, který je důsledkem včlenění molekul methyloraže do micel cetyltrimethylamoniumbromidu. (5,6) Indičtí autoři zkoumali interakce porphyrinových barviv a některých tenzidů. Popsali tvorbu tzv. premicelárních agregátů při koncentraci povrchově aktivních látek blížící se kritické micelární koncentraci. Vznik premicelárních agregátů nastává před inkorporací molekul barviva do micel tenzidů a důkazem tohoto jevu je přítomnost dvou nebo více isosbestických bodů v absorpčním spektru použitého barviva. Podle typu posunu absorpčního pásu ve spektru rozlišují H a J typ premicelárního agregátu. Tvorba H-agregátu se projeví hypsochromním posunem, kdežto tvorba J-agregátu bathochromním posunem. V některých případech tvorba H-agregátu předchází vznik J- agregátu. Jednotlivé typy vznikají při různých koncentracích tenzidu. J-agregát vzniká při poměrném zastoupení molekul barviva a tenzidu 1:2 a H-agregát při poměru 1:4. (3,7) Autoři studie ( 8 ) se zabývali účinky kationických a anionických tenzidů na gel tvořený poly-4-vinylfenolem. Ve vodných roztocích gelu v přítomnosti kationických tenzidů ( decyl- a dodecyltrimethylamoniumbromidů ) bylo pozorováno bobtnání, které se snižovalo s rostoucí koncentrací tenzidu a při koncetraci, která se blížila kritické micelární došlo opět k nárůstu bobtnání gelu. Při použití anionického tenzidu (sodiumdodecylsulfátu) docházelo k zřetelnému bobtnání pouze při koncentraci blížící 18

19 se kritické micelární. Autoři studie usoudili, že při použití kationického tenzidu nejprve nastala agregace částic gelu, která se s rostoucí koncentrací tenzidu snižovala, a při koncetraci blížící se kritické micelární koncentraci se částice solubilizovaly. Naopak při použití anionického tenzidu byla pozorována pouze solubilizace částic gelu. Tento předpoklad byl ověřen UV-VIS spektrofotometrií. Ve spektru systému kationický tenzid-gel byly pozorovány dva posuny související s agregací a s následnou solubilizací polymerních částic, ale ve spektru systému anionický tenzid-gel se objevil pouze posun jeden, protože k agregaci částic gelu v tomto systému vůbec nedošlo a částice byly rovnou solubilizovány. Autoři studie (9) zkoumali acidobazickou rovnováhu vodných roztoků anionických sulfoftaleinových barviv, a to bromthymolové modři, thymolové modři a kresolové červeně, v přítomnosti neiontových polymerů (polyvinylalkoholu a polyethylenglykolu) a anionického tenzidu (sodiumdodecylsulfátu). Byla zjištěna kritická agregační koncentrace tenzidů v přítomnosti neutrálních polymerů. Tato koncentrace byla v systémech polymer-tenzid nižší než kritická micelární koncetrace v systémech bez polymeru. Asociační konstanta sulfonftaleinových barviv v sodiumdodecylsufát-polymerním systému je závislá na ph a vzrůstá s molekulární hmotností polymeru Faktory ovlivňující tvorbu agregátů Délka uhlíkatého řetězce povrchově aktivních látek ovlivňuje zejména hydrofobní interakce organických barviv a tenzidů. Důkazem tohoto vlivu je skutečnost, že při použití decyltrimethylamoniumbromidu nebyla prokázána interakce s methyloranží, ale při použití tenzidu s delším uhlíkatým řetězcem dodecyltrimethylamoniumbromidu došlo k vzniku nového absorpčního pásu v oblasti vlnové délky 380 nm. (5,6) Polární iontové skupiny v molekule barviva, jejich přítomnost, respektive nepřítomnost, a poloha těchto skupin ovlivňují interakce organických barviv a tenzidů. Není nejdůležitější typ substituentu, ale spíše jeho poloha, což bylo vysledováno srovnáním methylčerveně, methylžluti a methyloranže. U methylčerveně, u které je 19

20 karboxylová skupina v poloze ortho, a u methylžluti, kde skupina zcela chybí, nedošlo k výrazným spektrálním posunům v absorpčních spektrech při nízkých koncentracích povrchově aktivních látek narozdíl od methyloranže, jejíž iontová skupina se nachází v poloze para. (5,6) Vliv iontové síly na absorpční spektrum organických barviv v roztoku v přítomnosti tenzidů byl zkoumán prostřednictvím různých koncentrací chloridu sodného, který byl přidáván do tohoto roztoku. Bylo zjištěno, že s rostoucí koncentrací chloridu sodného, to znamená s rostoucí iontovou silou, se zmenšuje i absorpční pás v důsledku nižších elektrostatických interakcí mezi tenzidem a organickým barvivem.(5,6) Vliv tenzidu a jeho koncentrace na absorpční spektrum barviv zkoumali holandští autoři u azobarviv při měnící se koncentraci kationických tenzidů. Výsledky jejich pozorování jsem popsala v úvodní části této kapitoly Závěrečné shrnutí Mezi tenzidy a organickými barvivy dochází v roztocích k vzájemným interakcím, které se projevují jako změny v absorpčních spektrech barviv. K interakcím dochází jak mezi anionickými povrchově aktivními látkami a kationickými organickými barvivy, tak i naopak mezi kationickými tenzidy a anionickými barvivy. Dokonce i neionogenní tenzidy ovlivňují absorpční spektra organických barviv. Zmíněné změny v absorpčních spektrech barviv jsou důsledkem tvorby agregátů barviva a povrchově aktivní látky, které vznikají hlavně díky elektrostatickým interakcím mezi opačně nabitým tenzidem a barvivem a nebo mezi neionogenní povrchově aktivní látkou a barvivem. Kromě elektrostatických sil je neméně důležité i působení sil hydrofobních, na čemž se shoduje většina autorů, kteří se touto problematikou zabývají. 20

21 2.4. Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti se řadí do tzv. optických instrumentálních metod, jejichž společným rysem je mechanismus založený na interakci hmoty a záření. Jde buď o schopnost molekul, atomů nebo iontů přecházet z kvantových stavů s menší energií do energeticky bohatších dodáním zářivé energie nebo opačně vyzářením energie do energeticky nižšího stavu. Molekulová absorpční spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti je analytická metoda založená na absorpci záření molekulou při přechodu z nižšího elektronového stavu do stavu vyššího. (10) Elektromagnetické záření a jeho vlastnosti Elektromagnetické záření je kombinací příčného a postupného magnetického vlnění a elektrického pole. Má tzv. dualistický charakter, to znamená, že se projevuje jako vlnění ( například při ohybu světla ) a zároveň i jako proud korpuskulárních částic tzv. fotonů ( například při fotoelektrickém jevu ). Toto záření můžeme charakterizovat pomocí fyzikálních veličin jako je rychlost c, vlnová délka λ, frekvence f a energie E. Mezi těmito veličinami platí vztah: h. c E = h. f =, λ přičemž h je Planckova konstanta, která je jednou ze základních fyzikálních konstant a má hodnotu h = 6, J s. Planckova rovnice platí pro všechny oblasti elektromagnetického spektra, od vysoce energetického záření gama až po nízkoenergetické radiové vlny. (10,11) 21

22 Absorpce elektromagnetického záření (10) Absorpce je pohlcování světla určité vlnové délky analyzovanou látkou. Dochází k snížení intenzity záření, ale nemění se jeho vlnová délka. Intenzita záření nesouvisí s jeho energií. Stupeň absorpce se dá zjistit měřením toku záření I. Při průchodu světelného paprsku o intenzitě I 0 vrstvou absorbujícího prostředí tloušťky l se část záření absorbuje a část vychází ven o intenzitě I. Poměr mezi I a I 0 se dá změřit a tato veličina se nazývá transmitance T. I T = I 0 Pro praxi je významnější veličinou absorbance A, která je rovna logaritmu převrácené hodnoty transmitance: 1 A = log T Kvantitativní vztah mezi absorbancí a koncentrací pohlcující látky c v roztoku při vlnové délce λ vystihuje Lambertův-Beerův zákon: A =.c.l, kde c je koncentrace látky v mol.l -1, l je tloušťka absorbující vrstvy v cm a je molární absorpční koeficient, který je závislý na vlnové délce λ. Tento zákon však platí pouze pro monochromatické světlo a pro určitý omezený rozsah koncentrace, k odchylkám dochází při změně molárního absorpčního koeficientu vlivem disociace, dimerizace, hydrolýzy, změnou teploty atd. Vlastní výpočet koncentrace látky v roztoku se provádí podle Lambertova- Beerova zákona na základě znalosti molárního absorpčního koeficientu buď z tabulek, nebo z měření standardního roztoku. Nejčastěji se koncentrace zjišťuje z tzv. kalibrační křivky A = f (c), která má podle zmíněného Lambertova-Beerova zákona lineární tvar, jestliže je λ a l konstantní. Absorpční spektrum představuje závislost absorbance na vlnové délce procházejícího záření. Znázorněním této závislosti vzniká absorpční křivka. Jednotlivé oblasti absorpce ve spektru se nazývají absorpční pásy a každý tento pás je charakterizován absorpčním maximem λ max. 22

23 Spektrofotometrie v ultrafialové a viditelné oblasti (10) Při absorpci záření dochází v molekule k přechodu valenčních elektronů ze základních orbitalů na orbitaly antivazebné excitované. Současně s excitací elektronů dochází ke změnám ve vibračních a rotačních stavech molekuly, proto absorpční pásy pokrývají širší interval vlnových délek. Hodnota vlnové délky v maximu absorpce absorpčního pásu λ max určuje rozdíl v energii mezi základním a excitovaným stavem. Tento rozdíl souvisí s typem vazby mezi jednotlivými atomy v molekule, tedy s molekulovými orbitaly. Intenzita absorpce, to znamená hodnota molárního absorpčního koeficientu max absorpčního pásu, souvisí s pravděpodobností, se kterou se přechod uskuteční. Chromofor je seskupení atomů v molekulách, které způsobuje absorpci v rozmezí vlnových délek nm. U organických sloučenin je absorpce záření v této oblasti podmíněna přechodem elektronů z vazebných π nebo nevazebných n molekulových orbitalů na antivazebné π * orbitaly. K měření absorpce se používá řada přístrojů, spektrofotometrů, od jednoduchých až po automaticky registrující. Spektrofotometr může být buď jednopaprskový nebo dvoupaprskový, u kterého je paprsek monochromatického světla optickou cestou rozdělen na dva, přičemž jeden prochází přes kyvetu se vzorkem a druhý přes kyvetu se slepým roztokem. Spektrofotometr se obecně skládá s několika základních částí. První částí je zdroj záření. Jako zdroj viditelného světla se používá žárovka s wolframovým vláknem, která poskytuje záření v rozsahu vlnových délek od 350 nm do 2500 nm, a jako zdroj ultrafialivého záření se používá vodíková nebo deuteriová lampa. Protože Lambertův-Beerův zákon platí pouze pro monochromatické záření, musí polychromatické záření projít další částí spektrofotometru, monochromátorem nebo spektrálními filtry, abychom získali záření úzkého spektrálního charakteru. Záření pak prochází kyvetou, kterou jsme naplnili roztokem vzorku. Při měření ve viditelné oblasti se používají umělohmotné nebo skleněné kyvety, při měření v ultrafialové oblasti musíme použít kyvety křemenné. Slepým nebo-li porovnávacím roztokem označujeme roztok, který obsahuje všechny složky kromě měřené. Světlo, které prošlo vzorkem, dopadá na detektor, který měří jeho intenzitu buď pomocí fotočlánků, které převádějí světelnou energii na elektrickou a po zesílení proudu se měří intenzita proudu, a nebo pomocí fotonásobičů, které také převádějí světelnou energii na elektrickou, ale současně fungují jako zesilovače. Signál detektoru je dále elektronicky zpracováván. U dnešních 23

24 moderních přístrojů jsou ovládání spektrofotometru, zpracování signálu a operace s daty prováděny pomocí počítače Extrakční spektrofotometrie Extrakční spektrofotometrie využívá poznatků o rozdělovacích rovnováhách kapalina kapalina a měření absorpce ultrafialového a viditelného záření. Pro všechny fázové rovnováhy platí klasický Gibbsův zákon fází: f + v = s + 2 kde f je počet fází, v je počet stupňů volnosti, což jsou vzájemně nezávislé fyzikální veličiny ( parametry, vnitřní proměnné ), které určují stav systému, a s je počet složek dané soustavy. Většinou se v případě extrakčních metod zabýváme dvěma prakticky vzájemně nemísitelnými rozpouštědly a jednou rozpuštěnou látkou, která se mezi ně rozděluje, tedy f = 2 a s = 3. Při konstantní teplotě a tlaku má taková soustava jeden stupeň volnosti.(12) Extrakce v systému kapalina kapalina je založena na převedení látky fázovým rozhraním dvou vzájemně nemísitelných kapalin. Mezi oběma kapalinami a rozpuštěnou látkou dochází k ustavení rovnováhy, při které je poměr koncentrací rozpuštěné látky v obou fázích konstantní. Uplatňuje se Nernstův rozdělovací zákon, který má tvar: [ X ] 2 K D =, [ X ] 1 kde K D je Nernstův rozdělovací koeficient, [X] n jsou látkové koncentrace látky rozpuštěné v jednotlivých fázích. Velký význam pro proces dělení mají chemické interakce extrahovatelných látek s ostatními složkami v obou fázích, protože mohou podstatně ovlivnit koncentrace 24

25 těchto látek. Protože často potřebujeme znát celkové nebo stechiometrické rozdělení sledované složky v obou fázích a proto byla zavedena další veličina rozdělovací poměr D: c o D = c v Tímto poměrem rozumíme stechiometrický poměr koncentrací extrahovatelné látky v obou rozpouštědlech a přihlíží se ke všem formám extrahovatelné sloučeniny v obou fázích, přičemž c o je celková koncentrace v organické fázi a c v je celková koncentrace ve fázi vodné. Za ideálních podmínek, to znamená, pokud extrahovatelná látka nereaguje se žádnou složkou v obou fázích, přechází rozdělovací poměr na Nernstův rozdělovací koeficient K D. (12,13) Při extrakci z kapaliny do kapaliny musí organická rozpouštědla splňovat základní požadavek, aby pro daný extrakční systém bylo dosaženo co nejvyššího rozdělovacího poměru. Aby byl zaručen dobrý průběh vzájemného oddělení fází, má se hustota rozpouštědla značně lišit od hustoty vody. Lépe je pracovat s rozpouštědlem, které má vyšší hustotu než voda, protože to zůstává po extrakci ve spodní části dělící nálevky a jeho oddělování od vodné fáze je výhodnější. (13) Použitelnost různých extrakčních systémů se sleduje měřením absorbance výtřepků získávaných z vodné fáze. Ve vodném prostředí měníme experimentální podmínky tak, aby bylo možné vyšetřovat optimální tvorbu extrahovatelného systému. Nejčastěji se sleduje vliv ph, doba extrakce, vliv iontové síly vodné fáze, vliv koncentrace přidávaných činidel, vliv teploty atd. (13). Extrakce se provádí v dělící nálevce nebo zkumavce mírným protřepáváním obou fází ručně nebo mechanicky pomocí třepaček až do dosažení rovnováhy. Potom se fáze nechají rozdělit. Oddělená, transparentní a stop vody zbavená organická fáze se potom poměřuje na spektrofotometru. (13) 25

26 2.5. Fluorimetrie Při fluorimetrických stanoveních se využívá jevu, kdy v některých látkách po ozáření dostatečně energetickým zdrojem světla tzv. excitačním zářením dochází následně k emisi sekundárního záření. Popsaný jev nazýváme fotoluminiscence. Látky tak vyzařují ( emitují ) světlo, jehož intenzita je přímo úměrná koncentraci fluoreskující sloučeniny. Při excitaci se molekuly dostanou na vyšší energetickou hladinu a při návratu do základního stavu se část energie vyzáří také ve formě tepla. Proto má emitované záření fluoreskujících sloučenin vždy vyšší vlnovou délku, to znamená nižší energii, než excitační záření. Fluoreskující sloučeniny jsou často citlivé na malé změny ph, polarity, na přítomnost oxidačních činidel nebo zhášedel fluorescence Fluorescenční měření a jeho omezení Fluorescenční měření je narozdíl od měření absorbance citlivější a to řádově stokrát až tisíckrát. Omezení fluorescenčního měření vyplývají z koncentračních efektů, zejména tzv. vnitřního filtrového efektu, dále z efektů pozadí jako je Rayleighův a Ramanův rozptyl, dále z vlivu rozpouštědel, teplotních a vzorkových efektů a z fotodekompozice vzorku. Intenzita fluorescence je úměrná koncentraci fluoroforu a excitační intenzitě. Toto ovšem platí pouze pro zředěné roztoky, ve kterých je absorbance nižší než 2% excitovaného záření. Při absorbanci nad 2% může mít závislost koncentrace fluoroforu na excitační intenzitě nelineární průběh. To je způsobeno tzv. vnitřním filtrovým efektem. Vnitřní filtrový efekt je situace, při které je excitované světlo absorbováno samotným fluoroforem. Mezi efekty pozadí, které podobně jako vnitřní filtrový efekt omezují fluorescenční měření patří zejména Rayleighův a Ramanův rozptyl. U Rayleighova nedochází narozdíl od Ramanova rozptylu ke změně vlnové délky. Předejít tomuto jevu lze použitím dobře definovaných excitačních a emisních interferenčních filtrů a nebo použitím polarizátorů. U Ramanova rozptylu dochází vlivem nepružných kolizí ke změně energie. Děje se tak například při excitaci, kdy se energie následkem zmíněných 26

27 kolizí sníží a rozptyl světla pak probíhá při větší vlnové délce. Tento jev lze ovlivnit buď optikou, ale za cenu snížené citlivosti, nebo volbou vhodné excitační a emisní vlnové délky. (15) Fluorimetr a jeho konstrukce Fluorimetr je tvořen zdrojem zářivé energie, dvěma optickými separačními prvky a detektorem. Zdrojem záření jsou nejčastěji halogenové žárovky a xenonové výbojky. Světlo ze zdroje prochází buď interferenčním filtrem nebo mřížkovým monochromátorem. Pak paprsek světla dále prochází kyvetou, která je naplněna měřeným roztokem vzorku. Fluorescenční záření se měří pod úhlem 90 a po průchodu monochromátorem (filtrem) nebo difrakci reflexní mřížkou dopadá toto emitované světlo na fotonásobič. (14) 27

28 3.EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 28

29 3.1. Použité chemikálie Cetrimid cetyltrimethylamoniumbromid ( M r = 364,46 ) Merck ( for cosmetics ), použitá značka CTAB N + Br - Benzethoniumchlorid N- benzyl -N,N-dimethyl-2-{2-[4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenoxy]ethoxy}ethylamoniumchlorid ( M r = 448,09 ) Sigma, použitá značka BCl O O C H 3 N + CH3 CH 3 H 3 C CH 3 Cl - H 3 C CH 3 Kresolová červeň - 4,4 -(3H-2,1-benzoxathiol-3-yliden)bis(2-methylfenol)-S,S-dioxid, tj. o-kresolsulfonftalein ( M r = 382,4 ) - Lachema n.p. Brno, použitá značka KČ Hydroxid sodný Lachema n.p. Brno, závod Neratovice Kyselina boritá Lachema a.s. Neratovice Kyselina octová Lachema n.p. Brno, o.z. Neratovice Deionizovaná voda připravená reverzní osmózou Chloroform Lachema n.p. Brno, závod Neratovice 29

30 3.2. Použité přístroje Digitální analytické váhy - Sartorius Mechanická laboratorní třepačka LT-2 Kavalier Sázava ph-metr PerpHect 350 Orion Spektofotometr SPEKOL Carl Zeiss, Jena Spektrofotometr HP 8453 Hewlet - Packard Fluorimetr Aminco Bowman Series 2 Thermo Spectronic 30

31 3.3. Příprava zásobních roztoků Příprava základních vodných roztoků KČ Pro svá měření jsem potřebovala základní roztoky KČ o koncentraci 10-3 a 10-4 mol.l -1. Roztok o koncentraci 10-3 mol.l -1 jsem připravila tak, že jsem si na analytických vahách navážila 0,0382 g KČ a toto množství jsem kvantitativně převedla do odměrné baňky, rozpustila a doplnila na 100 ml destilovanou vodou. Roztok o koncentraci 10-4 mol.l -1 jsem připravila odpipetováním 10 ml předchozího roztoku a doplněním destilovanou vodou ve 100 ml odměrné baňce Příprava vodných roztoků tenzidů Při měřeních jsem používala roztoky tenzidů o koncentracích 10-3 a 10-4 mol.l -1. Roztok o koncentraci 10-3 mol.l -1 jsem připravila navážením příslušného množství tenzidu ( viz. tab. č. 1 ), rozpuštěním a doplněním destilovanou vodou na 100 ml v odměrné baňce. Odpipetováním 10 ml tohoto roztoku a doplněním na 100 ml v odměrné baňce jsem připravila roztok o koncentraci 10-4 mol.l -1. Tabulka č. 1: Příprava roztoků tenzidů o koncetraci 10-3 mol.l -1 Koncentrace roztoku Navážené množství tenzidu ( g ) ( mol.l -1 ) CTAB BCl ,0364 0,

32 3.3.3 Příprava univerzálního pufru podle H.T.S. Brittona a R.A. Robinsona Brittonův-Robinsonův pufr jsem připravila tak, že jsem ke 100 ml roztoku kyseliny borité, kyseliny octové a kyseliny fosforečné o koncentraci 0,04 mol.l -1 přidala příslušné množství hydroxidu sodného ( viz tab. č. 2 ) o koncentraci 0,2 mol.l -1. Tím jsem získala pufr o potřebném ph. Tabulka č.2: Množství roztoku NaOH použitého na přípravu pufru ph pufru 2,09 3,29 4,10 5,02 6,09 7,00 8,36 9,15 10,38 11,20 11,98 NaOH(ml) 7,5 20,0 25,0 35,0 42,5 52,5 62,5 70,0 80,0 85,0 100,0 32

33 3.4. Pracovní postup Extrakční spektrofotometrie Vzorky jsem připravila tak, že jsem do zkumavky odpipetovala 1 ml roztoku příslušného tenzidu o koncentraci 10-4 mol.l -1, přidala jsem 3 ml Brittonova- Robinsonova pufru o potřebném ph, který jsem si připravila podle tabulky č.2, pak jsem přidala 1 ml roztoku KČ o příslušné koncentraci připravený podle tabulky č. 4 a nakonec jsem do každé zkumavky přidala 5 ml chloroformu. Slepé vzorky se od vzorků lišily tím, že místo 1 ml tenzidu obsahovaly 1 ml destilované vody. Příprava vzorků a slepých vzorků je zaznamenána v tabulce 3. Tabulka č. 3: Příprava vzorků a slepých vzorků Vzorek Slepý vzorek Tenzid 1 ml 0 ml Destilovaná voda 0 ml 1 ml Pufr 3 ml 3 ml Roztok KČ 1 ml 1 ml Chloroform 5 ml 5 ml Měřila jsem absorbance chloroformových výtřepků na spektrofotometru Spekol. Extrakci jsem provedla třepáním vzorků a slepých vzorků na laboratorní třepačce LT-2. Do chloroformové vrstvy byl extrahován předpokládaný vzniklý agregát barvivo-tenzid, případně určité množství samotného barviva. Při měřeních jsem zjišťovala absorpční maximum KČ, vliv doby třepání a vliv ph použitého Brittonova-Robinsonova pufru. 33

34 Zjištění absorpčního maxima Absorpční maximum jsem zjistila tak, že jsem změřila absorbance vzorku proti slepému vzorku v oblasti vlnových délek, kde jsem očekávala absorpční maximum, to znamená v oblasti od 390 do 500 nm. Vzorek jsem připravila tak, že jsem do zkumavky odpipetovala 1 ml tenzidu, 3 ml Brittonova-Robinsonova pufru o ph 10, 1 ml roztoku KČ o koncentraci mol.l -1 a nakonec jsem přidala 5 ml chloroformu. Slepý vzorek obsahoval místo 1 ml tenzidu 1 ml vody. Zkumavky se vzorkem i slepým vzorkem jsem nechala 20 minut třepat a pak 10 minut stát. Poté jsem změřila absorbanci Sledování vlivu ph pufru na interakci KČ s tenzidem Vytvořila jsem si řadu vzorků a k nim odpovídajících slepých vzorků, ve které stoupala hodnota ph použitého Brittonova-Robinsonova pufru a neměnila se koncentrace kresolové červeně ani tenzidu v roztoku. Do každé zkumavky jsem odpipetovala 1 ml roztoku barviva o koncentraci mol.l -1, který jsem si připravila podle tabulky č. 4. Další postup přípravy vzorků a slepých vzorků se nelišil od výše uvedeného. Zkumavky jsem třepala na mechanické třepačce LT - 2. Po 20 minutách třepání jsem je nechala 10 minut stát a poté jsem změřila absorbanci vzorků oproti slepým vzorkům ve zjištěném absorpčním maximu. U každého tenzidu jsem vybrala jednu nižší a jednu vyšší hodnotu ph pufru, u kterých jsem zjistila nejlepší dosažené výsledky a se kterými jsem dále pracovala Sledování vlivu doby třepání Při sledování vlivu ph pufru jsem současně zjišťovala i vliv doby třepání. Připravené vzorky a slepé vzorky jsem vložila do mechanické třepačky LT 2. Po určité době ( po 10, 20 a 30 minutách ) jsem třepání přerušila, nechala jsem zkumavky asi 10 minut stát, aby se dokonale oddělila chloroformová vrstva od vodné a změřila jsem absorbanci v absorpčním maximu. 34

35 Sledování vlivu koncentrace KČ na interakci s tenzidem Připravila jsem si řadu vzorků a slepých vzorků, ve které stoupala koncentrace KČ. Vzorky jsem si připravila tak, že jsem do zkumavky odpipetovala 1 ml příslušného tenzidu ( CTAB nebo BCl ), 3 ml Brittonova-Robinsonova pufru o vhodném ph, příslušný objem základního roztoku KČ o koncentraci 10-3 mol.l -1 a vody tak, aby celková koncentrace roztoku měla požadovanou hodnotu. Objemy základního roztoku KČ a vody jsou uvedeny v tabulce č. 4. Nakonec jsem do každé zkumavky přidala 5 ml chloroformu, vložila jsem je do mechanické třepačky LT- 2, po 20 minutách třepání jsem je nechala 10 minut stát a poté jsem změřila absorbanci. Tabulka č. 4: Objemy roztoku KČ ( 10-3 mol.l -1 ) a vody nutné k přípravě roztoků o příslušné koncentraci Koncentrace KČ v roztoku ( mol.l -1 ) Objem vody ( ml ) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Objem KČ ( ml ) 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 35

36 Spektrofotometrie vodných roztoků Při měření absorbancí vzorků oproti slepým vzorkům jsem používala spektrofotometr HP Sledovala jsem vliv přebytku barviva v roztoku a také vliv přebytku použitého tenzidu Sledování vlivu přebytku KČ na interakci s tenzidy na koncentrační hladině mol.l -1 Řadu vzorků o rostoucí koncentraci barviva v roztoku jsem připravila tak, že jsem do sedmi kádinek odpipetovala 0,8 ml zásobního roztoku tenzidu o koncentraci 10-4 mol.l -1, 1,6 ml Brittonova-Robinsonova pufru o vhodném ph, který jsem si připravila podle tabulky č. 2, pak jsem přidala příslušný objem zásobního roztoku KČ o příslušné koncentraci ( viz tabulka č.5 ). Vzniklý roztok jsem doplnila vodou na celkový objem 4 ml. Tabulka č. 5: Příprava vzorků Číslo kádinky Koncentrace zásobního roztoku KČ ( mol.l -1 ) Objem zásobního roztoku KČ ( ml ) Výsledná koncentrace KČ v roztoku ( mol.l -1 ) , , , , , , ,

37 Slepé vzorky jsem připravila odpipetováním 1,6 ml Brittonova-Robinsonova pufru o vhodném ph, dále jsem přidala příslušný objem zásobního roztoku KČ ( viz tabulka č. 6 ) a doplnila destilovanou vodou na objem 4 ml. Tabulka č. 6: Příprava slepých vzorků Číslo kádinky Koncentrace zásobního roztoku KČ ( mol.l -1 ) Objem zásobního roztoku KČ ( ml ) Výsledná koncentrace KČ v roztoku ( mol.l -1 ) , , , , , , Sledování vlivu stoupající koncentrace tenzidu v řadě roztoků Připravila jsem si řadu vzorků, ve kterých jsem postupně zvyšovala koncentraci použitého tenzidu, a to stejným způsobem jakým jsem v předchozím měření zvyšovala koncentraci barviva v roztocích vzorků. To znamená, že hodnoty koncentrace i objemu odpipetovaného zásobního roztoku použitého tenzidu, jakož i výsledné koncentrace tenzidu v roztoku, jsou totožné s hodnotami, které jsem uvedla v tabulce č. 5 pro KČ. K příslušnému objemu tenzidu jsem přidala 1,6 ml Brittonova-Robinsonova pufru o vhodném ph, 0,8 ml zásobního roztoku KČ o koncentraci 10-4 mol.l -1 a roztok jsem doplnila vodou na 4 ml. K celé řadě vzorků jsem potřebovala pouze jeden slepý vzorek, který jsem si připravila odpipetováním 0,8 ml zásobního roztoku tenzidu o koncentraci 10-4 mol.l -1, 1,6 ml pufru o příslušném ph a doplněním na 4 ml destilovanou vodou. 37

38 Fluorimetrie vodných roztoků Měřila jsem fluorescenci vzorků a slepých vzorků připravených stejně jako pro spektrofotometrické měření ( viz kapitola ). Při práci jsem používala fluorimetr Aminco Bowman Series 2. 38

39 4. VÝSLEDKY 39

40 4.1. Výsledky studia interakcí KČ s CTAB Extrakční spektrofotometrie Zjištění absorpčního maxima Při zjišťování absorpčního maxima jsem postupovala podle postupu v kapitole Jak vyplývá z tabulky č.7, nejvyšší absorbanci jsem naměřila při vlnové délce 405 nm. Tabulka č. 7: Zjištění absorpčního maxima λ (nm) A 0,260 0,265 0,275 0,260 0,240 0,11 0, Výsledky sledování vlivu doby třepání Vliv doby třepání na absorbanci jsem zkoumala zároveň s vlivem ph použitého Brittonova-Robinsonova pufru. Připravila jsem si řadu vzorků a slepých vzorků podle návodu v kapitole Konkrétně jsem na přípravu vzorků a k nim odpovídajících slepých vzorků použila Brittonův-Robinsonův pufr o ph 3,0; 4,0; 5,0 a 6,0. Absorbance jsem měřila v absorpčním maximu při 405 nm. Z níže uvedené tabulky vyplývá, že nejvyšší hodnoty absorbance byly naměřeny u vzorků s dobou třepání 40 minut. V době 10 minut jsou hodnoty nejnižší, po 20 minutách třepání následuje větší skok v naměřených hodnotách a v dobách 30 a 40 minut není nárůst absorbance tak významný, proto jsem usoudila, že pro další měření postačí doba třepání 20 minut. 40

41 Tabulka č. 8: Vliv doby třepání na hodnoty absorbance A Doba třepání ph = 3,0 ph = 4,0 ph =5,0 ph =6,0 10 min 0,290 0,280 0,270 0, min 0,355 0,365 0,350 0, min 0,385 0,415 0,365 0, min 0,415 0,435 0,375 0, Výsledky sledování vlivu ph pufru na interakci KČ s CTAB Připravila jsem si řadu vzorků a slepých vzorků podle pracovního postupu v kapitole , jednotlivé pufry o potřebném ph jsem si připravila podle tabulky č. 2. Po 20 minutách třepání jsem zkumavky nechala 10 minut stát a následně jsem změřila hodnoty absorbance při 405 nm. Pro další práci jsem vybrala jeden pufr z oblasti nižšího a jeden z oblasti vyššího ph. Z níže uvedené tabulky vyplývá, že nejvyšší hodnoty absorbance byly naměřeny při použití pufru o ph 4,0 a pufru o ph 10,0. Tabulka č. 9: Vliv ph pufru na naměřené hodnoty absorbance ph 3,0 4,0 5,0 6,0 10,0 11,0 12,0 A 0,355 0,365 0,350 0,330 0,315 0,285 0, Výsledky sledování vlivu koncentrace KČ na interakci s CTAB Vzorky a slepé vzorky jsem si připravila podle návodu v kapitole , použila jsem Brittonův-Robinsonův pufr o ph 4,0 a 10,0. Absorbanci jsem měřila při vlnové délce 405 nm a 420 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č

42 Tabulka č. 10: Vliv koncentrace KČ na absorbanci chloroformové vrstvy A ph pufru λ ( nm ) ,370 0,390 0,350 0,390 0,270 0,245 4, ,335 0,355 0,320 0,350 0,240 0, ,285 0,365 0,370 0,400 0,290 0,280 10, ,250 0,330 0,345 0,375 0,270 0,265 42

43 Abs orbanc e Spektrofotometrie vodných roztoků Výsledky sledování vlivu přebytku KČ na interakci s CTAB na koncentrační hladině mol.l -1 Při přípravě vzorků a slepých vzorků jsem postupovala podle návodu uvedeného v kapitole V grafu č. 1, který udává závislost absorbance na vlnové délce, je zobrazeno spektrum vzorku ( koncentrace KČ je mol.l -1 ). Při přípravě byl použit Brittonův- Robinsonův pufr o ph=4,0. Při měření jsem použila kyvetu o l = 0,2 cm. Graf č. 1 2,00E -01 1,80E -01 1,60E -01 1,40E -01 1,20E -01 1,00E -01 8,00E -02 6,00E -02 4,00E -02 2,00E -02 0,00E +00-2,00E Vlnová délka (nm) 43

44 Abs orbanc e V grafu č. 2 je uvedeno spektrum vzorku ( c (KČ) = mol.l -1 ), pufr použitý na přípravu měl ph=10,0. Měření jsem prováděla v kyvetě o l = 0,2 cm. Graf č. 2 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Vlnová délka (nm) 44

45 Abs orbanc e Výsledky sledování vlivu stoupající koncentrace CTAB v řadě roztoků Při přípravě vzorků a slepých vzorků jsem postupovala podle návodu uvedeného v kapitole V grafu č. 3 jsou zobrazena spektra jednotlivých vzorků. Při jejich přípravě byl použit Brittonův-Robinsonův pufr o ph = 10,0. Použila jsem kyvetu o l=1 cm. Hodnoty maximální naměřené absorbance a k nim odpovídajících hodnot vlnových délek jsou uvedeny v tabulce č. 11. Koncentrace KČ ve všech vzorcích byla mol/l. Graf č ,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, Vlnová délka (nm) Tabulka č. 11: Hodnoty maxim absorbance a vlnových délek grafu č. 3 Koncentrace Číslo kádinky CTAB v roztoku ( mol.l -1 ) λ ( nm ) A , , , , , , ,

46 Fluorimetrie vodných roztoků Výsledky sledování vlivu přebytku KČ na interakci s CTAB na koncentrační hladině mol.l -1 V tabulce č. 12 jsou uvedeny naměřené intenzity a vlnové délky maxim emitovaného záření u jednotlivých vzorků a slepých vzorků. Citlivost byla při měření vzorků nastavena vždy na první vzorek a při měření slepých vzorků na druhý slepý vzorek. Tabulka 12: Vliv přebytku KČ na intenzitu emitovaného záření a na vlnovou délku emisního maxima Pufr o ph=4,0 Pufr o ph=10,0 vzorek slepý vzorek vzorek slepý vzorek č. λ ( nm ) I λ ( nm ) I λ ( nm ) I λ ( nm ) I , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , ,

47 Intenz ita fluores c enc e Intenz ita fluores c enc e V grafu č. 4 je zobrazena závislost intenzity fluorescence na emisní vlnové délce. Toto spektrum odpovídá vzorku č. 3 v tabulce č. 11. Pufr použitý k přípravě vzorku měl hodnotu ph = 4,0. Graf č E misní vlnová délka (nm) V grafu č. 5, který udává závislost intenzity fluorescence na emisní vlnové délce, je zobrazeno naměřené spektrum slepého vzorku, jehož výsledná koncentrace KČ v roztoku byla mol.l -1, to znamená v pořadí u třetího slepého vzorku. Při přípravě slepého vzorku byl použit Brittonův-Robinsonův pufr o ph = 10,0. Citlivost byla nastavena přímo na tento slepý vzorek. Vlnová délka emisního maxima má hodnotu 609 nm a intenzita fluorescence v tomto maximu je 6,1441. Graf č E misní vlnová délka (nm 47

48 Intenz ita fluores c enc e : Výsledky sledování vlivu stoupající koncentrace CTAB v řadě roztoků V tabulce č. 13 jsou uvedeny naměřené intenzity a vlnové délky maxim emitovaného záření u jednotlivých vzorků. Citlivost byla při měření vzorků nastavena vždy na první vzorek. Tabulka č. 13: Vliv rostoucí koncentrace CTAB na intenzitu emitovaného záření a na vlnovou délku emisního maxima Pufr o ph=4,0 Pufr o ph=10,0 č. λ ( nm ) Intenzita λ ( nm ) Intenzita , , , , , , , , , , , , , ,3887 Spektrum vzorku č. 1, při jehož přípravě byl použit Brittonův-Robinsonův pufr o ph = 4,0, je uvedeno v grafu č. 6. Graf č E misní vlnová délka (nm) 48